Biology

通过纳流式细胞术表征单个细胞外囊泡跨膜蛋白

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/64020

Rebecca Lees*¹, Robert Tempest*¹, Alice Law*¹, Dimitri Aubert*¹, Owen G. Davies*², Soraya Williams*², Nick Peake*³, Ben Peacock*¹

¹NanoFCM Co., Ltd, ²School of Sport, Exercise and Health Sciences, Loughborough University, ³Biomolecular Sciences Research Centre, Sheffield Hallam University

* These authors contributed equally

Summary

最新一代的电动汽车表征工具能够同时对多个参数进行单个电动汽车分析。纳米流式细胞术无需标记即可测量所有大于 45 nm 的生物颗粒，并通过各种荧光标记技术识别亚群的特定特征。

Abstract

单颗粒表征与细胞外囊泡的研究越来越相关，从批量分析技术和第一代颗粒分析发展到全面的多参数测量，如纳米流式细胞术（nFCM）。nFCM是一种流式细胞术，它利用专为纳米颗粒分析设计的仪器，无论是否使用染色技术，每分钟都可以表征数千个EV。高分辨率侧向散射（SS）检测可以确定大于 45 nm 的所有生物颗粒的大小和浓度，而同步荧光（FL）检测可识别标记标记标记物和目标靶标的存在。然后可以用颗粒/mL的定量单位或侧向散射识别的总颗粒的百分比来描述标记的亚群。

在这里，来自条件细胞培养基（CCM）的EV用脂质染料标记，以鉴定带有膜的颗粒，以及CD9，CD63和CD81特异性抗体作为常见的EV标志物。在1分钟的分析中分析比较材料，二氧化硅纳米球的浓度标准品和尺寸标准品以及标记样品材料的测量值。然后，该软件用于测量所有颗粒的浓度和粒径分布曲线，与标记无关，然后再确定每个标记的阳性颗粒。

同步 SS 和 FL 检测可以灵活地用于许多不同的 EV 源和标记目标（外部和内部），以全面和定量的方式描述 EV 样品。

Introduction

什么是电动汽车？
细胞外囊泡（EV）是一系列细胞衍生的膜颗粒的统称，是许多正常细胞和组织活动不可或缺的一部分。它们对广泛科学领域的影响及其潜在的临床相关性推动了电动汽车研究和^{工业兴趣的增长}1。小型 EV （sEV）研究主要集中在外泌体、40-100 nm 颗粒，这些颗粒在成熟前在早期内体开始形成，并通过多泡体（MVB）融合到质膜而释放，以及直接从质膜萌芽的微囊泡，形成 80-1，000 nm 颗粒²。第三个EV群体是凋亡体，在细胞死亡过程中形成的50-1，500nm颗粒意味着它们与其他EV的相对比例可以有很大变化³。

由于EV特征可能代表其细胞/起源组织中发生的变化，因此它们有可能用于诊断。各种“组学”分析已经开始识别细胞起源和疾病状态的标志物，这可能允许使用血浆/血清、尿液、唾液和脑脊液（CSF^{）等} EV 来源对患者进行非侵入性评估4^，⁵。这些电动汽车相关创新背后的驱动力是克服先前局限性的新表征技术。

单一电动汽车表征的必要性和挑战
单一 EV 表征对于 EV 分离株的验证和描述以及阐明这些纳米颗粒的关键特征对于基于 EV 的疗法和诊断的进展变得越来越重要⁶.根据 EV 来源和预期用途，纯度分析（通常描述为 EV 与非 EV 颗粒或 EV 与游离蛋白质的比率）可能需要来自多个分析的大量数据⁷。

电动汽车出版物中的颗粒计数和尺寸测量以前严重依赖纳米粒子跟踪（NTA）、电阻脉冲传感（RPS）和电子显微镜（EM）²。标准 NTA 和 RPS 缺乏区分 EV 和非 EV 颗粒的能力，并且有自己的警告，例如吞吐量慢⁸ 和 NTA⁹^、¹⁰^、¹¹ 的检测下限不合适。

四蛋白CD9、CD63和CD81历来是EV分离/制剂中EV存在的重要标识符。通常，与细胞裂解物¹²相比，蛋白质印迹（WB）和斑点印迹技术用于显示EV分离物中这些蛋白质的富集。然而，这些方法缺乏定量以及这些EV标志物的异质性，无论是在EV亚群中的显示还是细胞，组织或患者相关变异，都鼓励了先进的分析技术，这些技术统一了物理和表型表征¹³。

纳米流式细胞术作为一种全面的 EV 分析技术
确定真正的 EV 浓度需要识别完整颗粒和通用标记，特别是在复杂颗粒分离物中，分辨率能够检测所有 EV，同时将它们与非 EV 颗粒区分开来¹⁴。

纳流式细胞术（nFCM）是一种允许对尺寸在 45-1，000 nm 之间的颗粒进行未标记分析的技术，同时利用荧光标记和检测来鉴定颗粒亚群。与传统流式细胞术的一个关键区别是使用专用于纳米颗粒分析的设备，可实现最高分辨率¹⁵。EV分析使用重新用于小颗粒分析的传统流量仪表正在改进，但仍难以达到检测和分析<100 nm EV的分辨率¹⁶^，¹⁷。基于微球的流式细胞术是EV分析中常用的进一步调整，但这消除了单颗粒检测的可能性，并引入了基于捕获的偏差¹⁸。

得益于用于 EV 分析的侧向散射（SS）通道中 ~45 nm 的检测下限，nFCM 利用 SS 触发。这可以被认为是“粒子优先”分析，因为这意味着事件必须提供SS信号，在分析荧光强度之前超过设定的阈值。这消除了假阳性，例如降解的膜和荧光团聚集，并将分析重点放在完整的EV上¹⁵。SS测量也用于通过与四模态二氧化硅纳米球标准¹⁹进行比较来确定单个颗粒的大小。荧光测量在另外两个检测器上进行，允许对每个颗粒同时进行三次测量，以描述颗粒浓度、大小和标记物或其他感兴趣目标的存在，以识别 EV 亚群²⁰。

在下面的实验中，SS和荧光（FL）测量用于测量>45nm颗粒，显示膜阳性EV的子集，并鉴定EV亚群中的CD9，CD63，CD81呈现。描述了这些亚群的浓度及其作为SS测量的总颗粒的一部分的比例，以及它们的大小分布。

Protocol

1. nFCM仪器的设置和nFCM标准的测量

注意：在开始对样品进行数据采集之前，需要进行三次测量，以验证nFCM仪器的正确对准，并提供仪器之间的有力比较。这些是浓度标准品/质量控制（QC），尺寸标准品和空白。

将QC珠在适当的0.6μL管中的蒸馏水中以1：100稀释，并置于装载舱中。
从 样品流 下拉菜单中，选择 增压以 将QC样品引入系统45秒，以完全替换先前的样品/清洁溶液。
1. 增强时，将激光功率设置为QC微球的预设模板“250 nm FL QC标准”，例如，蓝色激光为10/40 mW，红色激光为20/50 mW，SS衰减为0.2%。
从同一下拉菜单中选择采样压力以降低系统压力。
将自动采样压力设置为 1.0 kPa 以保持恒定压力。
通过从采集控件中选择记录 时间来 启动 1 分钟分析。数据将绘制在点图上，显示SS强度和所选FL强度的对数刻度。
在保存文件之前插入文件名和样品稀释液。
选择卸载以从装载区中取出管子。用 150 μL 清洁溶液替换，通过选择增强清洁 >30 秒，然后通过选择卸载去除清洁溶液。
1. 使用含有 150 μL 水的管从毛细管尖端去除任何多余的清洁溶液。
将大小标准珠在水中以 1：100 稀释，然后将 100 μL 加载到加载舱中，然后提升样品 45 秒。
将激光功率设置为预设模板“S16 exo 68-155 nm”。此设置适用于尺寸标准品和含有 EV < 200 nm 的样品。例如，蓝色激光为15/40 mW，红色激光为20/50 mW，SS衰减为0.2%。
选择采样并像以前一样继续记录样品 1 分钟。
用水或PBS样品执行第三次测量，以创建淋洗液的空白测量，识别假阳性以供软件去除。下一节将介绍输入标准测量值。

2. 确定未标记样品的颗粒浓度并生成 PDF 报告

将PBS中未标记的EV样品稀释至合适的颗粒浓度范围以进行nFCM分析，1 x 10 8- 5 x 10⁸颗粒/ mL。将 10-100 μL 稀释的样品加载到装载室中。
当颗粒浓度未知时，从EV样品的1：100稀释开始。样品浓度可以通过增强期间CCD相机上的激光光斑大小或在采样期间观察事件突发轨迹来快速近似。
在选择采样之前将加载的样品提升 45 秒并记录 1 分钟，如前所述保存。
要开始分析此数据，请从“ 采集 ”选项卡切换到 “分析 ”选项卡。打开保存的 nfa 文件。
为了进行准确的样品测量，请使用样品测量前进行的两次标准测量来设置样品比较值以及空白值。
通过首先选择尺寸标准文件并使用设置阈值工具（也称为自动阈值）创建尺寸标准曲线，以进行 SS 到直径的转换。阈值在事件突发跟踪中可见，用于标识将事件视为显著事件所需的最小信号强度。
设置阈值后，检查点图 x 和 y 参数在 x 轴上为 SS-H 或 SS-A，在 y 轴上为 FITC-A。
打开标准曲线生成工具并选择 S16 exo 68-155 nm 作为尺寸模板。单击查找峰，将峰 SS强度识别为直径为68、91、113或155 nm的颗粒。
在关闭窗口之前，检查是否已生成 r 值接近 1 的 SS 到直径曲线。
通过选择保存的文件并单击计数 STD 来设置浓度标准。输入标准的颗粒浓度。
设置标准信息后，选择 EV 示例文件并设置阈值。
选择空白文件，然后单击 “设置空白 ”以识别要从样本计数中删除的误报数。这应该使用与您的样品相同的阈值来完成。返回到 EV 示例文件。
打开 PDF 生成工具，然后选择 大小调整和浓度。输入样品的稀释液。显示了样品的浓度和颗粒的尺寸分布。

3. 样品标签

注意：可以同时使用两种染色策略对悬浮颗粒进行全面分析。标记方案通常需要针对新的抗体或样品来源进行优化。

将一部分 EV 样品稀释至 PBS 中的 1.25 x^{10 10} 个颗粒/mL 的浓度。将 8 μL 稀释的 EV 样品与 1 μL 抗体和 1 μL 染料孵育，颗粒浓度为 1 x 10 10 颗粒/mL（总颗粒为 1 x 10⁸ 悬浮在¹⁰ μL 中）。在这种情况下，抗体的孵育比为 1：50（1 μL 1：5 抗体）。
1. 在优化过程中使用三种以上不同浓度的抗体或染料，以提供表明该方案允许最大表位结合而不会使所选标记过度饱和的数据，这可能会损害低强度荧光事件的鉴定。膜染料的孵育浓度为 40 nM（1 μL 的 400 nM）。
通过涡旋 5 秒混合 10 μL 样品，并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。
注意：讨论中包括控制建议。
孵育后，取 1 μL 标记样品，在 0.6 mL 管中在 PBS 中稀释 1：50。
将样品装入装载舱并施加增压压力45秒。确保激光设置正确并加载适当的镜头。
切换到采样压力并选择 记录时间。采集 1 分钟后，命名数据文件并保存。
卸载样品并更换清洁溶液。在加载下一个标记样品之前将其提升 >30 秒。

4. nFCM分析-用于亚种群分析的PDF生成

对于 PDF 生成，请应用与以前相同的标准;只有空白测量值的设置方式不同。
选择示例文件并设置阈值。在点图上，更改 y 轴以显示来自绿色或红色通道的 FL 测量值。
选择方形门控工具，然后使用左键单击在 FL+ 总体周围绘制一个正方形。
打开空白测量文件并单击 设置空白 ，然后再恢复到示例文件。
像以前一样打开 PDF 生成工具，即可识别 FL+ 亚群的大小分布、浓度和百分比（与所有 SS+ 事件相比）。
1. 对标识为“总、P1、P2 等”的每个感兴趣的亚群重复此操作。

Representative Results

Tetraspanin对SW620衍生电动汽车和C2C12衍生电动汽车的介绍
对来自各种来源的电动汽车上关键四蛋白CD9，CD63和CD81丰度的现代分析强调了它们存在的极端变异性，无论是在批量分析中还是在分析它们在EV亚群中的呈现时²¹。这可能与不同生物发生途径的可用性有关，例如ESCRT依赖性和独立途径²²。

在图1中，CD9在C2C12 EV中的比例最大，为~50%，CD63仅在~30%上呈现。当在一次孵育中用所有三种抗四蛋白进行标记时，~70%的颗粒显示至少存在一种EV标记物。重复测量显示，C2C12 EV 的 CD9/63/81 标记的最低标准偏差为 ~3.8%，而 CD81 标记的 C2C12 EV 的标准偏差为 ~8.1%。

SW620衍生的EV显示出不同的tetraspanin谱，在~40%时呈现最多的CD9和在~7%时呈现最少的CD63之间的差异要大得多。与C2C12 EV类似，CD9存在于大多数tetraspanin阳性群体中，因为CD9 / 63 / 81组合标记将~42%的颗粒识别为具有三个标记中的至少一个。

大多数C2C12衍生颗粒，即总SS+群体，尺寸范围为45-120nm，中位数直径为~65nm。图1所示，每个单个tetraspanin标记的EV亚群的大小分布彼此相似，与总颗粒群相比，显示出更大的中位数尺寸~75-85 nm和更少的<65 nm EV。

SW620衍生颗粒的范围在45-160 nm之间，中位数尺寸为~65 nm，显示出偏态分布。tetraspanin标记的EV在90-110nm之间显示出更正态的分布和更大的中位数直径，单个tetraspanin阳性亚群之间的分布相似。

虽然这两种细胞系中最多和最少呈递的tetraspanin是相同的，但它们的比例代表差异很大，并且从CD9阳性和CD9 / 63 / 81阳性的差异中观察到的tetraspanins的潜在共同呈现之间存在有趣的差异。

将 EV 膜标记与抗体标记相结合
EV的双层膜提供了一个更通用的标记靶标，可以与类似大小的非EV颗粒（如蛋白质聚集体和某些形式的LDL与脂质单层²³）区分开来。必须验证此类标记的特异性，因为EV研究中使用的一些常见膜染料已被证明也可以与非EV颗粒结合²⁴。

膜标记反复显示 C2C12 衍生的 EV 和 SW620 EV 的阳性率为 ~80%。 SS强度（SS-H）在图2所示的C2C12和SW620结果的点图上与FITC强度具有良好的相关性。这是意料之中的，因为SS强度是相对于粒径，因此是相对于膜表面积的。

大多数抗体标记的EV也对膜标记呈阳性，显示出双阳性百分比（FITC+和APC+），与tetraspanin阳性百分比非常相似。FITC与APC点图显示膜和四蛋白标记之间存在轻微相关性，CD63标记似乎与膜标记的相关性最弱。很少检测到抗体标记呈阳性但膜标记呈阴性的事件。

重现性、双标签效率和替代数据输出
设计nFCM实验的一个重要考虑因素是荧光基团或标记交互性。 图3a 显示，在有和没有额外膜标记的情况下重复抗体标记会导致非常相似的阳性百分比测量。特别是，SW620标签显示两个测量组之间的差异很小。这表明染料和抗体结合之间的干扰有限，并且在重复EV标记时也突出了良好的重现性。

强度测量，包括侧向散射和荧光，可以导出到每个测量的单个颗粒的excel中。由此，我们可以生成平均荧光强度（MFI）测量值，以提供标记靶标丰度的比较近似值。与CD9 + EV的~850 MFI相比，C2C12衍生EV的荧光群体的MFI表明CD63和CD81的表现略低，MFI测量值分别为~550和~600。在这种情况下，MFI的测量单位是FL-A，并且没有针对荧光校准进行标准化。使用这三种抗体不会比CD9标记引起更大的荧光。这与SW620 MFI测量非常不同，SW620 MFI测量表明，与使用任何单个抗体标记相比，使用所有三种抗体的混合物可为标记的EV提供更大的荧光信号。

NanoFCM软件生成的尺寸分布直方图也可以导出到excel中，允许叠加一式三份的数据集。图 3 的尺寸分布曲线与图1 相似，但包括误差线。C2C12衍生的EV中四蛋白阳性亚群的中位数EV大小显示中位数约为70 nm，略大于总颗粒群的60 nm平均值。SW620 EVs阳性的tetraspanin标志物较大，在~100nm处显示峰。

图 1：通过抗体标记鉴定的 CD9、CD63、CD81 阳性 EV 亚群。（A）条形图显示标记的 EV 与 SS 观察到的 C2C12 衍生 EV 的总颗粒的百分比。（B）条形图显示标记的 EV 与 SS 观察到的 SW620 衍生 EV 的总颗粒的百分比。（C）C2C12衍生EV的代表性尺寸分布曲线。每个直方图都取自为第一次测量一式三份数据集而生成的 PDF。（D）SW620衍生EV的代表性尺寸分布曲线。每个直方图都取自为第一次测量一式三份数据集而生成的 PDF。误差线表示相同标记样品的一式三份测量的标准偏差。请点击此处查看此图的大图。

图 2：呈现 EV 亚群的 CD9、CD63、CD81 的膜标记和抗体标记。（A）条形图显示 C2C12 EV 的膜+ %、四跨素+ % 和双倍+ %。（B）条形图显示 SW620 电动汽车的膜+ %、四跨素+ % 和双倍+ %。（C）代表性的SS与FITC点图，显示膜阳性群体的门控。（D）代表性的 FITC 与 APC 点图，显示来自 C2C12 的 EV 双阳性群体的门控。（E）具有代表性的 FITC 与 APC 点图，显示来自 SW620 的 EV 双阳性群体的门控。误差线表示相同标记样品的一式三份测量的标准偏差。请点击此处查看此图的大图。

图 3：评估重复测量的变化。（A）条形图显示抗体标记阳性百分比，有和没有额外的膜标记。（B）门控EV子集的平均荧光强度测量值。（C） C2C12 EV 一式三份数据集的平均尺寸分布直方图。（D） SW620 EV一式三份数据集的平均尺寸分布直方图。误差线表示相同标记样品的一式三份测量的标准偏差。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

样品和试剂详细信息
选择来自不同细胞系的两种EV分离株用于展示荧光标记和随后的nFCM分析。两组EV均悬浮在PBS中并在-80°C下储存<3个月，但大多数其他条件在分离株之间有所不同。C2C12小鼠肌母细胞系代表骨骼肌细胞的胚胎前体，并在2D培养物中生长，在通过超速离心进行EV分离之前72小时内调节生长培养基。SW620是一种人结肠腺癌细胞系，在基本的生物反应器中生长，富集培养基超过7周，通过尺寸排阻色谱（SEC）进行EV分离，并从琼脂糖CL-2B柱中洗脱出的馏分7-9合并为单个样品。

虽然从CCM中分离和浓缩的EV是最容易处理的样品类型，但nFCM适用于大多数EV分离物，包括血清、血浆、尿液和脑脊液等生物流体。这些样品分析受益于对所有颗粒的nFCM SS检测，允许与NTA，TRPS和其他颗粒分析进行证实，同时以定量方式描述荧光标记的EV亚群以及总数的一部分，以实现多参数颗粒分析的无偏方法。也可以分析低处理样品，例如未澄清的尿液和富含EV的CCM，但需要低污染蛋白质。

这里使用的膜染料旨在整合到脂质双层中，具有用于膜负载的亲脂性部分和用于保留在质膜中的亲水染料²⁵。目前还没有完美的 EV 标记染料，选择时必须考虑几个标准，包括对 EV 的特异性、固定或透化的适用性以及 EV 标记的效率²⁶.

表面暴露表位的荧光偶联抗体标记已被证明是鉴定EV亚群的有效方法²⁷。方案优化的一个关键方面是满足而不是超过标记饱和点以结合所有可用的表位，而不会通过允许周围的缓冲液填充荧光未结合抗体²⁸来抑制低荧光颗粒的检测。此外，用于抗体标记的暴露结合位点的可用性可能受到多种因素的影响。EV的储存条件已被证明会影响EV的浓度和大小分布²⁹ ，观察结果也表明对抗体标记的影响³⁰。在某些情况下，表面电晕蛋白的存在、蛋白质修饰和分离技术的影响也可能对抗体标记产生影响。最终，随着荧光标记在电动汽车研究中的使用变得越来越普遍，多种分析技术的实验设计和优化将变得更加精细。

为了提高结果的准确性，可以包括几种对照，例如（1）PBS +染料对照，以评估某些染料中的胶束或聚集体形成，这些染料在nFCM分析中可能显示为SS +颗粒，（2）PBS +抗体对照，可能发生聚集体，尽管通常不足以散射足够的光进行SS检测，（3）EV样品+IgG抗体对照，在流式细胞术中很常见，用于鉴定任何非特异性结合，（4）非EV颗粒样品+抗体/染料对照 - 当需要鉴定复杂颗粒样品中的EV时尤其重要，纯化的低密度脂蛋白（LDL）颗粒或EV耗尽/消融样品等对照可以作为阴性对照来验证选择性标记，（5）阳性对照很难设计，但验证细胞上的抗体是一种有用的包含物。

四环戊胺在EV上的介绍
该实验的抗体和膜标记证明了通过nFCM分析可以在短时间内获得高水平的定量数据。同时测量颗粒直径/浓度的关键物理属性与膜和/或蛋白质存在的表型测量，可以对颗粒分离中的亚群进行高水平的描述。

重要的是，在这两个EV样品中鉴定出三种与EV相关的“关键”四蛋白CD9，CD63，CD81的不同水平。CD9在C2C12衍生的EV和SW620中呈递量的比例最大，CD81和CD63分别是第二种也是最少的蛋白。

尽管在来自两种非常不同的细胞来源的EV的tetraspanin谱中观察到一些相似之处，但细胞系和患者来源的EV的CD9，CD63和CD81水平可能非常不同³¹。

两个EV样本之间CD63表达的差异与正在进行的“EV-ness”关键标识符的讨论特别相关。虽然CD63仅在~8%的SW620 EV中出现可能会出乎一些人的意料，但CD63被认为是按大小或密度分离的不同类型的EV的不良识别³²，并且已经鉴定出tetraspanin阴性EV，即使被描述为外泌体样³³。

在复杂颗粒分离中识别电动汽车
在细胞系和患者来源的EV中，EV tetraspanin谱的异质性警告不要依赖基于tetraspanin的EV捕获，并强调了未来对新的EV鉴定方法的需求³¹。如果可以证明EV特异性非常高，则独立于特定蛋白质的EV标记可以证明对从类似大小的非EV颗粒中识别EV非常有益。对于生物流体 EV 分离物尤其如此，因为有人建议人血浆中 EV 的浓度在 10 10 粒/mL 的范围内，而脂蛋白的测量值为每毫升^{10 16 14}^，³⁴。即使在 EV 富集时，比较四蛋白标志物和/或低密度脂蛋白标志物 ApoB 的颗粒阳性的研究表明，与 EV³⁵ 相比，游离血浆（PFP）样品中的 LDL 丰度高出 ~50-100 倍。

所使用的分离技术极大地影响了共分离的非EV颗粒的范围，例如极低密度脂蛋白（VLDL），中密度脂蛋白（IDL）和LDL³⁶。还有与 EV 结合的脂蛋白共分离物的描述，虽然可能发挥重要的生物学作用，但使实现 EV 纯样品成为一个具有挑战性的目标³⁵。

因此，可以说，应该更加关注对构成样品的颗粒的描述，而不是实现对纯粹但有限的电动汽车选择的分离。通过分别测量体积和颗粒计数的四西班牙蛋白丰度来实现颗粒的全面描述可能不足以准确确定 EV 浓度，特别是来自生物流体来源³⁶^，³⁷。如本实验所示，以基于层的方法鉴定亚群，显示总颗粒、EV 和呈现某些蛋白质的 EV，可以为纳米颗粒表征提供可靠的解决方案。对于涉及EV负载的项目，其设计用于未来的治疗应用²⁰ 以及识别CD63 + EV与线粒体³⁸等管腔货物。

电动汽车分析库中的nFCM
nFCM EV分析的优势在于数据可以证实和建立最常见的EV分析，并在物理数据集和表型数据集之间形成桥梁。然而，这是基于准确的标记方案，通常需要针对独特的标记试剂（如染料和抗体）进行优化。准确分析的一个关键标准是将标记的颗粒悬浮在非荧光缓冲液中，这依赖于去除过量的未结合荧光团或改进方案以不超过表位饱和度。

比较研究表明，电动汽车的nFCM尺寸提供的数据符合TRPS和冷冻透射电镜，这些技术被描述为比NTA更准确的电动汽车尺寸分析¹⁰^，³⁹。然而，与任何基于光学的方法一样，在解释数据时，必须考虑EV异质光学特性的影响以及参考物质和EV光学特性之间的差异¹⁰。

蛋白质印迹一直是通过鉴定EV标志物来指示EV富集的关键方法⁴⁰。但是，证明颗粒上存在此类标记物的愿望推动了基于EV的流式细胞术分析的进步¹⁷。然而，提供可靠数据所需的分辨率目前最好通过有关散射光和荧光光的专用仪器来实现¹⁹。

nFCM提供了一种无偏的方法，通过使用侧向散射测量，最初描述与特定标志物无关的所有颗粒，允许与NTA，RPS和TEM¹的最常见技术进行证实，同时以定量方式添加类似于WB或Elisa的表型测量。

Disclosures

A.L.，B.P.，D.A.，R.L，R.T是NanoFCM的员工，他们对本文的贡献是作为其工作的一部分。

Acknowledgments

我们要感谢欧文·戴维斯和尼克·皮克小组继续提供材料和专业知识。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Anti-CD81 antibody (M38)	abcam	ab233259	Anti-Human CD81 APC conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04)	Abcam	ab82392	Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted	abcam	ab82389	Anti-Human CD9 APC conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody	biolegend	143905	Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody	biolegend	104909	Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC	invitrogen Via Fisherscientific	A15712	Anti-Human CD63 APC conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor	Merck	Z688037-5EA
Cleaning solution	NanoFCM	17159	In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12	Gifted		Mouse line
EVs from SW620	Gifted		Human line
Memglow - Fluorogenic Membrane Probe	Cytoskeleton	MG01	non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer	NanoFCM		nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2	Gibco Via Fisherscientific	12549079	Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL	Axygen Via Fisherscientific	11371944	Tubes required to load sample into nanoanalyser