Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Enkelt ekstracellulær vesikkel transmembranproteinkarakterisering ved nano-flowcytometri

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/64020
Automatic Translation
*1, *1, *1, *1, *2, *2, *3, *1
1NanoFCM Co., Ltd, 2School of Sport, Exercise and Health Sciences, Loughborough University, 3Biomolecular Sciences Research Centre, Sheffield Hallam University
* These authors contributed equally

Summary

Den nyeste generasjonen av EV-karakteriseringsverktøy er i stand til enkelt EV-analyse på tvers av flere parametere samtidig. Nano-flow cytometri måler alle biologiske partikler større enn 45 nm uten merking og identifiserer spesifikke egenskaper av underpopulasjoner ved en rekke fluorescerende merkingsteknikker.

Abstract

Karakterisering av enkeltpartikler har blitt stadig mer relevant for forskning på ekstracellulære vesikler, som går fra bulkanalyseteknikker og førstegenerasjons partikkelanalyse til omfattende multiparametermålinger som nano-flow cytometri (nFCM). nFCM er en form for flowcytometri som benytter instrumentering spesielt utviklet for nanopartikkelanalyse, slik at tusenvis av elbiler kan karakteriseres per minutt både med og uten bruk av fargeteknikker. Deteksjon av høyoppløselig sidespredning (SS) gjør det mulig å bestemme størrelse og konsentrasjon for alle biologiske partikler større enn 45 nm, mens deteksjon av samtidig fluorescens (FL) identifiserer tilstedeværelsen av merkede markører og mål av interesse. Merkede underpopulasjoner kan deretter beskrives i kvantitative enheter av partikler/ml eller som en prosentandel av de totale partiklene identifisert ved sidespredning.

Her er elbiler avledet fra betingede cellekulturmedier (CCM) merket med både et lipidfargestoff, for å identifisere partikler med en membran, og antistoffer som er spesifikke for CD9, CD63 og CD81 som vanlige EV-markører. Målinger av sammenligningsmateriale, en konsentrasjonsstandard og en størrelsesstandard for silika nanosfærer, samt merket prøvemateriale analyseres i en 1-minutters analyse. Programvaren brukes deretter til å måle konsentrasjons- og størrelsesfordelingsprofilen til alle partikler, uavhengig av merking, før du bestemmer partiklene som er positive for hver av etikettene.

Samtidig SS- og FL-deteksjon kan brukes fleksibelt med mange forskjellige EV-kilder og merkingsmål, både eksterne og interne, som beskriver EV-prøver på en omfattende og kvantitativ måte.

Introduction

Hva er elbiler?
Ekstracellulære vesikler (EV) er samlebetegnelsen for en rekke celleavledede membranøse partikler som er integrert i mange normale cellulære og vevsaktiviteter. Deres innvirkning på et bredt spekter av vitenskapelige felt og deres potensielle kliniske relevans har drevet en vekst i EV-forskning og industriell interesse1. Liten EV (sEV) forskning fokuserer primært på eksosomer, 40-100 nm partikler som begynner dannelse i de tidlige endosomene før modning og frigjøring gjennom fusjon av multi-vesikulære legemer (MVB) til plasmamembranen, samt mikrovesikler, som knopper direkte fra plasmamembranen som danner 80-1000 nm partikler2. En tredje EV-populasjon er apoptotiske legemer, 50-1,500 nm partikler dannet under celledød, noe som betyr at deres relative andel til andre elbiler kan være sterkt variabel3.

Fordi EV-egenskaper kan representere endringer som forekommer i deres celle / vev av opprinnelse, er det potensial for bruk i diagnostikk. Ulike "omics" -analyser har begynt å identifisere markører for celleopprinnelse og sykdomstilstand, noe som kan muliggjøre ikke-invasiv vurdering av pasienter ved hjelp av EV-kilder som blodplasma / serum, urin, spytt og cerebral spinalvæske (CSF) 4,5. En drivkraft bak disse EV-relaterte innovasjonene er nye karakteriseringsteknikker som overvinner tidligere begrensninger.

Behovet for, og utfordringene med, karakterisering av én elbil
Single EV-karakterisering blir stadig viktigere for både validering og beskrivelse av EV-isolater, samt belyser nøkkelegenskaper ved disse nanopartiklene for progresjon av EV-baserte terapier og diagnostikk6. Avhengig av EV-kilden og tiltenkt bruk, kan analyse av renhet, ofte beskrevet som et forhold mellom EV og ikke-EV-partikler eller som EV til fritt protein, kreve betydelige mengder data fra flere analyser7.

Partikkeltelling og dimensjoneringsmålinger i EV-publikasjoner har tidligere stolt sterkt på Nanopartikkelsporing (NTA), resistiv pulsmåling (RPS) og elektronmikroskopi (EM) 2. Standard NTA og RPS mangler evnen til å skille elbiler fra ikke-EV-partikler og har sine egne advarsler som langsom gjennomstrømning8 og uegnet nedre deteksjonsgrense sett med NTA 9,10,11.

Tetraspaninene CD9, CD63 og CD81 har historisk sett vært viktige identifikatorer for tilstedeværelsen av elbiler i EV-isolasjoner/preparater. Vanligvis brukes western blotting (WB) og dot blotting teknikker for å vise anrikning av disse proteinene i EV-isolater sammenlignet med cellelysat12. Imidlertid oppfordrer mangelen på kvantifisering til disse metodene og heterogeniteten til disse EV-markørene, både når det gjelder visning i EV-underpopulasjoner og celle-, vevs- eller pasientrelatert variasjon, avanserte analytiske teknikker, som forener fysisk og fenotypisk karakterisering13.

Nano-flow cytometri som en omfattende EV analyse teknikk
Bestemmelse av sanne EV-konsentrasjoner krever identifisering av intakte partikler og en universell markør, spesielt i komplekse partikkelisolater, med oppløsning som er i stand til å oppdage alle elbiler mens de skiller dem fra ikke-EV-partikler14.

Nano-flow cytometri (nFCM) er en teknikk som tillater umerket analyse av partikler størrelse mellom 45-1000 nm samtidig som fluorescerende merking og deteksjon for å identifisere partikkel subpopulasjoner. Et viktig skille fra konvensjonell flowcytometri er bruken av utstyr dedikert til nanopartikkelanalyse, noe som gir størst oppløsning15. EV-analyse, som bruker konvensjonell strømningsinstrumentering repurposed for liten partikkelanalyse, forbedres, men sliter fortsatt med å oppnå oppløsningen for å oppdage og analysere < 100 nm EV16,17. Perlebasert flowcytometri er en ytterligere tilpasning som ofte brukes til EV-analyse, men dette fjerner muligheten for enkeltpartikkeldeteksjon og introduserer fangstbaserte skjevheter18.

Ved å dra nytte av en nedre deteksjonsgrense på ~ 45 nm i sidespredningskanalen (SS) for EV-analyse, bruker nFCM SS-utløsing. Dette kan betraktes som "partikkel først" -analyse, da det betyr at hendelser må gi et SS-signal, som overskrider en angitt terskel før analyse av fluorescensintensiteten. Dette fjerner falske positiver som nedbrutt membran og fluoroforaggregeringer, og fokuserer analysen på intakte elbiler15. SS-målinger brukes også til å dimensjonere individuelle partikler sammenlignet med en firemodal silika nanosfærestandard19. Fluorescensmålingene er tatt på ytterligere to detektorer som tillater tre samtidige målinger for hver partikkel for å beskrive partikkelkonsentrasjon, størrelser og tilstedeværelse av markører eller andre mål av interesse for å identifisere EV-underpopulasjoner20.

I det følgende eksperimentet brukes SS- og fluorescerende (FL) målinger til å måle >45 nm partikler, vise delmengden av membranpositive elbiler og identifisere CD9, CD63, CD81-presentasjon på EV-underpopulasjoner. Både konsentrasjonen av disse subpopulasjonene og deres forhold som en del av de totale partiklene målt ved SS er beskrevet, og det samme er deres størrelsesprofiler.

Protocol

1. Oppsett av nFCM-instrumentet og målinger av nFCM-standardene

MERK: Tre målinger er tatt før du begynner datainnsamling for prøver for å validere riktig justering av nFCM-instrumentet og gi sterk sammenligning mellom instrumenter. Dette er konsentrasjonsstandard / kvalitetskontroll (QC), størrelsesstandard og et emne.

  1. Fortynn QC-perlene 1:100 i destillert vann i et passende 0,6 μL-rør og plasser i lasterommet.
  2. Fra rullegardinmenyen Prøveflyt velger du Boosting for å introdusere QC-prøven i systemet i 45 sekunder for å erstatte den forrige prøve-/rengjøringsløsningen fullstendig.
    1. Mens du øker, sett lasereffekten til den forhåndsinnstilte malen for QC-perler "250 nm FL QC-standard", for eksempel 10/40 mW for den blå laseren, 20/50 mW for den røde laseren, med 0,2% SS-forfall.
  3. Velg prøvetakingstrykket fra samme nedmeny for å redusere systemtrykket.
  4. Sett automatisk prøvetakingstrykk til 1,0 kPa for å opprettholde et konstant trykk.
  5. Start analysen på 1 minutt ved å velge Tid til registrering fra anskaffelseskontrollene. Data vil bli plottet på punktdiagrammet som viser en loggskala for SS-intensitet og en valgt FL-intensitet.
  6. Sett inn filnavnet og eksempelfortynningen før du lagrer filen.
  7. Velg lossing for å fjerne røret fra lasterommet. Bytt ut med 150 μL rengjøringsmiddel og rengjør i >30 s ved å velge Boosting før du fjerner rengjøringsløsningen ved å velge Unload.
    1. Fjern overflødig rengjøringsmiddel fra kapillærspissen ved hjelp av et rør som inneholder 150 μL vann.
  8. Fortynn størrelsesstandardperlene 1:100 i vann og last 100 μL inn i lasterommet, før du øker prøven i 45 s.
  9. Sett lasereffekten til den forhåndsinnstilte malen "S16 exo 68-155 nm". Denne innstillingen er for både størrelsesstandarden og prøver som inneholder elbiler < 200 nm. For eksempel 15/40 mW for den blå laseren, 20/50 mW for den røde laseren, med 0,2% SS-forfall.
  10. Velg Sampling og fortsett med å registrere prøven i 1 min som før.
  11. Utfør den tredje målingen med enten en vann- eller PBS-prøve for å lage en tom måling av unnvikelsen, og identifiser falske positiver for fjerning av programvaren. Inputting standardmålene er beskrevet i følgende avsnitt.

2. Bestemme partikkelkonsentrasjonen til en umerket prøve og generere en PDF-rapport

  1. Fortynn den umerkede EV-prøven i PBS til et passende partikkelkonsentrasjonsområde for nFCM-analyse, 1 x 10 8- 5 x 108 partikler / ml. Last 10-100 μL av den fortynnede prøven inn i lasterommet.
  2. Når partikkelkonsentrasjonen er ukjent, begynn med en 1:100 fortynning av EV-prøven. Prøvekonsentrasjonen kan raskt tilnærmes av størrelsen på laserpunktet på CCD-kameraet under boosting, eller ved observasjon av Event Burst Trace under prøvetaking.
  3. Øk den lastede prøven i 45 sekunder før du velger Prøvetaking og ta opp i 1 min, og lagre som tidligere beskrevet.
  4. Hvis du vil begynne å analysere disse dataene, bytter du fra Anskaffelse-fanen til Analyse-fanen . Åpne de lagrede nfa-filene.
  5. For å muliggjøre nøyaktig prøvemåling, bruk de to standardmålingene som ble tatt før prøvemåling for å angi verdier for prøvesammenligning så vel som det tomme.
  6. Opprett størrelsesstandardkurven, for SS til diameterkonvertering, ved først å velge størrelsesstandardfilen og bruke det angitte terskelverktøyet (også kjent som automatisk terskel). Terskelen, som er synlig i hendelsessporingen, identifiserer den minste signalintensiteten som kreves for at en hendelse skal anses som signifikant.
  7. Når terskelen er angitt, kontrollerer du at punktplottet x og y-parameterne er SS-H eller SS-A på x-aksen og FITC-A på y-aksen.
  8. Åpne standardkurvegenereringsverktøyet, og velg S16 exo 68-155 nm som størrelsesmal. Klikk på Finn topper for å identifisere topp SS-intensiteter som enten en partikkel på 68, 91, 113 eller 155 nm.
  9. Kontroller om kurven SS til diameter er generert med en r-verdi nær 1 før du lukker vinduet.
  10. Angi konsentrasjonsstandarden ved å velge den lagrede filen og klikke på Count STD. Skriv inn partikkelkonsentrasjonen til standarden.
  11. Når du har angitt standardinformasjonen, velger du EV-eksempelfilen og angir terskelen.
  12. Velg den tomme filen og klikk på Set Blank for å identifisere antall falske positiver for fjerning fra prøvetellingen. Dette bør gjøres med samme terskel som prøven din. Gå tilbake til EV-eksempelfilen.
  13. Åpne PDF-genereringsverktøyet og velg Størrelse og konsentrasjon. Skriv inn fortynningene av prøven. Konsentrasjonen av prøven og størrelsesfordelingen av partiklene er vist.

3. Eksempel på merking

MERK: To fargestrategier kan brukes samtidig for en omfattende analyse av partiklene i suspensjon. Merkingsprotokoller krever ofte optimalisering for nye antistoffer eller prøvekilder.

  1. Fortynn en del av EV-prøven til en konsentrasjon på 1,25 x 1010 partikler / ml i PBS. Inkuber 8 μL av den fortynnede EV-prøven med 1 μL antistoff og 1 μL fargestoff for en partikkelkonsentrasjon på 1 x 10 10 partikler / ml (totale partikler vil være 1 x 108 suspendert i10 μL). Inkubasjonsforholdet for antistoffet er 1:50 (1 μL av 1:5 antistoff) i dette tilfellet.
    1. Bruk mer enn tre forskjellige konsentrasjoner av antistoff eller fargestoff under optimalisering, for å gi data som indikerer at protokollen tillater maksimal epitopbinding uten overmetning av den valgte etiketten, noe som kan svekke identifiseringen av fluorescenshendelser med lav intensitet. Inkubasjonskonsentrasjonen for membranfargestoffet er 40 nM (1 μL på 400 nM).
  2. Bland 10 μL-prøven ved vortexing i 5 s og inkuber ved RT i 30 minutter i mørket.
    MERK: Anbefalinger for kontroller er inkludert i diskusjonen.
  3. Etter inkubasjon, ta 1 μL av den merkede prøven og fortynn 1:50 i PBS i et 0,6 ml rør.
  4. Legg prøven inn i lasterommet og bruk trykkøkningstrykk i 45 s. Forsikre deg om at laserinnstillingene er riktige og at de riktige linsene er lastet inn.
  5. Bytt til prøvetakingstrykk, og velg Tid til opptak. Etter anskaffelsen på 1 min, navngi datafilen og lagre.
  6. Last ut prøven og erstatt med rengjøringsmiddel. Øk dette i >30 s før du laster inn neste merkede prøve.

4. nFCM-analyse-PDF-generering for subpopulasjonsanalyse

  1. For PDF-generering, bruk de samme standardene som tidligere gjort; bare den tomme målingen vil bli satt annerledes.
  2. Velg eksempelfilen, og angi terskelen. På punkttegnet endrer du y-aksen for å vise FL-målinger fra den grønne eller røde kanalen.
  3. Velg det firkantede gatingverktøyet og bruk venstreklikk for å tegne en firkant rundt FL + -befolkningen.
  4. Åpne den tomme målefilen og klikk på Angi tom før du går tilbake til eksempelfilen.
  5. Åpne PDF-genereringsverktøyet som før, og størrelsesfordelingen, konsentrasjonen og prosentandelen (sammenlignet med alle SS+-hendelser) identifiseres for FL+-delpopulasjonen.
    1. Gjenta for hver underpopulasjon av interesse identifisert som "Totalt, P1, P2 osv."

Representative Results

Tetraspanin-presentasjon på SW620-avledede elbiler og C2C12-avledede elbiler
Moderne analyse av overflod av viktige tetraspaniner CD9, CD63 og CD81 på elbiler fra en rekke kilder har fremhevet den ekstreme variasjonen i deres tilstedeværelse, både i bulkanalyser og når de analyserer presentasjonen på EV-underpopulasjoner21. Dette er sannsynligvis relatert til tilgjengeligheten av forskjellige biogeneseveier som ESCRT-avhengige og uavhengige veier22.

CD9 ble presentert på den største prosentandelen av C2C12 EV på ~ 50%, med CD63-presentasjon på bare ~ 30%, i figur 1. Når merking ble utført med alle tre antitetraspaniner i en inkubasjon, ble ~ 70% av partiklene vist å presentere minst en av EV-markørene. Gjentatte målinger viste laveste standardavvik for CD9/63/81-merkingen av C2C12 EV på ~ 3,8%, mens dette var ~ 8,1% for CD81 merket C2C12 EV.

SW620-avledede elbiler viste en annen tetraspaninprofil, med en mye større forskjell mellom den mest presenterte CD9 på ~ 40% og den minst presenterte CD63 på ~ 7%. I likhet med C2C12 EV var CD9 tilstede på flertallet av den tetraspaninpositive populasjonen, da CD9/63/81 kombinert merking identifiserte ~ 42% av partiklene som å ha minst en av de tre markørene.

Flertallet av C2C12-avledede partikler, den totale SS + -befolkningen, varierte i størrelse fra 45-120 nm, med en median ~ 65 nm diameter. Størrelsesprofilene for hver av de enkelte tetraspanin-merkede EV-subpopulasjonene, vist i figur 1, ligner hverandre, og viser en større medianstørrelse på ~ 75-85 nm og færre <65 nm EV sammenlignet med den totale partikkelpopulasjonen.

SW620-avledede partikler varierte mellom 45-160 nm med en medianstørrelse på ~ 65 nm, som viser en skjev fordeling. Tetraspanin-merkede elbiler viser en mer normalfordeling og større mediandiameter mellom 90-110 nm, med lignende fordelinger mellom individuelle tetraspaninpositive underpopulasjoner.

Mens de mest og minst presenterte tetraspaninene er de samme for disse to cellelinjene, varierer deres proporsjonale representasjon sterkt, og det er en interessant forskjell mellom den potensielle sampresentasjonen av tetraspaniner som kan observeres fra forskjellen i CD9-positivitet og CD9/63/81-positiviteten.

Kombinere EV-membranmerking med antistoffmerking
Tolagsmembranen til elbiler gir et mer generisk merkingsmål, som kan tillate skille fra lignende størrelser ikke-EV-partikler som proteinaggregater og noen former for LDL med lipidmonolag23. Spesifisiteten til denne typen merking må valideres, da noen vanlige membranfarger som brukes i EV-forskning, har vist seg å binde seg til ikke-EV-partikler også24.

Membranmerking viste gjentatte ganger ~ 80% positivitet av C2C12-avledede EV-er og SW620-elbiler. SS-intensiteten (SS-H) viser god korrelasjon med FITC-intensitet på punktplottene til både C2C12- og SW620-resultatene vist i figur 2. Dette forventes ettersom SS-intensiteten er i forhold til partikkelstørrelsen og dermed membranoverflaten.

Flertallet av antistoffmerkede elbiler var også positive for membranmerkingen som viste doble positive prosenter (FITCH+ &APC+) svært lik tetraspanin-positive prosenter. FITC vs APC dot plott viser liten korrelasjon mellom membran og tetraspanin merking med CD63 merking synes å vise den svakeste korrelasjonen til membran merking. Det ble påvist få hendelser som var positive for antistoffmerking, men negative for membranmerking.

Reproduserbarhet, dobbel merkingseffektivitet og alternative datautganger
En viktig faktor i utformingen av nFCM-eksperimenter er fluorofor eller etikettinteraktivitet. Figur 3a viser at å gjenta antistoffmerkingen med og uten ekstra membranmerking fører til svært like % positivitetsmålinger. Spesielt viser SW620-merkingen svært liten variasjon mellom de to målesettene. Dette viser begrenset interferens mellom fargestoff- og antistoffbindingen og fremhever også god reproduserbarhet ved gjentatt EV-merking.

Intensitetsmålinger, både sidespredning og fluorescens, kan eksporteres for å utmerke seg for hver enkelt partikkel som måles. Fra dette kan vi generere gjennomsnittlige fluorescensintensitetsmålinger (MFI) for å gi komparative tilnærminger av overflod av vårt merkede mål. MFI for fluorescerende populasjoner av C2C12-avledede EV-er antyder litt lavere presentasjon av CD63 og CD81 med MFI-målinger på henholdsvis ~ 550 og ~ 600, sammenlignet med ~ 850 MFI sett for CD9 + EV. Måleenhetene for MFI i dette tilfellet er FL-A og er ikke standardisert mot en fluorescerende kalibrering. Bruken av alle tre antistoffene fremkaller ikke en mye større fluorescens enn bare CD9-merking. Dette er veldig forskjellig fra SW620 MFI-målingene, noe som tyder på at bruk av en cocktail av alle tre antistoffene gir et større fluorescenssignal for merkede elbiler, enn bruk av noen individuell antistoffetikett.

Størrelsesfordelingshistogrammer produsert av NanoFCM-programvaren kan også eksporteres til Excel, slik at tredoble datasett kan legges over. Størrelsesfordelingsprofilene i figur 3 ligner på figur 1 , men inkluderer feilfelt. Median EV-størrelse på tetraspanin-positive subpopulasjoner i C2C12-avledede elbiler viser en median rundt 70 nm, litt større enn gjennomsnittet på 60 nm av de totale partikkelpopulasjonene. SW620 EV positive for tetraspanin markører er større, viser topper på ~ 100 nm.

Figure 1
Figur 1: CD9, CD63, CD81 positive EV-subpopulasjoner identifisert ved antistoffmerking . (A) Stolpediagram som viser prosentandel av merkede elbiler sammenlignet med totale partikler observert av SS for C2C12-avledede elbiler. (B) Stolpediagram som viser prosentandel av merkede elbiler sammenlignet med totale partikler observert av SS for SW620-avledede elbiler. (C) Representative størrelsesfordelingsprofiler for C2C12-avledede elbiler. Hvert histogram er hentet fra PDF-filene som genereres for den første målingen av tredoble datasett. (D) Representative størrelsesdistribusjonsprofiler for SW620-avledede elbiler. Hvert histogram er hentet fra PDF-filene som genereres for den første målingen av tredoble datasett. Feilfelt representerer standardavvik for tredoble målinger av de samme merkede prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Membranmerking og antistoffmerking av CD9, CD63, CD81 som presenterer EV-underpopulasjoner. (A) Søylediagram som viser Membran+ %, tetraspanin+ % og dobbel+ % for C2C12 elbiler. (B) Søylediagram som viser Membran+ %, tetraspanin+ % og dobbel+ % for SW620 elbiler. (C) Representative SS vs FITC prikkplott som viser gating for den membranpositive populasjonen. (D) Representative FITC vs APC dot plots som viser gating for dobbelt positiv populasjon av elbiler fra C2C12. (E) Representative FITC vs APC dot plots som viser gating for dobbelt positiv populasjon av elbiler fra SW620. Feilfelt representerer standardavvik for tredoble målinger av de samme merkede prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Vurdering av variasjon i repetisjonsmålinger . (A) Søylediagrammer som viser antistoffmerking % positivitet med og uten ytterligere membranmerking. (B) Gjennomsnittlige målinger av fluorescensintensitet for inngjerdede EV-undergrupper. (C) Gjennomsnittlig størrelsesfordelinghistogrammer for tredoble datasett for C2C12 elbiler. (D) Gjennomsnittlig størrelsesfordeling histogrammer for tredoble datasett for SW620 EV. Feilfelt representerer standardavvik for tredoble målinger av de samme merkede prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Eksempel- og reagensdetaljer
To EV-isolater fra separate cellelinjer ble valgt for demonstrasjon av fluorescerende merking og påfølgende nFCM-analyse. Begge EV-settene ble suspendert i PBS og lagret ved -80 ° C i <3 måneder, men de fleste andre forhold var forskjellige mellom isolater. C2C12-musemyoblastcellelinjen representerer en embryonal forløper til skjelettmuskelceller og ble dyrket i 2D-kultur, og kondisjonerte vekstmediet over 72 timer før EV-isolasjon ved ultracentrifugering. SW620 er en human kolon adenokarsinom cellelinje og ble dyrket i en rudimentær bioreaktor, berikende media over 7 uker, med EV-isolasjon utført ved størrelse eksklusjonskromatografi (SEC) og fraksjoner 7-9 eluert fra sepharose CL-2B kolonner kombinert i en enkelt prøve.

Mens elbiler isolert og konsentrert fra CCM er de enkleste prøvetypene å jobbe med, gjelder nFCM for de fleste EV-isolater, inkludert biofluider som serum, plasma, urin og CSF. Disse prøveanalysene drar nytte av nFCM SS-deteksjon av alle partikler, noe som muliggjør bekreftelse med NTA, TRPS og andre partikkelanalyser, samtidig som de beskriver de fluorescerende merkede EV-underpopulasjonene i kvantitative termer så vel som en andel av totalen, for en objektiv tilnærming til multiparameterpartikkelanalyse. Analyse av lavt bearbeidede prøver er også mulig, for eksempel uavklart urin og EV-beriket CCM med forbehold om å kreve lavt forurenset protein.

Membranfargestoffet som brukes her er ment å integreres i lipid-dobbeltlaget, med en lipofil del for membranbelastning og et hydrofilt fargestoff for å forbli i plasmamembranen25. Det er for tiden ingen perfekt EV-merkingsfargestoff, og flere kriterier må vurderes når du velger, inkludert spesifisitet til elbiler, egnethet med fiksering eller permeabilisering, og effektiviteten til EV-merking26.

Fluorescerende konjugert antistoffmerking av overflateeksponerte epitoper har vist seg å være en effektiv metode for å identifisere EV-underpopulasjoner27. Et viktig aspekt ved protokolloptimalisering er å møte, og ikke overskride, merkingsmetningspunktet for å binde seg til alle tilgjengelige epitoper uten å hemme deteksjon av partikler med lav fluorescens ved å la den omkringliggende bufferen fylles med fluorescerende ubundet antistoff28. I tillegg er tilgjengeligheten av eksponerte bindingssteder for antistoffmerking potensielt påvirket av flere faktorer. Lagringsforhold for elbiler har vist seg å påvirke konsentrasjons- og størrelsesprofiler for elbiler29 , med observasjoner som også indikerer effekter på antistoffmerking30. Tilstedeværelsen av overflatekoronaproteiner, proteinmodifikasjoner og virkninger av isolasjonsteknikker kan også ha effekter på antistoffmerking i noen tilfeller. Til slutt, ettersom bruken av fluorescerende merking blir mer utbredt for EV-studier, vil eksperimentell design og optimalisering for flere analytiske teknikker bli mer raffinert.

For å øke nøyaktigheten av resultatene, kan flere kontroller inkluderes som (1) PBS + fargestoffkontroll, for å vurdere micelle- eller aggregatdannelse i noen fargestoffer, som kan vises som SS + -partikler i nFCM-analyse, (2) PBS + antistoffkontroll, aggregater kan forekomme, men ofte ikke store nok til å spre nok lys til SS-deteksjon, (3) EV-prøve + IgG-antistoffkontroll, vanlig i flowcytometri og brukes til å identifisere ikke-spesifikk binding, (4) ikke-EV-partikkelprøve + antistoff / fargestoffkontroll - spesielt viktig når du trenger å identifisere elbiler i komplekse partikkelprøver, kontroller som renset LDL-partikler (Low-density lipoprotein) eller EV-utarmede / ablerte prøver kan fungere som en negativ kontroll for å validere selektiv merking, (5) positive kontroller er vanskelig å designe, men validering av et antistoff på celler er en nyttig inkludering.

Presentasjon av tetraspaniner på elbiler
Antistoff- og membranmerkingen av dette eksperimentet demonstrerer det høye nivået av kvantitative data som kan oppnås i en liten tidsramme ved nFCM-analyse. Samtidig måling av de viktigste fysiske egenskapene til partikkeldiameter/konsentrasjon med fenotypiske målinger av membran- og/eller proteintilstedeværelse fører til høye nivåbeskrivelser av underpopulasjoner innen partikkelisolering.

Det er viktig at varierende nivåer av de tre "viktige" EV-relaterte tetraspaninene, CD9, CD63, CD81, ble identifisert i disse to EV-prøvene. CD9 ble presentert på den største andelen elbiler for både C2C12-avledede elbiler og SW620, med CD81 og CD63 som henholdsvis det andre og minst presenterte proteinet.

Til tross for noen likheter observert her i tetraspaninprofilene til elbiler fra to svært forskjellige cellekilder, kan nivåene av CD9, CD63 og CD81 være svært forskjellige mellom cellelinje og pasientavledede EV31.

Forskjellen i CD63-uttrykk mellom de to EV-prøvene er spesielt relevant for den pågående diskusjonen om nøkkelidentifikatorer for 'EV-ness'. Mens presentasjon av CD63 i bare ~ 8% av SW620 EV kan være uventet av noen, har CD63 blitt foreslått som dårlig identifikator for de forskjellige typer EV isolert etter størrelse eller tetthet32, og tetraspanin negative EV har blitt identifisert, selv når beskrevet som exosome-lignende33.

Identifisering av elbiler i komplekse partikkelisolasjoner
Heterogeniteten til EV-tetraspaninprofiler, både i cellelinje og pasientavledede elbiler, advarer mot avhengighet av tetraspaninbasert fangst av elbiler og fremhever det fremtidige behovet for nye EV-identifikasjonsmetoder31. EV-merking uavhengig av spesifikke proteiner kan vise seg å være svært gunstig for å identifisere EV-er fra lignende størrelse ikke-EV-partikler hvis EV-spesifisitet kan bevises å være svært høy. Dette gjelder spesielt for biofluid EV-isolater, da det har blitt foreslått at konsentrasjonen av EV i humant blodplasma er i området 10 10 partikler / ml mens lipoproteiner måles ved 1016 per ml14,34. Selv ved EV-berikelse foreslår studier som sammenligner partikkelpositivitet for tetraspaninmarkører og / eller LDL-markør ApoB ~ 50-100x større overflod av LDL i blodplatefri plasma (PFP) prøver sammenlignet med EV35.

Isoleringsteknikken som brukes påvirker i stor grad rekkevidden av koisolerte ikke-EV-partikler som svært lavdensitetslipoproteiner (VLDL), lipoproteiner med mellomliggende tetthet (IDL) og LDL36. Det er også beskrivelser av lipoprotein-koisolater bundet til elbiler som, selv om de potensielt spiller en viktig biologisk rolle, gjør oppnåelse av EV-rene prøver til et utfordrende mål35.

Derfor kan det argumenteres for at det legges større vekt på beskrivelsen av partikler som utgjør en prøve, i stedet for å oppnå isolasjon av et rent, men begrenset utvalg av elbiler. Å oppnå omfattende beskrivelse av partikler ved å måle tetraspanin overflod i bulk og partikkeltall separat kan være utilstrekkelig for å nøyaktig bestemme EV-konsentrasjoner, spesielt fra biofluidkilder36,37. Identifisering av underpopulasjoner i en tierbasert tilnærming, som viser totale partikler, EV og EV som presenterer visse proteiner, som vist i dette eksperimentet, kan gi en robust løsning på nanopartikkelkarakterisering. Dette har vært tilfelle for prosjekter som involverer EV-lasting med design for fremtidige terapeutiske applikasjoner20 og identifisering av CD63+ elbiler med luminal last som mitokondrier38.

nFCM innenfor repertoaret av EV-analyse
En styrke ved nFCM EV-analyse er måten data kan bekrefte og bygge på de vanligste EV-analysene og danne broer mellom fysiske og fenotypiske datasett. Dette er imidlertid basert på nøyaktige merkingsprotokoller som ofte må optimaliseres for unike merkingsreagenser som fargestoffer og antistoffer. Et nøkkelkriterium for nøyaktig analyse er å ha merkede partikler suspendert i en ikke-fluorescerende buffer, som er avhengig av enten fjerning av overflødig ubundet fluorofor eller forfining av protokoller for ikke å overstige epitopmetning.

Sammenligningsstudier har vist at nFCM-dimensjonering av elbiler gir data i tråd med TRPS og cryo-TEM, teknikker som beskrives som mer nøyaktige enn NTA for EV-størrelsesanalyse10,39. Imidlertid, som med enhver optisk-basert metode, må påvirkningen av heterogene optiske egenskaper sett for elbiler og forskjeller mellom de optiske egenskapene til referansemateriale og elbiler anerkjennes ved tolkning av data10.

Western blotting har vært en viktig metode for å indikere EV-anrikning gjennom identifisering av EV-markører40. Men ønsket om å demonstrere tilstedeværelsen av slike markører på partikler har drevet fremskritt i EV-baserte flowcytometriske analyser17. Imidlertid oppnås de nødvendige oppløsningene for å gi robuste data for tiden best gjennom dedikert instrumentering med hensyn til både spredt og fluorescerende lys19.

nFCM gir en objektiv tilnærming til først å beskrive alle partikler irrelevant for spesifikke markører, ved bruk av sidespredningsmåling, noe som muliggjør bekreftelse med de vanligste teknikkene for NTA, RPS og TEM1, samtidig som fenotypisk måling ligner på WB eller Elisa på en kvantitativ måte.

Disclosures

A.L., B.P., D.A., R.L., R.T er ansatte i NanoFCM og deres bidrag til dette papiret ble gjort som en del av deres ansettelse.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke gruppene av Owen Davies og Nick Peake for å fortsette å gi materiale og kompetanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC Anti-CD81 antibody (M38) abcam ab233259 Anti-Human CD81 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) Abcam ab82392 Anti-mouse CD9 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted abcam ab82389 Anti-Human CD9 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody biolegend 143905 Anti-Mouse CD63 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody biolegend 104909 Anti-Mouse CD81 APC
conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC invitrogen Via Fisherscientific A15712 Anti-Human CD63 APC
conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor Merck Z688037-5EA
Cleaning solution NanoFCM 17159 In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12 Gifted Mouse line
EVs from SW620 Gifted Human line
Memglow - Fluorogenic Membrane Probe Cytoskeleton MG01 non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer NanoFCM nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2 Gibco Via Fisherscientific 12549079 Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL Axygen Via Fisherscientific 11371944 Tubes required to load sample into nanoanalyser

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).
  2. Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  3. Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
  4. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325 (2019).
  5. Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
  6. Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).
  7. Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  10. Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).
  11. Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
  12. Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
  13. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
  14. Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
  15. Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
  16. Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  17. Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).
  18. Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
  19. Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
  20. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).
  21. Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).
  22. Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).
  23. Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
  24. Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).
  25. Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
  26. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  27. Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).
  28. Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).
  29. Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
  30. Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
  31. Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).
  32. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  33. Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
  34. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  35. Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
  36. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).
  37. Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).
  38. Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).
  39. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  40. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).

Tags

Biologi utgave 185 Ekstracellulære vesikler nanopartikler nanostrømningscytometri tetraspaniner membranmerking subpopulasjonsanalyse eksosomer
Enkelt ekstracellulær vesikkel transmembranproteinkarakterisering ved nano-flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lees, R., Tempest, R., Law, A.,… More

Lees, R., Tempest, R., Law, A., Aubert, D., Davies, O. G., Williams, S., Peake, N., Peacock, B. Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (185), e64020, doi:10.3791/64020 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter