Summary
De nieuwste generatie EV-karakteriseringstools is in staat om één EV-analyse over meerdere parameters tegelijk uit te voeren. Nano-flow cytometrie meet alle biologische deeltjes groter dan 45 nm zonder labeling en identificeert specifieke kenmerken van subpopulaties door een verscheidenheid aan fluorescerende etiketteringstechnieken.
Abstract
Karakterisering van enkelvoudige deeltjes is steeds relevanter geworden voor onderzoek naar extracellulaire blaasjes, gaande van bulkanalysetechnieken en deeltjesanalyse van de eerste generatie tot uitgebreide multiparametermetingen zoals nano-flow cytometrie (nFCM). nFCM is een vorm van flowcytometrie die gebruik maakt van instrumentatie die specifiek is ontworpen voor nanodeeltjesanalyse, waardoor duizenden EV's per minuut kunnen worden gekarakteriseerd, zowel met als zonder het gebruik van kleuringstechnieken. Hoge resolutie side scatter (SS) detectie maakt het mogelijk om grootte en concentratie te bepalen voor alle biologische deeltjes groter dan 45 nm, terwijl gelijktijdige fluorescentie (FL) detectie de aanwezigheid van gelabelde markers en doelen van belang identificeert. Gelabelde subpopulaties kunnen vervolgens worden beschreven in kwantitatieve eenheden van deeltjes / ml of als een percentage van de totale deeltjes geïdentificeerd door zijdelingse verstrooiing.
Hier worden EV's afgeleid van geconditioneerde celkweekmedia (CCM) gelabeld met zowel een lipidekleurstof, om deeltjes met een membraan te identificeren, als antilichamen die specifiek zijn voor CD9, CD63 en CD81 als gemeenschappelijke EV-markers. Metingen van vergelijkingsmateriaal, een concentratiestandaard en een groottestandaard van silica nanosferen, evenals gelabeld monstermateriaal worden geanalyseerd in een analyse van 1 minuut. De software wordt vervolgens gebruikt om het concentratie- en grootteverdelingsprofiel van alle deeltjes te meten, onafhankelijk van etikettering, voordat de deeltjes worden bepaald die positief zijn voor elk van de labels.
Gelijktijdige SS- en FL-detectie kunnen flexibel worden gebruikt met veel verschillende EV-bronnen en etiketteringsdoelen, zowel extern als intern, waarbij EV-monsters op een uitgebreide en kwantitatieve manier worden beschreven.
Introduction
Wat zijn EV's?
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn de verzamelnaam voor een reeks van cellen afgeleide vliezige deeltjes die integraal deel uitmaken van veel normale cellulaire en weefselactiviteiten. Hun impact op een breed scala van wetenschappelijke gebieden en hun potentiële klinische relevantie hebben geleid tot een groei in EV-onderzoek en industriële interesse1. Small EV (sEV) onderzoek richt zich voornamelijk op exosomen, 40-100 nm deeltjes die beginnen te vormen in de vroege endosomen vóór rijping en afgifte door fusie van multi-vesiculaire lichamen (MVB) naar het plasmamembraan, evenals microvesicles, die direct uit het plasmamembraan komen en 80-1.000 nm deeltjesvormen 2. Een derde EV-populatie zijn apoptotische lichamen, 50-1.500 nm deeltjes gevormd tijdens celdood, wat betekent dat hun relatieve verhouding tot andere EV's sterk variabel kan zijn3.
Omdat EV-kenmerken veranderingen kunnen vertegenwoordigen die optreden in hun cel / weefsel van oorsprong, is er potentieel voor hun gebruik in diagnostiek. Verschillende 'omics'-analyses zijn begonnen met het identificeren van markers van celoorsprong en ziektetoestand, die niet-invasieve beoordeling van patiënten mogelijk maken met behulp van EV-bronnen zoals bloedplasma / serum, urine, speeksel en hersenvocht (CSF)4,5. Een drijvende kracht achter deze EV-gerelateerde innovaties zijn nieuwe karakteriseringstechnieken die eerdere beperkingen overwinnen.
De behoefte aan en uitdagingen van enkele EV-karakterisering
Single EV-karakterisering wordt steeds belangrijker voor zowel validatie als beschrijving van EV-isolaten, evenals het ophelderen van de belangrijkste kenmerken van deze nanodeeltjes voor de progressie van EV-gebaseerde therapieën en diagnostiek6. Afhankelijk van de EV-bron en het beoogde gebruik, kan analyse van zuiverheid, vaak beschreven als een verhouding van EV tot niet-EV-deeltjes of als EV tot vrij eiwit, aanzienlijke hoeveelheden gegevens van meerdere analyses vereisen7.
Deeltjestel- en dimensioneringsmetingen in EV-publicaties zijn eerder sterk afhankelijk geweest van Nanoparticle tracking (NTA), resistive pulse sensing (RPS) en elektronenmicroscopie (EM)2. Standaard NTA en RPS missen de mogelijkheid om EV's te onderscheiden van niet-EV-deeltjes en hebben hun eigen kanttekeningen zoals langzame doorvoer8 en ongeschikte ondergrens van detectie gezien met NTA 9,10,11.
De tetraspaninen CD9, CD63 en CD81 zijn van oudsher belangrijke identificatiemiddelen voor de aanwezigheid van EV's in EV-isolaties / -preparaten. Gewoonlijk worden western blotting (WB) en dot blotting technieken gebruikt om de verrijking van deze eiwitten in EV isolaten aan te tonen in vergelijking met cellysaat12. Het gebrek aan kwantificering van deze methoden en de heterogeniteit van deze EV-markers, met betrekking tot zowel weergave binnen EV-subpopulaties als cel-, weefsel- of patiëntgerelateerde variatie, moedigt echter geavanceerde analytische technieken aan, die fysieke en fenotypische karakterisering verenigen13.
Nano-flow cytometrie als uitgebreide EV-analysetechniek
Het bepalen van echte EV-concentraties vereist identificatie van intacte deeltjes en een universele marker, met name in complexe deeltjesisolaten, met een resolutie die in staat is om alle EV's te detecteren en ze te onderscheiden van niet-EV-deeltjes14.
Nano-flow cytometrie (nFCM) is een techniek die ongelabelde analyse van deeltjes met een grootte tussen 45-1.000 nm mogelijk maakt, terwijl tegelijkertijd fluorescerende etikettering en detectie worden gebruikt om deeltjessubpopulaties te identificeren. Een belangrijk onderscheid met conventionele flowcytometrie is het gebruik van apparatuur die is gewijd aan nanodeeltjesanalyse, waardoor de grootste resolutie15 mogelijk is. EV-analyse, die conventionele stroominstrumentatie gebruikt die wordt hergebruikt voor analyse van kleine deeltjes, verbetert, maar worstelt nog steeds om de resolutie te bereiken om <100 nm EV's16,17 te detecteren en te analyseren. Bead-gebaseerde flowcytometrie is een verdere aanpassing die vaak wordt gebruikt voor EV-analyse, maar dit elimineert de mogelijkheid van detectie van enkele deeltjes en introduceert op vangst gebaseerde vooroordelen18.
Profiterend van een ondergrens van detectie van ~ 45 nm in het side scatter (SS) kanaal voor EV-analyse, maakt nFCM gebruik van SS-triggering. Dit kan worden gezien als 'deeltjes eerst'-analyse, omdat het betekent dat gebeurtenissen een SS-signaal moeten leveren, waarbij een vastgestelde drempel wordt overschreden voordat de fluorescentie-intensiteit wordt geanalyseerd. Dit verwijdert valse positieven zoals gedegradeerde membraan- en fluorofooraggregaties en richt de analyse op intacte EV's15. SS-metingen worden ook gebruikt om individuele deeltjes te dimensioneren in vergelijking met een viermodale silica nanosfeerstandaard19. De fluorescentiemetingen worden uitgevoerd op twee andere detectoren die drie gelijktijdige metingen voor elk deeltje mogelijk maken om de deeltjesconcentratie, grootte en aanwezigheid van markers of andere doelen van belang te beschrijven om EV-subpopulaties te identificeren20.
In het volgende experiment worden SS- en fluorescerende (FL) metingen gebruikt om >45 nm deeltjes te meten, de subset van membraanpositieve EV's te tonen en CD9, CD63, CD81-presentatie op EV-subpopulaties te identificeren. Zowel de concentratie van deze subpopulaties als hun verhouding als onderdeel van de totale deeltjes gemeten door SS worden beschreven, evenals hun grootteprofielen.
Protocol
1. Opstelling van het nFCM-instrument en metingen van de nFCM-normen
OPMERKING: Er worden drie metingen uitgevoerd voordat wordt begonnen met het verzamelen van gegevens voor monsters om de juiste uitlijning van het nFCM-instrument te valideren en een sterke vergelijking tussen instrumenten te bieden. Dit zijn de concentratiestandaard/kwaliteitscontrole (QC), maatnorm en een blanco.
- Verdun de QC-kralen 1:100 in gedestilleerd water in een geschikte buis van 0,6 μL en plaats in het laadperron.
- Selecteer in het vervolgkeuzemenu Sample Flow de optie Boosting om het QC-monster gedurende 45 s in het systeem te introduceren om het vorige monster/de vorige reinigingsoplossing volledig te vervangen.
- Stel tijdens het boosten het laservermogen in op de vooraf ingestelde sjabloon voor QC-kralen "250 nm FL QC-standaard", bijvoorbeeld 10/40 mW voor de blauwe laser, 20/50 mW voor de rode laser, met 0,2% SS-verval.
- Selecteer de bemonsteringsdruk in hetzelfde neerwaartse menu om de systeemdruk te verlagen.
- Stel de automatische bemonsteringsdruk in op 1,0 kPa om een constante druk te handhaven.
- Start de analyse van 1 minuut door Tijd om op te nemen te selecteren in de acquisitiebesturingselementen. Gegevens worden uitgezet op de dot-plot met een logschaal voor SS-intensiteit en een geselecteerde FL-intensiteit.
- Voeg de bestandsnaam en voorbeeldverdunning in voordat u het bestand opslaat.
- Selecteer lossen om de buis van het laadperron te verwijderen. Vervang door 150 μL reinigingsoplossing en reinig gedurende >30 s door Boosting te selecteren voordat u de reinigingsoplossing verwijdert door Lossen te selecteren.
- Verwijder overtollige reinigingsoplossing uit de capillaire punt met behulp van een buis met 150 μL water.
- Verdun de standaardparels 1:100 in water en laad 100 μL in het laadperron, voordat het monster gedurende 45 s wordt gestimuleerd.
- Stel het laservermogen in op de vooraf ingestelde sjabloon "S16 exo 68-155 nm". Deze instelling geldt voor zowel de groottestandaard als monsters met EV's < 200 nm. Bijvoorbeeld 15/40 mW voor de blauwe laser, 20/50 mW voor de rode laser, met 0,2% RVS-verval.
- Selecteer Sampling en ga verder met het opnemen van het sample gedurende 1 minuut zoals voorheen.
- Voer de derde meting uit met een water- of PBS-monster om een blanco meting van uw eluent te maken, waarbij valse positieven worden geïdentificeerd voor verwijdering door de software. Het invoeren van de standaardmetingen wordt beschreven in de volgende sectie.
2. Het bepalen van de deeltjesconcentratie van een niet-gelabeld monster en het genereren van een PDF-rapport
- Verdun het niet-gelabelde EV-monster in PBS tot een geschikt deeltjesconcentratiebereik voor nFCM-analyse, 1 x 108- 5 x 108 deeltjes / ml. Laad 10-100 μL van het verdunde monster in het laadperron.
- Wanneer de deeltjesconcentratie onbekend is, begin dan met een verdunning van 1:100 van het EV-monster. De monsterconcentratie kan snel worden benaderd door de grootte van de laserspot op de CCD-camera tijdens het boosten, of door observatie van de Event Burst Trace tijdens de bemonstering.
- Verhoog het geladen monster gedurende 45 s voordat u Bemonstering selecteert en neem gedurende 1 minuut op, waarbij u bespaart zoals eerder beschreven.
- Als u wilt beginnen met het analyseren van deze gegevens, schakelt u over van het tabblad Acquisitie naar het tabblad Analyse . Open de opgeslagen nfa-bestanden.
- Om nauwkeurige monstermeting mogelijk te maken, gebruikt u de twee standaardmetingen die voorafgaand aan de monstermeting zijn uitgevoerd om waarden voor monstervergelijking en de blanco in te stellen.
- Maak de groottestandaardcurve voor conversie van SS naar diameter door eerst het standaardformaatbestand te selecteren en het ingestelde drempelgereedschap (ook wel automatische drempels genoemd) te gebruiken. De drempel, zichtbaar in de gebeurtenis burst trace, geeft de minimale signaalintensiteit aan die nodig is om een gebeurtenis als significant te beschouwen.
- Als de drempel is ingesteld, controleert u of de puntplot x- en y-parameters SS-H of SS-A op de x-as en FITC-A op de y-as zijn.
- Open het standaard gereedschap voor het genereren van curven en selecteer S16 exo 68-155 nm als de maatsjabloon. Klik op Find Peaks om de piek SS-intensiteiten te identificeren als een deeltje met een diameter van 68, 91, 113 of 155 nm.
- Controleer of de SS-naar-diametercurve is gegenereerd met een r-waarde in de buurt van 1 voordat u het venster sluit.
- Stel de concentratiestandaard in door het opgeslagen bestand te selecteren en op Count STD te klikken. Voer de deeltjesconcentratie van de norm in.
- Nadat u de standaardinformatie hebt ingesteld, selecteert u het EV-voorbeeldbestand en stelt u de drempel in.
- Selecteer het lege bestand en klik op Leeg instellen om het aantal fout-positieven te identificeren dat uit het aantal monsters moet worden verwijderd. Dit moet gebeuren met dezelfde drempel als uw monster. Ga terug naar het EV-voorbeeldbestand.
- Open het gereedschap PDF-genereren en selecteer Grootte en concentratie. Voer de verdunningen van het monster in. De concentratie van het monster en de grootteverdeling van de deeltjes worden weergegeven.
3. Voorbeeldetikettering
OPMERKING: Twee kleuringsstrategieën kunnen tegelijkertijd worden gebruikt voor een uitgebreide analyse van de deeltjes in suspensie. Etiketteringsprotocollen vereisen vaak optimalisatie voor nieuwe antilichamen of monsterbronnen.
- Verdun een deel van het EV-monster tot een concentratie van 1,25 x 1010 deeltjes/ml in PBS. Incubeer 8 μL van het verdunde EV-monster met 1 μL antilichaam en 1 μL kleurstof voor een deeltjesconcentratie van 1 x 1010 deeltjes/ml (totale deeltjes zijn 1 x 108 gesuspendeerd in 10 μL). De incubatieverhouding voor het antilichaam is in dit geval 1:50 (1 μL van 1:5 antilichaam).
- Gebruik meer dan drie verschillende concentraties van antilichamen of kleurstof tijdens de optimalisatie, om gegevens te verstrekken die aangeven dat het protocol maximale epitoopbinding mogelijk maakt zonder oververzadiging van het gekozen label, wat de identificatie van fluorescentiegebeurtenissen met lage intensiteit kan schaden. De incubatieconcentratie voor de membraankleurstof is 40 nM (1 μL van 400 nM).
- Meng het monster van 10 μL door gedurende 5 s te vortexen en incubeer op RT gedurende 30 minuten in het donker.
OPMERKING: Aanbevelingen voor besturingselementen zijn opgenomen in de discussie. - Neem na incubatie 1 μL van het gelabelde monster en verdun 1:50 in PBS in een buis van 0,6 ml.
- Laad het monster in het laadperron en oefen gedurende 45 s opvoerdruk uit. Zorg ervoor dat de laserinstellingen correct zijn en dat de juiste lenzen zijn geladen.
- Schakel over naar bemonsteringsdruk en selecteer Tijd om op te nemen. Na de acquisitie van 1 minuut geeft u het gegevensbestand een naam en slaat u het op.
- Verwijder het monster en vervang het door een reinigingsoplossing. Boost dit gedurende >30 s voordat u het volgende gelabelde monster laadt.
4. nFCM-analyse-PDF-generatie voor subpopulatieanalyse
- Pas voor het genereren van PDF's dezelfde standaarden toe als voorheen; alleen de blanco meting wordt anders ingesteld.
- Selecteer het voorbeeldbestand en stel de drempelwaarde in. Wijzig op de puntplot de y-as om FL-metingen weer te geven vanaf het groene of rode kanaal.
- Selecteer het gereedschap vierkante gating en gebruik de linkerklik om een vierkant rond de FL + -populatie te tekenen.
- Open het lege meetbestand en klik op Leeg instellen voordat u terugkeert naar het voorbeeldbestand.
- Open de PDF-generatietool zoals voorheen en de grootteverdeling, concentratie en percentage (vergeleken met alle SS+-gebeurtenissen) worden geïdentificeerd voor de FL+-subpopulatie.
- Herhaal dit voor elke subpopulatie van belang geïdentificeerd als "Totaal, P1, P2 enz."
Representative Results
Tetraspanin presentatie op SW620 afgeleide EV's en C2C12 afgeleide EV's
Moderne analyse van de overvloed aan belangrijke tetraspaninen CD9, CD63 en CD81 op EV's uit verschillende bronnen heeft de extreme variabiliteit van hun aanwezigheid benadrukt, zowel in bulkanalyses als bij het analyseren van hun presentatie op EV-subpopulaties21. Dit houdt waarschijnlijk verband met de beschikbaarheid van verschillende biogeneseroutes zoals de ESCRT-afhankelijke en onafhankelijke routes22.
CD9 werd gepresenteerd op het grootste percentage C2C12 EV's met ~ 50%, met CD63-presentatie op slechts ~ 30%, in figuur 1. Toen etikettering werd uitgevoerd met alle drie de anti-tetraspaninen in één incubatie, bleek ~ 70% van de deeltjes ten minste één van de EV-markers te vertonen. Herhaalde metingen toonden de laagste standaarddeviatie voor de CD9/63/81-etikettering van C2C12 EV's op ~ 3,8%, terwijl dit ~ 8,1% was voor de CD81-gelabelde C2C12 EV's.
SW620 afgeleide EV's vertoonden een ander tetraspanineprofiel, met een veel groter verschil tussen de meest gepresenteerde CD9 op ~ 40% en de minst gepresenteerde CD63 op ~ 7%. Vergelijkbaar met de C2C12 EV's, was CD9 aanwezig op de meerderheid van de tetraspanine positieve populatie, omdat de CD9/63/81 gecombineerde etikettering identificeerde ~ 42% van de deeltjes met ten minste één van de drie markers.
De meerderheid van de C2C12-afgeleide deeltjes, de totale SS + -populatie, varieerde in grootte van 45-120 nm, met een mediane diameter van ~ 65 nm. De grootteprofielen voor elk van de enkele tetraspanine gelabelde EV-subpopulaties, weergegeven in figuur 1, zijn vergelijkbaar met elkaar, met een grotere mediane grootte van ~ 75-85 nm en minder <65 nm EV's in vergelijking met de totale deeltjespopulatie.
Sw620 afgeleide deeltjes varieerden tussen 45-160 nm met een mediane grootte van ~ 65 nm, met een scheve verdeling. De tetraspanine gelabelde EV's vertonen een meer normale verdeling en een grotere mediane diameter tussen 90-110 nm, met vergelijkbare verdelingen tussen individuele tetraspanine positieve subpopulaties.
Hoewel de meest en minst gepresenteerde tetraspaninen hetzelfde zijn voor deze twee cellijnen, verschilt hun evenredige vertegenwoordiging sterk en is er een interessant verschil tussen de potentiële co-presentatie van tetraspaninen waarneembaar van het verschil in CD9-positiviteit en de CD9/63/81 positiviteit.
Ev-membraanetikettering combineren met antilichaametikettering
Het dubbellaagse membraan van EV's biedt een meer generiek etiketteringsdoel, dat onderscheid kan maken van niet-EV-deeltjes van vergelijkbare grootte, zoals eiwitaggregaten en sommige vormen van LDL met lipide monolagen23. De specificiteit van dit type etikettering moet worden gevalideerd, aangezien van sommige veel voorkomende membraankleurstoffen die in EV-onderzoek worden gebruikt, is aangetoond dat ze ook binden aan niet-EV-deeltjes24.
Membraanetikettering toonde herhaaldelijk ~ 80% positiviteit van C2C12 afgeleide EV's en SW620 EV's. De SS-intensiteit (SS-H) vertoont een goede correlatie met FITC-intensiteit op de dot plots van zowel C2C12- als SW620-resultaten in figuur 2. Dit wordt verwacht omdat de RVS-intensiteit relatief is ten opzichte van de deeltjesgrootte en dus het membraanoppervlak.
De meerderheid van de antilichaam gelabelde EV's waren ook positief voor de membraanetikettering met dubbele positieve percentages (FITC + & APC +) die zeer vergelijkbaar zijn met de tetraspaninepositieve percentages. FITC vs APC dot plots tonen een lichte correlatie tussen membraan- en tetraspanine-etikettering met CD63-etikettering die de zwakste correlatie met membraanetikettering lijkt te vertonen. Er werden weinig gebeurtenissen gedetecteerd die positief waren voor antilichaametikettering, maar negatief voor membraanetikettering.
Reproduceerbaarheid, dubbele etiketteringsefficiëntie en alternatieve gegevensuitvoer
Een belangrijke overweging bij het ontwerpen van nFCM-experimenten is fluorofoor of labelinteractiviteit. Figuur 3a laat zien dat het herhalen van de antilichaametikettering met en zonder aanvullende membraanetikettering leidt tot zeer vergelijkbare % positiviteitsmetingen. Met name de SW620-etikettering vertoont zeer weinig variatie tussen de twee meetsets. Dit toont beperkte interferentie tussen de kleurstof- en antilichaambinding en benadrukt ook een goede reproduceerbaarheid bij het herhalen van EV-etikettering.
Intensiteitsmetingen, zowel zijdelingse verstrooiing als fluorescentie, kunnen worden geëxporteerd om uit te blinken voor elk afzonderlijk gemeten deeltje. Hieruit kunnen we metingen van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) genereren om vergelijkende benaderingen te geven van de abundantie van ons gelabelde doel. MFI voor de fluorescerende populaties van C2C12 afgeleide EV's suggereren een iets lagere presentatie van CD63 en CD81 met MFI-metingen van respectievelijk ~ 550 en ~ 600, vergeleken met de ~ 850 MFI gezien voor CD9 + EV's. De meeteenheden voor MFI zijn in dit geval FL-A en zijn niet gestandaardiseerd tegen een fluorescerende kalibratie. Het gebruik van alle drie de antilichamen lokt geen veel grotere fluorescentie uit dan alleen CD9-etikettering. Dit is heel anders dan de SW620 MFI-metingen, die suggereren dat het gebruik van een cocktail van alle drie de antilichamen een groter fluorescentiesignaal oplevert voor gelabelde EV's, dan het gebruik van een individueel antilichaamlabel.
De histogrammen voor de grootteverdeling die door de NanoFCM-software worden geproduceerd, kunnen ook worden geëxporteerd naar Excel, waardoor drievoudige datasets kunnen worden overlayed. De grootteverdelingsprofielen van figuur 3 zijn vergelijkbaar met die van figuur 1, maar bevatten foutbalken. De mediane EV-grootte van de tetraspaninepositieve subpopulaties in C2C12-afgeleide EV's vertonen een mediaan rond 70 nm, iets groter dan het 60 nm-gemiddelde van de totale deeltjespopulaties. SW620 EV's positief voor tetraspaninemarkers zijn groter en vertonen pieken bij ~ 100 nm.
Figuur 1: CD9, CD63, CD81 positieve EV-subpopulaties geïdentificeerd door antilichaametikettering. (A) Staafdiagram met het percentage gelabelde EV's in vergelijking met de totale deeltjes waargenomen door SS voor C2C12 afgeleide EV's. (B) Staafdiagram met het percentage gelabelde EV's in vergelijking met het totale aantal deeltjes dat door SS is waargenomen voor sw620-afgeleide EV's. (C) Representatieve grootteverdelingsprofielen voor van C2C12 afgeleide EV's. Elk histogram wordt genomen uit de PDF's die zijn gegenereerd voor de eerste meting van drievoudige gegevenssets. (D) Representatieve maatverdelingsprofielen voor van SW620 afgeleide EV's. Elk histogram wordt genomen uit de PDF's die zijn gegenereerd voor de eerste meting van drievoudige gegevenssets. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drievoudige metingen van dezelfde gelabelde monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Membraanetikettering en antilichaametikettering van CD9, CD63, CD81 met EV-subpopulaties. (A) Staafdiagram met membraan+ %, tetraspanine+ % en dubbel+ % voor C2C12 EV's. (B) Staafdiagram met membraan+ %, tetraspanine+ % en double+ % voor SW620 EV's. (C) Representatieve SS vs FITC dot plots die gating laten zien voor de Membraan positieve populatie. (D) Representatieve FITC versus APC dot plots die gating laten zien voor dubbele positieve populatie van EV's van C2C12. (E) Representatieve FITC vs APC dot plots die gating laten zien voor dubbele positieve populatie van EV's vanaf SW620. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drievoudige metingen van dezelfde gelabelde monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beoordeling van de variatie in herhaalde metingen. (A) Staafdiagrammen die antilichaametikettering % positiviteit tonen met en zonder aanvullende membraanetikettering. (B) Gemiddelde fluorescentie-intensiteitsmetingen voor gated EV-subsets. (C) Histogrammen met gemiddelde grootteverdeling voor drievoudige datasets voor C2C12 EV's. (D) Histogrammen met gemiddelde grootteverdeling voor drievoudige datasets voor SW620 EV's. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drievoudige metingen van dezelfde gelabelde monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Details van monsters en reagens
Twee EV-isolaten uit afzonderlijke cellijnen werden geselecteerd voor demonstratie van fluorescerende etikettering en daaropvolgende nFCM-analyse. Beide EV-sets werden opgehangen in PBS en opgeslagen bij -80 °C gedurende <3 maanden, maar de meeste andere omstandigheden waren verschillend tussen isolaten. De C2C12 muismyoblastcellijn vertegenwoordigt een embryonale voorloper van skeletspiercellen en werd gekweekt in 2D-cultuur, waarbij het groeimedium gedurende 72 uur werd geconditioneerd vóór EV-isolatie door ultracentrifugatie. SW620 is een menselijke colon adenocarcinoom cellijn en werd gekweekt in een rudimentaire bioreactor, verrijkende media gedurende 7 weken, met EV-isolatie uitgevoerd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en fracties 7-9 geëlueerd uit sepharose CL-2B-kolommen gecombineerd in een enkel monster.
Hoewel EV's geïsoleerd en geconcentreerd uit CCM de gemakkelijkste monstertypen zijn om mee te werken, is nFCM van toepassing op de meeste EV-isolaten, inclusief biovloeistoffen zoals serum, plasma, urine en CSF. Deze monsteranalyses profiteren van de nFCM SS-detectie van alle deeltjes, waardoor bevestiging met NTA, TRPS en andere deeltjesanalyses mogelijk is, terwijl de fluorescerend gelabelde EV-subpopulaties in kwantitatieve termen en een deel van het totaal worden beschreven, voor een onbevooroordeelde benadering van multiparameter deeltjesanalyse. Analyse van laag verwerkte monsters is ook mogelijk, zoals niet-verklaarde urine en EV-verrijkte CCM met de kanttekening dat er weinig verontreinigd eiwit nodig is.
De hier gebruikte membraankleurstof is bedoeld om te integreren in de lipide bilaag, met een lipofiele component voor membraanbelasting en een hydrofiele kleurstof om in het plasmamembraan te blijven25. Er is momenteel geen perfecte EV-etiketteringskleurstof en verschillende criteria moeten worden overwogen bij het kiezen, waaronder specificiteit voor EV's, geschiktheid met fixatie of permeabilisatie en efficiëntie van EV-etikettering26.
Fluorescerende geconjugeerde antilichaametikettering van aan het oppervlak blootgestelde epitopen is een effectieve methode gebleken voor het identificeren van EV-subpopulaties27. Een belangrijk aspect van protocoloptimalisatie is het voldoen aan, en niet overschrijden, van het etiketteringsverzadigingspunt om te binden aan alle beschikbare epitopen zonder de detectie van lage fluorescentiedeeltjes te remmen door de omringende buffer te laten vullen met fluorescerend ongebonden antilichaam28. Bovendien wordt de beschikbaarheid van blootgestelde bindingsplaatsen voor antilichaametikettering mogelijk beïnvloed door verschillende factoren. Van de opslagcondities van EV's is aangetoond dat ze de concentratie- en grootteprofielen van EV's29 beïnvloeden, waarbij waarnemingen ook wijzen op effecten op antilichaametikettering30. De aanwezigheid van oppervlakte-corona-eiwitten, eiwitmodificaties en effecten van isolatietechnieken kunnen in sommige gevallen ook effecten hebben op de etikettering van antilichamen. Uiteindelijk, naarmate het gebruik van fluorescerende etikettering vaker voorkomt voor EV-studies, zullen experimenteel ontwerp en optimalisatie voor meerdere analytische technieken verfijnder worden.
Om de nauwkeurigheid van de resultaten te vergroten, kunnen verschillende controles worden opgenomen, zoals (1) PBS + kleurstofcontrole, om micel- of aggregaatvorming in sommige kleurstoffen te beoordelen, die kunnen verschijnen als SS + deeltjes in nFCM-analyse, (2) PBS + antilichaamcontrole, aggregaten kunnen optreden, hoewel vaak niet groot genoeg om voldoende licht te verstrooien voor SS-detectie, (3) EV-monster + IgG-antilichaamcontrole, gebruikelijk in flowcytometrie en gebruikt om elke niet-specifieke binding te identificeren, (4) niet-EV-deeltjesmonster + antilichaam / kleurstofcontrole - vooral belangrijk bij het identificeren van EV's in complexe deeltjesmonsters, controles zoals gezuiverde low-density lipoproteïne (LDL) deeltjes of EV uitgeputte / ablated monsters kunnen fungeren als een negatieve controle om selectieve etikettering te valideren, (5) positieve controles zijn moeilijk te ontwerpen, maar validatie van een antilichaam op cellen is een nuttige toevoeging.
Presentatie van tetraspaninen op EV's
De antilichaam- en membraanetikettering van dit experiment toont het hoge niveau van kwantitatieve gegevens die in een klein tijdsbestek kunnen worden verkregen door nFCM-analyse. Gelijktijdige meting van de belangrijkste fysische kenmerken van deeltjesdiameter/-concentratie met de fenotypische metingen van membraan- en/of eiwitaanwezigheid leidt tot beschrijvingen op hoog niveau van subpopulaties binnen deeltjesisolatie.
Belangrijk is dat verschillende niveaus van de drie 'belangrijkste' EV-gerelateerde tetraspaninen, CD9, CD63, CD81, werden geïdentificeerd in deze twee EV-monsters. CD9 werd gepresenteerd op het grootste deel van de EV's voor zowel C2C12 afgeleide EV's als SW620, met CD81 en CD63 als respectievelijk de tweede en minst gepresenteerde eiwitten.
Ondanks enkele overeenkomsten die hier zijn waargenomen in de tetraspanineprofielen van EV's van twee zeer verschillende celbronnen, kunnen niveaus van CD9, CD63 en CD81 heel verschillend zijn tussen cellijn en patiënt afgeleide EV's31.
Het verschil in CD63-expressie tussen de twee EV-monsters is met name relevant voor de voortdurende discussie over de belangrijkste identificatiegegevens van 'EV-ness'. Hoewel de presentatie van CD63 in slechts ~ 8% van de SW620 EV's door sommigen onverwacht kan zijn, is CD63 gesuggereerd als slechte identificatie van de verschillende soorten EV's geïsoleerd door grootte of dichtheid32, en tetraspanine negatieve EV's zijn geïdentificeerd, zelfs wanneer beschreven als exosoomachtige33.
Identificatie van EV's binnen complexe deeltjesisolaten
De heterogeniteit van EV-tetraspanineprofielen, in zowel cellijn- als patiënt-afgeleide EV's, waarschuwt voor afhankelijkheid van tetraspanine-gebaseerde vangst van EV's en benadrukt de toekomstige behoefte aan nieuwe EV-identificatiemethoden31. EV-etikettering onafhankelijk van specifieke eiwitten kan zeer gunstig blijken te zijn voor het identificeren van EV's van niet-EV-deeltjes van vergelijkbare grootte als ev-specificiteit kan worden bewezen zeer hoog te zijn. Dit geldt met name voor biofluïde EV-isolaten, omdat is gesuggereerd dat de concentratie van EV's in menselijk bloedplasma in het bereik van 1010 deeltjes / ml ligt, terwijl lipoproteïnen worden gemeten bij 1016 per ml14,34. Zelfs bij EV-verrijking suggereren studies die deeltjespositiviteit vergelijken voor tetraspaninemarkers en / of LDL-marker ApoB ~ 50-100x grotere overvloed aan LDL in bloedplaatjesvrij plasma (PFP) -monsters in vergelijking met EV35.
De gebruikte isolatietechniek heeft een grote invloed op het bereik van co-geïsoleerde niet-EV-deeltjes zoals lipoproteïnen met zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met gemiddelde dichtheid (IDL) en LDL36. Er zijn ook beschrijvingen van lipoproteïne co-isolaten gebonden aan EV's die, hoewel ze mogelijk een belangrijke biologische rol spelen, het bereiken van EV-zuivere monsters een uitdagend doel maakt35.
Daarom zou kunnen worden gesteld dat er meer nadruk moet worden gelegd op de beschrijving van deeltjes waaruit een monster bestaat, in plaats van het bereiken van isolatie van een zuivere maar beperkte selectie van EV's. Het bereiken van een uitgebreide beschrijving van deeltjes door het meten van tetraspanine abundantie in bulk en deeltjesaantallen afzonderlijk kan onvoldoende zijn om ev-concentraties nauwkeurig te bepalen, met name uit biofluïde bronnen36,37. Het identificeren van subpopulaties in een tier-gebaseerde benadering, met totale deeltjes, EV's en EV's die bepaalde eiwitten presenteren, zoals aangetoond in dit experiment, kan een robuuste oplossing bieden voor nanodeeltjeskarakterisering. Dit is het geval geweest voor projecten met EV-loading met ontwerpen voor toekomstige therapeutische toepassingen20 en identificatie van CD63+ EV's met luminale lading zoals mitochondriën38.
nFCM binnen het repertoire van EV analytics
Een kracht van nFCM EV-analyse is de manier waarop gegevens de meest voorkomende EV-analyses kunnen bevestigen en erop kunnen voortbouwen en bruggen kunnen vormen tussen fysieke en fenotypische datasets. Dit is echter gebaseerd op nauwkeurige etiketteringsprotocollen die vaak moeten worden geoptimaliseerd voor unieke etiketteringsreagentia zoals kleurstoffen en antilichamen. Een belangrijk criterium voor nauwkeurige analyse is het hebben van gelabelde deeltjes gesuspendeerd in een niet-fluorescerende buffer, die afhankelijk is van ofwel verwijdering van overtollige ongebonden fluorofoor of de verfijning van protocollen om de verzadiging van epitoop niet te overschrijden.
Vergelijkingsstudies hebben aangetoond dat nFCM-dimensionering van EV's gegevens levert in overeenstemming met TRPS en cryo-TEM, technieken die worden beschreven als nauwkeuriger dan NTA voor EV-grootteanalyse10,39. Zoals bij elke op optische methode moet echter bij de interpretatievan gegevens rekening worden gehouden met de invloed van heterogene optische eigenschappen die voor EV's wordt waargenomen en verschillen tussen de optische eigenschappen van referentiemateriaal en EV's.
Western blotting is een belangrijke methode geweest voor het aangeven van EV-verrijking door identificatie van EV-markers40. Maar de wens om de aanwezigheid van dergelijke markers op deeltjes aan te tonen, heeft geleid tot vooruitgang in ev-gebaseerde flowcytometrische analyses17. De noodzakelijke oplossingen om robuuste gegevens te verstrekken, kunnen momenteel echter het best worden bereikt door middel van speciale instrumentatie met betrekking tot zowel verstrooid als fluorescerend licht19.
nFCM biedt een onbevooroordeelde benadering van het in eerste instantie beschrijven van alle deeltjes die irrelevant zijn voor specifieke markers, door gebruik te maken van zijdelingse verstrooiingsmeting, waardoor bevestiging mogelijk is met de meest voorkomende technieken van NTA, RPS en TEM1, terwijl tegelijkertijd fenotypische metingen vergelijkbaar met WB of Elisa op een kwantitatieve manier worden toegevoegd.
Disclosures
A.L., B.P., D.A., R.L, R.T zijn werknemers van NanoFCM en hun bijdragen aan dit artikel werden geleverd als onderdeel van hun dienstverband.
Acknowledgments
We willen de groepen van Owen Davies en Nick Peake bedanken voor het blijven leveren van materiaal en expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
| CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
| Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
| Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
| EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
| EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
| Memglow - Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
| NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
| PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
| Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |
References
- Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325 (2019).
- Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
- Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).
- Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).
- Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
- Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
- Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
- Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
- Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
- Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).
- Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
- Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).
- Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).
- Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).
- Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
- Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).
- Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).
- Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
- Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).
- Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
