Summary
La dernière génération d’outils de caractérisation des véhicules électriques est capable d’analyser simultanément plusieurs paramètres uniques. La cytométrie en nanoflux mesure toutes les particules biologiques de plus de 45 nm sans marquage et identifie les caractéristiques spécifiques des sous-populations par diverses techniques de marquage fluorescent.
Abstract
La caractérisation d’une seule particule est devenue de plus en plus pertinente pour la recherche sur les vésicules extracellulaires, passant des techniques d’analyse en vrac et de l’analyse des particules de première génération à des mesures multiparamètres complètes telles que la cytométrie en nanoflux (nFCM). La nFCM est une forme de cytométrie en flux qui utilise des instruments spécialement conçus pour l’analyse des nanoparticules, permettant de caractériser des milliers de VE par minute avec et sans l’utilisation de techniques de coloration. La détection par diffusion latérale (SS) à haute résolution permet de déterminer la taille et la concentration de toutes les particules biologiques de plus de 45 nm, tandis que la détection simultanée par fluorescence (FL) identifie la présence de marqueurs marqués et de cibles d’intérêt. Les sous-populations marquées peuvent ensuite être décrites en unités quantitatives de particules/mL ou en pourcentage du total des particules identifiées par diffusion latérale.
Ici, les VE dérivés de milieux de culture cellulaire conditionnés (CCM) sont marqués à la fois avec un colorant lipidique, pour identifier les particules avec une membrane, et des anticorps spécifiques pour CD9, CD63 et CD81 comme marqueurs EV communs. Les mesures du matériau de comparaison, une norme de concentration et une norme de taille des nanosphères de silice, ainsi que des échantillons marqués sont analysées dans une analyse de 1 minute. Le logiciel est ensuite utilisé pour mesurer la concentration et le profil de distribution granulométrique de toutes les particules, indépendamment du marquage, avant de déterminer les particules positives pour chacune des étiquettes.
La détection simultanée de SS et de FL peut être utilisée de manière flexible avec de nombreuses sources de véhicules électriques et cibles d’étiquetage différentes, externes et internes, décrivant les échantillons de véhicules électriques de manière complète et quantitative.
Introduction
Que sont les véhicules électriques?
Les vésicules extracellulaires (VE) sont le terme collectif désignant une gamme de particules membraneuses dérivées de cellules faisant partie intégrante de nombreuses activités cellulaires et tissulaires normales. Leur impact sur un large éventail de domaines scientifiques et leur pertinence clinique potentielle ont entraîné une croissance de la recherche sur les véhicules électriques et de l’intérêt industriel1. La recherche sur les petits EV (sEV) se concentre principalement sur les exosomes, des particules de 40 à 100 nm qui commencent à se former dans les premiers endosomes avant la maturation et sont libérées par fusion de corps multivésiculaires (MVB) dans la membrane plasmique, ainsi que sur les microvésicules, qui bourgeonnent directement de la membrane plasmique formant des particules de 80 à 1 000 nm2. Une troisième population de VE sont des corps apoptotiques, des particules de 50 à 1 500 nm formées lors de la mort cellulaire, ce qui signifie que leur proportion relative par rapport aux autres VE peut être très variable3.
Étant donné que les caractéristiques des VE peuvent représenter des changements se produisant dans leur cellule ou tissu d’origine, il est possible de les utiliser dans les diagnostics. Diverses analyses « omiques » ont commencé à identifier des marqueurs de l’origine cellulaire et de l’état de la maladie, ce qui peut permettre une évaluation non invasive des patients utilisant des sources de VE telles que le plasma/sérum sanguin, l’urine, la salive et le liquide céphalorachidien (LCR)4,5. Une force motrice derrière ces innovations liées aux véhicules électriques sont de nouvelles techniques de caractérisation qui surmontent les limites précédentes.
La nécessité et les défis de la caractérisation des véhicules électriques uniques
La caractérisation d’un seul EV devient de plus en plus importante pour la validation et la description des isolats EV, ainsi que pour l’élucidation des caractéristiques clés de ces nanoparticules pour la progression des thérapies et des diagnostics basés sur les VE6. Selon la source de VE et l’utilisation prévue, l’analyse de la pureté, souvent décrite comme un rapport entre les particules EV et les particules non-EV ou comme EV par rapport aux protéines libres, peut nécessiter des quantités importantes de données provenant de plusieurs analyses7.
Les mesures de comptage et de dimensionnement des particules dans les publications sur les véhicules électriques reposaient auparavant fortement sur le suivi des nanoparticules (NTA), la détection d’impulsions résistives (RPS) et la microscopie électronique (EM)2. Les NTA et RPS standard n’ont pas la capacité de distinguer les VE des particules non-EV et ont leurs propres mises en garde telles que le débit lent8 et la limite inférieure de détection inappropriée observée avec NTA 9,10,11.
Les tétraspanines CD9, CD63 et CD81 ont toujours été des identificateurs importants de la présence de VE dans les isolements/préparations de VE. Généralement, les techniques de Western blot (WB) et de dot blot sont utilisées pour montrer l’enrichissement de ces protéines dans les isolats EV par rapport au lysatcellulaire 12. Cependant, le manque de quantification de ces méthodes et l’hétérogénéité de ces marqueurs EV, tant en ce qui concerne l’affichage au sein des sous-populations EV que la variation liée aux cellules, aux tissus ou aux patients, encouragent les techniques analytiques avancées, qui unifient la caractérisation physique et phénotypique13.
La cytométrie en nanoflux comme technique complète d’analyse EV
La détermination des concentrations réelles de VE nécessite l’identification de particules intactes et d’un marqueur universel, en particulier dans les isolats de particules complexes, avec une résolution capable de détecter tous les VE tout en les distinguant des particules non EV14.
La nanocytométrie en flux (nFCM) est une technique qui permet d’analyser sans marquage des particules de taille comprise entre 45 et 1 000 nm tout en utilisant simultanément le marquage fluorescent et la détection pour identifier les sous-populations de particules. Une distinction clé par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle est l’utilisation d’équipements dédiés à l’analyse des nanoparticules, permettant la plus grande résolution15. L’analyse EV, qui utilise une instrumentation de flux conventionnelle réutilisée pour l’analyse de petites particules, s’améliore, mais a encore du mal à atteindre la résolution nécessaire pour détecter et analyser les EV <100 nm16,17. La cytométrie en flux basée sur les billes est une autre adaptation souvent utilisée pour l’analyse EV, mais elle élimine la possibilité de détection de particules uniques et introduit des biais basés sur la capture18.
Bénéficiant d’une limite inférieure de détection de ~45 nm dans le canal de diffusion latérale (SS) pour l’analyse EV, nFCM utilise le déclenchement SS. Cela peut être considéré comme une analyse « particule d’abord » car cela signifie que les événements doivent fournir un signal SS, dépassant un seuil défini avant l’analyse de l’intensité de fluorescence. Cela élimine les faux positifs tels que les agrégations de membranes dégradées et de fluorophores, et concentre l’analyse sur les VE intacts15. Les mesures SS sont également utilisées pour dimensionner des particules individuelles par rapport à une norme de nanosphère de silice à quatre modales19. Les mesures de fluorescence sont effectuées sur deux autres détecteurs permettant trois mesures simultanées pour chaque particule afin de décrire la concentration de particules, les tailles et la présence de marqueurs ou d’autres cibles d’intérêt afin d’identifier les sous-populations EV20.
Dans l’expérience suivante, des mesures SS et fluorescentes (FL) sont utilisées pour mesurer des particules de >45 nm, montrer le sous-ensemble des VE positifs sur membrane et identifier la présentation de CD9, CD63, CD81 sur les sous-populations de VE. La concentration de ces sous-populations et leur rapport par rapport au total des particules mesurées par SS sont décrits, de même que leurs profils de taille.
Protocol
1. Configuration de l’instrument nFCM et mesures des étalons nFCM
NOTE: Trois mesures sont prises avant de commencer l’acquisition des données pour les échantillons afin de valider l’alignement correct de l’instrument nFCM et de fournir une comparaison solide entre les instruments. Il s’agit de la norme de concentration/contrôle de la qualité (CQ), de la norme de taille et d’un blanc.
- Diluer les billes de CQ 1:100 dans de l’eau distillée dans un tube approprié de 0,6 μL et les placer dans le quai de chargement.
- Dans le menu déroulant Débit d’échantillons , sélectionnez Booster pour introduire l’échantillon de CQ dans le système pendant 45 s afin de remplacer complètement l’échantillon/solution de nettoyage précédent.
- Lors de l’amplification, réglez la puissance laser sur le modèle prédéfini pour les perles QC « 250 nm FL QC standard », par exemple, 10/40 mW pour le laser bleu, 20/50 mW pour le laser rouge, avec 0,2% de désintégration SS.
- Sélectionnez la pression d’échantillonnage dans le même menu vers le bas pour réduire la pression du système.
- Réglez la pression d’échantillonnage automatique à 1,0 kPa pour maintenir une pression constante.
- Lancez l’analyse de 1 minute en sélectionnant Time to Record dans les contrôles d’acquisition. Les données seront tracées sur le graphique à points montrant une échelle logarithmique pour l’intensité SS et une intensité FL sélectionnée.
- Insérez le nom du fichier et la dilution de l’échantillon avant d’enregistrer le fichier.
- Sélectionnez décharger pour retirer le tube du quai de chargement. Remplacer par 150 μL de solution de nettoyage et nettoyer pendant >30 s en sélectionnant Booster avant de retirer la solution de nettoyage en sélectionnant Décharger.
- Retirer tout excès de solution nettoyante de l’extrémité capillaire à l’aide d’un tube contenant 150 μL d’eau.
- Diluer les billes étalons de taille 1:100 dans de l’eau et charger 100 μL dans le quai de chargement, avant de booster l’échantillon pendant 45 s.
- Réglez la puissance laser sur le modèle prédéfini « S16 exo 68-155 nm ». Ce réglage s’applique à la fois à la norme de taille et aux échantillons contenant des VE < 200 nm. Par exemple, 15/40 mW pour le laser bleu, 20/50 mW pour le laser rouge, avec 0,2% de désintégration SS.
- Sélectionnez Échantillonnage et procédez à l’enregistrement de l’échantillon pendant 1 min comme précédemment.
- Effectuez la troisième mesure avec un échantillon d’eau ou de PBS pour créer une mesure à blanc de votre éluant, identifiant les faux positifs à éliminer par le logiciel. La saisie des mesures standard est décrite dans la section suivante.
2. Détermination de la concentration en particules d’un échantillon non étiqueté et génération d’un rapport PDF
- Diluer l’échantillon de VE non marqué dans du PBS à une plage de concentration de particules appropriée pour l’analyse nFCM, 1 x 10 8- 5 x 108 particules/mL. Charger 10-100 μL de l’échantillon dilué dans le quai de chargement.
- Lorsque la concentration de particules est inconnue, commencer par une dilution de 1:100 de l’échantillon EV. La concentration de l’échantillon peut être rapidement estimée par la taille de la tache laser sur la caméra CCD pendant le boost, ou par l’observation de la trace de sursaut d’événement pendant l’échantillonnage.
- Booster l’échantillon chargé pendant 45 s avant de sélectionner Échantillonnage et enregistrer pendant 1 min, en économisant comme décrit précédemment.
- Pour commencer à analyser ces données, passez de l’onglet Acquisition à l’onglet Analyse . Ouvrez les fichiers nfa enregistrés.
- Pour permettre une mesure précise de l’échantillon, utilisez les deux mesures standard prises avant la mesure de l’échantillon pour définir les valeurs pour la comparaison de l’échantillon ainsi que le blanc.
- Créez la courbe standard de taille, pour la conversion SS en diamètre, en sélectionnant d’abord le fichier standard de taille et en utilisant l’outil de définition du seuil (également appelé seuil automatique). Le seuil, visible dans la trace de rafale d’événement, identifie l’intensité minimale du signal requise pour qu’un événement soit considéré comme significatif.
- Une fois le seuil défini, vérifiez que les paramètres x et y sont SS-H ou SS-A sur l’axe x et FITC-A sur l’axe y.
- Ouvrez l’outil de génération de courbe standard et sélectionnez S16 exo 68-155 nm comme modèle de dimensionnement. Cliquez sur Trouver des pics pour identifier les intensités SS de crête comme une particule de 68, 91, 113 ou 155 nm de diamètre.
- Vérifiez si la courbe SS/diamètre a été générée avec une valeur r proche de 1 avant de fermer la fenêtre.
- Définissez la norme de concentration en sélectionnant le fichier enregistré et en cliquant sur Count STD. Entrez la concentration de particules de l’étalon.
- Après avoir défini les informations standard, sélectionnez le fichier d’exemple EV et définissez le seuil.
- Sélectionnez le fichier vierge et cliquez sur Définir comme blanc pour identifier le nombre de faux positifs à supprimer du nombre d’échantillons. Cela devrait être fait avec le même seuil que votre échantillon. Revenez à l’exemple de fichier EV.
- Ouvrez l’outil de génération PDF et sélectionnez Dimensionnement et concentration. Entrez les dilutions de l’échantillon. La concentration de l’échantillon et la distribution granulométrique des particules sont indiquées.
3. Exemple d’étiquetage
NOTE: Deux stratégies de coloration peuvent être utilisées simultanément pour une analyse complète des particules en suspension. Les protocoles de marquage nécessitent souvent une optimisation pour de nouveaux anticorps ou sources d’échantillons.
- Diluer une partie de l’échantillon de VE à une concentration de 1,25 x 1010 particules/mL dans du PBS. Incuber 8 μL de l’échantillon EV dilué avec 1 μL d’anticorps et 1 μL de colorant pour une concentration de particules de 1 x 10 10 particules/mL (les particules totales seront de 1 x 108 en suspension dans10 μL). Le rapport d’incubation de l’anticorps est de 1:50 (1 μL d’anticorps 1:5) dans ce cas.
- Utiliser plus de trois concentrations différentes d’anticorps ou de colorant pendant l’optimisation, pour fournir des données indiquant que le protocole permet une liaison maximale aux épitopes sans sursaturation de l’étiquette choisie, ce qui peut nuire à l’identification des événements de fluorescence de faible intensité. La concentration d’incubation du colorant membranaire est de 40 nM (1 μL de 400 nM).
- Mélanger l’échantillon de 10 μL en tourbillonnant pendant 5 s et incuber à TA pendant 30 min dans l’obscurité.
REMARQUE : Les recommandations relatives aux contrôles sont incluses dans la discussion. - Après l’incubation, prélever 1 μL de l’échantillon marqué et diluer 1:50 dans du PBS dans un tube de 0,6 mL.
- Chargez l’échantillon dans le quai de chargement et appliquez une pression de suralimentation pendant 45 s. Assurez-vous que les réglages laser sont corrects et que les lentilles appropriées sont chargées.
- Passez à la pression d’échantillonnage et sélectionnez Temps d’enregistrement. Après l’acquisition de 1 min, nommez le fichier de données et enregistrez.
- Déchargez l’échantillon et remplacez-le par une solution de nettoyage. Boostez cela pendant >30 s avant de charger l’échantillon étiqueté suivant.
4. Analyse nFCM-Génération PDF pour l’analyse de sous-population
- Pour la génération de PDF, appliquez les mêmes normes que précédemment; Seule la mesure à blanc sera réglée différemment.
- Sélectionnez l’exemple de fichier et définissez le seuil. Sur le graphique à points, modifiez l’axe y pour afficher les mesures FL à partir du canal vert ou rouge.
- Sélectionnez l’outil de contrôle carré et utilisez le clic gauche pour dessiner un carré autour de la population FL+.
- Ouvrez le fichier de mesure vierge et cliquez sur Définir blanc avant de revenir au fichier d’exemple.
- Ouvrez l’outil de génération PDF comme précédemment et la distribution de la taille, la concentration et le pourcentage (par rapport à tous les événements SS+) sont identifiés pour la sous-population FL+.
- Répéter pour chaque sous-population d’intérêt identifiée comme « Total, P1, P2, etc. ».
Representative Results
Présentation de la tétraspanine sur les VE dérivés du SW620 et les VE dérivés du C2C12
L’analyse moderne de l’abondance des tétraspanines clés CD9, CD63 et CD81 sur les VE provenant de diverses sources a mis en évidence l’extrême variabilité de leur présence, tant dans les analyses en vrac que lors de l’analyse de leur présentation sur les sous-populations de VE21. Cela est probablement lié à la disponibilité de différentes voies de biogenèse telles que les voies dépendantes et indépendantes des DESC22.
Le CD9 a été présenté sur le plus grand pourcentage de véhicules électriques C2C12 à ~50%, avec la présentation CD63 sur seulement ~30%, à la figure 1. Lorsque le marquage a été effectué avec les trois anti-tétraspanines en une seule incubation, ~70% des particules présentaient au moins un des marqueurs EV. Les mesures répétées ont montré l’écart type le plus faible pour l’étiquetage CD9/63/81 des VE C2C12 à ~3,8%, alors que cela était de ~8,1% pour les VE C2C12 marqués CD81.
Les VE dérivés du SW620 ont montré un profil de tétraspanine différent, avec une différence beaucoup plus grande entre le CD9 le plus présenté à ~40% et le CD63 le moins présenté à ~7%. Semblable aux VE C2C12, CD9 était présent sur la majorité de la population positive à la tétraspanine, car le marquage combiné CD9/63/81 a identifié ~42% des particules comme ayant au moins un des trois marqueurs.
La majorité des particules dérivées de C2C12, la population totale de SS+, variait en taille de 45 à 120 nm, avec un diamètre médian de ~65 nm. Les profils de taille pour chacune des sous-populations uniques de tétraspanine marquées EV, illustrées à la figure 1, sont similaires les uns aux autres, montrant une taille médiane plus grande de ~75-85 nm et moins de <65 nm EV par rapport à la population totale de particules.
Les particules dérivées de SW620 variaient entre 45 et 160 nm avec une taille médiane de ~ 65 nm, montrant une distribution asymétrique. Les VE marqués à la tétraspanine montrent une distribution plus normale et un diamètre médian plus grand entre 90 et 110 nm, avec des distributions similaires entre les sous-populations individuelles positives à la tétraspanine.
Bien que les tétraspanines les plus et les moins présentées soient les mêmes pour ces deux lignées cellulaires, leur représentation proportionnelle diffère considérablement et il existe une différence intéressante entre la co-présentation potentielle des tétraspanines observable à partir de la différence de positivité CD9 et la positivité CD9/63/81.
Combinaison du marquage de la membrane EV avec le marquage des anticorps
La membrane bicouche des VE fournit une cible de marquage plus générique, ce qui peut permettre de distinguer les particules non EV de taille similaire telles que les agrégats de protéines et certaines formes de LDL avec des monocouches lipidiques23. La spécificité de ce type d’étiquetage doit être validée, car il a été démontré que certains colorants membranaires courants utilisés dans la recherche sur les véhicules électriques se lient également aux particules non électriques24.
Le marquage membranaire a montré à plusieurs reprises ~80% de positivité des VE dérivés de C2C12 et des VE SW620. L’intensité SS (SS-H) montre une bonne corrélation avec l’intensité FITC sur les diagrammes à points des résultats C2C12 et SW620 illustrés à la figure 2. Ceci est attendu car l’intensité SS est relative à la taille des particules et donc à la surface de la membrane.
La majorité des VE marqués par des anticorps étaient également positifs pour le marquage membranaire, montrant des pourcentages doublement positifs (FITC + et APC +) très similaires aux pourcentages positifs à la tétraspanine. Les diagrammes de points FITC vs APC montrent une légère corrélation entre le marquage sur membrane et la tétraspanine, le marquage CD63 semblant montrer la corrélation la plus faible avec le marquage membranaire. Peu d’événements positifs pour le marquage des anticorps mais négatifs pour le marquage membranaire ont été détectés.
Reproductibilité, efficacité du double étiquetage et sorties de données alternatives
Une considération importante dans la conception d’expériences nFCM est l’interactivité fluorophore ou marqueur. La figure 3a montre que la répétition du marquage des anticorps avec et sans marquage membranaire supplémentaire conduit à des mesures de % de positivité très similaires. En particulier, l’étiquetage SW620 montre très peu de variation entre les deux ensembles de mesure. Cela montre une interférence limitée entre le colorant et la liaison des anticorps et met également en évidence une bonne reproductibilité lors de la répétition du marquage EV.
Les mesures d’intensité, à la fois la diffusion latérale et la fluorescence, peuvent être exportées pour exceller pour chaque particule individuelle mesurée. À partir de là, nous pouvons générer des mesures d’intensité de fluorescence moyenne (IMF) pour fournir des approximations comparatives de l’abondance de notre cible marquée. L’IMF pour les populations fluorescentes de VE dérivés de C2C12 suggère une présentation légèrement inférieure de CD63 et CD81 avec des mesures MFI de ~550 et ~600, respectivement, par rapport aux ~850 MFI observées pour les VE CD9+. Les unités de mesure de l’IMF dans ce cas sont FL-A et ne sont pas normalisées par rapport à un étalonnage fluorescent. L’utilisation des trois anticorps ne provoque pas une fluorescence beaucoup plus grande que le simple marquage CD9. Ceci est très différent des mesures de l’IMF SW620, qui suggèrent que l’utilisation d’un cocktail des trois anticorps fournit un signal de fluorescence plus important pour les VE marqués, que l’utilisation de n’importe quel marqueur d’anticorps individuel.
Les histogrammes de distribution de taille produits par le logiciel NanoFCM peuvent également être exportés dans Excel, ce qui permet de superposer des ensembles de données triples. Les profils de distribution de taille de la figure 3 sont similaires à ceux de la figure 1 , mais incluent des barres d’erreur. La taille médiane des EV des sous-populations positives à la tétraspanine dans les VE dérivées de C2C12 montre une médiane d’environ 70 nm, légèrement supérieure à la moyenne de 60 nm des populations totales de particules. Les VE SW620 positifs pour les marqueurs de tétraspanine sont plus grands, montrant des pics à ~ 100 nm.
Figure 1 : Sous-populations de VE CD9, CD63 et CD81 positives identifiées par marquage des anticorps. (A) Diagramme à barres montrant le pourcentage de VE marqués par rapport au nombre total de particules observées par SS pour les VE dérivés de C2C12. (B) Diagramme à barres montrant le pourcentage de VE marqués par rapport au nombre total de particules observées par SS pour les VE dérivés du SW620. (C) Profils représentatifs de distribution granulométrique pour les VE dérivés du C2C12. Chaque histogramme est tiré des PDF générés pour la première mesure de jeux de données triplicates. (D) Profils représentatifs de distribution de la taille pour les VE dérivés du SW620. Chaque histogramme est tiré des PDF générés pour la première mesure de jeux de données triplicates. Les barres d’erreur représentent l’écart-type des mesures triples des mêmes échantillons étiquetés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Marquage membranaire et marquage des anticorps des sous-populations de VE CD9, CD63 et CD81. (A) Diagramme à barres montrant la membrane+ %, la tétraspanine + % et le double+ % pour les VE C2C12. (B) Diagramme à barres montrant Membrane+ %, tétraspanine+ % et double+ % pour les VE SW620. (C) Graphiques à points représentatifs SS vs FITC montrant les points de contrôle pour la population positive de la membrane. (D) Graphiques à points FITC représentatifs vs APC montrant la prise de contrôle pour une population doublement positive de VE à partir de C2C12. (E) Graphiques à points FITC représentatifs vs APC montrant la prise de contrôle pour une population doublement positive de VE à partir de SW620. Les barres d’erreur représentent l’écart-type des mesures triples des mêmes échantillons étiquetés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de la variation des mesures répétées. (A) Graphiques à barres montrant le % de positivité du marquage des anticorps avec et sans marquage membranaire supplémentaire. (B) Mesures de l’intensité moyenne de fluorescence pour les sous-ensembles de véhicules électriques fermés. (C) Histogrammes de distribution granulométrique moyenne pour les ensembles de données triplicates pour les VE C2C12. (D) Histogrammes de distribution granulométrique moyenne pour les ensembles de données triples pour les véhicules électriques SW620. Les barres d’erreur représentent l’écart-type des mesures triples des mêmes échantillons étiquetés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Détails de l’échantillon et du réactif
Deux isolats EV provenant de lignées cellulaires distinctes ont été sélectionnés pour la démonstration du marquage fluorescent et l’analyse ultérieure de la nFCM. Les deux EV ont été suspendus dans du PBS et stockés à -80 °C pendant <3 mois, mais la plupart des autres conditions étaient différentes d’un isolat. La lignée cellulaire de myoblastes de souris C2C12 représente un précurseur embryonnaire des cellules musculaires squelettiques et a été cultivée en culture 2D, conditionnant le milieu de croissance pendant 72 heures avant l’isolement de l’EV par ultracentrifugation. SW620 est une lignée cellulaire d’adénocarcinome du côlon humain et a été cultivé dans un bioréacteur rudimentaire, enrichissant les milieux pendant 7 semaines, avec isolement EV effectué par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et fractions 7-9 éluées à partir de colonnes de sépharose CL-2B combinées en un seul échantillon.
Bien que les VE isolés et concentrés à partir de CCM soient les types d’échantillons les plus faciles à utiliser, le nFCM s’applique à la plupart des isolats de VE, y compris les biofluides tels que le sérum, le plasma, l’urine et le LCR. Ces analyses d’échantillons bénéficient de la détection nFCM SS de toutes les particules, permettant une corroboration avec NTA, TRPS et d’autres analyses de particules, tout en décrivant les sous-populations EV marquées par fluorescence en termes quantitatifs ainsi qu’une proportion du total, pour une approche non biaisée de l’analyse multiparamétrique des particules. L’analyse d’échantillons faiblement transformés est également possible, comme l’urine non clarifiée et la CCM enrichie en EV avec la mise en garde d’exiger des protéines faiblement contaminées.
Le colorant membranaire utilisé ici est destiné à s’intégrer dans la bicouche lipidique, avec une fraction lipophile pour la charge membranaire et un colorant hydrophile pour rester dans la membrane plasmique25. Il n’existe actuellement aucun colorant d’étiquetage EV parfait et plusieurs critères doivent être pris en compte lors du choix, notamment la spécificité des VE, l’adéquation à la fixation ou à la perméabilisation et l’efficacité de l’étiquetage EV26.
Le marquage par anticorps conjugués fluorescents des épitopes exposés en surface s’est avéré une méthode efficace pour identifier les sous-populations de VE27. Un aspect clé de l’optimisation du protocole est de respecter, et non de dépasser, le point de saturation du marquage pour se lier à tous les épitopes disponibles sans inhiber la détection des particules de faible fluorescence en permettant au tampon environnant d’être rempli d’anticorps fluorescents non liés28. De plus, la disponibilité des sites de liaison exposés pour le marquage des anticorps est potentiellement influencée par plusieurs facteurs. Il a été démontré que les conditions de stockage des VE affectent les profils de concentration et de taille des VE29 , les observations indiquant également des effets sur le marquage des anticorps30. La présence de protéines corona de surface, les modifications protéiques et les impacts des techniques d’isolement peuvent également avoir des effets sur le marquage des anticorps dans certains cas. En fin de compte, à mesure que l’utilisation du marquage fluorescent deviendra plus répandue pour les études sur les véhicules électriques, la conception expérimentale et l’optimisation de multiples techniques analytiques deviendront plus raffinées.
Pour augmenter la précision des résultats, plusieurs contrôles peuvent être inclus tels que (1) PBS + contrôle colorant, pour évaluer la formation de micelle ou d’agrégats dans certains colorants, qui peuvent apparaître comme des particules SS + dans l’analyse nFCM, (2) PBS + contrôle des anticorps, des agrégats peuvent se produire, bien que souvent pas assez grands pour diffuser suffisamment de lumière pour la détection SS, (3) échantillon EV + contrôle des anticorps IgG, commun en cytométrie de flux et utilisé pour identifier toute liaison non spécifique, (4) échantillon de particules non EV + contrôle d’anticorps / colorant - particulièrement important lorsque vous devez identifier des VE dans des échantillons de particules complexes, des contrôles tels que des particules de lipoprotéines de basse densité (LDL) purifiées ou des échantillons appauvris / ablés en EV peuvent agir comme un contrôle négatif pour valider le marquage sélectif, (5) les contrôles positifs sont difficiles à concevoir, mais la validation d’un anticorps sur les cellules est une inclusion utile.
Présentation des tétraspanines sur les véhicules électriques
Le marquage des anticorps et de la membrane de cette expérience démontre le niveau élevé de données quantitatives qui peuvent être obtenues dans un court laps de temps par l’analyse nFCM. La mesure simultanée des principaux attributs physiques du diamètre/concentration des particules avec les mesures phénotypiques de la présence membranaire et/ou protéique conduit à des descriptions de haut niveau des sous-populations dans l’isolement des particules.
Il est important de noter que des niveaux variables des trois tétraspanines « clés » liées à l’EV, CD9, CD63, CD81, ont été identifiés dans ces deux échantillons de VE. CD9 a été présenté sur la plus grande proportion de VE pour les VE dérivés de C2C12 et SW620, CD81 et CD63 étant les deuxièmes et les moins présentées protéines, respectivement.
Malgré certaines similitudes observées ici dans les profils de tétraspanine des VE provenant de deux sources cellulaires très différentes, les niveaux de CD9, CD63 et CD81 peuvent être très différents entre la lignée cellulaire et les EV31 dérivés du patient.
La différence d’expression de CD63 entre les deux échantillons de VE est particulièrement pertinente pour la discussion en cours sur les identificateurs clés de « EV-ness ». Bien que la présentation de CD63 dans seulement ~8% des VE SW620 puisse être inattendue pour certains, CD63 a été suggéré comme mauvais identifiant des différents types de VE isolés par taille ou densité32, et les VE négatifs à la tétraspanine ont été identifiés, même lorsqu’ils sont décrits comme exosomes33.
Identification des VE dans des isolements de particules complexes
L’hétérogénéité des profils de tétraspanine EV, à la fois dans les VE de lignées cellulaires et les VE dérivés de patients, met en garde contre le recours à la capture des VE à base de tétraspanine et souligne le besoin futur de nouvelles méthodes d’identification des VE31. Le marquage des VE indépendant de protéines spécifiques pourrait s’avérer très bénéfique pour identifier les VE à partir de particules non EV de taille similaire si la spécificité EV peut être prouvée très élevée. Cela est particulièrement vrai pour les isolats de VE biofluide, car il a été suggéré que la concentration de VE dans le plasma sanguin humain est de l’ordre de 10 10 particules/mL, tandis que les lipoprotéines sont mesurées à10 16 par mL14,34. Même lors de l’enrichissement en EV, les études comparant la positivité des particules pour les marqueurs de tétraspanine et / ou le marqueur LDL ApoB suggèrent ~50-100 fois plus grande abondance de LDL dans les échantillons de plasma libre de plaquettes (PFP) par rapport à EV35.
La technique d’isolement utilisée affecte grandement la gamme de particules non EV co-isolées telles que les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL) et LDL36. Il existe également des descriptions de co-isolats de lipoprotéines liés aux VE qui, tout en jouant potentiellement un rôle biologique important, font de l’obtention d’échantillons purs de VE un objectif difficile35.
Par conséquent, on pourrait soutenir qu’il faudrait mettre davantage l’accent sur la description des particules qui composent un échantillon, plutôt que de parvenir à isoler une sélection pure mais limitée de VE. Obtenir une description complète des particules en mesurant séparément l’abondance de tétraspanine en vrac et en nombre de particules peut être insuffisant pour déterminer avec précision les concentrations de VE, en particulier à partir de sources biofluides36,37. L’identification de sous-populations dans une approche à plusieurs niveaux, montrant les particules totales, les VE et les VE présentant certaines protéines, comme démontré dans cette expérience, peut fournir une solution robuste à la caractérisation des nanoparticules. Cela a été le cas pour les projets impliquant le chargement de véhicules électriques avec des conceptions pour de futures applications thérapeutiques20 et l’identification de VE CD63+ avec une cargaison luminale telle que les mitochondries38.
nFCM dans le répertoire de l’analyse des véhicules électriques
L’une des forces de l’analyse nFCM EV est la façon dont les données peuvent corroborer et s’appuyer sur les analyses EV les plus courantes et former des ponts entre les ensembles de données physiques et phénotypiques. Cependant, cela est basé sur des protocoles de marquage précis qui doivent souvent être optimisés pour des réactifs de marquage uniques tels que les colorants et les anticorps. Un critère clé pour une analyse précise est d’avoir des particules marquées en suspension dans un tampon non fluorescent, ce qui repose soit sur l’élimination de l’excès de fluorophore non lié, soit sur le raffinement des protocoles pour ne pas dépasser la saturation des épitopes.
Des études comparatives ont montré que le dimensionnement nFCM des VE fournit des données conformes au TRPS et à la cryo-TEM, techniques décrites comme plus précises que la NTA pour l’analyse de la taille des VE10,39. Cependant, comme pour toute méthode optique, l’influence des propriétés optiques hétérogènes observées pour les VE et les différences entre les propriétés optiques du matériau de référence et des VE doivent être reconnues lors de l’interprétation des données10.
Le transfert Western a été une méthode clé pour indiquer l’enrichissement des VE par l’identification des marqueurs de VE40. Mais le désir de démontrer la présence de tels marqueurs sur les particules a conduit à des avancées dans les analyses cytométriques en flux basées sur EV17. Cependant, les résolutions nécessaires pour fournir des données robustes sont actuellement mieux atteintes par une instrumentation dédiée en ce qui concerne la lumière diffusée et fluorescente19.
nFCM fournit une approche impartiale de la description initiale de toutes les particules non pertinentes pour des marqueurs spécifiques, en utilisant la mesure de diffusion latérale, permettant une corroboration avec les techniques les plus courantes de NTA, RPS et TEM1, tout en ajoutant simultanément une mesure phénotypique similaire à WB ou Elisa de manière quantitative.
Disclosures
A.L., B.P., D.A., R.L, R.T sont des employés de NanoFCM et leurs contributions à cet article ont été faites dans le cadre de leur emploi.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les groupes d’Owen Davies et de Nick Peake pour avoir continué à fournir du matériel et de l’expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
| CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
| Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
| Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
| EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
| EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
| Memglow - Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
| NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
| PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
| Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |
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