Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

नैनो-फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल बाह्य पुटिका ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन लक्षण वर्णन

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/64020
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, *2, *2, *3, *1
1NanoFCM Co., Ltd, 2School of Sport, Exercise and Health Sciences, Loughborough University, 3Biomolecular Sciences Research Centre, Sheffield Hallam University
* These authors contributed equally

Summary

ईवी लक्षण वर्णन उपकरण की नवीनतम पीढ़ी एक साथ कई मापदंडों में एकल ईवी विश्लेषण करने में सक्षम हैं। नैनो-फ्लो साइटोमेट्री लेबलिंग के बिना 45 एनएम से बड़े सभी जैविक कणों को मापता है और विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीकों द्वारा उप-आबादी की विशिष्ट विशेषताओं की पहचान करता है।

Abstract

एकल कण लक्षण वर्णन बाह्य पुटिकाओं में अनुसंधान के लिए तेजी से प्रासंगिक हो गया है, थोक विश्लेषण तकनीकों और पहली पीढ़ी के कण विश्लेषण से नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) जैसे व्यापक बहु-पैरामीटर माप तक प्रगति कर रहा है। एनएफसीएम फ्लो साइटोमेट्री का एक रूप है जो विशेष रूप से नैनो-कण विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किए गए इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करता है, जिससे हजारों ईवी को धुंधला तकनीकों के उपयोग के साथ और बिना प्रति मिनट विशेषता दी जा सकती है। उच्च रिज़ॉल्यूशन साइड स्कैटर (एसएस) का पता लगाने से 45 एनएम से बड़े सभी जैविक कणों के लिए आकार और एकाग्रता निर्धारित करने की अनुमति मिलती है, जबकि एक साथ प्रतिदीप्ति (एफएल) का पता लगाने से लेबल मार्करों और रुचि के लक्ष्यों की उपस्थिति की पहचान होती है। लेबल की गई उप-आबादी को तब कणों / एमएल की मात्रात्मक इकाइयों में या साइड स्कैटर द्वारा पहचाने गए कुल कणों के प्रतिशत के रूप में वर्णित किया जा सकता है।

यहां, वातानुकूलित सेल कल्चर मीडिया (सीसीएम) से प्राप्त ईवी को एक लिपिड डाई दोनों के साथ लेबल किया जाता है, ताकि झिल्ली के साथ कणों की पहचान की जा सके, और सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी सामान्य ईवी मार्करों के रूप में। तुलना सामग्री के माप, एक एकाग्रता मानक और सिलिका नैनोस्फीयर के आकार मानक, साथ ही लेबल नमूना सामग्री का विश्लेषण 1 मिनट के विश्लेषण में किया जाता है। सॉफ्टवेयर का उपयोग तब लेबलिंग से स्वतंत्र सभी कणों की एकाग्रता और आकार वितरण प्रोफ़ाइल को मापने के लिए किया जाता है, इससे पहले कि प्रत्येक लेबल के लिए सकारात्मक कणों का निर्धारण किया जाए।

एक साथ एसएस और एफएल डिटेक्शन का उपयोग कई अलग-अलग ईवी स्रोतों और लेबलिंग लक्ष्यों, बाहरी और आंतरिक दोनों के साथ लचीले ढंग से किया जा सकता है, जो व्यापक और मात्रात्मक तरीके से ईवी नमूनों का वर्णन करते हैं।

Introduction

ईवी क्या हैं?
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) कई सामान्य सेलुलर और ऊतक गतिविधियों के अभिन्न अंग सेल-व्युत्पन्न झिल्लीदार कणों की एक श्रृंखला के लिए सामूहिक शब्द हैं। वैज्ञानिक क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला पर उनके प्रभाव और उनकी संभावित नैदानिक प्रासंगिकता ने ईवी अनुसंधान और औद्योगिक हित में वृद्धि को प्रेरितकिया है। छोटे ईवी (एसईवी) अनुसंधान मुख्य रूप से एक्सोसोम, 40-100 एनएम कणों पर केंद्रित है जो परिपक्वता से पहले शुरुआती एंडोसोम में गठन शुरू करते हैं और प्लाज्मा झिल्ली में मल्टी-वेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के संलयन के माध्यम से रिलीज होते हैं, साथ ही माइक्रोवेसिकल्स, जो सीधे प्लाज्मा झिल्ली से 80-1,000 एनएम कणबनाते हैं। एक तीसरी ईवी आबादी एपोप्टोटिक निकाय हैं, कोशिका मृत्यु के दौरान 50-1,500 एनएम कण बनते हैं, जिसका अर्थ है कि अन्य ईवी के लिए उनका सापेक्ष अनुपात बहुत परिवर्तनशील हो सकताहै।

चूंकि ईवी विशेषताएं उनके सेल / मूल के ऊतक में होने वाले परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व कर सकती हैं, इसलिए निदान में उनके उपयोग की संभावना है। विभिन्न 'ओमिक्स' विश्लेषणों ने कोशिका उत्पत्ति और रोग की स्थिति के मार्करों की पहचान करना शुरू कर दिया है, जो ईवी स्रोतों जैसे रक्त प्लाज्मा / सीरम, मूत्र, लार और सेरेब्रल स्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) 4,5 का उपयोग करके रोगियों के गैर-इनवेसिव मूल्यांकन की अनुमति दे सकता है। इन ईवी से संबंधित नवाचारों के पीछे एक प्रेरणा शक्ति नई लक्षण वर्णन तकनीकें हैं जो पिछली सीमाओं को दूर करती हैं।

एकल ईवी लक्षण वर्णन की आवश्यकता और चुनौतियां
एकल ईवी लक्षण वर्णन ईवी आइसोलेट्स के सत्यापन और विवरण दोनों के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है, साथ ही ईवी-आधारित उपचारों और निदानकी प्रगति के लिए इन नैनोकणों की प्रमुख विशेषताओं को स्पष्ट करता है। ईवी स्रोत और इच्छित उपयोग के आधार पर, शुद्धता का विश्लेषण, जिसे अक्सर ईवी से गैर-ईवी कणों के अनुपात के रूप में या ईवी से मुक्त प्रोटीन के रूप में वर्णित किया जाता है, को कई एनालिटिक्स 7 से महत्वपूर्ण मात्रा में डेटा की आवश्यकता हो सकतीहै।

ईवी प्रकाशनों में कण गणना और आकार माप पहले नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग (एनटीए), प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग (आरपीएस), और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 2 पर बहुत अधिक निर्भर हैं। मानक एनटीए और आरपीएस में ईवी को गैर-ईवी कणों से अलग करने की क्षमता की कमी है और उनकी अपनी चेतावनी है जैसे कि धीमी थ्रूपुट8 और एनटीए 9,10,11 के साथ देखी गई पहचान की अनुपयुक्त निचली सीमा।

टेट्रास्पैनिन सीडी 9, सीडी 63, और सीडी 81 ऐतिहासिक रूप से ईवी अलगाव / तैयारी में ईवी की उपस्थिति के लिए महत्वपूर्ण पहचानकर्ता रहे हैं। आमतौर पर, सेल लाइसेट12 की तुलना में ईवी आइसोलेट्स में इन प्रोटीनों के संवर्धन को दिखाने के लिए पश्चिमी सोख्ता (डब्ल्यूबी) और डॉट ब्लॉटिंग तकनीकों का उपयोग किया जाता है। हालांकि, ईवी उप-आबादी और सेल, ऊतक या रोगी से संबंधित भिन्नता दोनों के भीतर प्रदर्शन के संबंध में इन विधियों की मात्रा की कमी और इन ईवी मार्करों की विविधता, उन्नत विश्लेषणात्मक तकनीकों को प्रोत्साहित करती है, जो भौतिक और फेनोटाइपिक लक्षण वर्णनको एकीकृत करती हैं।

नैनो-फ्लो साइटोमेट्री एक व्यापक ईवी विश्लेषण तकनीक के रूप में
सही ईवी सांद्रता का निर्धारण करने के लिए बरकरार कणों की पहचान और एक सार्वभौमिक मार्कर की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से जटिल कण आइसोलेट्स में, जिसमें संकल्प सभी ईवी का पता लगाने में सक्षम होता है, जबकि उन्हें गैर-ईवी कणों से अलग कियाजाता है।

नैनो-फ्लो साइटोमेट्री (एनएफसीएम) एक ऐसी तकनीक है जो कण उप-आबादी की पहचान करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग और पहचान का उपयोग करते हुए 45-1,000 एनएम के बीच आकार के कणों के अनलेबल विश्लेषण की अनुमति देती है। पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री से एक महत्वपूर्ण अंतर नैनोपार्टिकल विश्लेषण के लिए समर्पित उपकरणों का उपयोग है, जो सबसे बड़े रिज़ॉल्यूशन15 की अनुमति देता है। ईवी विश्लेषण, जो छोटे कण विश्लेषण के लिए पारंपरिक प्रवाह इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करता है, में सुधार हो रहा है, लेकिन फिर भी <100 एनएम ईवी16,17 का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए संकल्प प्राप्त करने के लिए संघर्ष करता है। बीड-आधारित फ्लो साइटोमेट्री एक और अनुकूलन है जो अक्सर ईवी विश्लेषण के लिए नियोजित होता है, लेकिन यह एकल कण का पता लगाने की संभावना को हटा देता है और कैप्चर आधारित पूर्वाग्रहों का परिचय देताहै।

ईवी विश्लेषण के लिए साइड स्कैटर (एसएस) चैनल में ~ 45 एनएम की पहचान की कम सीमा से लाभान्वित, एनएफसीएम एसएस ट्रिगरिंग का उपयोग करता है। इसे 'कण प्रथम' विश्लेषण के रूप में माना जा सकता है क्योंकि इसका मतलब है कि घटनाओं को प्रतिदीप्ति तीव्रता के विश्लेषण से पहले एक निर्धारित सीमा को पार करते हुए एक एसएस संकेत प्रदान करना चाहिए। यह अवक्रमित झिल्ली और फ्लोरोफोरे एकत्रीकरण जैसे झूठे सकारात्मक को हटा देता है, और बरकरार ईवी15 पर विश्लेषण केंद्रित करता है। एसएस माप का उपयोग चार-मोडल सिलिका नैनोस्फीयर मानक19 की तुलना में व्यक्तिगत कणों को आकार देने के लिए भी किया जाता है। प्रतिदीप्ति माप दो और डिटेक्टरों पर लिया जाता है, जिससे ईवी उप-आबादी20 की पहचान करने के लिए कण एकाग्रता, आकार और मार्करों की उपस्थिति या रुचि के अन्य लक्ष्यों का वर्णन करने के लिए प्रत्येक कण के लिए तीन साथ-साथ माप की अनुमति मिलती है।

निम्नलिखित प्रयोग में, एसएस और फ्लोरोसेंट (एफएल) माप का उपयोग >45 एनएम कणों को मापने, झिल्ली सकारात्मक ईवी के उप-समूह को दिखाने और ईवी उप-आबादी पर सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81 प्रस्तुति की पहचान करने के लिए किया जाता है। एसएस द्वारा मापे गए कुल कणों के हिस्से के रूप में इन उप-आबादी की एकाग्रता और उनके अनुपात दोनों का वर्णन किया गया है, जैसा कि उनके आकार प्रोफाइल हैं।

Protocol

1. एनएफसीएम उपकरण की स्थापना और एनएफसीएम मानकों का माप

नोट: एनएफसीएम उपकरण के सही संरेखण को मान्य करने और उपकरणों के बीच मजबूत तुलना प्रदान करने के लिए नमूनों के लिए डेटा अधिग्रहण शुरू करने से पहले तीन माप लिए जाते हैं। गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी), आकार मानक, और एक रिक्त स्थान हैं।

  1. क्यूसी मोतियों को आसुत जल में 1:100 को एक उपयुक्त 0.6 μL ट्यूब में पतला करें और लोडिंग बे में रखें।
  2. नमूना प्रवाह ड्रॉप डाउन मेनू से, पिछले नमूना / सफाई समाधान को पूरी तरह से बदलने के लिए 45 सेकंड के लिए सिस्टम में क्यूसी नमूने को पेश करने के लिए बूस्टिंग का चयन करें।
    1. बूस्ट करते समय, क्यूसी बीड्स "250 एनएम एफएल क्यूसी मानक" के लिए पूर्व निर्धारित टेम्पलेट पर लेजर पावर सेट करें, उदाहरण के लिए, नीले लेजर के लिए 10/40 मेगावाट, लाल लेजर के लिए 20/50 मेगावाट, 0.2% एसएस क्षय के साथ।
  3. सिस्टम दबाव को कम करने के लिए उसी डाउन मेनू से नमूना दबाव का चयन करें।
  4. निरंतर दबाव बनाए रखने के लिए ऑटो नमूना दबाव को 1.0 kPa पर सेट करें।
  5. अधिग्रहण नियंत्रणों से रिकॉर्ड करने के लिए समय का चयन करके 1 मिनट का विश्लेषण शुरू करें। डेटा को डॉट-प्लॉट पर प्लॉट किया जाएगा जो एसएस-तीव्रता और चयनित एफएल तीव्रता के लिए लॉग स्केल दिखाएगा।
  6. फ़ाइल सहेजने से पहले फ़ाइल नाम और नमूना कमजोर पड़ने डालें.
  7. लोडिंग बे से ट्यूब को हटाने के लिए अनलोड का चयन करें। सफाई समाधान के 150 μL के साथ बदलें और अनलोड का चयन करके सफाई समाधान को हटाने से पहले बूस्टिंग का चयन करके >30 सेकंड के लिए साफ करें।
    1. 150 μL पानी युक्त ट्यूब का उपयोग करके केशिका टिप से किसी भी अतिरिक्त सफाई समाधान को हटा दें।
  8. आकार मानक मोतियों को पानी में 1: 100 पतला करें और 45 सेकंड के लिए नमूने को बढ़ाने से पहले लोडिंग बे में 100 μL लोड करें ।
  9. लेजर पावर को प्रीसेट टेम्पलेट "एस 16 एक्सो 68-155 एनएम" पर सेट करें। यह सेटिंग आकार मानक और 200 एनएम < ईवी युक्त नमूने दोनों के लिए है। उदाहरण के लिए, नीले लेजर के लिए 15/40 मेगावाट, लाल लेजर के लिए 20/50 मेगावाट, 0.2% एसएस क्षय के साथ।
  10. नमूनाकरण का चयन करें और पहले की तरह 1 मिनट के लिए नमूना रिकॉर्ड करने के लिए आगे बढ़ें।
  11. सॉफ्टवेयर द्वारा हटाने के लिए झूठे सकारात्मक की पहचान करते हुए, अपने एलुएंट का एक रिक्त माप बनाने के लिए पानी या पीबीएस नमूने के साथ तीसरा माप करें। मानक माप को इनपुट करना निम्नलिखित अनुभाग में वर्णित है।

2. एक बिना लेबल वाले नमूने की कण एकाग्रता का निर्धारण करना और एक पीडीएफ रिपोर्ट तैयार करना

  1. पीबीएस में अनलेबल ईवी नमूने को एनएफसीएम विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त कण एकाग्रता सीमा, 1 x 108- 5 x 108 कण / एमएल में पतला करें। पतला नमूना के 10-100 μL को लोडिंग बे में लोड करें।
  2. जब कण एकाग्रता अज्ञात होती है, तो ईवी नमूने के 1: 100 कमजोर पड़ने से शुरू करें। नमूना एकाग्रता को बूस्टिंग के दौरान सीसीडी कैमरे पर लेजर स्पॉट के आकार से, या नमूनाकरण के दौरान इवेंट बर्स्ट ट्रेस के अवलोकन से जल्दी से अनुमानित किया जा सकता है।
  3. नमूनाकरण का चयन करने से पहले लोड किए गए नमूने को 45 सेकंड के लिए बूस्ट करें और 1 मिनट के लिए रिकॉर्ड करें, जैसा कि पहले वर्णित है।
  4. इस डेटा का विश्लेषण शुरू करने के लिए, अधिग्रहण टैब से विश्लेषण टैब पर स्विच करें। सहेजी गई nfa फ़ाइलें खोलें।
  5. सटीक नमूना माप की अनुमति देने के लिए, नमूना तुलना के साथ-साथ रिक्त स्थान के लिए मान सेट करने के लिए नमूना माप से पहले लिए गए दो मानक मापों का उपयोग करें।
  6. पहले आकार मानक फ़ाइल का चयन करके और सेट थ्रेशोल्ड टूल (जिसे ऑटो-थ्रेशोल्डिंग भी कहा जाता है) का उपयोग करके, एसएस से व्यास रूपांतरण के लिए आकार मानक वक्र बनाएं। घटना विस्फोट ट्रेस में दिखाई देने वाली दहलीज, किसी घटना को महत्वपूर्ण माने जाने के लिए आवश्यक न्यूनतम सिग्नल तीव्रता की पहचान करती है।
  7. थ्रेशोल्ड सेट के साथ, डॉट प्लॉट एक्स की जांच करें और वाई पैरामीटर एक्स अक्ष पर एसएस-एच या एसएस-ए और वाई अक्ष पर एफआईटीसी-ए हैं।
  8. मानक वक्र पीढ़ी उपकरण खोलें और साइज़िंग टेम्पलेट के रूप में S16 एक्सो 68-155 एनएम का चयन करें। पीक एसएस तीव्रता को 68, 91, 113, या 155 एनएम व्यास कण के रूप में पहचानने के लिए चोटियों को खोजें पर क्लिक करें।
  9. विंडो को बंद करने से पहले जांचें कि क्या एसएस से व्यास वक्र 1 के करीब आर मान के साथ उत्पन्न किया गया है।
  10. सहेजी गई फ़ाइल का चयन करके और काउंट एसटीडी पर क्लिक करके एकाग्रता मानक सेट करें। मानक की कण एकाग्रता इनपुट करें।
  11. मानक जानकारी सेट करने के बाद, ईवी नमूना फ़ाइल का चयन करें और सीमा सेट करें।
  12. रिक्त फ़ाइल का चयन करें और नमूना गणना से हटाने के लिए झूठे सकारात्मक की संख्या की पहचान करने के लिए रिक्त स्थान सेट करें पर क्लिक करें। यह आपके नमूने के समान सीमा के साथ किया जाना चाहिए। ईवी नमूना फ़ाइल पर लौटें।
  13. पीडीएफ जनरेशन टूल खोलें और साइज़िंग और एकाग्रता का चयन करें। नमूने के कमजोर पड़ने को इनपुट करें। नमूने की एकाग्रता और कणों के आकार वितरण को दिखाया गया है।

3. नमूना लेबलिंग

नोट: निलंबन में कणों के व्यापक विश्लेषण के लिए दो धुंधला रणनीतियों का एक साथ उपयोग किया जा सकता है। लेबलिंग प्रोटोकॉल को अक्सर नए एंटीबॉडी या नमूना स्रोतों के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है।

  1. पीबीएस में ईवी नमूने के एक हिस्से को 1.25 x 1010 कणों / एमएल की एकाग्रता में पतला करें। 1 x 10 10 कणों/एमएल की कण सांद्रता के लिए पतला ईवी नमूने के 8 μL को एंटीबॉडी के 1 μL और डाई के1 μL के साथ इनक्यूबेट करें (कुल कण 1 x 10 8 10μL में निलंबित होंगे)। एंटीबॉडी के लिए इनक्यूबेशन अनुपात इस उदाहरण में 1: 50 (1: 5 एंटीबॉडी का 1 μL) है।
    1. अनुकूलन के दौरान एंटीबॉडी या डाई की तीन से अधिक अलग-अलग सांद्रता का उपयोग करें, यह दर्शाता है कि प्रोटोकॉल चुने हुए लेबल की अधिक संतृप्ति के बिना अधिकतम एपिटोप बाइंडिंग की अनुमति देता है, जो कम तीव्रता प्रतिदीप्ति घटनाओं की पहचान को बाधित कर सकता है। झिल्ली डाई के लिए इनक्यूबेशन एकाग्रता 40 एनएम (400 एनएम का 1 μL) है।
  2. 10 μL नमूने को 5 सेकंड के लिए भंवर द्वारा मिलाएं और अंधेरे में 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: नियंत्रण के लिए सिफारिशें चर्चा में शामिल हैं।
  3. इनक्यूबेशन बाद, लेबल किए गए नमूने का 1 μL लें और 0.6 एमएल ट्यूब में पीबीएस में 1:50 को पतला करें।
  4. नमूने को लोडिंग बे में लोड करें और 45 सेकंड के लिए बूस्टिंग दबाव लागू करें। सुनिश्चित करें कि लेजर सेटिंग्स सही हैं और उपयुक्त लेंस लोड किए गए हैं।
  5. नमूना दबाव पर स्विच करें और रिकॉर्ड करने के लिए समय का चयन करें। 1 मिनट के अधिग्रहण के बाद, डेटा फ़ाइल को नाम दें और सहेजें।
  6. नमूना अनलोड करें और सफाई समाधान के साथ बदलें। अगले लेबल वाले नमूने को लोड करने से पहले इसे >30 सेकंड के लिए बढ़ाएं।

4. एनएफसीएम विश्लेषण-उप-जनसंख्या विश्लेषण के लिए पीडीएफ उत्पादन

  1. पीडीएफ पीढ़ी के लिए, पहले किए गए मानकों के समान मानकों को लागू करें; केवल रिक्त माप अलग तरह से सेट किया जाएगा।
  2. नमूना फ़ाइल का चयन करें और सीमा सेट करें। डॉट प्लॉट पर, हरे या लाल चैनल से एफएल माप दिखाने के लिए वाई-अक्ष बदलें।
  3. स्क्वायर गेटिंग टूल का चयन करें और एफएल + आबादी के चारों ओर एक वर्ग खींचने के लिए बाएं क्लिक का उपयोग करें।
  4. रिक्त माप फ़ाइल खोलें और नमूना फ़ाइल पर वापस जाने से पहले रिक्त सेट करें पर क्लिक करें।
  5. पहले की तरह पीडीएफ जनरेशन टूल खोलें और एफएल + उपजनसंख्या के लिए आकार वितरण, एकाग्रता और प्रतिशत (सभी एसएस + घटनाओं की तुलना में) की पहचान की जाती है।
    1. ब्याज की प्रत्येक उप-जनसंख्या के लिए दोहराएं जिसे "कुल, पी 1, पी 2 आदि" के रूप में पहचाना जाता है।

Representative Results

SW620 व्युत्पन्न EV और C2C12 व्युत्पन्न EV पर टेट्रास्पैनिन प्रस्तुति
विभिन्न स्रोतों से ईवी पर प्रमुख टेट्रास्पैनिन सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 की प्रचुरता के आधुनिक विश्लेषण ने थोक विश्लेषण में और ईवी उप-आबादी21 पर उनकी प्रस्तुति का विश्लेषण करते समय उनकी उपस्थिति की चरम परिवर्तनशीलता पर प्रकाश डाला है। यह संभवतः विभिन्न बायोजेनेसिस मार्गों की उपलब्धता से संबंधित है जैसे कि ईएससीआरटी-निर्भर और स्वतंत्र मार्ग22।

सीडी 9 को सी 2 सी 12 ईवी के सबसे बड़े प्रतिशत ~ 50% पर प्रस्तुत किया गया था, जिसमें सीडी 63 प्रस्तुति केवल ~ 30% पर थी, चित्रा 1 में। जब एक इनक्यूबेशन में सभी तीन एंटी-टेट्रास्पैनिन के साथ लेबलिंग की गई, तो ~ 70% कणों को ईवी मार्करों में से कम से कम एक पेश करने के लिए दिखाया गया था। दोहराए गए मापों ने सी 2 सी 12 ईवी के सीडी 9/63/81 लेबलिंग के लिए ~ 3.8% पर सबसे कम मानक विचलन दिखाया, जबकि यह सीडी 81 लेबल सी 2 सी 12 ईवी के लिए ~ 8.1% था।

SW620 व्युत्पन्न ईवी ने एक अलग टेट्रास्पैनिन प्रोफ़ाइल दिखाई, जिसमें ~ 40% पर सबसे अधिक प्रस्तुत CD9 और ~ 7% पर सबसे कम प्रस्तुत CD63 के बीच बहुत अधिक अंतर था। सी 2 सी 12 ईवी के समान, सीडी 9 टेट्रास्पैनिन सकारात्मक आबादी के बहुमत पर मौजूद था, क्योंकि सीडी 9/63/81 संयुक्त लेबलिंग ने ~ 42% कणों को तीन मार्करों में से कम से कम एक के रूप में पहचाना।

सी 2 सी 12 व्युत्पन्न कणों का बहुमत, कुल एसएस + आबादी, 45-120 एनएम के आकार में थी, जिसमें औसत ~ 65 एनएम व्यास था। चित्रा 1 में दिखाए गए एकल टेट्रास्पैनिन लेबल ईवी-उप-आबादी में से प्रत्येक के लिए आकार प्रोफाइल एक दूसरे के समान हैं, जो कुल कण आबादी की तुलना में ~ 75-85 एनएम और कम <65 एनएम ईवी का बड़ा औसत आकार दिखाते हैं।

एसडब्ल्यू 620 व्युत्पन्न कण ~ 65 एनएम के औसत आकार के साथ 45-160 एनएम के बीच थे, जो एक विषम वितरण दिखाते हैं। टेट्रास्पैनिन लेबल ईवी 90-110 एनएम के बीच अधिक सामान्य वितरण और बड़ा औसत व्यास दिखाते हैं, जिसमें व्यक्तिगत टेट्रास्पैनिन पॉजिटिव उप-आबादी के बीच समान वितरण होता है।

जबकि इन दो सेल लाइनों के लिए सबसे अधिक और सबसे कम प्रस्तुत टेट्रास्पैनिन समान हैं, उनका आनुपातिक प्रतिनिधित्व बहुत भिन्न होता है और सीडी 9 सकारात्मकता और सीडी 9/63/81 सकारात्मकता में अंतर से देखने योग्य टेट्रास्पैनिन की संभावित सह-प्रस्तुति के बीच एक दिलचस्प अंतर है।

एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ ईवी झिल्ली लेबलिंग का संयोजन
ईवी की बाईलेयर झिल्ली एक अधिक सामान्य लेबलिंग लक्ष्य प्रदान करती है, जो प्रोटीन समुच्चय जैसे समान आकार के गैर-ईवी कणों और लिपिड मोनोलेयर23 के साथ एलडीएल के कुछ रूपों से भेद की अनुमति दे सकती है। इस प्रकार के लेबलिंग की विशिष्टता को मान्य किया जाना चाहिए क्योंकि ईवी अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले कुछ सामान्य झिल्ली रंगों को गैर-ईवी कणों के साथ-साथबांधने के लिए दिखाया गया है।

मेम्ब्रेन लेबलिंग ने बार-बार C2C12 व्युत्पन्न ईवी और SW620 ईवी की ~ 80% सकारात्मकता दिखाई। एसएस तीव्रता (एसएस-एच) चित्रा 2 में दिखाए गए सी 2 सी 12 और एसडब्ल्यू 620 परिणामों दोनों के डॉट प्लॉट पर एफआईटीसी तीव्रता के साथ अच्छा सहसंबंध दिखाती है। यह अपेक्षित है क्योंकि एसएस तीव्रता कण आकार के सापेक्ष है और इसलिए झिल्ली सतह क्षेत्र है।

अधिकांश एंटीबॉडी लेबल ईवी झिल्ली लेबलिंग के लिए भी सकारात्मक थे, जो टेट्रास्पैनिन सकारात्मक प्रतिशत के समान डबल सकारात्मक प्रतिशत (एफआईटीसी + और एपीसी +) दिखाते थे। एफआईटीसी बनाम एपीसी डॉट प्लॉट झिल्ली और टेट्रास्पैनिन लेबलिंग के बीच मामूली सहसंबंध दिखाते हैं, जिसमें सीडी 63 लेबलिंग झिल्ली लेबलिंग के लिए सबसे कमजोर सहसंबंध दिखाता है। कुछ घटनाओं का पता चला जो एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए सकारात्मक थे लेकिन झिल्ली लेबलिंग के लिए नकारात्मक थे।

प्रजनन क्षमता, दोहरी लेबलिंग दक्षता, और वैकल्पिक डेटा आउटपुट
एनएफसीएम प्रयोगों को डिजाइन करने में एक महत्वपूर्ण विचार फ्लोरोफोरे या लेबल अन्तरक्रियाशीलता है। चित्रा 3 ए से पता चलता है कि अतिरिक्त झिल्ली लेबलिंग के साथ और बिना एंटीबॉडी लेबलिंग को दोहराने से बहुत समान % सकारात्मकता माप होता है। विशेष रूप से, एसडब्ल्यू 620 लेबलिंग दो माप सेटों के बीच बहुत कम भिन्नता दिखाती है। यह डाई और एंटीबॉडी बाइंडिंग के बीच सीमित हस्तक्षेप दिखाता है और ईवी लेबलिंग को दोहराते समय अच्छी प्रजनन क्षमता पर भी प्रकाश डालता है।

तीव्रता माप, साइड स्कैटर और फ्लोरेसेंस दोनों, मापा प्रत्येक व्यक्तिगत कण के लिए उत्कृष्टता प्राप्त करने के लिए निर्यात किया जा सकता है। इससे हम अपने लेबल लक्ष्य की बहुतायत के तुलनात्मक अनुमान प्रदान करने के लिए औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) माप उत्पन्न कर सकते हैं। सी 2 सी 12 व्युत्पन्न ईवी की फ्लोरोसेंट आबादी के लिए एमएफआई सीडी 9 + ईवी के लिए देखे गए ~ 850 एमएफआई की तुलना में क्रमशः ~ 550 और ~ 600 के एमएफआई माप के साथ सीडी 63 और सीडी 81 की थोड़ी कम प्रस्तुति का सुझाव देता है। इस उदाहरण में एमएफआई के लिए माप की इकाइयां एफएल-ए हैं और फ्लोरोसेंट अंशांकन के खिलाफ मानकीकृत नहीं हैं। सभी तीन एंटीबॉडी का उपयोग केवल सीडी 9 लेबलिंग की तुलना में बहुत अधिक प्रतिदीप्ति प्राप्त नहीं करता है। यह एसडब्ल्यू 620 एमएफआई माप से बहुत अलग है, जो सुझाव देता है कि सभी तीन एंटीबॉडी के कॉकटेल का उपयोग किसी भी व्यक्तिगत एंटीबॉडी लेबल के उपयोग की तुलना में लेबल ईवी के लिए अधिक प्रतिदीप्ति संकेत प्रदान करता है।

नैनोएफसीएम सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पादित आकार वितरण हिस्टोग्राम को एक्सेल में भी निर्यात किया जा सकता है जिससे तीन प्रतियों के डेटा सेट को ओवरले करने की अनुमति मिलती है। चित्रा 3 के आकार वितरण प्रोफाइल चित्रा 1 के समान हैं लेकिन इसमें त्रुटि पट्टियाँ शामिल हैं। सी 2 सी 12 व्युत्पन्न ईवी में टेट्रास्पैनिन पॉजिटिव उप-आबादी का औसत ईवी आकार लगभग 70 एनएम दिखाता है, जो कुल कण आबादी के 60 एनएम औसत से थोड़ा बड़ा है। टेट्रास्पैनिन मार्करों के लिए एसडब्ल्यू 620 ईवी सकारात्मक बड़े हैं, जो ~ 100 एनएम पर चोटियों को दिखाते हैं।

Figure 1
चित्र 1: CD9, CD63, CD81 पॉजिटिव EV उप-जनसंख्या एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा पहचानी जाती है। (A) बार चार्ट C2C12 व्युत्पन्न EV के लिए SS द्वारा देखे गए कुल कणों की तुलना में लेबल किए गए EV का प्रतिशत दर्शाता है। (बी) बार चार्ट एसडब्ल्यू 620 व्युत्पन्न ईवी के लिए एसएस द्वारा देखे गए कुल कणों की तुलना में लेबल किए गए ईवी के प्रतिशत को दर्शाता है। (सी) सी 2 सी 12 व्युत्पन्न ईवी के लिए प्रतिनिधि आकार वितरण प्रोफाइल। प्रत्येक हिस्टोग्राम तीन प्रतियों के डेटासेट के पहले माप के लिए उत्पन्न पीडीएफ से लिया जाता है। (घ) एसडब्ल्यू620 व्युत्पन्न ईवी के लिए प्रतिनिधि आकार वितरण प्रोफाइल। प्रत्येक हिस्टोग्राम तीन प्रतियों के डेटासेट के पहले माप के लिए उत्पन्न पीडीएफ से लिया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ एक ही लेबल किए गए नमूनों के तीन प्रतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: CD9, CD63, CD81 की मेम्ब्रेन लेबलिंग और एंटीबॉडी लेबलिंग EV उप-जनसंख्या प्रस्तुत करती है। (A) C2C12 EV के लिए मेम्ब्रेन + %, टेट्रास्पैनिन + % और डबल + % दिखाने वाला बार चार्ट। (बी) एसडब्ल्यू 620 ईवी के लिए मेम्ब्रेन + %, टेट्रास्पैनिन + % और डबल + % दिखाने वाला बार चार्ट। (सी) प्रतिनिधि एसएस बनाम एफआईटीसी डॉट प्लॉट जो मेम्ब्रेन पॉजिटिव आबादी के लिए गेटिंग दिखाते हैं। (घ) प्रतिनिधि एफआईटीसी बनाम एपीसी डॉट प्लॉट जो सी2सी12 से इलेक्ट्रिक वाहनों की दोहरी सकारात्मक आबादी के लिए प्रशंसा दर्शा रहे हैं। (ई) प्रतिनिधि एफआईटीसी बनाम एपीसी डॉट प्लॉट एसडब्ल्यू 620 से ईवी की दोहरी सकारात्मक आबादी के लिए गेटिंग दिखाते हैं। त्रुटि पट्टियाँ एक ही लेबल किए गए नमूनों के तीन प्रतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: दोहराए जाने वाले मापों में भिन्नता का आकलन करना। (A) बार चार्ट अतिरिक्त झिल्ली लेबलिंग के साथ और बिना एंटीबॉडी लेबलिंग % सकारात्मकता दिखाते हैं। (बी) गेटेड ईवी उपसमुच्चय के लिए औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता माप। (सी) सी 2 सी 12 ईवी के लिए तीन प्रतियों के डेटा सेट के लिए औसत आकार वितरण हिस्टोग्राम। (डी) एसडब्ल्यू 620 ईवी के लिए तीन प्रतियों के डेटा सेट के लिए औसत आकार वितरण हिस्टोग्राम। त्रुटि पट्टियाँ एक ही लेबल किए गए नमूनों के तीन प्रतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

नमूना और अभिकर्मक विवरण
फ्लोरोसेंट लेबलिंग और बाद में एनएफसीएम विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए अलग-अलग सेल लाइनों से दो ईवी आइसोलेट्स का चयन किया गया था। दोनों ईवी सेट पीबीएस में निलंबित कर दिए गए थे और <3 महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे, लेकिन अधिकांश अन्य स्थितियां आइसोलेट्स के बीच अलग थीं। सी 2 सी 12 माउस मायोब्लास्ट सेल लाइन कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के भ्रूण अग्रदूत का प्रतिनिधित्व करती है और 2 डी संस्कृति में उगाई गई थी, जो अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा ईवी अलगाव से पहले 72 घंटे से अधिक विकास माध्यम को कंडीशनिंग करती थी। एसडब्ल्यू 620 एक मानव बृहदान्त्र एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन है और इसे एक अल्पविकसित बायोरिएक्टर में उगाया गया था, जो 7 सप्ताह में मीडिया को समृद्ध करता है, जिसमें ईवी अलगाव आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा आयोजित किया जाता है और सेफ्रोस सीएल -2 बी कॉलम से 7-9 अंश एक नमूने में संयुक्त होते हैं।

जबकि सीसीएम से अलग और केंद्रित ईवी काम करने के लिए सबसे आसान नमूना प्रकार हैं, एनएफसीएम अधिकांश ईवी आइसोलेट्स पर लागू होता है, जिसमें सीरम, प्लाज्मा, मूत्र और सीएसएफ जैसे बायोफ्लुइड शामिल हैं। ये नमूना विश्लेषण सभी कणों के एनएफसीएम एसएस का पता लगाने से लाभान्वित होते हैं, जिससे एनटीए, टीआरपीएस और अन्य कण विश्लेषणों के साथ पुष्टि करने की अनुमति मिलती है, जबकि मात्रात्मक शब्दों में फ्लोरोसेंटली लेबल ईवी उप-आबादी के साथ-साथ कुल का अनुपात भी वर्णन किया जाता है, मल्टीपैरामीटर कण विश्लेषण के निष्पक्ष दृष्टिकोण के लिए। कम संसाधित नमूनों का विश्लेषण भी संभव है, जैसे कि अनक्लेरिफाइड मूत्र और ईवी समृद्ध सीसीएम कम दूषित प्रोटीन की आवश्यकता की चेतावनी के साथ।

यहां उपयोग की जाने वाली झिल्ली डाई का उद्देश्य लिपिड बाइलेयर में एकीकृत करना है, जिसमें झिल्ली लोडिंग के लिए लिपोफिलिक मोइटी और प्लाज्मा झिल्ली25 में बने रहने के लिए एक हाइड्रोफिलिक डाई है। वर्तमान में कोई सही ईवी लेबलिंग डाई नहीं है और चुनते समय कई मानदंडों पर विचार किया जाना चाहिए, जिसमें ईवी की विशिष्टता, निर्धारण या परमेबिलाइजेशन के साथ उपयुक्तता और ईवी लेबलिंग26 की दक्षता शामिल है।

सतह उजागर एपिटोप्स के फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी लेबलिंग ईवी उप-आबादी की पहचान करने के लिए एक प्रभावी तरीका साबित हुआहै। प्रोटोकॉल अनुकूलन का एक प्रमुख पहलू आसपास के बफर को फ्लोरोसेंट अनबाउंड एंटीबॉडी28 से भरने की अनुमति देकर कम फ्लोरेसेंस कणों का पता लगाने में बाधा डाले बिना सभी उपलब्ध एपिटोप्स से जुड़ने के लिए लेबलिंग संतृप्ति बिंदु को पूरा करना है, और उससे अधिक नहीं है। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए उजागर बाध्यकारी साइटों की उपलब्धता संभावित रूप से कई कारकों से प्रभावित होती है। ईवी की भंडारण स्थितियों को ईवी29 की एकाग्रता और आकार प्रोफाइल को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, जिसमें अवलोकन भी एंटीबॉडी लेबलिंग30 पर प्रभाव का संकेत देते हैं। सतही कोरोना प्रोटीन की उपस्थिति, प्रोटीन संशोधन, और अलगाव तकनीकों के प्रभाव भी कुछ मामलों में एंटीबॉडी लेबलिंग पर प्रभाव डाल सकते हैं। अंततः, जैसे-जैसे फ्लोरोसेंट लेबलिंग का उपयोग ईवी अध्ययनों के लिए अधिक प्रचलित हो जाता है, कई विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुकूलन अधिक परिष्कृत हो जाएगा।

परिणामों की सटीकता बढ़ाने के लिए, कई नियंत्रण शामिल किए जा सकते हैं जैसे (1) पीबीएस + डाई नियंत्रण, कुछ रंगों में मिसेल या कुल गठन का आकलन करने के लिए, जो एनएफसीएम विश्लेषण में एसएस + कणों के रूप में दिखाई दे सकते हैं, (2) पीबीएस + एंटीबॉडी नियंत्रण, समुच्चय हो सकते हैं, हालांकि अक्सर एसएस का पता लगाने के लिए पर्याप्त प्रकाश बिखेरने के लिए पर्याप्त बड़े नहीं होते हैं, (3) ईवी नमूना + आईजीजी एंटीबॉडी नियंत्रण, फ्लो साइटोमेट्री में आम और किसी भी गैर-विशिष्ट बाइंडिंग की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, (4) गैर-ईवी कण नमूना + एंटीबॉडी / डाई नियंत्रण - जटिल कण नमूनों में ईवी की पहचान करने की आवश्यकता होने पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण, शुद्ध कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एलडीएल) कणों या ईवी क्षीण / एब्लेटेड नमूने जैसे नियंत्रण चयनात्मक लेबलिंग को मान्य करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं, (5) सकारात्मक नियंत्रण डिजाइन करना कठिन है लेकिन कोशिकाओं पर एंटीबॉडी का सत्यापन एक उपयोगी समावेश है।

ईवी पर टेट्रास्पैनिन की प्रस्तुति
इस प्रयोग के एंटीबॉडी और झिल्ली लेबलिंग मात्रात्मक डेटा के उच्च स्तर को प्रदर्शित करता है जिसे एनएफसीएम विश्लेषण द्वारा एक छोटी समय सीमा में प्राप्त किया जा सकता है। झिल्ली और / या प्रोटीन उपस्थिति के फेनोटाइपिक माप के साथ कण व्यास / एकाग्रता की प्रमुख भौतिक विशेषताओं का एक साथ माप कण अलगाव के भीतर उप-आबादी के उच्च स्तर के विवरण की ओर जाता है।

महत्वपूर्ण रूप से, इन दो ईवी नमूनों में तीन 'कुंजी' ईवी-संबंधित टेट्रास्पैनिन, सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81 के अलग-अलग स्तरों की पहचान की गई थी। सीडी 9 को सी 2 सी 12 व्युत्पन्न ईवी और एसडब्ल्यू 620 दोनों के लिए ईवी के सबसे बड़े अनुपात पर प्रस्तुत किया गया था, जिसमें सीडी 81 और सीडी 63 क्रमशः दूसरे और सबसे कम प्रस्तुत प्रोटीन थे।

दो बहुत अलग सेल स्रोतों से ईवी के टेट्रास्पैनिन प्रोफाइल में यहां देखी गई कुछ समानताओं के बावजूद, सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81 के स्तर सेल लाइन और रोगी व्युत्पन्न ईवी31 के बीच बहुत भिन्न हो सकते हैं।

दो ईवी नमूनों के बीच सीडी 63 अभिव्यक्ति में अंतर विशेष रूप से 'ईवी-नेस' के प्रमुख पहचानकर्ताओं की चल रही चर्चा के लिए प्रासंगिक है। जबकि SW620 EV के केवल ~ 8% में CD63 की प्रस्तुति कुछ लोगों द्वारा अप्रत्याशित हो सकती है, CD63 को आकार या घनत्व32 द्वारा अलग किए गए विभिन्न प्रकार के EV के खराब पहचानकर्ता के रूप में सुझाया गया है, और टेट्रास्पैनिन नकारात्मक ईवी की पहचान की गई है, भले ही एक्सोसोम जैसे33 के रूप में वर्णित किया गया हो।

जटिल कण अलगाव के भीतर ईवी की पहचान
सेल लाइन और रोगी-व्युत्पन्न ईवी दोनों में ईवी टेट्रास्पैनिन प्रोफाइल की विविधता, ईवी के टेट्रास्पैनिन-आधारित कैप्चर पर निर्भरता के खिलाफ चेतावनी देती है और नए ईवी पहचान विधियों की भविष्य की आवश्यकता पर प्रकाशडालती है। विशिष्ट प्रोटीन से स्वतंत्र ईवी लेबलिंग समान आकार के गैर-ईवी कणों से ईवी की पहचान करने के लिए अत्यधिक फायदेमंद साबित हो सकती है यदि ईवी विशिष्टता बहुत अधिक साबित हो सकती है। यह बायोफ्लुइड ईवी आइसोलेट्स के लिए विशेष रूप से सच है क्योंकि यह सुझाव दिया गया है कि मानव रक्त प्लाज्मा में ईवी की एकाग्रता 1010 कणों / एमएल की सीमा में है जबकि लिपोप्रोटीन को 1016 प्रति एमएल14,34 पर मापा जाता है। ईवी संवर्धन पर भी, टेट्रास्पैनिन मार्करों और / या एलडीएल मार्कर एपीओबी के लिए कण सकारात्मकता की तुलना करने वाले अध्ययन ईवी35 की तुलना में प्लेटलेट मुक्त प्लाज्मा (पीएफपी) नमूनों में एलडीएल की ~ 50-100 गुना अधिक प्रचुरता का सुझाव देते हैं।

इस्तेमाल की जाने वाली अलगाव तकनीक बहुत कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (वीएलडीएल), मध्यवर्ती घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (आईडीएल), और एलडीएल36 जैसे सह-पृथक गैर-ईवी कणों की सीमा को बहुत प्रभावित करती है। ईवी से बंधे लिपोप्रोटीन सह-आइसोलेट्स का विवरण भी है, जो संभावित रूप से एक महत्वपूर्ण जैविक भूमिका निभाते हुए, ईवी शुद्ध नमूने प्राप्त करना एक चुनौतीपूर्ण लक्ष्यबनाता है।

इसलिए, यह तर्क दिया जा सकता है कि ईवी के शुद्ध लेकिन सीमित चयन के अलगाव को प्राप्त करने के बजाय, उन कणों के विवरण पर अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए जो एक नमूना बनाते हैं। थोक में टेट्रास्पैनिन बहुतायत को मापकर कणों का व्यापक विवरण प्राप्त करना और कण गणना अलग-अलग ईवी सांद्रता को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए अपर्याप्त हो सकता है, विशेष रूप से बायोफ्लुइड स्रोतोंसे 36,37। एक टियर-आधारित दृष्टिकोण में उप-आबादी की पहचान करना, कुल कणों, ईवी और ईवी को कुछ प्रोटीन पेश करना, जैसा कि इस प्रयोग में दिखाया गया है, नैनोपार्टिकल लक्षण वर्णन के लिए एक मजबूत समाधान प्रदान कर सकता है। यह भविष्य के चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए डिजाइनके साथ ईवी-लोडिंग और माइटोकॉन्ड्रिया38 जैसे ल्यूमिनल कार्गो के साथ सीडी 63 + ईवी की पहचान से जुड़ी परियोजनाओं के लिए मामला रहा है।

ईवी एनालिटिक्स के प्रदर्शनों की सूची में एनएफसीएम
एनएफसीएम ईवी विश्लेषण की ताकत वह तरीका है जिससे डेटा सबसे आम ईवी विश्लेषणों की पुष्टि और निर्माण कर सकता है और भौतिक और फेनोटाइपिक डेटा सेटों के बीच पुल बना सकता है। हालांकि, यह सटीक लेबलिंग प्रोटोकॉल पर आधारित है जिसे अक्सर रंगों और एंटीबॉडी जैसे अद्वितीय लेबलिंग अभिकर्मकों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। सटीक विश्लेषण के लिए एक प्रमुख मानदंड गैर-फ्लोरोसेंट बफर में निलंबित कणों को लेबल करना है, जो या तो अतिरिक्त अनबाउंड फ्लोरोफोरे को हटाने या एपिटोप संतृप्ति से अधिक नहीं होने के लिए प्रोटोकॉल के शोधन पर निर्भर करता है।

तुलनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि ईवी का एनएफसीएम साइजिंग टीआरपीएस और क्रायो-टीईएम के अनुरूप डेटा प्रदान करता है, तकनीकों को ईवी आकार विश्लेषण10,39 के लिए एनटीए की तुलना में अधिक सटीक बताया गया है। हालांकि, किसी भी ऑप्टिकल-आधारित विधि के साथ, ईवी के लिए देखे गए हेटेरोजेनिक ऑप्टिकल गुणों के प्रभाव और संदर्भ सामग्री और ईवी के ऑप्टिकल गुणों के बीच अंतर को डेटा10 की व्याख्या करते समय स्वीकार किया जाना चाहिए।

वेस्टर्न ब्लॉटिंग ईवीमार्कर40 की पहचान के माध्यम से ईवी संवर्धन को इंगित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका रहा है। लेकिन कणों पर ऐसे मार्करों की उपस्थिति को प्रदर्शित करने की इच्छा ने ईवी-आधारित प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण17 में प्रगति की है। हालांकि, मजबूत डेटा प्रदान करने के लिए आवश्यक संकल्प वर्तमान में बिखरे हुए और फ्लोरोसेंट लाइट 19 दोनों के संबंध में समर्पित इंस्ट्रूमेंटेशन के माध्यम से प्राप्त किएजाते हैं।

एनएफसीएम शुरू में साइड स्कैटर माप का उपयोग करके विशिष्ट मार्करों के अप्रासंगिक सभी कणों का वर्णन करने का एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है, एनटीए, आरपीएस और टीईएम1 की सबसे आम तकनीकों के साथ पुष्टि करने की अनुमति देता है, जबकि साथ ही मात्रात्मक तरीके से डब्ल्यूबी या एलिसा के समान फेनोटाइपिक माप जोड़ता है।

Disclosures

ए.एल., बी.पी., डी.ए., आर.एल., आर.टी. नैनोएफसीएम के कर्मचारी हैं और इस पेपर में उनका योगदान उनके रोजगार के हिस्से के रूप में किया गया था।

Acknowledgments

हम सामग्री और विशेषज्ञता प्रदान करना जारी रखने के लिए ओवेन डेविस और निक पीक के समूहों को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC Anti-CD81 antibody (M38) abcam ab233259 Anti-Human CD81 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) Abcam ab82392 Anti-mouse CD9 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted abcam ab82389 Anti-Human CD9 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody biolegend 143905 Anti-Mouse CD63 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody biolegend 104909 Anti-Mouse CD81 APC
conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC invitrogen Via Fisherscientific A15712 Anti-Human CD63 APC
conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor Merck Z688037-5EA
Cleaning solution NanoFCM 17159 In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12 Gifted Mouse line
EVs from SW620 Gifted Human line
Memglow - Fluorogenic Membrane Probe Cytoskeleton MG01 non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer NanoFCM nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2 Gibco Via Fisherscientific 12549079 Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL Axygen Via Fisherscientific 11371944 Tubes required to load sample into nanoanalyser

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).
  2. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  3. Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
  4. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325 (2019).
  5. Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
  6. Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).
  7. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  10. Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).
  11. Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
  12. Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
  13. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
  14. Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
  15. Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
  16. Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  17. Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).
  18. Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
  19. Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
  20. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).
  21. Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).
  22. Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).
  23. Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
  24. Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).
  25. Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
  26. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  27. Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).
  28. Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).
  29. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  30. Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
  31. Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).
  32. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  33. Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
  34. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  35. Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
  36. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).
  37. Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).
  38. Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).
  39. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  40. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).

Tags

जीव विज्ञान अंक 185 बाह्य पुटिकाओं नैनोकणों नैनोफ्लो साइटोमेट्री टेट्रास्पैनिन झिल्ली लेबलिंग उप-जनसंख्या विश्लेषण एक्सोसोम
नैनो-फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एकल बाह्य पुटिका ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन लक्षण वर्णन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lees, R., Tempest, R., Law, A.,… More

Lees, R., Tempest, R., Law, A., Aubert, D., Davies, O. G., Williams, S., Peake, N., Peacock, B. Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (185), e64020, doi:10.3791/64020 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter