Summary
최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.
Abstract
단일 입자 특성 분석은 벌크 분석 기술 및 1세대 입자 분석에서 나노 유세포분석(nFCM)과 같은 포괄적인 다중 파라미터 측정으로 발전하면서 세포외 소포 연구에 점점 더 중요해지고 있습니다. nFCM은 나노 입자 분석을 위해 특별히 설계된 기기를 활용하는 유세포분석의 한 형태로, 염색 기술을 사용하거나 사용하지 않고 분당 수천 개의 EV를 특성화할 수 있습니다. 고분해능 측면 산란(SS) 검출을 통해 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자에 대해 크기와 농도를 측정할 수 있으며, 동시 형광(FL) 검출은 표지된 마커 및 관심 대상의 존재를 식별합니다. 그런 다음 레이블이 지정된 하위 집단은 입자/mL의 정량적 단위 또는 측면 산란으로 식별된 전체 입자의 백분율로 설명할 수 있습니다.
여기에서 컨디셔닝 세포 배양 배지(CCM)에서 파생된 EV는 막이 있는 입자를 식별하기 위해 지질 염료로 표지되고 CD9, CD63 및 CD81에 특이적인 항체가 공통 EV 마커로 사용됩니다. 비교 물질, 실리카 나노스피어의 농도 표준물질 및 크기 표준물질, 표지된 시료 물질의 측정은 1분 분석으로 분석됩니다. 그런 다음 소프트웨어는 각 라벨에 대해 양성인 입자를 결정하기 전에 라벨링과 관계없이 모든 입자의 농도 및 크기 분포 프로파일을 측정하는 데 사용됩니다.
SS 및 FL 동시 검출은 다양한 EV 소스 및 라벨링 대상(외부 및 내부)과 함께 유연하게 활용하여 EV 샘플을 포괄적이고 정량적인 방식으로 설명할 수 있습니다.
Introduction
전기차란?
세포외 소포(EV)는 많은 정상적인 세포 및 조직 활동에 필수적인 다양한 세포 유래 막 입자의 총칭입니다. 광범위한 과학 분야에 미치는 영향과 잠재적인 임상 관련성은 EV 연구 및산업 관심의 성장을 주도했습니다1. 소형 EV (sEV) 연구는 주로 다중 소포체 (MVB)가 원형질막에 융합되어 성숙 및 방출되기 전에 초기 엔도 좀에서 형성되기 시작하는 40-100 nm 입자 인 엑소 좀과 원형질막에서 직접 싹이 트고 80-1,000 nm 입자를 형성하는 미세 소포에 중점을 둡니다2. 세 번째 EV 집단은 세포 사멸 중에 형성된 50-1,500nm 입자인 세포사멸체이며, 이는 다른 EV에 대한 상대적 비율이크게 가변적일 수 있음을 의미합니다3.
EV 특성은 기원의 세포/조직에서 발생하는 변화를 나타낼 수 있기 때문에 진단에 사용할 가능성이 있습니다. 다양한 'omics' 분석이 세포 기원 및 질병 상태의 마커를 식별하기 시작했으며, 이는 혈장/혈청, 소변, 타액 및 뇌척수액(CSF)과 같은 EV 소스를 사용하여 환자의 비침습적 평가를 허용할 수 있습니다4,5. 이러한 EV 관련 혁신의 원동력은 이전의 한계를 극복하는 새로운 특성화 기술입니다.
단일 EV 특성화의 필요성과 과제
단일 EV 특성화는 EV 분리 물의 검증 및 설명뿐만 아니라 EV 기반 치료및 진단의 진행을 위한 이러한 나노입자의 주요 특징을 밝히는 데 점점 더 중요해지고 있습니다6. EV 소스 및 용도에 따라 EV 대 비 EV 입자 또는 EV 대 유리 단백질의 비율로 설명되는 순도 분석에는 여러 분석에서 상당한 양의 데이터가 필요할 수 있습니다7.
EV 간행물의 입자 계수 및 크기 측정은 이전에 나노입자 추적(NTA), 저항성 펄스 감지(RPS) 및 전자 현미경(EM)2에 크게 의존해 왔습니다. 표준 NTA 및 RPS는 EV를 비 EV 입자와 구별하는 기능이 부족하며 느린 처리량8 및 NTA 9,10,11에서 볼 수 있는 부적절한 감지 하한과 같은 자체 주의 사항이 있습니다.
테트라스파닌 CD9, CD63 및 CD81은 역사적으로 EV 분리/준비에서 EV의 존재에 대한 중요한 식별자였습니다. 일반적으로, 웨스턴 블로팅 (WB) 및 도트 블로팅 기술은 세포 용해물12와 비교하여 EV 분리물에서 이들 단백질의 농축을 보여주기 위해 사용된다. 그러나 EV 하위 집단 및 세포, 조직 또는 환자 관련 변이 모두와 관련하여 이러한 방법에 대한 정량 분석의 부족과 이러한 EV 마커의 이질성은 물리적 및 표현형 특성화를 통합하는 고급 분석 기술을 장려합니다13.
포괄적인 EV 분석 기술로서의 나노 유세포분석
실제 EV 농도를 결정하려면 손상되지 않은 입자와 범용 마커, 특히 복잡한 분리 입자에서 모든 EV를 검출하면서 비 EV 입자와 구별할 수 있는 분해능을 식별해야 합니다14.
나노 유세포 분석 (nFCM)은 45-1,000 nm 크기의 입자에 대한 표지되지 않은 분석을 가능하게하는 동시에 형광 표지 및 검출을 활용하여 입자 하위 집단을 식별 할 수있는 기술입니다. 기존의 유세포분석과의 주요 차이점은 나노입자 분석 전용 장비를 사용하여 최고의 분해능15를 허용한다는 것입니다. 작은 입자 분석을 위해 용도가 변경된 기존 유량 계측을 사용하는 EV 분석은 개선되고 있지만 <100nm EV를 감지하고 분석하기 위한 분해능을 달성하는 데 여전히 어려움을 겪고 있습니다16,17. 비드 기반 유세포분석은 EV 분석에 자주 사용되는 추가 적응이지만, 이는 단일 입자 검출의 가능성을 제거하고 포획 기반 바이어스(18)를 도입합니다.
EV 분석을 위한 측면 산란(SS) 채널에서 ~45nm의 낮은 검출 한계를 활용하는 nFCM은 SS 트리거링을 활용합니다. 이는 이벤트가 형광 강도를 분석하기 전에 설정된 임계값을 초과하는 SS 신호를 제공해야 함을 의미하므로 '입자 우선' 분석으로 생각할 수 있습니다. 이는 저하된 멤브레인 및 형광단 응집과 같은 오탐을 제거하고 손상되지 않은 EV(15)에 분석을 집중합니다. SS 측정은 또한 4 모달 실리카 나노 스피어 표준19와 비교하여 개별 입자의 크기를 조정하는 데 사용됩니다. 형광 측정은 EV 하위 집단(20)을 식별하기 위해 입자 농도, 크기 및 마커 또는 다른 관심 대상의 존재를 설명하기 위해 각 입자에 대해 3 개의 동시 측정을 허용하는 2 개의 추가 검출기에서 수행됩니다.
다음 실험에서는 SS 및 형광(FL) 측정을 사용하여 >45nm 입자를 측정하고, 막 양성 EV의 하위 집합을 표시하고, EV 하위 집단에서 CD9, CD63, CD81 표시를 식별합니다. 이들 하위 집단의 농도와 SS에 의해 측정 된 전체 입자의 일부로서의 비율은 크기 프로파일과 마찬가지로 설명된다.
Protocol
1. nFCM 기기 설정 및 nFCM 표준 측정
알림: 샘플에 대한 데이터 수집을 시작하기 전에 세 가지 측정을 수행하여 nFCM 기기의 올바른 정렬을 검증하고 기기 간의 강력한 비교를 제공합니다. 이들은 농도 표준/품질 관리(QC), 크기 표준 및 블랭크입니다.
- QC 비드를 적절한 0.6μL 튜브의 증류수에 1:100으로 희석하고 로딩 베이에 놓습니다.
- 샘플 흐름 드롭다운 메뉴에서 부스팅을 선택하여 QC 샘플을 45초 동안 시스템에 도입하여 이전 샘플/세척 용액을 완전히 대체합니다.
- 부스팅하는 동안 레이저 출력을 QC 비드 "250nm FL QC 표준"에 대한 사전 설정 템플릿으로 설정합니다(예: 청색 레이저의 경우 10/40mW, 적색 레이저의 경우 20/50mW, 0.2% SS 감쇠).
- 동일한 아래쪽 메뉴에서 샘플링 압력을 선택하여 시스템 압력을 줄입니다.
- 일정한 압력을 유지하려면 자동 샘플링 압력을 1.0kPa로 설정하십시오.
- 획득 컨트롤에서 기록 시간을 선택하여 1분 분석을 시작합니다. 데이터는 SS 강도와 선택한 FL 강도에 대한 로그 스케일을 보여주는 점도표에 표시됩니다.
- 파일을 저장하기 전에 파일 이름과 샘플 희석액을 삽입하십시오.
- 언로드를 선택하여 로딩 베이에서 튜브를 제거합니다. 150μL의 세척액으로 교체하고 부스팅 을 선택하여 >30초 동안 세척한 후 언로드를 선택하여 세척액을 제거합니다.
- 150μL의 물이 포함된 튜브를 사용하여 모세관 팁에서 과도한 세척액을 제거합니다.
- 크기 표준 비드를 물에 1:100으로 희석하고 100μL를 로딩 베이에 로드한 후 샘플을 45초 동안 부스트합니다 .
- 레이저 출력을 사전 설정 템플릿 "S16 exo 68-155 nm"로 설정합니다. 이 설정은 크기 표준과 200nm < EV를 포함하는 샘플 모두에 적용됩니다. 예를 들어, 청색 레이저의 경우 15/40mW, 적색 레이저의 경우 20/50mW, 0.2% SS 감쇠.
- 샘플링을 선택하고 이전과 같이 1분 동안 샘플 기록을 진행합니다.
- 물 또는 PBS 샘플로 세 번째 측정을 수행하여 용리액의 빈 측정값을 생성하고 소프트웨어에서 제거할 오탐을 식별합니다. 표준 측정값 입력은 다음 섹션에 설명되어 있습니다.
2. 라벨링되지 않은 샘플의 입자 농도 결정 및 PDF 보고서 생성
- PBS에서 라벨링되지 않은 EV 샘플을 nFCM 분석에 적합한 입자 농도 범위(1 x 10 8-5 x 108 입자/mL)로 희석합니다. 희석된 시료 10-100μL를 로딩 베이에 넣습니다.
- 입자 농도를 알 수 없는 경우 EV 샘플의 1:100 희석으로 시작합니다. 시료 농도는 부스팅 중 CCD 카메라의 레이저 스폿 크기 또는 샘플링 중 이벤트 버스트 트레이스 관찰을 통해 빠르게 근사화할 수 있습니다.
- 샘플링을 선택하기 전에 로드된 샘플을 45초 동안 부스트하고 1분 동안 기록하여 앞에서 설명한 대로 절약합니다.
- 이 데이터 분석을 시작하려면 수집 탭에서 분석 탭으로 전환합니다. 저장된 nfa 파일을 엽니다.
- 정확한 샘플 측정을 허용하려면 샘플 측정 전에 수행 한 두 가지 표준 측정을 사용하여 샘플 비교 값과 블랭크를 설정합니다.
- 먼저 크기 표준 파일을 선택하고 임계값 설정 도구(자동 임계값이라고도 함)를 사용하여 SS에서 지름으로 변환하는 크기 표준 곡선을 생성합니다. 이벤트 버스트 추적에 표시되는 임계값은 이벤트가 중요한 것으로 간주되는 데 필요한 최소 신호 강도를 식별합니다.
- 임계값을 설정한 상태에서 점도표 x 및 y 매개변수가 x축의 SS-H 또는 SS-A이고 y축의 FITC-A인지 확인합니다.
- 표준 곡선 생성 도구를 열고 크기 조정 템플릿으로 S16 exo 68-155nm 를 선택합니다. 피크 찾기 를 클릭하여 피크 SS 강도를 68, 91, 113 또는 155nm 직경의 입자로 식별합니다.
- 창을 닫기 전에 r 값이 1에 가까운 SS-지름 곡선이 생성되었는지 확인하십시오.
- 저장된 파일을 선택하고 성병 계산을 클릭하여 농도 표준을 설정하십시오. 표준물질의 입자 농도를 입력합니다.
- 표준 정보를 설정 한 후 EV 샘플 파일을 선택하고 임계 값을 설정하십시오.
- 빈 파일을 선택하고 공백으로 설정을 클릭하여 샘플 수에서 제거할 가양성 수를 식별합니다. 이 작업은 샘플과 동일한 임계값으로 수행해야 합니다. EV 샘플 파일로 돌아갑니다.
- PDF 생성 도구를 열고 크기 조정 및 농도를 선택합니다. 샘플의 희석액을 입력합니다. 샘플의 농도와 입자의 크기 분포가 표시됩니다.
3. 샘플 라벨링
참고: 현탁액의 입자에 대한 포괄적인 분석을 위해 두 가지 염색 전략을 동시에 사용할 수 있습니다. 라벨링 프로토콜은 종종 새로운 항체 또는 샘플 소스에 대한 최적화가 필요합니다.
- EV 샘플의 일부를 PBS에서 1.25 x 1010 입자 / mL의 농도로 희석합니다. 희석된 EV 샘플 8μL를 1μL의 항체 및 1μL의 염료와 함께 1 x10 입자/mL의 입자 농도로 배양합니다(총 입자는 1 x 108 10μL에 현탁됨). 이 경우 항체에 대한 배양 비율은 1:50(1:5 항체의 1μL)입니다.
- 최적화 동안 3개 이상의 상이한 농도의 항체 또는 염료를 사용하여, 프로토콜이 선택된 표지의 과포화 없이 최대 에피토프 결합을 허용함을 나타내는 데이터를 제공하여, 이는 저강도 형광 이벤트의 식별을 손상시킬 수 있다. 멤브레인 염료에 대한 배양 농도는 40 nM (400 nM의 1 μL)이다.
- 10 μL 샘플을 5 초 동안 볼텍싱하여 혼합하고 어둠 속에서 30 분 동안 RT에서 배양합니다.
참고: 컨트롤에 대한 권장 사항은 토론에 포함되어 있습니다. - 배양 후 표지된 샘플 1μL를 취하여 0.6mL 튜브의 PBS에서 1:50으로 희석합니다.
- 샘플을 로딩 베이에 넣고 45초 동안 부스팅 압력을 가합니다. 레이저 설정이 올바르고 적절한 렌즈가 로드되었는지 확인하십시오.
- 샘플링 압력으로 전환하고 기록 시간을 선택합니다. 1분 획득 후 데이터 파일의 이름을 지정하고 저장합니다.
- 샘플을 내리고 세척액으로 교체하십시오. 다음 라벨이 붙은 샘플을로드하기 전에 >30 초 동안 이것을 높이십시오.
4. 하위 집단 분석을 위한 nFCM 분석-PDF 생성
- PDF 생성의 경우 이전에 수행한 것과 동일한 표준을 적용합니다. 공백 측정만 다르게 설정됩니다.
- 샘플 파일을 선택하고 임계값을 설정합니다. 점도표에서 y축을 변경하여 녹색 또는 빨간색 채널의 FL 측정값을 표시합니다.
- 정사각형 게이팅 도구를 선택하고 왼쪽 클릭을 사용하여 FL+ 채우기 주위에 정사각형을 그립니다.
- 샘플 파일로 되돌리기 전에 빈 측정 파일을 열고 공백으로 설정을 클릭합니다.
- 이전과 같이 PDF 생성 도구를 열면 FL+ 하위 모집단에 대한 크기 분포, 농도 및 백분율(모든 SS+ 이벤트와 비교)이 식별됩니다.
- "총계, P1, P2 등"으로 식별된 각 관심 하위 모집단에 대해 반복합니다.
Representative Results
SW620 파생 EV 및 C2C12 파생 EV에 대한 테트라스파닌 프레젠테이션
다양한 출처의 EV에 대한 주요 테트라스파닌 CD9, CD63 및 CD81의 풍부함에 대한 현대적인 분석은 대량 분석과 EV 하위 집단에 대한 프레젠테이션을 분석할 때 존재의 극도의 가변성을 강조했습니다21. 이는 ESCRT 의존성 및 독립적 경로(22)와 같은 상이한 생물발생 경로의 이용가능성과 관련될 가능성이 있다.
CD9는 그림 1에서 ~50%에서 C2C12 EV의 가장 큰 비율로 표시되었으며 CD63은 ~30%에 불과했습니다. 한 번의 배양에서 세 가지 항테트라스파닌 모두로 표지를 수행했을 때 ~70%의 입자가 EV 마커 중 하나 이상을 나타내는 것으로 나타났습니다. 반복 측정은 C2C12 EV의 CD9/63/81 라벨링에 대해 ~3.8%에서 가장 낮은 표준 편차를 보인 반면, 이는 CD81 라벨링된 C2C12 EV의 경우 ~8.1%였습니다.
SW620 유래 EV는 ~40%에서 가장 많이 제시된 CD9와 ~7%에서 가장 적게 제시된 CD63 사이에 훨씬 더 큰 차이를 보인 다른 테트라스파닌 프로파일을 보여주었습니다. C2C12 EV와 유사하게, CD9/63/81 결합 라벨링이 입자의 ~42%가 세 마커 중 하나 이상을 갖는 것으로 식별되었기 때문에 CD9는 대부분의 테트라스파닌 양성 집단에 존재했습니다.
C2C12 유래 입자의 대부분인 전체 SS+ 집단의 크기는 45-120nm이고 직경은 중앙값 ~65nm입니다. 그림 1에 표시된 단일 테트라스파닌 표지 EV 하위 집단 각각에 대한 크기 프로파일은 서로 유사하여 전체 입자 집단에 비해 ~75-85nm의 더 큰 중간 크기와 더 적은 <65nm EV를 보여줍니다.
SW620 유래 입자는 45-160nm 범위였으며 중간 크기는 ~ 65nm로 비뚤어진 분포를 보여줍니다. 테트라 스파닌 표지 EV는 90-110 nm 사이에서 더 정규 분포와 더 큰 중앙값 직경을 보여 주며 개별 테트라 스파닌 양성 하위 집단간에 유사한 분포를 보입니다.
가장 많이 제시된 테트라스파닌과 가장 적게 제시된 테트라스파닌은 이 두 세포주에 대해 동일하지만 비례 표현은 크게 다르며 CD9 양성의 차이와 CD9/63/81 양성에서 관찰할 수 있는 테트라스파닌의 잠재적 공동 표시 사이에는 흥미로운 차이가 있습니다.
EV 멤브레인 라벨링과 항체 라벨링의 결합
EV의 이중층 막은 단백질 응집체 및 지질 단분자층(23)을 갖는 LDL의 일부 형태와 같은 유사한 크기의 비-EV 입자로부터 구별할 수 있는 보다 일반적인 라벨링 표적을 제공한다. EV 연구에 사용되는 일부 일반적인 멤브레인 염료가 비 EV 입자에도 결합하는 것으로 나타났기 때문에 이러한 유형의 라벨링의 특이성을 검증해야 합니다24.
멤브레인 라벨링은 반복적으로 C80C2 파생 EV 및 SW2 EV의 ~620% 양성을 보여주었습니다. SS 강도(SS-H)는 그림 2에 표시된 C2C12 및 SW620 결과의 점도표에서 FITC 강도와 양호한 상관 관계를 보여줍니다. 이것은 SS 강도가 입자 크기 및 따라서 막 표면적에 상대적이기 때문에 예상됩니다.
항체 표지 EV의 대다수는 테트라스파닌 양성 비율과 매우 유사한 이중 양성 비율(FITC+ 및 APC+)을 나타내는 막 표지에 대해서도 양성이었습니다. FITC 대 APC 점도표는 막 표지와 테트라스파닌 표지 사이에 약간의 상관 관계를 보여주며, CD63 표지는 막 표지와 가장 약한 상관 관계를 보이는 것으로 보입니다. 항체 표지에 대해서는 양성이지만 막 표지에는 음성인 사건은 거의 발견되지 않았습니다.
재현성, 이중 라벨링 효율성 및 대체 데이터 출력
nFCM 실험을 설계할 때 중요한 고려 사항은 형광단 또는 라벨 상호 작용입니다. 도 3a는 추가적인 막 표지를 사용하거나 사용하지 않고 항체 표지를 반복하는 것이 매우 유사한 양성% 측정을 유도한다는 것을 보여준다. 특히 SW620 라벨링은 두 측정 세트 간의 변동이 거의 없습니다. 이는 염료와 항체 결합 사이의 제한된 간섭을 나타내며 EV 라벨링을 반복할 때 우수한 재현성을 강조합니다.
측면 산란 및 형광 모두의 강도 측정은 측정된 각 개별 입자에 대해 탁월하도록 내보낼 수 있습니다. 이를 통해 평균 형광 강도(MFI) 측정값을 생성하여 라벨링된 표적의 풍부도에 대한 비교 근사치를 제공할 수 있습니다. C2C12 유래 EV의 형광 집단에 대한 MFI는 CD63+ EV에서 볼 수 있는 ~850 MFI에 비해 각각 ~550 및 ~600의 MFI 측정으로 CD9 및 CD81의 약간 더 낮은 표현을 시사합니다. 이 경우 MFI의 측정 단위는 FL-A이며 형광 보정에 대해 표준화되지 않았습니다. 세 가지 항체 모두의 사용은 단지 CD9 표지보다 훨씬 더 큰 형광을 유도하지 않습니다. 이는 SW620 MFI 측정과 매우 다르며, 이는 세 항체 모두의 칵테일을 사용하는 것이 개별 항체 라벨을 사용하는 것보다 표지된 EV에 대해 더 큰 형광 신호를 제공한다는 것을 시사합니다.
NanoFCM 소프트웨어에서 생성된 크기 분포 히스토그램을 Excel로 내보내 삼중 데이터 세트를 오버레이할 수도 있습니다. 그림 3 의 크기 분포 프로파일은 그림 1 의 크기 분포 프로파일과 유사하지만 오차 막대를 포함합니다. C2C12 유래 EV에서 테트라스파닌 양성 하위 집단의 중간 EV 크기는 전체 입자 집단의 60nm 평균보다 약간 큰 약 70nm의 중앙값을 보여줍니다. 테트라스파닌 마커에 양성인 SW620 EV는 더 커서 ~100nm에서 피크를 보여줍니다.
그림 1: 항체 표지로 식별된 CD9, CD63, CD81 양성 EV 하위 집단 . (A) C2C12 파생 EV에 대해 SS가 관찰한 총 입자와 비교하여 표지된 EV의 백분율을 보여주는 막대 차트. (B) SW620 파생 EV에 대해 SS에 의해 관찰된 총 입자와 비교하여 표지된 EV의 백분율을 보여주는 막대 차트. (C) C2C12 파생 EV에 대한 대표 크기 분포 프로파일. 각 히스토그램은 삼중 데이터 세트의 첫 번째 측정을 위해 생성된 PDF에서 가져옵니다. (D) SW620 파생 EV의 대표 크기 분포 프로파일. 각 히스토그램은 삼중 데이터 세트의 첫 번째 측정을 위해 생성된 PDF에서 가져옵니다. 오차 막대는 레이블이 지정된 동일한 샘플의 삼중 측정값의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EV 하위 집단을 나타내는 CD9, CD63, CD81의 막 표지 및 항체 표지. (A) C2C12 EV에 대한 막+ %, 테트라스파닌+ % 및 더블+ %를 보여주는 막대 차트. (B) SW620 EV의 멤브레인 + %, 테트라 스파닌 + % 및 더블 + %를 보여주는 막대 차트. (C) 멤브레인 양성 모집단에 대한 게이팅을 보여주는 대표 SS 대 FITC 점도표. (D) C2C12에서 EV의 이중 양성 모집단에 대한 게이팅을 보여주는 대표적인 FITC 대 APC 점도표. (E) SW620에서 EV의 이중 양성 모집단에 대한 게이팅을 보여주는 대표적인 FITC 대 APC 점도표. 오차 막대는 레이블이 지정된 동일한 샘플의 삼중 측정값의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 반복 측정의 변동 평가 . (A) 추가 막 표지가 있거나 없는 항체 표지 양성률(%)을 보여주는 막대 차트. (B) 게이트 EV 하위 집합에 대한 평균 형광 강도 측정. (C) C2C12 EV에 대한 삼중 데이터 세트에 대한 평균 크기 분포 히스토그램. (D) SW620 EV에 대한 삼중 데이터 세트에 대한 평균 크기 분포 히스토그램. 오차 막대는 레이블이 지정된 동일한 샘플의 삼중 측정값의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
샘플 및 시약 세부 정보
별개의 세포주로부터 분리된 2개의 EV 분리물을 형광 표지 및 후속 nFCM 분석의 입증을 위해 선택하였다. 두 EV 세트 모두 PBS에 현탁되어 -80°C에서 <3개월 동안 보관되었지만 대부분의 다른 조건은 분리물 간에 달랐습니다. C2C12 마우스 근원세포 세포주는 골격근 세포의 배아 전구체를 나타내며 초원심분리에 의한 EV 분리 전 72시간 동안 성장 배지를 컨디셔닝하여 2D 배양에서 성장시켰다. SW620은 인간 결장 선암 세포주이며 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 EV 분리를 수행하고 세파로즈 CL-2B 컬럼에서 용리된 분획 7-9를 단일 샘플로 결합하여 7주에 걸쳐 배지를 농축하는 기초적인 생물 반응기에서 성장시켰습니다.
CCM에서 분리 및 농축된 EV가 작업하기 가장 쉬운 샘플 유형인 반면, nFCM은 혈청, 혈장, 소변 및 CSF와 같은 생체 유체를 포함한 대부분의 EV 분리주에 적용할 수 있습니다. 이러한 샘플 분석은 모든 입자의 nFCM SS 검출의 이점을 활용하여 NTA, TRPS 및 기타 입자 분석으로 확증할 수 있으며, 형광 표지된 EV 하위 집단을 정량적 용어와 전체의 비율로 설명하여 다중 매개변수 입자 분석의 편향되지 않은 접근 방식을 제공합니다. 낮은 오염 단백질이 필요하다는 주의 사항과 함께 명확하지 않은 소변 및 EV가 풍부한 CCM과 같이 가공이 적은 샘플의 분석도 가능합니다.
여기에 사용된 막 염료는 막 로딩을 위한 친유성 부분 및 원형질막(25)에 잔존하기 위한 친수성 염료와 함께 지질 이중층으로 통합되도록 의도된다. 현재 완벽한 EV 라벨링 염료는 없으며 EV에 대한 특이성, 고정 또는 투과성에 대한 적합성, EV 라벨링26의 효율성을 포함하여 선택할 때 몇 가지 기준을 고려해야합니다.
표면 노출된 에피토프의 형광 접합 항체 표지는 EV 서브집단27을 확인하기 위한 효과적인 방법인 것으로 입증되었다. 프로토콜 최적화의 핵심 측면은 주변 완충액이 형광 결합되지 않은 항체28로 채워지도록 함으로써 낮은 형광 입자의 검출을 억제하지 않으면서 모든 이용가능한 에피토프에 결합하는 표지 포화점을 초과하지 않고 충족하는 것이다. 또한, 항체 표지를 위한 노출된 결합 부위의 가용성은 잠재적으로 여러 인자에 의해 영향을 받는다. EV의 저장 조건은 EV29의 농도 및 크기 프로파일에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 관찰은 또한 항체 표지(30)에 대한 영향을 나타낸다. 표면 코로나 단백질의 존재, 단백질 변형 및 분리 기술의 영향도 일부 경우 항체 표지에 영향을 미칠 수 있습니다. 궁극적으로 EV 연구에서 형광 라벨링의 활용이 보편화됨에 따라 여러 분석 기술에 대한 실험 설계 및 최적화가 더욱 정교해질 것입니다.
결과의 정확성을 높이기 위해, nFCM 분석에서 SS+ 입자로 나타날 수 있는 일부 염료에서 미셀 또는 응집체 형성을 평가하기 위해, (1) PBS+ 염료 대조군, (2) PBS+ 항체 대조군, 응집체가 발생할 수 있지만, 종종 SS 검출을 위해 충분한 빛을 산란시킬 만큼 충분히 크지는 않지만, (3) EV 샘플 + IgG 항체 대조군, 유세포분석에서 일반적이며 비특이적 결합을 식별하는 데 사용되는 (4) 비 EV 입자 샘플 + 항체/염료 제어 - 복잡한 입자 샘플에서 EV를 식별해야 할 때 특히 중요하며, 정제된 저밀도 지단백질(LDL) 입자 또는 EV 고갈/절제 샘플과 같은 대조군은 선택적 라벨링을 검증하기 위한 음성 대조군으로 작용할 수 있으며, (5) 양성 대조군은 설계하기 어렵지만 세포에 대한 항체의 검증은 유용한 포함입니다.
EV에 대한 테트라스파닌 프레젠테이션
이 실험의 항체 및 막 표지는 nFCM 분석으로 짧은 시간 내에 얻을 수 있는 높은 수준의 정량적 데이터를 보여줍니다. 입자 직경/농도의 주요 물리적 특성을 막 및/또는 단백질 존재의 표현형 측정과 동시에 측정하면 입자 분리 내의 하위 집단에 대한 높은 수준의 설명이 가능합니다.
중요하게도, 세 가지 '핵심'EV 관련 테트라 스파닌 인 CD9, CD63, CD81의 다양한 수준이이 두 EV 샘플에서 확인되었습니다. CD9는 C2C12 유래 EV 및 SW620 모두에 대해 EV의 가장 큰 비율로 제시되었으며, CD81 및 CD63은 각각 두 번째 및 가장 적게 제시된 단백질입니다.
2개의 매우 상이한 세포 공급원으로부터의 EV의 테트라스파닌 프로파일에서 여기에서 관찰된 일부 유사성에도 불구하고, CD9, CD63, 및 CD81의 수준은 세포주와 환자 유래 EV31 사이에서 매우 상이할 수 있다.
두 EV 샘플 간의 CD63 발현의 차이는 특히 'EV-ness'의 주요 식별자에 대한 지속적인 논의와 관련이 있습니다. SW620 EV의 ~8%에서만 CD63의 발현이 일부 사람들에게는 예상치 못한 것일 수 있지만, CD63은 크기 또는 밀도에 의해 분리된 다양한 유형의 EV의 불량한 식별자로 제안되었습니다.32, 테트라스파닌 음성 EV는 엑소좀과 유사하게 설명되는 경우에도 확인되었습니다.33.
복잡한 입자 분리 내에서 EV 식별
세포주와 환자 유래 EV 모두에서 EV 테트라스파닌 프로파일의 이질성은 EV의 테트라스파닌 기반 캡처에 대한 의존에 대해 경고하고 새로운 EV 식별 방법에 대한 미래의 필요성을 강조합니다31. 특정 단백질과 무관한 EV 라벨링은 EV 특이성이 매우 높은 것으로 입증될 수 있다면 유사한 크기의 비 EV 입자에서 EV를 식별하는 데 매우 유용할 수 있습니다. 이것은 인간 혈장 내 EV의 농도가 10 10 입자 / mL의 범위에 있고 지단백질은 mL 14,34 당10 16에서 측정된다는 것이 제안되었으므로 생체 유체 EV 분리 물의 경우 특히 그렇습니다. EV 농축 시에도 테트라스파닌 마커 및/또는 LDL 마커 ApoB에 대한 입자 양성을 비교한 연구는 EV50에 비해 혈소판 없는 혈장(PFP) 샘플에서 LDL이 ~100-35배 더 많다는 것을 시사합니다.
사용된 분리 기술은 초저밀도 지단백질(VLDL), 중간 밀도 지단백질(IDL) 및 LDL36과 같은 공동 분리된 비 EV 입자의 범위에 큰 영향을 미칩니다. 또한 잠재적으로 중요한 생물학적 역할을 수행하면서도 EV 순수 샘플을 달성하는 것을 어려운 목표로 만드는 EV에 결합된 지단백질 공동 분리물에 대한 설명도 있습니다35.
따라서 순수하지만 제한된 EV 선택의 분리를 달성하기보다는 샘플을 구성하는 입자의 설명에 더 중점을 두어야한다고 주장 할 수 있습니다. 벌크 및 입자 수를 개별적으로 측정하여 입자에 대한 포괄적 인 설명을 달성하는 것은 특히 생체 유체 소스36,37에서 EV 농도를 정확하게 결정하기에 불충분 할 수 있습니다. 이 실험에서 입증 된 바와 같이 특정 단백질을 나타내는 총 입자, EV 및 EV를 보여주는 계층 기반 접근 방식으로 하위 집단을 식별하면 나노 입자 특성화에 대한 강력한 솔루션을 제공 할 수 있습니다. 이것은 미래의 치료 애플리케이션20을 위한 설계와 미토콘드리아38과 같은 내강 화물이 있는 CD63+ EV의 식별을 포함하는 EV 로딩과 관련된 프로젝트의 경우였습니다.
EV 분석 레퍼토리 내의 nFCM
nFCM EV 분석의 강점은 데이터가 가장 일반적인 EV 분석을 확증하고 구축하고 물리적 데이터 세트와 표현형 데이터 세트 간의 다리를 형성하는 방법입니다. 그러나 이는 염료 및 항체와 같은 고유한 라벨링 시약에 최적화해야 하는 정확한 라벨링 프로토콜을 기반으로 합니다. 정확한 분석을 위한 핵심 기준은 라벨링된 입자를 비형광 완충액에 현탁시키는 것인데, 이는 과도한 결합되지 않은 형광단의 제거 또는 에피토프 포화도를 초과하지 않도록 프로토콜의 개선에 의존합니다.
비교 연구에 따르면 EV의 nFCM 크기 조정은 EV 크기 분석에서 NTA보다 더 정확한 것으로 설명되는 기술인 TRPS 및 cryo-TEM에 따라 데이터를 제공합니다10,39. 그러나 모든 광학 기반 방법과 마찬가지로 EV에 대해 나타나는 이종 광학 특성의 영향과 기준 물질과 EV의 광학 특성 간의 차이를 데이터10을 해석 할 때 인정해야합니다.
웨스턴 블로팅은 EV 마커(40)의 식별을 통해 EV 농축을 나타내는 핵심 방법이었다. 그러나 입자에 이러한 마커의 존재를 입증하려는 욕구는 EV 기반 유세포 분석17의 발전을 주도했습니다. 그러나, 강력한 데이터를 제공하기 위해 필요한 분해능은 현재 산란광 및 형광광(19) 모두에 관한 전용 계측을 통해 가장 잘 달성된다.
nFCM은 측면 산란 측정을 사용하여 특정 마커와 관련이 없는 모든 입자를 초기에 설명하는 편향되지 않은 접근 방식을 제공하여 NTA, RPS 및 TEM1의 가장 일반적인 기술로 확증을 허용하는 동시에 정량적 방식으로 WB 또는 Elisa와 유사한 표현형 측정을 추가합니다.
Disclosures
A.L., B.P., D.A., R.L, R.T는 NanoFCM의 직원이며 이 논문에 대한 기여는 고용의 일환으로 이루어졌습니다.
Acknowledgments
자료와 전문 지식을 계속 제공해 주신 Owen Davies와 Nick Peake 그룹에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
| APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
| APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
| CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
| Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
| Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
| EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
| EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
| Memglow - Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
| NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
| PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
| Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |
References
- Couch, Y., et al. A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144 (2021).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Grant, L. R., Milic, I., Devitt, A. Apoptotic cell-derived extracellular vesicles: structure-function relationships. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 509-516 (2019).
- Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2, 325 (2019).
- Sahoo, S., et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases. Circulation. 143 (14), 1426-1449 (2021).
- Chiang, C. -Y., Chen, C. Toward characterizing extracellular vesicles at a single-particle level. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 9 (2019).
- Karimi, N., et al. Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLOS ONE. 11 (2), 0149866 (2016).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Vogel, R., et al. Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12052 (2021).
- Van Der Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
- Hartjes, T. A., Mytnyk, S., Jenster, G. W., Van Steijn, V., Van Royen, M. E. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracellular Vesicles and Circulating Nucleic Acids. 2, 80-103 (2021).
- Johnsen, K. B., Gudbergsson, J. M., Andresen, T. L., Simonsen, J. B. What is the blood concentration of extracellular vesicles? Implications for the use of extracellular vesicles as blood-borne biomarkers of cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1871 (1), 109-116 (2019).
- Zhu, S., et al. Light-scattering detection below the level of single fluorescent molecules for high-resolution characterization of functional nanoparticles. ACS Nano. 8 (10), 10998-11006 (2014).
- Van Der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
- Lucchetti, D., et al. Measuring extracellular vesicles by conventional flow cytometry: dream or reality. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6257 (2020).
- Suárez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Tian, Y., et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry. ACS Nano. 12 (1), 671-680 (2018).
- Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (10), 12130 (2021).
- Dragovic, R. A., Southcombe, J. H., Tannetta, D. S., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Multicolor flow cytometry and nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles in the plasma of normal pregnant and pre-eclamptic women. Biology of Reproduction. 89 (6), 151 (2013).
- Teng, F., Fussenegger, M. Shedding light on extracellular vesicle biogenesis and bioengineering. Advanced Science. 8 (1), 2003505 (2021).
- Laulagnier, K., et al. Mast cell- and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochemical Journal. 380, 161-171 (2004).
- Simonsen, J. B. Pitfalls associated with lipophilic fluorophore staining of extracellular vesicles for uptake studies. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1582237 (2019).
- Collot, M., et al. MemBright: A family of fluorescent membrane probes for advanced cellular imaging and neuroscience. Cell Chemical Biology. 26 (4), 600-614 (2019).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Tian, Y., et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1697028 (2020).
- Mondal, A., Ashiq, K. A., Phulpagar, P., Singh, D. K., Shiras, A. Effective visualization and easy tracking of extracellular vesicles in glioma cells. Biological Procedures Online. 21, 4 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Jayachandran, M., Miller, V. M., Heit, J. A., Owen, W. G. Methodology for isolation, identification and characterization of microvesicles in peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 375 (1-2), 207-214 (2012).
- Mizenko, R. R., et al. Tetraspanins are unevenly distributed across single extracellular vesicles and bias sensitivity to multiplexed cancer biomarkers. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 250 (2021).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Laulagnier, K., et al. Amyloid precursor protein products concentrate in a subset of exosomes specifically endocytosed by neurons. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (4), 757-773 (2018).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Scientific Reports. 6, 24316 (2016).
- Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Scientific Reports. 10 (1), 103 (2020).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. -A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Peruzzotti-Jametti, L., et al. Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles. PLOS Biology. 19 (4), 3001166 (2021).
- Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
