Summary
Den senaste generationen av EV-karakteriseringsverktyg kan utföra en enda EV-analys över flera parametrar samtidigt. Nanoflödescytometri mäter alla biologiska partiklar större än 45 nm utan märkning och identifierar specifika egenskaper hos delpopulationer med en mängd olika fluorescerande märkningstekniker.
Abstract
Karakterisering av enstaka partiklar har blivit alltmer relevant för forskning om extracellulära vesiklar, som går från bulkanalystekniker och första generationens partikelanalys till omfattande multiparametermätningar som nanoflödescytometri (nFCM). nFCM är en form av flödescytometri som använder instrumentering speciellt utformad för nanopartikelanalys, vilket gör att tusentals elbilar kan karakteriseras per minut både med och utan användning av färgningstekniker. Detektering av högupplöst sidospridning (SS) gör det möjligt att bestämma storlek och koncentration för alla biologiska partiklar större än 45 nm, medan samtidig fluorescensdetektering (FL) identifierar närvaron av märkta markörer och mål av intresse. Märkta delpopulationer kan sedan beskrivas i kvantitativa enheter av partiklar/ml eller som en procentandel av de totala partiklar som identifieras med sidospridning.
Här är elbilar härledda från konditionerade cellodlingsmedier (CCM) märkta med både ett lipidfärgämne för att identifiera partiklar med ett membran och antikroppar som är specifika för CD9, CD63 och CD81 som vanliga EV-markörer. Mätningar av jämförelsematerial, en koncentrationsstandard och en storleksstandard för kiseldioxidnanosfärer samt märkt provmaterial analyseras i en 1-minuters analys. Programvaran används sedan för att mäta koncentrationen och storleksfördelningsprofilen för alla partiklar, oberoende av märkning, innan man bestämmer partiklarna som är positiva för var och en av etiketterna.
Samtidig SS- och FL-detektering kan användas flexibelt med många olika EV-källor och märkningsmål, både externa och interna, som beskriver EV-prover på ett omfattande och kvantitativt sätt.
Introduction
Vad är elbilar?
Extracellulära vesiklar (EV) är samlingsbegreppet för en rad cell-härledda membranösa partiklar som är integrerade i många normala cell- och vävnadsaktiviteter. Deras inverkan på ett brett spektrum av vetenskapliga områden och deras potentiella kliniska relevans har drivit en tillväxt inom EV-forskning och industriellt intresse1. Liten EV (sEV) forskning fokuserar främst på exosomer, 40-100 nm partiklar som börjar bildas i de tidiga endosomerna före mognad och frigörs genom fusion av multi-vesikulära kroppar (MVB) till plasmamembranet, samt mikrovesiklar, som knoppar direkt från plasmamembranet och bildar 80-1 000 nm partiklar2. En tredje EV-population är apoptotiska kroppar, 50-1,500 nm partiklar bildade under celldöd, vilket innebär att deras relativa andel till andra elbilar kan vara mycket varierande3.
Eftersom EV-egenskaper kan representera förändringar som inträffar i deras cell / ursprungsvävnad, finns det potential för deras användning i diagnostik. Olika "omics" -analyser har börjat identifiera markörer för cellursprung och sjukdomstillstånd, vilket kan möjliggöra icke-invasiv bedömning av patienter som använder EV-källor som blodplasma / serum, urin, saliv och cerebral ryggmärgsvätska (CSF) 4,5. En drivkraft bakom dessa EV-relaterade innovationer är nya karakteriseringstekniker som övervinner tidigare begränsningar.
Behovet av, och utmaningarna med, karakterisering av enstaka elbilar
Single EV-karakterisering blir allt viktigare för både validering och beskrivning av EV-isolat, samt för att belysa nyckelfunktioner hos dessa nanopartiklar för progression av EV-baserade terapier och diagnostik6. Beroende på EV-källa och avsedd användning kan analys av renhet, som ofta beskrivs som ett förhållande mellan EV och icke-EV-partiklar eller som EV till fritt protein, kräva betydande mängder data från flera analyser7.
Partikelräkning och storleksmätningar i EV-publikationer har tidigare förlitat sig starkt på nanopartikelspårning (NTA), resistiv pulsavkänning (RPS) och elektronmikroskopi (EM)2. Standard NTA och RPS saknar förmågan att skilja elbilar från icke-EV-partiklar och har sina egna försiktighetsåtgärder som långsam genomströmning8 och olämplig nedre detektionsgräns sett med NTA 9,10,11.
Tetraspaninerna CD9, CD63 och CD81 har historiskt sett varit viktiga identifierare för förekomsten av elbilar i EV-isoleringar/förberedelser. Vanligtvis används western blotting (WB) och dot blotting-tekniker för att visa anrikningen av dessa proteiner i EV-isolat jämfört med celllysat12. Bristen på kvantifiering av dessa metoder och heterogeniteten hos dessa EV-markörer, avseende både visning inom EV-subpopulationer och cell-, vävnads- eller patientrelaterad variation, uppmuntrar emellertid avancerade analytiska tekniker som förenar fysisk och fenotypisk karakterisering13.
Nanoflödescytometri som en omfattande EV-analysteknik
För att bestämma sanna EV-koncentrationer krävs identifiering av intakta partiklar och en universell markör, särskilt i komplexa partikelisolat, med upplösning som kan detektera alla elbilar samtidigt som de skiljer dem från icke-EV-partiklar14.
Nanoflödescytometri (nFCM) är en teknik som möjliggör omärkt analys av partiklar som är stora mellan 45-1 000 nm samtidigt som fluorescerande märkning och detektion används för att identifiera partikelunderpopulationer. En viktig skillnad från konventionell flödescytometri är användningen av utrustning avsedd för nanopartikelanalys, vilket möjliggör den största upplösningen15. EV-analys, som använder konventionell flödesinstrumentation som återanvänds för analys av små partiklar, förbättras, men kämpar fortfarande för att uppnå upplösningen för att upptäcka och analysera <100 nm elbilar16,17. Pärlbaserad flödescytometri är en ytterligare anpassning som ofta används för EV-analys, men detta tar bort möjligheten till detektering av enstaka partiklar och introducerar fångstbaserade fördomar18.
Genom att dra nytta av en lägre detektionsgräns på ~ 45 nm i sidospridningskanalen (SS) för EV-analys, använder nFCM SS-utlösning. Detta kan ses som "partikel först" -analys eftersom det betyder att händelser måste ge en SS-signal som överskrider en inställd tröskel före analys av fluorescensintensiteten. Detta tar bort falska positiva resultat som nedbrutet membran och fluoroforaggregeringar och fokuserar analysen på intakta elbilar15. SS-mätningar används också för att dimensionera enskilda partiklar genom jämförelse med en fyrmodal kiseldioxidnanosfärstandard19. Fluorescensmätningarna görs på ytterligare två detektorer som möjliggör tre samtidiga mätningar för varje partikel för att beskriva partikelkoncentration, storlekar och närvaro av markörer eller andra mål av intresse för att identifiera EV-delpopulationer20.
I följande experiment används SS- och fluorescerande (FL) mätningar för att mäta >45 nm partiklar, visa delmängden membranpositiva elbilar och identifiera CD9, CD63, CD81-presentation på EV-delpopulationer. Både koncentrationen av dessa delpopulationer och deras förhållande som en del av de totala partiklarna uppmätta med SS beskrivs, liksom deras storleksprofiler.
Protocol
1. Inställning av nFCM-instrumentet och mätningar av nFCM-standarderna
OBS: Tre mätningar görs innan datainsamling påbörjas för prover för att validera korrekt inriktning av nFCM-instrumentet och ge stark jämförelse mellan instrument. Dessa är koncentrationsstandarden / kvalitetskontrollen (QC), storleksstandarden och ett tomt.
- Späd QC-pärlorna 1:100 i destillerat vatten i ett lämpligt 0,6 μl-rör och placera i lastbryggan.
- I listrutan Exempelflöde väljer du Öka för att introducera QC-provet i systemet i 45 s för att helt ersätta det tidigare provet/rengöringslösningen.
- Under förstärkning, ställ in lasereffekten på den förinställda mallen för QC-pärlor "250 nm FL QC-standard", t.ex. 10/40 mW för den blå lasern, 20/50 mW för den röda lasern, med 0,2% SS-sönderfall.
- Välj samplingstrycket från samma nedmeny för att minska systemtrycket.
- Ställ in det automatiska provtagningstrycket på 1,0 kPa för att upprätthålla ett konstant tryck.
- Starta 1-minutersanalysen genom att välja Tid att spela in från förvärvskontrollerna. Data plottas på punktdiagrammet som visar en loggskala för SS-intensitet och en vald FL-intensitet.
- Infoga filnamnet och provutspädningen innan du sparar filen.
- Välj lossa för att ta bort röret från lastkajen. Byt ut mot 150 μl rengöringslösning och rengör i >30 s genom att välja Boosting innan du tar bort rengöringslösningen genom att välja Avlasta.
- Ta bort överflödig rengöringslösning från kapillärspetsen med ett rör som innehåller 150 μl vatten.
- Späd storleksstandardpärlorna 1:100 i vatten och ladda 100 μL i lastkajen innan du ökar provet i 45 s.
- Ställ in lasereffekten på den förinställda mallen "S16 exo 68-155 nm". Den här inställningen gäller både storleksstandarden och prover som innehåller elbilar < 200 nm. Till exempel 15/40 mW för den blå lasern, 20/50 mW för den röda lasern, med 0,2% SS-sönderfall.
- Välj Provtagning och fortsätt med att spela in provet i 1 min som tidigare.
- Utför den tredje mätningen med antingen ett vatten- eller PBS-prov för att skapa en tom mätning av ditt elueringsmedel och identifiera falska positiva resultat för borttagning av programvaran. Inmatning av standardmätningarna beskrivs i följande avsnitt.
2. Bestämning av partikelkoncentrationen för ett omärkt prov och generering av en PDF-rapport
- Späd det omärkta EV-provet i PBS till ett lämpligt partikelkoncentrationsområde för nFCM-analys, 1 x 10 8-5 x 108 partiklar/ml. Ladda 10-100 μl av det utspädda provet i lastbryggan.
- När partikelkoncentrationen är okänd, börja med en utspädning på 1:100 av EV-provet. Provkoncentrationen kan snabbt approximeras med storleken på laserfläcken på CCD-kameran under boosting, eller genom observation av Event Burst Trace under provtagning.
- Öka det laddade provet i 45 s innan du väljer Sampling och spela in i 1 min, spara som tidigare beskrivits.
- Börja analysera dessa data genom att växla från fliken Förvärv till fliken Analys . Öppna de sparade nfa-filerna.
- För att möjliggöra noggrann provmätning, använd de två standardmätningarna som gjorts före provmätningen för att ställa in värden för provjämförelse såväl som blindprovet.
- Skapa storleksstandardkurvan för konvertering av SS till diameter genom att först välja storleksstandardfilen och använda verktyget set threshold (kallas även automatisk tröskel). Tröskelvärdet, som är synligt i händelseburstspårningen, identifierar den minsta signalintensitet som krävs för att en händelse ska anses vara signifikant.
- Med tröskelvärdet inställt kontrollerar du att punktdiagrammet x och y-parametrarna är SS-H eller SS-A på x-axeln och FITC-A på y-axeln.
- Öppna standardverktyget för kurvgenerering och välj S16 exo 68-155 nm som storleksmall. Klicka på Hitta toppar för att identifiera topp-SS-intensiteterna som antingen en partikel med en diameter på 68, 91, 113 eller 155 nm.
- Kontrollera om SS till diameterkurvan har genererats med ett r-värde nära 1 innan du stänger fönstret.
- Ställ in koncentrationsstandarden genom att välja den sparade filen och klicka på Count STD. Mata in standardens partikelkoncentration.
- När du har ställt in standardinformationen väljer du EV-exempelfilen och ställer in tröskeln.
- Välj den tomma filen och klicka på Ange tom för att identifiera antalet falska positiva resultat för borttagning från provantalet. Detta bör göras med samma tröskel som ditt prov. Gå tillbaka till EV-exempelfilen.
- Öppna PDF-genereringsverktyget och välj Storlek och koncentration. Mata in utspädningarna av provet. Provets koncentration och partiklarnas storleksfördelning visas.
3. Exempel på märkning
OBS: Två färgningsstrategier kan användas samtidigt för en omfattande analys av partiklarna i suspension. Märkningsprotokoll kräver ofta optimering för nya antikroppar eller provkällor.
- Späd en del av EV-provet till en koncentration av 1,25 x 1010 partiklar/ml i PBS. Inkubera 8 μl av det utspädda EV-provet med 1 μl antikropp och 1 μL färgämne för en partikelkoncentration på 1 x 10 10 partiklar/ml (det totala antalet partiklar blir 1 x 108 suspenderade i10 μl). Inkubationsförhållandet för antikroppen är 1:50 (1 μL av 1:5 antikropp) i detta fall.
- Använd mer än tre olika koncentrationer av antikropp eller färgämne under optimering, för att tillhandahålla data som indikerar att protokollet möjliggör maximal epitopbindning utan övermättnad av den valda etiketten, vilket kan försämra identifieringen av lågintensiva fluorescenshändelser. Inkubationskoncentrationen för membranfärgämnet är 40 nM (1 μL av 400 nM).
- Blanda provet på 10 μl genom virvel i 5 s och inkubera vid RT i 30 minuter i mörker.
Rekommendationer för kontroller ingår i diskussionen. - Efter inkubation tar du 1 μl av det märkta provet och späd 1:50 i PBS i ett 0,6 ml rör.
- Ladda provet i lastbryggan och applicera förstärkningstryck i 45 s. Se till att laserinställningarna är korrekta och att lämpliga linser laddas.
- Byt till samplingstryck och välj Tid att spela in. Efter förvärvet på 1 min, namnge datafilen och spara.
- Lossa provet och ersätt med rengöringslösning. Öka detta i >30 s innan du laddar nästa märkta prov.
4. nFCM-analys-PDF-generering för subpopulationsanalys
- För PDF-generering, tillämpa samma standarder som tidigare gjort; Endast det tomma måttet kommer att ställas in annorlunda.
- Välj exempelfilen och ange tröskelvärdet. På punktdiagrammet ändrar du y-axeln för att visa FL-mätningar från den gröna eller röda kanalen.
- Välj det fyrkantiga grindverktyget och använd vänsterklick för att rita en fyrkant runt FL + -populationen.
- Öppna den tomma mätfilen och klicka på Ange tom innan du återgår till exempelfilen.
- Öppna PDF-genereringsverktyget som tidigare och storleksfördelningen, koncentrationen och procentandelen (jämfört med alla SS+-händelser) identifieras för FL+-delpopulationen.
- Upprepa för varje delpopulation av intresse som identifieras som "Totalt, P1, P2 etc."
Representative Results
Tetraspaninpresentation på SW620-härledda elbilar och C2C12-härledda elbilar
Modern analys av överflödet av viktiga tetraspaniner CD9, CD63 och CD81 på elbilar från en mängd olika källor har belyst den extrema variationen i deras närvaro, både i bulkanalyser och när man analyserar deras presentation på EV-delpopulationer21. Detta är sannolikt relaterat till tillgängligheten av olika biogenesvägar såsom ESCRT-beroende och oberoende vägar22.
CD9 presenterades på den största andelen C2C12 elbilar på ~ 50%, med CD63-presentation på endast ~ 30%, i figur 1. När märkning utfördes med alla tre antitetraspaniner i en inkubation visade sig ~ 70% av partiklarna presentera minst en av EV-markörerna. Upprepade mätningar visade lägsta standardavvikelse för CD9/63/81-märkningen av C2C12-elbilar vid ~ 3,8%, medan detta var ~ 8,1% för CD81-märkta C2C12-elbilar.
SW620-härledda elbilar visade en annan tetraspaninprofil, med en mycket större skillnad mellan den mest presenterade CD9 vid ~ 40% och den minst presenterade CD63 vid ~ 7%. I likhet med C2C12-elbilarna var CD9 närvarande på majoriteten av den tetraspaninpositiva populationen, eftersom CD9/63/81-den kombinerade märkningen identifierade ~ 42% av partiklarna som att ha minst en av de tre markörerna.
Majoriteten av C2C12-härledda partiklar, den totala SS + -populationen, varierade i storlek från 45-120 nm, med en median ~ 65 nm diameter. Storleksprofilerna för var och en av de enskilda tetraspaninmärkta EV-delpopulationerna, som visas i figur 1, liknar varandra och visar en större medianstorlek på ~ 75-85 nm och färre <65 nm elbilar jämfört med den totala partikelpopulationen.
SW620-härledda partiklar varierade mellan 45-160 nm med en medianstorlek på ~ 65 nm, vilket visar en skev fördelning. De tetraspaninmärkta elbilarna visar en mer normal fördelning och större mediandiameter mellan 90-110 nm, med liknande fördelningar mellan enskilda tetraspaninpositiva delpopulationer.
Medan de mest och minst presenterade tetraspaninerna är desamma för dessa två cellinjer, skiljer sig deras proportionella representation kraftigt och det finns en intressant skillnad mellan den potentiella sampresentationen av tetraspaniner som kan observeras från skillnaden i CD9-positivitet och CD9/63/81-positiviteten.
Kombinera EV-membranmärkning med antikroppsmärkning
Tvåskiktsmembranet hos elbilar ger ett mer generiskt märkningsmål, vilket kan möjliggöra skillnad från icke-EV-partiklar av liknande storlek, såsom proteinaggregat och vissa former av LDL med lipidmonolager23. Specificiteten för denna typ av märkning måste valideras eftersom vissa vanliga membranfärger som används i EV-forskning har visat sig binda till icke-EV-partiklar också24.
Membranmärkning upprepade gånger visade ~ 80% positivitet av C2C12-härledda elbilar och SW620-elbilar. SS-intensiteten (SS-H) visar god korrelation med FITC-intensitet på punktdiagrammen för både C2C12- och SW620-resultaten som visas i figur 2. Detta förväntas eftersom SS-intensiteten är i förhållande till partikelstorleken och därmed membranytan.
Majoriteten av antikroppsmärkta elbilar var också positiva för membranmärkningen som visade dubbla positiva procentsatser (FITC + & APC +) som mycket liknar de tetraspaninpositiva procentsatserna. FITC vs APC-punktdiagram visar liten korrelation mellan membran- och tetraspaninmärkning med CD63-märkning som verkar visa den svagaste korrelationen till membranmärkning. Få händelser upptäcktes som var positiva för antikroppsmärkning men negativa för membranmärkning.
Reproducerbarhet, dubbel märkningseffektivitet och alternativa datautdata
En viktig faktor vid utformningen av nFCM-experiment är fluorofor eller etikettinteraktivitet. Figur 3a visar att upprepning av antikroppsmärkningen med och utan ytterligare membranmärkning leder till mycket liknande % positivitetsmätningar. I synnerhet visar SW620-märkningen mycket liten variation mellan de två mätuppsättningarna. Detta visar begränsad interferens mellan färgämnet och antikroppsbindningen och belyser också god reproducerbarhet vid upprepning av EV-märkning.
Intensitetsmätningar, både sidospridning och fluorescens, kan exporteras för att utmärka sig för varje enskild partikel som mäts. Från detta kan vi generera mätningar av medelfluorescensintensitet (MFI) för att ge jämförande approximationer av överflödet av vårt märkta mål. MFI för de fluorescerande populationerna av C2C12-härledda elbilar tyder på något lägre presentation av CD63 och CD81 med MFI-mätningar på ~ 550 respektive ~ 600, jämfört med ~ 850 MFI sett för CD9 + elbilar. Måttenheterna för MFI i detta fall är FL-A och är inte standardiserade mot en fluorescerande kalibrering. Användningen av alla tre antikropparna framkallar inte en mycket större fluorescens än bara CD9-märkning. Detta skiljer sig mycket från SW620 MFI-mätningarna, vilket tyder på att användning av en cocktail av alla tre antikropparna ger en större fluorescenssignal för märkta elbilar än användningen av någon enskild antikroppsetikett.
Storleksfördelningshistogrammen som produceras av NanoFCM-programvaran kan också exporteras till excel så att tredubbla datamängder kan överlagras. Storleksfördelningsprofilerna i figur 3 liknar dem i figur 1 men innehåller felstaplar. Median EV-storlek för de tetraspaninpositiva subpopulationerna i C2C12-härledda elbilar visar en median runt 70 nm, något större än 60 nm-genomsnittet av de totala partikelpopulationerna. SW620 Elbilar positiva för tetraspaninmarkörer är större och visar toppar vid ~ 100 nm.
Figur 1: CD9, CD63, CD81 positiva EV-delpopulationer identifierade genom antikroppsmärkning . (A) Stapeldiagram som visar procentandel märkta elbilar jämfört med totala partiklar som observerats av SS för C2C12-härledda elbilar. (B) Stapeldiagram som visar procentandel märkta elbilar jämfört med totala partiklar som observerats av SS för SW620-härledda elbilar. (C) Representativa storleksfördelningsprofiler för C2C12-härledda elbilar. Varje histogram hämtas från PDF-filerna som genereras för den första mätningen av tredubbla datauppsättningar. (D) Representativa storleksfördelningsprofiler för SW620-härledda elfordon. Varje histogram hämtas från PDF-filerna som genereras för den första mätningen av tredubbla datauppsättningar. Felstaplar representerar standardavvikelse för tredubbla mätningar av samma märkta prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Membranmärkning och antikroppsmärkning av CD9, CD63, CD81 som presenterar EV-delpopulationer . (A) Stapeldiagram som visar membran+ %, tetraspanin+ % och dubbel+ % för C2C12-elbilar. (B) Stapeldiagram som visar membran+ %, tetraspanin+ % och dubbel+ % för SW620 elbilar. (C) Representativa SS vs FITC-punktdiagram som visar gating för membranpositiv population. (D) Representativa FITC- vs APC-punktdiagram som visar gating för dubbelt positiv population av elbilar från C2C12. (E) Representativa FITC- vs APC-punktdiagram som visar gating för dubbel positiv population av elbilar från SW620. Felstaplar representerar standardavvikelse för tredubbla mätningar av samma märkta prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bedömning av variation i upprepade mätningar . (A) Stapeldiagram som visar antikroppsmärkning % positivitet med och utan ytterligare membranmärkning. (B) Genomsnittliga mätningar av fluorescensintensitet för gated EV-delmängder. (C) Histogram för genomsnittlig storleksfördelning för tredubbla datamängder för C2C12-elbilar. (D) Histogram för genomsnittlig storleksfördelning för tredubbla datamängder för SW620-elbilar. Felstaplar representerar standardavvikelse för tredubbla mätningar av samma märkta prover. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Prov- och reagensdetaljer
Två EV-isolat från separata cellinjer valdes för demonstration av fluorescerande märkning och efterföljande nFCM-analys. Båda EV-uppsättningarna hängdes upp i PBS och lagrades vid -80 ° C i <3 månader men de flesta andra förhållanden skilde sig åt mellan isolat. C2C12-musmyoblastcellinjen representerar en embryonal föregångare till skelettmuskelceller och odlades i 2D-odling och konditionerade tillväxtmediet över 72 timmar före EV-isolering genom ultracentrifugering. SW620 är en human kolon adenokarcinom cellinje och odlades i en rudimentär bioreaktor, berikande media under 7 veckor, med EV-isolering utförd av storleksuteslutningskromatografi (SEC) och fraktioner 7-9 eluterade från seferos CL-2B-kolumner kombinerade till ett enda prov.
Medan elbilar isolerade och koncentrerade från CCM är de enklaste provtyperna att arbeta med, är nFCM tillämpligt på de flesta EV-isolat, inklusive biofluider som serum, plasma, urin och CSF. Dessa provanalyser drar nytta av nFCM SS-detektionen av alla partiklar, vilket möjliggör bekräftelse med NTA, TRPS och andra partikelanalyser, samtidigt som de fluorescerande märkta EV-delpopulationerna beskrivs i kvantitativa termer samt en andel av totalen, för ett opartiskt tillvägagångssätt för multiparameterpartikelanalys. Analys av lågbearbetade prover är också möjlig, såsom oklargjord urin och EV-berikad CCM med förbehållet att kräva lågt förorenat protein.
Membranfärgämnet som används här är avsett att integreras i lipid-dubbelskiktet, med en lipofil enhet för membranbelastning och ett hydrofilt färgämne för kvarstående i plasmamembranet25. Det finns för närvarande inget perfekt EV-märkningsfärgämne och flera kriterier måste beaktas vid valet, inklusive specificitet för elbilar, lämplighet med fixering eller permeabilisering och effektivitet för EV-märkning26.
Fluorescerande konjugerad antikroppsmärkning av ytexponerade epitoper har visat sig vara en effektiv metod för att identifiera EV-delpopulationer27. En viktig aspekt av protokolloptimering är att uppfylla, och inte överskrida, märkningsmättnadspunkten för att binda till alla tillgängliga epitoper utan att hämma detektion av partiklar med låg fluorescens genom att låta den omgivande bufferten fyllas med fluorescerande obunden antikropp28. Dessutom påverkas tillgängligheten av exponerade bindningsställen för antikroppsmärkning potentiellt av flera faktorer. Lagringsförhållanden för elbilar har visat sig påverka koncentrations- och storleksprofiler för elbilar29 med observationer som också indikerar effekter på antikroppsmärkning30. Närvaron av ytkoronaproteiner, proteinmodifieringar och effekter av isoleringstekniker kan också ha effekter på antikroppsmärkning i vissa fall. I slutändan, när användningen av fluorescerande märkning blir vanligare för EV-studier, kommer experimentell design och optimering för flera analytiska tekniker att bli mer förfinad.
För att öka noggrannheten i resultaten kan flera kontroller inkluderas, såsom (1) PBS + färgämneskontroll, för att bedöma micell- eller aggregatbildning i vissa färgämnen, som kan visas som SS + partiklar i nFCM-analys, (2) PBS + antikroppskontroll, aggregat kan förekomma, även om de ofta inte är tillräckligt stora för att sprida tillräckligt med ljus för SS-detektion, (3) EV-prov + IgG-antikroppskontroll, vanligt i flödescytometri och används för att identifiera någon icke-specifik bindning, (4) icke-EV-partikelprov + antikropps- / färgämneskontroll - särskilt viktigt när man behöver identifiera elbilar i komplexa partikelprover, kontroller som renade LDL-partiklar (low-density lipoprotein) eller EV-utarmade / ablerade prover kan fungera som en negativ kontroll för att validera selektiv märkning, (5) positiva kontroller är svåra att designa men validering av en antikropp på celler är en användbar inkludering.
Presentation av tetraspaniner på elbilar
Antikropps- och membranmärkningen av detta experiment visar den höga nivån av kvantitativa data som kan erhållas inom en liten tidsram genom nFCM-analys. Samtidig mätning av de viktigaste fysiska egenskaperna hos partikeldiameter/koncentration med fenotypiska mätningar av membran- och/eller proteinnärvaro leder till högnivåbeskrivningar av subpopulationer inom partikelisolering.
Viktigt är att varierande nivåer av de tre "viktiga" EV-relaterade tetraspaninerna, CD9, CD63, CD81, identifierades i dessa två EV-prover. CD9 presenterades på den största andelen elbilar för både C2C12-härledda elbilar och SW620, där CD81 och CD63 var de andra respektive minst presenterade proteinerna.
Trots vissa likheter som observerats här i tetraspaninprofilerna för elbilar från två mycket olika cellkällor kan nivåerna av CD9, CD63 och CD81 vara mycket olika mellan cellinje och patienthärledda elbilar31.
Skillnaden i CD63-uttryck mellan de två EV-proverna är särskilt relevant för den pågående diskussionen om nyckelidentifierare för "EV-ness". Medan presentation av CD63 i endast ~ 8% av SW620-elbilarna kan vara oväntad av vissa, har CD63 föreslagits som dålig identifierare för de olika typerna av elbilar isolerade efter storlek eller densitet32, och tetraspaninnegativa elbilar har identifierats, även när de beskrivs som exosomliknande33.
Identifiering av elbilar inom komplexa partikelisoleringar
Heterogeniteten hos EV-tetraspaninprofiler, i både cellinjer och patient-härledda elbilar, varnar för beroende av tetraspaninbaserad infångning av elbilar och belyser det framtida behovet av nya EV-identifieringsmetoder31. EV-märkning oberoende av specifika proteiner kan visa sig vara mycket fördelaktigt för att identifiera elbilar från liknande storlekar som inte är EV-partiklar om EV-specificitet kan bevisas vara mycket hög. Detta gäller särskilt för biofluid EV-isolat eftersom det har föreslagits att koncentrationen av elbilar i humant blodplasma ligger i intervallet 10 10 partiklar / ml medan lipoproteiner mäts till10 16 per ml14,34. Även vid EV-anrikning föreslår studier som jämför partikelpositivitet för tetraspaninmarkörer och / eller LDL-markör ApoB ~ 50-100 gånger större överflöd av LDL i trombocytfria plasmaprover (PFP) jämfört med EV35.
Isoleringstekniken som används påverkar i hög grad utbudet av samisolerade icke-EV-partiklar såsom lipoproteiner med mycket låg densitet (VLDL), lipoproteiner med mellanliggande densitet (IDL) och LDL36. Det finns också beskrivningar av lipoprotein-co-isolat bundna till elbilar som, även om de potentiellt spelar en viktig biologisk roll, gör att uppnå EV-rena prover till ett utmanande mål35.
Det skulle därför kunna hävdas att större fokus läggs på beskrivningen av partiklar som utgör ett prov, snarare än att uppnå isolering av ett rent men begränsat urval av elbilar. Att uppnå en omfattande beskrivning av partiklar genom att mäta tetraspaninförekomst i bulk och partikelantal separat kan vara otillräckligt för att exakt bestämma EV-koncentrationer, särskilt från biofluidkällor36,37. Att identifiera delpopulationer i ett nivåbaserat tillvägagångssätt, som visar totala partiklar, elbilar och elbilar som presenterar vissa proteiner, vilket demonstreras i detta experiment, kan ge en robust lösning på nanopartikelkarakterisering. Detta har varit fallet för projekt som involverar EV-lastning med design för framtida terapeutiska tillämpningar20 och identifiering av CD63 + elbilar med luminal last som mitokondrier38.
nFCM inom repertoaren för EV-analys
En styrka med nFCM EV-analys är hur data kan bekräfta och bygga på de vanligaste EV-analyserna och bilda broar mellan fysiska och fenotypiska datamängder. Detta är dock baserat på exakta märkningsprotokoll som ofta måste optimeras för unika märkningsreagenser som färgämnen och antikroppar. Ett viktigt kriterium för noggrann analys är att ha märkta partiklar suspenderade i en icke-fluorescerande buffert, som bygger på antingen avlägsnande av överskott av obunden fluorofor eller förfining av protokoll för att inte överskrida epitopmättnad.
Jämförelsestudier har visat att nFCM-dimensionering av elbilar ger data i linje med TRPS och kryo-TEM, tekniker som beskrivs som mer exakta än NTA för EV-storleksanalys 10,39. Som med alla optiskt baserade metoder måste dock påverkan av heterogena optiska egenskaper som ses för elbilar och skillnader mellan de optiska egenskaperna hos referensmaterial och elbilar beaktas vid tolkning av data10.
Western blotting har varit en nyckelmetod för att indikera EV-anrikning genom identifiering av EV-markörer40. Men önskan att demonstrera förekomsten av sådana markörer på partiklar har drivit framsteg inom EV-baserade flödescytometriska analyser17. De nödvändiga upplösningarna för att tillhandahålla robusta data uppnås dock för närvarande bäst genom dedikerad instrumentering med avseende på både spritt och fluorescerande ljus19.
nFCM ger ett opartiskt tillvägagångssätt för att initialt beskriva alla partiklar som är irrelevanta för specifika markörer, med hjälp av sidospridningsmätning, vilket möjliggör bekräftelse med de vanligaste teknikerna för NTA, RPS och TEM1, samtidigt som fenotypisk mätning som liknar WB eller Elisa läggs till på ett kvantitativt sätt.
Disclosures
A.L., B.P., D.A., R.L, R.T är anställda av NanoFCM och deras bidrag till detta dokument gjordes som en del av deras anställning.
Acknowledgments
Vi vill tacka grupperna Owen Davies och Nick Peake för att de fortsätter att tillhandahålla material och expertis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
| CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
| Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
| Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
| EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
| EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
| Memglow - Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
| NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
| PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
| Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |
References
- Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325 (2019).
- Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
- Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).
- Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).
- Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
- Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
- Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
- Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
- Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
- Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).
- Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
- Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).
- Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).
- Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).
- Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
- Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).
- Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).
- Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
- Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).
- Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
