Summary
Här presenterar vi ett protokoll för isolering av BMM från SD-råttor, kallad sekundär vidhäftningsmetod.
Abstract
Med en minskning av benmineraltätheten är ben mer benägna att spricka, vilket påverkar patientens livskvalitet negativt. Tillväxten och utvecklingen av ben regleras huvudsakligen av osteoblaster och osteoklaster. Det har varit allmänt accepterat att osteoklaster härrör från benmärgsmonocyt-makrofagceller (BMM). BMM och andra hematopoetiska stamceller finns i benmärgshålan. Därför är det en enorm utmaning att isolera enstaka stabila BMM från olika och heterogena cellpopulationer. Här presenterar vi ett protokoll för isolering av BMM från SD-råttor, kallad sekundär vidhäftningsmetod. Vidhäftande celler odlade i 24-48 h i primärkulturen samlades in. Flödescytometrisk analys visade att cirka 37,94% av cellerna var CD11b / c + (monocyt-makrofagytantigen). Tartratresistent syrafosfatas (TRAP) färgning och western blot analys visade att BMM kunde differentiera till osteoklaster in vitro. Ovanstående resultat föreslog att de sekundära följsamhetscellerna kunde betraktas som en lämplig cellulär modell för osteoklastdifferentieringsforskning.
Introduction
Det har rapporterats att monocyt-makrofag-härstamningsceller som finns i benmärgen kan differentiera till blodmonocyter och vävnadsmakrofager 1,2. Ovanstående celler, som kan differentieras till osteoklaster för att balansera bentillväxt och utveckling, används ofta som en cellmodell för att inducera osteoklaster in vivo 3,4. Benmärg är en speciell vävnad som innehåller flera olika typer av celler, som inkluderar men inte bara är begränsade till benmärgsmesenkymala stamceller, benmärgsmonocyt-makrofagceller (BMM), hematopoetiska stamceller, endotelceller och immunceller. Faktum är att flera tidigare studier föreslog att vidhäftande celler som rusade ut ur benmärgshålan i det långa benet kunde differentieras till osteoblaster, osteoklaster, kondrocyter eller adipocyter 5,6,7,8. Även om olika isolerings- och odlingsmetoder har använts för att producera olika homogena cellpopulationer, finns det fortfarande stora utmaningar med att isolera och odla BMM från en mängd olika celltyper.
Flera metoder har utvecklats för att extrahera benmärgsmononukleära makrofager (BMSC). Majoriteten av dessa metoder är dock komplexa 9,10,11. Till exempel kräver densitetsgradientcentrifugering ett specialiserat kit och operationen är tidskrävande och besvärlig. Denna metod är lämplig för isolering av BMM från blodprover med hög volym, men inte från benmärgsprover 9,12,13. Dessutom är extraktion av vävnadsprover med användning av kollagenasuppslutning ett komplext och tidskrävande förfarande; Denna metod rekommenderas inte för isolering av BMM från benmärgsprover14,15. Dessutom, även om flödesseparation kan resultera i högrenade monocyt- / makrofagpopulationer, kräver det mycket stora provstorlekar och höga instrument- och utrustningskrav10,16. Dessutom är mikroberikningsmetoden extremt dyr och är inte genomförbar i ett allmänt laboratorium17.
Därför föreslogs i den aktuella studien en bekväm, snabb och billig metod för isolering av mononukleära makrofager från benmärgen. Benmärgsceller vidhäftade under olika tidpunkter användes för att isolera BMM med hjälp av en sekundär vidhäftningsmetod. BMM extraherade med ovanstående metod kan inducera bildandet av osteoklaster in vitro, vilket ger en enkel och bekväm cellmodell för framtida studier av osteoporos in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment i denna studie genomfördes i enlighet med riktlinjerna för djurförsök från Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center (godkännande nr: IACUC-20181029-11).
1. Cell extraktion
- Lägg Sprague-Dawley-råttorna (SD-råttor, 1-10 dagar gamla, hane eller hona) i eutanasiburarna fyllda med CO2 med en balanserad hastighet på 30%-70% behållarvolym/minut. Efter att råttorna förlorat medvetandet (20-60 min), avliva råttan genom cervikal förskjutning för att säkerställa en smärtfri död.
- Sänk ner råttorna i 75% alkohol i 10 min för desinfektion.
- Ta försiktigt bort alla råttans lemmar med sax och pincett, aspirera med PBS med en pipett och spola blodet som fäster vid lemmarna.
- Tillsätt 5 ml penicillin/streptomycinlösning till 500 ml DMEM och blanda väl. Ta ett 50 ml sterilt centrifugrör, tillsätt 5 ml FBS och 45 ml DMEM-medium och blanda noggrant för att erhålla en 10% FBS DMEM innehållande 1% penicillin / streptomycinlösning. Tillsätt 2 ml av ovanstående odlingsmedium i ett 5 ml rör.
- Överför benbenen till 5 ml röret. Använd sax för att skära benbenen i röret i små bitar (1-3 mm) och blanda homogenatet för att åter suspendera benmärgscellerna i odlingsmediet. Stå i 5 minuter tills vävnadsfragmenten lagt sig i botten av röret.
- Tillsätt 10 ml 10% FBS DMEM i en 100 mm kulturskål och överför sedan supernatanten till odlingsskålen. När du aspirerar supernatanten, undvik att överföra vävnadsskräpet till odlingsskålen.
- Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 i cirka 24 timmar. Efter denna inkubationstid kommer majoriteten av mesenkymala stamceller att fästa vid odlingsskålväggen och växa långsamt, medan de flesta BMM fortfarande kommer att suspenderas i odlingsmediet.
- Överför cellsuspensionen i 100 mm odlingsskålen till en ny25 cm 2-kolv och fortsätt att odla cellerna vid 37 °C och 5 %CO2 i ytterligare 24 timmar. Ta försiktigt bort det gamla mediet och byt ut det med ett nytt medium efter att BMM har fästs på kolvväggen.
- Subkultur när cellerna i kolven nådde 80%-90% sammanflöde.
OBS: Alla celler odlades vid 37 °C och 5% CO2. Under odlingen förenades cellmorfologin gradvis. Cellerna var stora, oregelbundet formade, radiellt växande och fästa vid kolven i en form av skiva, där flera kärnor kunde observeras.
2. FACS-färgning av cellen
- Trypsin smälter med 1-2 ml kommersiellt trypsin vid 37 °C och 5% CO2 i 5 min och räknar sekundära vidhäftande celler för att säkerställa ett slutligt cellantal på 100 000/prov (räkna celler med Neubauer-hemocytometer).
- Dela cellerna i tre grupper (500 μL PBS innehåller 100 000 celler): (1) den tomma kontrollgruppen som innehåller oskadade celler; 2) Isotypkontrollgruppen. och (3) experimentgruppen (CD11b/c-färgning).
- Inkubera primära antikroppar (ingen antikropp för blankkontrollgruppen; anti-CD11 isotypkontroll för isotypkontrollgruppen, 0,6 μl antikropp/prov, 1 μg/prov; anti-CD11b/c för experimentgruppen, 1 μL antikropp/prov, 1 μg/prov) på is i 30 minuter.
- Centrifugera vid 300-350 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera cellerna med 500 μL PBS. Upprepa ovanstående procedur en gång för att säkerställa att de obundna primära antikropparna tvättas bort.
- Inkubera motsvarande sekundära antikropp (ingen antikropp för blindkontrollgruppen; get-anti-kanin IgG för isotypkontrollen och experimentgrupperna, 0,25 μL antikropp/prov, 1:2 000) på is i mörker i 30 minuter.
- Centrifugera vid 300-350 x g i 5 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera cellerna med 500 μL PBS. Upprepa ovanstående procedur en gång för att säkerställa att de obundna andra antikropparna tvättas bort.
- Detektera cd11b/c-positiva celler med flödescytometri (10 000 celler/prov) och analysera data med programvara (t.ex. FlowJo 7.5).
OBS: För att erhålla den slutliga procentandelen CD11b / c + -celler användes följande formel: Procentandel av CD11b / c + -celler i experimentgruppen - procentandelen CD11 + -celler i isotypkontrollgruppen.
3. Wright-Giemsa färgning
- Frö de vidhäftande sekundära cellerna som har passerat tre gånger på 35 mm2-cells klätterplattor (1 × 106 celler/brunn) och odla vid 37 °C och 5%CO2 i 24 timmar.
- Kassera odlingsmediet och tvätta tre gånger med PBS.
- Tillsätt Wright-Giemsa färglösning (0,5 ml-0,8 ml) till cellklättringsarket i 1 min.
- Blanda färgämnet med destillerat vatten (0,5 ml-0,8 ml) med en bomullspinne och stå i 10 minuter.
- Tvätta färglösningen med destillerat vatten och torka sedan i 1-3 minuter. Observera under ett mikroskop.
4. TRAP färgning
- Frö de vidhäftande sekundära cellerna som har passerat tre gånger på 35 mm2-cells klätterplattor (1 × 106 celler/brunn) och odla vid 37 °C och 5%CO2 i 24 timmar.
- Ersätt det gamla mediet med 10% FBS DMEM eller osteoklastinduktionsmedium kompletterat med 50 ng / ml receptoraktivator av kärnfaktor-κB-ligand (RANKL) och 30 ng / ml makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och odling vid 37 ° C och 5% CO2 i ytterligare 7 dagar.
- Färga cellerna med TRAP-färgningssatsen enligt tillverkarens protokoll och observera under ett mikroskop.
OBS: TRAP-positiva celler definierades som osteoklaster, som var lila under ett ljusmikroskop. Antalet TRAP-positiva celler mättes med hjälp av ImageJ-programvaran.
5. Västra fläcken
- Frö de vidhäftande sekundära cellerna som har passerats tre gånger på 35 mm2-cells klätterark (1 × 106 celler / brunn) och kultur i 24 timmar.
- Byt ut det gamla mediet mot färskt 10% FBS DMEM eller osteoklastinduktionsmedium (50 ng/ml RANKL och 30 ng/ml M-CSF) och odla i ytterligare 7 dagar vid 37 °C och 5 % CO2.
- Extrahera totala cellulära proteiner med RIPA-buffert, separerade med 10% SDS-PAGE, och överför till polyvinylidenfluoridmembran18,19.
- Blockera med 5% skimmilkpulver (25 ml) i 2 timmar och tvätta tre gånger, i 10 minuter varje gång, med TBS-Tween 20 (TBST).
- Inkubera primära antikroppar vid 4 °C över natten (anti-β-aktin, anti-TRAP och anti-cathepsin K; alla primära antikroppar späddes 1:1 000, 10 ml utspädd antikropp/band) och tvättades tre gånger med TBST.
- Inkubera den sekundära antikroppen (get-antikanin IgG, 1:2 000 utspädning, 10 ml utspädd antikropp/band) vid rumstemperatur i 2 timmar och tvätta tre gånger med TBST. Visualisera proteinbanden med hjälp av en utvecklande lösning.
OBS: Uttrycksnivåerna för ovanstående proteiner normaliserades till β-aktin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den sekundära vidhäftande cellpopulationen var stabil och enhetlig. Med den kontinuerliga cellproliferationen blev majoriteten av cellerna större, med oregelbunden form och växte till en radiell vidhäftande skiva (figur 2C, D). Flödescytometri visade att andelen celler som uttrycker CD11b / c, en molekylär markör på ytan av monocyt-makrofaglinjeceller, var cirka 37,94% (figur 2A, B). För att ytterligare verifiera att de CD11b/c-positiva cellerna var monocyt-makrofag-härstamningsceller inducerades differentieringen av sekundära vidhäftande celler till osteoklaster efter cellbehandling med RANKL och M-CSF. TRAP-färgningsresultaten visade att jämfört med kontrollgruppen ökade antalet intracellulära lila-röda granuler signifikant i celler inducerade med RANKL och M-CSF (figur 2E,F). Vidare ökade uttrycksnivåerna för de osteoklastspecifika proteinerna TRAP och cathepsin K signifikant (figur 2G,H).
Figur 1: Flödesschema för den sekundära vidhäftande cellutvinningsmetoden.
Figur 2: (A-B) Efter tre generationer av stabil odling av sekundära vidhäftande celler detekterades CD11b / c-positiva celler med flödescytometri. (C-D) Morfologin hos sekundära vidhäftande celler efter tre generationer visas (C för vitt ljus, D för Wright-Giemsa-färgning). (E-F) TRAP-färgning användes för att detektera effekten av RANKL och M-CSF på osteoklastbildning (E för kontroll; F för RANKL och M-CSF). (G-H) Cellerna behandlades med RANKL och M-CSF i 7 dagar och uttrycksnivåerna för TRAP och cathepsin K bestämdes genom western blot-analys. Data uttrycks som medelvärdet ± SD för tre oberoende experiment. P < 0,001 jämfört med kontrollgruppen. TRAP, tartratresistent syrafosfatas; RANKL, receptoraktivator för kärnfaktor-κB-ligand; M-CSF, makrofagkolonistimulerande faktor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Metod för att extrahera makrofager Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Osteoklaster är en av de viktigaste celltyperna som är involverade i förekomst och utveckling av bensjukdomar, liksom ett av de primära föremålen för bensjukdomsforskning20. Monocyt/makrofager kan differentieras till osteoklaster. Eftersom mononukleära makrofager (RAW264.7-celler) är för dyra att köpa och lätt aktiveras under odling är det svårt att utföra in vitro-differentieringsexperiment med denna cellinje. Även om flera metoder har utvecklats för att extrahera monocyter/makrofager från benmärgen, inklusive densitetsgradientcentrifugering, kollagenasuppslutning, mikrosfäranrikning och flödescytometri (tabell 1), är dessa metoder tidskrävande, medan de kräver höga provvolymer och kostsam utrustning. Därför syftade den aktuella studien till att föreslå en enkel och snabb metod för att extrahera monocytec/makrofager från benmärgsprover.
Det finns många cellpopulationer i benmärgen, inklusive BMSC, endotelceller och immunceller förutom BMM. Som vi alla vet att BMSC kan differentieras till osteoblaster, och denna process kommer att påverka differentieringen av BMM till osteoklaster21. Enhetliga och stabila BMM är viktiga faktorer för att inducera osteoklastdifferentiering in vitro, så det är särskilt viktigt att överväga dessa begränsande faktorer när man isolerar och extraherar BMM. Samtidigt kommer BMM: s förmåga att differentiera till osteoklaster också att försvagas under den kontinuerliga passagen. Därför är det utmanande att isolera BMM från benmärgen och framgångsrikt inducera dem till osteoklaster.
Vi fann att det finns skillnader i vidhäftningstiden för vidhäftande celler i benmärgen. Mer specifikt följde BMSC: er i princip kulturskålväggen under 0-24 timmars kultur, medan BMM börjar fästa vid kulturskålväggen efter 24 timmar. Baserat på ovanstående fynd valdes den sekundära följsamhetsmetoden för att isolera BMM. Sugande SD-råttor (ålder, 1-10 dagar gamla) valdes för att extrahera BMM, eftersom BMM hos unga råttor uppvisar en starkare differentieringsförmåga. Benmärgscellerna hos SD-råttor samlades in, och efter odling i 24 timmar överfördes cellsuspensionen och odlades i ytterligare 24 timmar. De uppsamlade sekundära vidhäftande cellerna innehöll ett stort antal BMM. Efter odling renades de sekundära vidhäftande cellerna gradvis och blev stabila och enhetliga. Flödescytometriresultaten visade att andelen CD11b / c-positiva celler nådde cirka 37,94%. Dessutom visade TRAP-färgning och western blot-analys att de extraherade BMM: erna kunde differentieras till osteoklaster. Detta resultat överensstämde med en tidigare studie som också tyder på att BMM som extraherats med den sekundära vidhäftningsmetoden framgångsrikt kunde differentieras till osteoklaster22.
Den sekundära vidhäftningsmetoden kan användas för att enkelt och snabbt extrahera mononukleära makrofager från benmärgen utan att kräva högteknologisk laboratorieutrustning. Samtidigt är denna metod lämplig för att isolera celler från ett litet benmärgsprov, vilket övervinner de besvärliga och tidskrävande svårigheterna som observerats i de tidigare metoderna som vanligtvis används för att extrahera mononukleära makrofager. Sammantaget kan BMM extraherade med den sekundära vidhäftningsmetoden framgångsrikt differentieras till osteoklaster in vitro, vilket ger en stabil cellmodell för in vitro-studier av osteoklaster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (bidrag nr. LY19H060001) och Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (nr 2022ZB093).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm2 cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Anti-cathepsin K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| Anti-CD11 isotype control | Abcam | ab172730 | 1 μg/test,1.675 mg/Ml |
| Anti-CD11b/c | Absin | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| Anti-β-actin | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| Cell climbing slices | NEST Biotechnology | 80102 | |
| Cell culture dish | corning | 430167 | |
| Cell culture flask | corning | 430168 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141C | |
| Goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab150077 | for IF, 1:2,000 |
| goat anti-rabbit IgG | Abcam | ab6721 | for WB, 1:2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD rat | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd | 1-10 days old | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Solarbio | P1200 | |
| TRAP/ALP Staining Kit | Wako | 294-67001 | |
| Trypsin-EDTA solution | Biosharp | BL512A | |
| Wright-Giemsa solution | Keygen Biotech | KGA225-1 |
References
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L.
- Ono, T., Nakashima, T.
- Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
- Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
- Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
- Horowitz, M. C., et al.
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750 (2018).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
- Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
- Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
- Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
- Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657 (2020).
- Gallagher, S., Chakavarti, D.
- Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550 (2019).
- Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
- Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).
