Summary
光学透明度是斑马鱼细胞生物学和生理学工作的主要优势。描述了用于测量个体动物细胞生长的稳健方法，该方法允许对骨骼肌和邻近组织的生长如何与全身生长相结合的新见解。
Abstract
许多方法可用于可视化活体胚胎、幼虫或幼年斑马鱼全身的单个细胞。我们表明，可以在共聚焦激光扫描显微镜中扫描具有荧光标记质膜的活鱼，以确定肌肉组织的体积和存在的肌肉纤维的数量。描述并验证了随时间推移测量活体动物细胞数量和大小的有效方法，并针对更艰巨的分割方法进行了验证。描述了允许控制肌肉电活动的方法，从而控制收缩活动。骨骼肌收缩活动的丧失大大降低了肌肉生长。在幼虫中，描述了一种允许重新引入模式化的电诱发收缩活动的协议。所描述的方法最大限度地减少了个体间变异性的影响，并允许分析电，遗传，药物或环境刺激对生物体背景下的各种细胞和生理生长参数的影响。随后可以对定义的早期生活干预对个体的测量效果进行长期随访。
Introduction
调节的组织生长，包括细胞数量（增生）和/或细胞大小（肥大）的增加，是发育、再生以及生态和进化适应的关键因素。尽管近几十年来在细胞和发育生物学的分子遗传学理解方面取得了巨大进步，但对组织和器官大小调节的机制理解仍处于起步阶段。这种知识空白的一个原因是难以以必要的空间和时间精度量化生物体中的组织生长。
随着时间的推移，可以反复测量整个生物体生长的各个方面，揭示每个个体的生长曲线1，2，3，4，5。日益复杂的扫描方法，如双X射线吸收测定法（DXA），计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），允许跟踪单个个体（包括人类和模式生物）的整个器官和其他身体区域（例如，个体识别的骨骼肌）的生长6，7，8，9，10.然而，这些方法尚不具有揭示单个细胞的分辨率，因此很难辨别细胞行为与组织水平生长之间的联系。为了建立这种联系，传统研究通常依赖于类似个体动物的队列，其中一些在连续的时间点被处死，然后进行细胞学细节分析。这种方法需要平均跨组（最好是相似但可变的）个体观察到的变化，因此缺乏时间和空间分辨率，因此很难在细胞水平上找到暗示因果关系的相关事件。
对无脊椎动物模式生物的研究，最初在秀丽隐杆线虫和D. melanogaster中，通过开发光学显微镜来实现细胞分辨率并准确测量单个个体随时间推移的生长，从而规避了这些问题。这些研究揭示了这些小型模式生物生长过程中惊人的不变细胞谱系行为11，12，13，14，15，16，17。然而，许多动物，包括所有脊椎动物，具有不确定的细胞谱系，并通过神秘的反馈过程控制组织生长，这些反馈过程有助于将基因编码的生长程序转变为功能性三维生物体，其所有组成组织和器官的大小都适当匹配。为了理解这些复杂的生长过程，需要对单个个体的整个组织或器官进行随时间推移的成像，这些组织或器官可以在选择的时间通过遗传，药理学或其他干预措施进行实验操作，并随后分析效果。
每块脊椎动物骨骼肌都有确定的大小、形状和功能，以及与相邻组织（如骨骼、肌腱和神经）的相互作用。有些肌肉很小，就在皮肤下，因此是高分辨率成像研究的良好候选者。与大多数器官类似，每块肌肉在达到稳定的成年大小之前，都会在整个胚胎、出生后和青少年生命中生长。然而，肌肉在成年后也具有改变大小的独特能力，这取决于使用和营养18，这种特性对机体健康，运动表现和独立生活有重大影响。老年肌肉质量和功能的丧失，肌肉减少症，是面临人口老龄化的社会日益关注的问题19，20，21。
我们和其他人专注于斑马鱼幼虫节段重复体内骨骼肌组织块的生长，作为一个包含数百个细胞的明显封闭系统，其中可以观察和操纵组织生长，维持和修复22，23，24，25，26。虽然之前已经报道了一些定量工作25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，但没有详细和经过验证的方法来测量单个脊椎动物生物的细胞细节肌肉生长。这里描述了如何执行这种重复测量的有效协议以及验证，并提供了一个用于分析肥大和增生生长变化以响应改变的电活动的示例。
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Protocol
所描述的所有研究均按照机构指南进行，并根据1986年《动物（科学程序）法》和随后的修改获得英国内政部的适当许可。胚胎/幼虫应在28.5°C下饲养，直到原肠胚形成完成，但随后可以保持在22-31°C以控制发育速度。可以在室温下扫描或刺激鱼。
1.麻醉斑马鱼幼虫
- 将合适的荧光报告成鱼如 Tg（Ola.Actb：Hsa.HRAS-EGFP）vu119Tg 参考文献36或 Tg（α-肌动蛋白：mCherry-CAAX）pc22Tg 参考文献37 并收集如描述38的胚胎。
- 在选择时，例如受精后 2 天 （dpf），使用含三卡因的鱼培养基（鱼水或 E3 培养基）短暂麻醉胚胎，并在荧光显微镜下筛选 EGFP 或 mCherry，例如徕卡 MZ16F。如果一个人有很多胚胎，请选择信号最亮的胚胎。筛选后立即将胚胎恢复到正常鱼培养基。
2. 用于共聚焦扫描的安装鱼
- 打开共聚焦激光扫描系统和激光器，让系统稳定30-60分钟。
注意：在这里，我们使用了蔡司LSM 5激发器显微镜，该显微镜带有配备20x/1.0 W水浸物镜的直立材料支架（可增强工作距离）。 - 制备 1% 低熔点琼脂糖 （LMA） 并保存在 37 °C 加热块中，以便在 1.5 mL 管中重复使用。为避免热休克，请从加热块中取出 LMA 等分试样，让它冷却到略高于设置水平，然后再涂抹到幼虫身上，在皮肤上进行测试以判断适当的温度，就像评估婴儿配方奶粉的温度一样。
- 选择要安装的鱼，并依次用三卡因（鱼培养基中0.6mM）暂时麻醉每条鱼。
- 取一个直径为60毫米的培养皿，该培养皿涂有一层1%琼脂糖，并放置在解剖显微镜的载物台上。
- 用 1 mL 塑料巴斯德移液管将幼虫转移到 60 mm 包被的培养皿上，并尽可能多地去除转移培养基。然后，仍然使用巴斯德移液管，将 5 到 10 滴 LMA 滴在鱼上，并在 LMA 凝固之前用镊子（或火抛光的细玻璃针）快速水平定位。为了获得最佳成像，希望将幼虫放置在靠近LMA的上表面的位置。
- 或者，使用 1 mL 塑料巴斯德移液管，用尽可能少的鱼培养基收集幼虫，并将幼虫转移到冷却的 LMA 等分试样中。让幼虫下沉5秒，完全被LMA包围。然后，取出幼虫并将其在一滴LMA中转移到琼脂糖包被的培养皿上。如上所述快速定位和定位幼虫。
- 将幼虫的前后轴和背腹轴定向在水平线的10°以内（见下文第4.6点的注释“关于错误及其纠正”）。
- 如果幼虫没有正确水平安装在琼脂糖液滴表面附近，请取出并重新嵌入。使用微细 1 mL 塑料巴斯德移液管轻轻抽吸即可轻松取回幼虫，并且可以使用 Kimwipes 轻轻去除 LMA。在安装过程中，实践确实是完美的;花一个下午嵌入一些不重要的幼虫，然后再在真正的实验中尝试。
注意：关于显微镜设计：许多实验室使用倒置共聚焦显微镜通过盖玻片进行成像。我们发现，与使用正置显微镜进行所述程序相比，在盖玻片下反复嵌入和移除琼脂糖中的鱼以在倒置显微镜中观察会导致重复扫描期间样品的损失更大。因此，如果可用，建议使用直立系统。然而，高质量数据的关键是正确选择和使用物镜和扫描参数，这是一个太大的主题，无法在此讨论。
- 如果幼虫没有正确水平安装在琼脂糖液滴表面附近，请取出并重新嵌入。使用微细 1 mL 塑料巴斯德移液管轻轻抽吸即可轻松取回幼虫，并且可以使用 Kimwipes 轻轻去除 LMA。在安装过程中，实践确实是完美的;花一个下午嵌入一些不重要的幼虫，然后再在真正的实验中尝试。
3. 共聚焦扫描
- LMA 凝固后，在培养皿中注入约 10 mL 含有三卡因的鱼培养基。如果计划捕获共聚焦堆栈，请让安装的鱼休息至少 10 分钟，然后再继续扫描，因为会发生一些琼脂糖肿胀。
- 将样品培养皿加载到共聚焦系统的阶段，找到幼虫并聚焦在所需的体细胞上。可以选择 Somite 17，因为它易于定位在肛门通风口附近且易于成像。通过从前部计数体细胞进行检查。
注意：第一个体细胞融合在耳后，没有前缘，但可以很容易地观察到有横纹肌纤维。 - 设置起来好像通过定义顶部（即，就在皮肤上方）和底部（即，就在凹槽下方，以便包括整个体石，即使鱼的安装略微倾斜）来捕获 Z 堆栈。可以根据需要捕获左侧和右侧。这将确保所有快速 YZ 扫描捕获所需的区域。
- 按如下方式捕获 XY 映像。在共聚焦软件允许的情况下，相对于鱼的方向调整扫描区域。将鱼的前后轴平行于成像的 X 轴和背腹轴平行于 Y 轴，体细胞 17 位于场的中心，如 补充文件 1 所示。聚焦在最上部肌切片的中层平面上，其中整个外轴和上轴体细胞的两半以及垂直和水平肌隔膜是可见的，并捕获高分辨率 的XY 图像。请记住命名并保存图像。
- 捕获一个或多个 YZ 图像，如下所示。在代表性结果（下图）中，比较了2层和4层方法的精度。在2层方法中，采用单 XY 和 YZ 扫描。在 4 层方法中，对三次 YZ 扫描进行平均，以更准确地估计肌切片体积。如果共聚焦软件要求，请重新定向扫描区域。
- 在选定的前后位置绘制一条精确的背侧到腹侧线，穿过垂直于鱼的前后轴的所选体细胞。执行 Z 堆栈线扫描。
- 沿所选肌切片在定义的前后位置重复 YZ 线扫描 3 次，以捕获 YZa、YZm 和 YZp。 代表性结果如图2A所示。命名这些图像并将其与相关的 XY 图像一起保存。
注意：在选择YZ平面时：肌切球是V形的，其形状在生长过程中会发生变化。为了使用4层法获得肌切片17体积的最准确评估，将YZa放在肌组的前端，YZp放在肌切开的背侧和腹侧末端的肌切开后端，YZm位于YZa和 YZp之间。 假设体细胞均匀地逐渐变细，每个YZ部分的测量平均值将代表整个肌切片。对于2层法，单次YZ扫描应位于水平肌间隔的后端，大致对应于感兴趣的肌切开的前后中心（例如YZm）。或者，可以在水平肌间隔的前部、中部和后部进行一组三个 YZ 切片，但如下图所示，这种测量将略微高估或低估肌切开体积（分别对于喙部和尾部体，由于肌切骨逐渐变细）。从根本上说，鱼和实验之间YZ切片平面定位的一致性是可重复性的关键。
4. 分析
- 由于肌切片沿鱼的大小以分级方式变化，因此在比较研究中始终使用相同的体细胞。
- 要测量和计算肌切片体积，请使用共聚焦软件（例如使用蔡司ZEN显微镜软件创建的.lsm文件）或开源通用图像分析软件，例如Fiji / ImageJ。
注意：如果更改文件格式，请确保正确传输 Z 步长，因为并非所有软件都可以正确读取专有共聚焦文件格式。例如，要将 ZEN 线扫描图像导入斐济，请先使用“文件/导出”命令在“全分辨率图像”窗口中导出为.tif - 单平面格式，然后导入到斐济。虽然YZ scan.lsm可以直接在斐济打开，但由于对Z步长的评估不正确，生成的YZ图像通常会在Z维度上压缩。 - 使用禅进行分析
- 首先，在 ZEN 中打开 XY scan.lsm 文件。转到 图形 选项卡，然后选择线工具。在横跨整个肌切片长度（平行于鱼的前后轴）的体状体 17 的两个垂直肌收缩之间画一条线。选中 M 框以显示测量值（长度 = 89.71 μm，请参阅 补充文件 2）。
- 打开 YZ scan.lsm 文件。在 图形 选项卡下，选择 闭合贝塞尔 工具。画在肌组的周边。完成后，选中M框，这将显示测量值（面积= 11980.01μm2，参见 补充文件3）。
- 在电子表格中手动记录每个测量值。根据需要平均 CSA 测量值。肌切片的体积可以计算为体积=肌切片长度x CSA，即89.71μm x 11980.01μm2 = 1.075 x 106μm 3。
- 使用斐济/图像J进行分析
- 在 Fiji/ImageJ 中打开 XY scan.lsm 文件。检查在斐济直接打开的 XY 图像是否按比例进行了正确校准。
- 从图标中选择 直线 工具。如步骤4.3.1中所述，沿体体17的长度绘制一条线。通过转到 分析来设置测量参数，然后选择设置 测量...，并选中 以下框区域 和 显示标签。要测量，只需按热键 M，或转到 分析 菜单并选择 测量。生成的弹出窗口列出了所有测量值（即长度= 90.023 μm;参见 补充文件4）。结果可以保存为.csv，并在Microsoft Excel或类似文件中打开以进行后续分析。
- 要测量 YZ 图像上的 CSA，请按照步骤 4.2 中所述.tif格式打开 YZ 图像。
- 校准 YZ .tif图像，因为它们在导出时未校准。校准参数可以在ZEN中通过转到所选 图像的信息获得 ：记录缩放X（0.489μm）和 缩放 Z值（0.890μm;请参阅 补充文件5）。接下来，当图像在斐济打开时，转到 图像 并选择 属性...。输入 0.489 μm 作为 像素宽度 和 像素高度，输入 0.890 μm 作为 体素深度。 选中 全局 框以在预期重复测量 YZ 图像时普遍应用校准（请参阅 补充文件6）。
注意：确保使用相同的扫描参数捕获所有 YZ 图像;重新启动斐济/ImageJ，如果需要一组新的校准，请修改校准值。 - 要测量校准 YZ 图像的 CSA，请从图标中选择 面选择 工具。在体石的周长周围绘制，然后按 M 以显示测量值（面积= 11980.395μm2;参见 补充文件7）。肌切片的体积可以计算为体积=肌切片长度x CSA，即90.023μm x 11980.395μm2 = 1.079 x 106μm 3。
- 对其他XY和YZ图像重复测量。建议对实验系列中的所有测量使用相同的软件，以保持一致性。由于绘图工具不同，每个软件的体积估计值相似但不完全相同，即 ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 和 Fiji/ImageJ = 1.079 × 106 μm3。肌切片在两个时间点（即 3 至 4 dpf）之间的生长可以计算为：（第 4 卷 dpf - 第 3 卷 dpf）/第 3 卷 dpf × 100%。
注：出错时及其更正。在安装过程中，鱼的方向应使其矢状面（即前后轴和背腹轴）尽可能靠近水平，以避免分别偏航和滚动。这是因为如果鱼由于倾斜的前后安装而显示偏航（绕背腹轴旋转），则从 XY 扫描测量的肌切肌长度L和 从YZ 扫描测量的CSA都会被高估。安装过程中的俯仰和滚动都不应影响扫描后的测量，如第3节所述。然而，背腹旋转（滚动）会降低图像质量。简单的三角函数表明，高达10°的偏航角将在体积测量中产生3%的误差，因为测量的L和CSA都与（cosq）-1成比例增加，其中q是远离前后水平（偏航）的角度。15° 和 20° 关闭将分别高估 7% 和 13% 的体积。
由于凹槽是圆柱形的，因此在 YZ 扫描中包含整个凹槽可用于根据长轴和短轴的方向和大小计算倾斜的角度和范围，从而校正测量的L和CSA，以最大限度地提高精度。校正的 CSA = 测量的 CSA x 诺托弦短轴/诺托弦长轴。校正 L = 在显微镜 Z 方向上测量的 L x 诺托弦短轴/诺托弦轴。
进一步的考虑允许对L进行进一步更正。随着肌切开的生长，它在冠状平面（垂直于背腹轴）中倾斜，使得内侧肌切开略微位于外侧肌组的前面。从背部看，左右两侧的垂直肌败感形成一个指向前方的宽人字形。如果偏航低，则这种形态不会影响L的测量。但是，如果偏航显著，三角校正变得具有挑战性，更好的方法是通过估计前后垂直肌隔与水平肌间隔处的脊索相交的两个点的XYZ坐标来直接测量真L。简单的三角函数允许从这些坐标计算真 L 为 L = SQRT[（X 2 - X 1）2 + （Y 2 - Y 1）2 + （Z 2 - Z 1）2]。最后一种方法的缺点是 a） 点的选择可能因操作员而异，b） 不保留所选点的视觉记录。此考虑不会影响 CSA 更正。
5.可选方法：去除并重新引入肌肉电活动
- 创建一个刺激室。
- 取一个6 x 35 mm的孔板，使用狭窄的烙铁在每个孔的每一侧（见图1）上创建两个小开口（直径<5 mm，相距1 cm）。
注意：小心处理热烙铁，如果需要，请在通风橱中工作，以避免吸入蒸汽。 - 将一对银线或铂线（~20厘米长）穿过每个孔的开口（见图1）。可重复使用的粘合剂材料（例如 BluTack）可以涂在开口附近，以保持电线就位，并确保电线之间的距离为 1 厘米（见图 1）。
- 取一个6 x 35 mm的孔板，使用狭窄的烙铁在每个孔的每一侧（见图1）上创建两个小开口（直径<5 mm，相距1 cm）。
- 在 3 dpf 下，将鱼分成三种条件：鱼培养基对照、非活动和非活动 + 刺激。
- 对于非活性和非活性+刺激组，在受精后 72 小时 （hpf） 用三卡因 （0.6 mM） 麻醉幼虫。
注意：按照参考文献38，将三卡因原液的冷冻等分试样解冻并稀释（40μL/mL鱼培养基，终浓度为0.6mM），然后再添加到鱼中。不要将三卡因直接添加到含有鱼的水中，因为有些鱼可能会接受高剂量。三卡因原液应在一个月内使用，切勿重新冷冻。 - 对于鱼培养基控制鱼，让它们不麻醉。
- 对于非活性和非活性+刺激组，在受精后 72 小时 （hpf） 用三卡因 （0.6 mM） 麻醉幼虫。
- 在三卡因暴露开始后的选定时间（即，在 80 hpf 下），准备 Inactive + Stim 组进行刺激。
- 准备60 mL 2%琼脂糖（1.2 g琼脂糖粉在60 mL鱼培养基中），并使用微波充分融化，冷却，加入三卡因并将4 mL倒入刺激室的每个孔中（图1）。
- 立即在电极之间添加定制的4孔梳（通过切割出所需尺寸的塑料（例如聚丙烯）并使用强力胶粘在一起而创建;见 图1）。等待10分钟凝胶凝固。小心地取下梳子以创建四个矩形孔。
- 用三卡因水填充每个孔，并使用微量移液器在每个孔中放置单个麻醉的Inactive + Stim幼虫，其前后轴垂直于电极（见 图1）。
- 在解剖荧光显微镜下检查每条鱼是否在腔室的每个孔内完全麻醉。
- 使用连接到腔室一侧每个电极的鳄鱼夹，通过极性控制器 将 可调节的电生理模式产生刺激器连接到腔室（见 图 1）。
注意：极性控制器用于每5秒反转一次极性，以防止电极电解和腐蚀。 - 刺激鱼。例如，1s具有200个200 V脉冲的序列，脉冲持续时间为0.5 ms，脉冲间隔为4.5 ms，每5 s一次，可提供有效的重复破伤风收缩抵抗方案。
- 定期在显微镜下检查，确认鱼受到刺激;示例电刺激应每 5 秒一次诱导可见的双侧收缩和轻微运动。
- 对于阻力/高力状态，以高频率刺激鱼 5 分钟，三次，每次间隔 5 分钟休息。
注意：当腔室一侧的鱼休息时，鳄鱼夹可以连接到腔室另一侧的电极对，并刺激那些额外的鱼。 - 刺激后，用塑料移液管轻轻冲洗鱼，小心地从每个孔中取出鱼，然后在新鲜的含三卡因的鱼培养基中返回培养箱。
- 倒掉腔室内的三卡因水，用镊子切开并从每个孔中取出琼脂糖。用自来水冲洗井并晾干。
注意：如果使用银线电极，刺激实验后偶尔氧化银可能会积聚在线的表面上。由于氧化银的导电性低于银，为了保持重现性，在重新使用设置之前，请使用 Kimwipes 小心地将氧化银从电线上擦掉。
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Representative Results
快速精确地测量体细胞体积
描述了一种样品制备、数据采集和体积分析的方法，该方法可以快速测量斑马鱼幼虫的肌肉生长。可以在活体动物中使用用膜靶向GFP（β-actin：HRAS-EGFP） 或mCherry（α-actin：mCherry-CAAX ）标记在其质膜上的鱼来测量肌肉大小。使用三卡因暂时麻醉幼虫，安装在低熔点琼脂糖中，并使用共聚焦荧光显微镜成像。选择Somite 17来分析肌肉大小，因为它在躯干 - 尾部界面31处的可访问性。在实践中，与理论上一样，肌切片体积可以计算为肌切片长度（L）和三个横截面积测量值（CSA）的平均值的乘积（图2A，称为4层法）。
为了验证该方法，获得了活斑马鱼幼虫的整个肌切片共聚焦Z堆栈（图2B），并通过将每个切片（80-100个切片）中体细胞17个剖面区域的总和乘以切片间距离（1-1.2μm）来计算体细胞体积。观察到 4 切片和全栈计算方法之间存在很强的相关性（图 2C）。然而，4层方法通常给出的体积估计略大（平均大~2%）（图2D）。这种差异可能是由于a）给出错误大体积测量的样品的倾斜度或b）观察到斑马鱼肌组沿前后轴逐渐变细，朝向动物尾巴较小。由于 YZa、YZm 和 YZp CSA 测量值朝向体细胞 17 肌多孔 V 形的前部（图 2A），因此通过对体细胞 16 和 18 的肌组进行体积分析来测试后一种解释。 每个体细胞比后面的体体大约7%（图2E）。进一步的分析表明，只需要一次YZ测量的2层方法，位于体细胞的中间，外轴和半轴两半在水平肌间隔（YZm）和XY切片相交，给出了相当准确的肌切片体积估计（图2F，G）。当时间限制可以扫描的鱼数量时，2切片方法可实现更快速的数据采集。综上所述，这些数据表明，可以在活斑马鱼幼虫中快速准确地测量肌切片体积。用这种方法在6天内成功重复测量单个幼虫。
对于已鉴定组织单位生长的比较研究，所述方法提供了可靠和精确的体积估计。但是，为了获得准确的绝对体积，可以进行一些修改。首先，可以通过倾斜培养皿或显微镜载物台来校正斜安装引起的误差，以便在成像过程中或使用YZ切片中的脊索轮廓获得更好的横向YZ和副矢状面XY切片;横截面短轴显示圆柱形凹槽的真实直径，而其长轴显示倾斜的角度和大小（见上文第4.6点的注释）。其次，在扫描过程中，必须选择XY和YZ切片的位置，以准确反映所需的肌组。（见上文第4.6点的说明）。但是请注意，肌子宫 V 形的形状会根据发育阶段而变化，在选择 YZ 扫描时必须考虑到这一点。最后，为了确定肌切片17的变化是否反映了整个轴的肌肉生长，可以通过所述方法测量进一步进入躯干或尾部区域的肌组。
重复测量显示体细胞生长
所述方法的一个优点是易于对单条鱼进行重复分析。单个胚胎和幼虫可以反复嵌入，测量和释放，而不会遭受明显的长期影响（图2H）。肌切片在L和CSA中可检测到2至5dpf之间的生长，导致体积稳定增加（图2H）。在1至8 dpf之间以这种方式成像生长，幼虫在成像后也被释放并成长为成年。预计可以进一步分析幼虫晚期，尽管在与未成像的兄弟姐妹进行比较时，需要仔细监测重复成像对摄食行为的影响。重要的是，色素沉着的发展会掩盖成像。虽然色素沉着在正确定向的鱼中不是问题，因为黑色素载体条纹不会阻止所需的测量，但在倾斜安装的样品中，色素可能更成问题。预计使用色素沉着突变系，例如 roy;mitfa39，这将延长生长测量的时间窗口，直到达到可行的共聚焦扫描深度的极限。
所述程序的另一个优点是易于详细分析单根纤维的生长，与它们的整个肌切片在短时间内进行比较。通过DNA注射对纤维进行镶嵌标记，开发了一种方法，可以在4小时内检测单个鉴定纤维中的核获取和生长，然后允许在以后重新分析（图2I）。此外，整个肌切片的生长可以在12小时或更短的时间内测量26 （并且数据未显示）。通过反复测量同一条鱼，消除了个体间的差异性，少数动物可以产生统计上可靠的结果26。
很容易检测到改变体细胞体积的操作
目前的协议允许人们询问各种生物和生理条件下肌肉生长的变化，例如身体活动的改变。麻醉三卡因通过抑制电压门控Na+ 通道40来阻断神经动作电位，用于诱导 β-肌动蛋白：HRAS-EGFP 幼虫的肌肉不活动。如前26所示，在第三和第四dpf之间24小时不活动大大减少了肌切片体积，表明幼虫肌肉生长是活动依赖性的（图3A）。也可以使用其他揭示体细胞结构的检测方法研究无活性的影响，例如mCherry-CAAX（在转基因系中或通过mRNA注射）或通过将幼虫浸入BODIPY染料中过夜（图3A）。后一种方法虽然消除了将鱼杂交到转基因背景或注射胚胎的需要，但由于BODIPY的毒性，不能用于重复测量。因此，目前的方法允许人们可重复地测量肌肉组织体积的变化。
如上所述，遗传标记方法可用于重复测量肌切片体积，从而可以跟踪连续几天个体鱼类肌肉大小的变化。由于处于同一发育阶段的单个鱼和整个产卵的绝对肌切片体积不同（图3A;可能是由于卵的大小或健康状况），测量每个个体生长的能力通过允许配对样本统计分析来减少个体差异的影响。重复测量同一条鱼可以减少可靠检测效果所需的鱼数量。为了说明这种效果，将分析活跃和非活跃幼虫种群中每个个体从3至4 dpf的生长结果与仅使用在4 dpf下进行的肌切片大小的单一测量来分析相同的两个种群的结果进行了比较。从躺到躺，与测量每个人的4/3 dpf体积相比，仅测量4 dpf的肌切片体积时，观察到肌切片体积的明显减小变化更大（图3B）。请注意，与 4/3 dpf 方法（78%-89%）相比，仅 4 dpf 测量的减少范围更大 （68%-91%），并且两种测量之间的相关性较弱。尽管正如预期的那样，所有13个生物学重复的平均减少在每次评估（图3C）中相似，4/3 dpf方法为82.62±1.01%（平均±SEM，n = 13），仅4 dpf方法为82.31±1.92%，但仅4 dpf方法的估计误差几乎是4/3 dpf方法的两倍。因此，通过重复测量来量化个体生长是更准确的方法，通过消除同一产地内鱼类之间的大小差异，如前所述26。尽管如此，由于仅在4 dpf测量肌切片体积时，由于不活动引起的肌切片体积减少没有显着差异（图3C），数据表明~6-8条鱼足以平均产卵内的个体大小差异。显然，当尺寸变化较小时，首选 4/3 dpf 方法。
细胞生长基础分析
肌切球CSA由肌纤维数量和纤维大小决定。光纤数可以通过计算三个YZ部分（YZ a，YZ m，YZp）上的快速和慢速光纤数量来估计。尽管两个相邻肌组的区域包含在这样的YZ切片中，如大多数切片中垂直肌收缩（VM）的存在所示（图2A），但这些计数准确地反映了纤维数量。由于虚拟机上每个相邻网段的光纤对逐渐变细，因此在虚拟机上会发生超计数（图 4A）。这种超额计数可以用以下公式来解释：光纤数=总纤维数-（与VM接触的纤维）/2参考33。此外，平均纤维体积可以通过将肌切片体积除以纤维数量来确定。我们使用这些分析来揭示活动控制生长的两个细胞方面（图4B，C）。
从图2A可以明显看出，纤维在肌组上的尺寸不同，这一现实并未反映在计算的平均纤维体积测量中。通过从两条鱼中绘制体石17的每根纤维，测量的纤维横截面积显示范围为28μm 2至217μm2（图4D）。然而，实际上，许多纤维在肌组内倾斜，因此这种CSA测量不能反映垂直于其长轴的纤维的真实CSA。相反，由于肌组内纤维的角度不同，所有以前后对齐的方向运行的纤维的长度与肌切骨长度不同。尽管有这些警告，只能通过将肌切片完全分割成单个纤维体积或通过测量每根纤维的倾斜角度后进行计算来规避，但测量的CSA提供了每条鱼纤维大小多样性的估计。例如，CSA中的单个纤维在不活动的情况下减少，导致相对于活动（未麻醉）对照幼虫的累积频率曲线向左移动（图4E）。由于非活性鱼的纤维比活跃的鱼少~10（图4B），因此比较中省略了来自活性未麻醉鱼的10种最小纤维（假设它们是新的纤维）或10种最大的纤维（作为替代极端），这表明肌切片体积的大部分损失是由于缺乏纤维生长， 而不是新纤维形成的失败（图4F）。综上所述，这些数据表明，所描述的方法允许详细研究身体活动对肌肉组织形成和生长的作用。
通过电刺激重新施加活性
肌肉生长需要身体活动（图3A）。描述了一种通过电刺激在其他不活跃的幼虫中重新施加肌肉收缩的方法，从而引起强烈的收缩反应（图5A，补充文件8）。尽管此处描述了精确的刺激参数（图5B）以最大程度地激活肌肉组织，但可以改变协议（通过改变电流幅度，频率，脉冲持续时间等）以控制肌肉激活和运动剂量。因此，当前的方法提供了一种受控的活动刺激，在活动回合之间具有标准化的行为，克服了当前运动动物模型18的重要局限性。
所描述的方法证明了使用斑马鱼幼虫研究肌肉生长的各个方面（例如，增生和肥大）的潜力。特别是，斑马鱼幼虫的肌生成被证明可以通过药理学诱导的无活性和电诱导的收缩力进行分析。该方法允许研究身体活动导致 体内肌肉生长的分子机制。
图 1：用于将肌肉电活动重新引入斑马鱼幼虫的刺激室的设计。 装有电极的6孔细胞培养板允许在2%琼脂糖凝胶内制成的孔中维持幼虫。定制的4孔梳子用于在琼脂糖中创建矩形孔（尺寸如图所示），以保持单个鱼幼虫的位置和方向，并防止它们在电刺激下剧烈抽搐时接触银线。 请点击此处查看此图的大图。
图2：测量活斑马鱼α-肌动蛋白：mCherry-CAAX（A，B，E）或β-肌动蛋白：HRAS-EGFP转基因幼虫（H，I）的肌肉体积。幼虫从侧视图成像，在上面板（A，B，E）中显示背侧至顶部，前方至左侧。（A）在4层法中，肌切片体积的计算方法是将XY平面上垂直肌收缩率（VM）（VM）之间测量的体细胞17（L）的长度乘以在YZ平面上测量的三个横截面积（CSA）的平均值（YZm，YZa和YZp;黄色虚线）。（B）在全栈法中，在活斑马鱼幼虫的整个Z栈的每个切片中测量体状体17肌切开的面积（以黄色概述的示例），并将肌瘤面积的总和乘以切片间距离。（C） 4 层和全栈方法之间的高度一致性。颜色表示单个β-肌动蛋白：HRAS-EGFP（正方形）或α-肌动蛋白：mCherry-CAAX（圆圈）鱼。（D）使用4层法计算时，肌切片体积略大，但明显较大。（E）在锥形斑马鱼幼虫中，通过4切片法测量，前体比后体大。（法，八）使用三个 CSA 切片（4 层法）或单个 YZm CSA（2 层法）的平均值进行的体积测量之间存在很强的相关性。p 值显示具有相等方差 （D，G） 的两个尾部 t 检验或具有邦弗朗尼事后检验 （E） 的单因素方差分析的结果。ns，不重要。（H） 测量表达 β-肌动蛋白：HRAS-EGFP 和 myog：H2B-mRFP 的三种单独鱼（颜色）的肌切片 16 体积、长度 （L） 和横截面积 （CSA） 从 2 到 5 dpf。每个时间点的绿色个体的YZm图像如上所示。（I） 通过自动恒定阈值分割法测量的单纤生长。通过在1-2细胞阶段注射CMV：蔚蓝质粒马赛克标记的β-肌动蛋白：HRAS-EGFP;myog：H2B-mRFP鱼。在蔡司LSM880上用高分辨率全XYZ堆栈反复扫描体状10中的单个蔚蓝标记光纤。显示的图像是具有代表性的单切片（左）和三维分段体积的投影（右）。图表上的每个数据点代表同一光纤的单次扫描，在 3 dpf（0 小时）、4 小时后和 5 dpf（54 小时）。进行一式三份扫描并按时间点分段以显示可重复性。白色箭头指向纤维核;请注意，在 3 到 5 DPF 之间添加了两个细胞核。请点击此处查看此图的大图。
图 3：体细胞中活动依赖性肌肉生长 17. （A）通过施用3至4dpf之间的三卡因（粉红色）抑制活性24小时，与兄弟姐妹（蓝色）的载体对照相比，减少了转基因品系和用BODIPY染色的非转基因鱼的肌切片体积。通过4层法定量的体积。符号形状表示来自不同铺设的重复实验（生物重复）。大符号表示平均± SEM 值。小的微弱符号显示单个复制幼虫的数量。（B）非活动鱼类的肌切片体积减少与对照兄弟姐妹的比较，通过单次测量4 dpf（仅4 dpf，上图）或肌切片体积在3和4 dpf之间的变化（4/3 dpf，下部示意图）确定。每个符号代表单产卵中~5条非活动鱼中肌切片17的平均体积除以~5个活动对照兄弟姐妹的平均肌切片17体积。（C）仅通过4 dpf或4/3 dpf方法测量时，未观察到非活动鱼类肌肉生长的平均减少没有差异。条形中的数字表示分析的鱼总数。 p 值显示具有邦弗朗尼事 后 检验 （A） 的双向方差分析或具有不等方差的双尾 t 检验的结果。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：不活动引起的肌肉生长的细胞水平变化。 （A） 示意图，显示由于蓝色和红色肌组相遇的锥形光纤的重复计数，VM上如何发生超计数。请注意，平均光纤计数为 6，但真实平均值为 5.5。校正后的计数给出了更好的近似值。（乙，丙）与活跃（bue）幼虫相比，非活性（粉红色）幼虫的纤维数（B）和平均纤维体积（C）减少。符号形状表示来自不同铺设的重复实验（生物重复）。大符号表示平均± SEM 值。较小的微弱符号显示单个复制幼虫的价值。条形中的数字表示分析的鱼总数。（D）在单个幼虫中，勾勒出肌多肌17中的每个纤维分布并确定CSA。方框显示 SEM ±平均值。 p 值显示具有邦弗朗尼事 后 检验 （B，C） 的双向方差分析或具有相等方差 （D） 的双尾 t 检验的结果。（中、女）累积频率曲线显示主动对照（蓝色）和非活动（粉红色）幼虫的纤维尺寸分布。比较所有纤维（E），或在省略假定新生的小纤维或替代极端的大纤维（F）后，纤维尺寸增加，而不是纤维数量的增加，主要解释肌组的活动驱动生长。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：短暂的电刺激在麻醉的斑马鱼幼虫中引起破伤风肌肉收缩。 （A）连续图像（从补充文件8中的视频中捕获），显示电刺激如何在3dpf时触发麻醉幼虫的最大收缩。以秒为单位的时间刻度。红框表示三个连续的 1 s 刺激序列开始时的运动。每张图像的曝光时间为 40 毫秒。（B） 显示电刺激制度的示意图，其中每 5 秒给出一个 1 秒的 200 个高频、20 V 电脉冲的列车。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1： 完美（左上）和未完美安装的幼虫相对于显微镜 XYZ 参考系（黑色轴）捕获的图像示意图。肌切（绿色），脊索（黄色），神经管（棕褐色），测量的肌瘤参数（红色），测量的脊索参数（黑色箭头）以及可能或实际的鱼旋转（蓝色）。 请点击此处下载此文件。
补充文件2： 屏幕截图显示了 ZEN 中 XY 图像的体长测量值。 请点击此处下载此文件。
补充文件3： 屏幕截图显示了来自 ZEN 中 YZ 图像的 CSA 测量值。 请点击此处下载此文件。
补充文件4： 屏幕截图显示了斐济/ImageJ中 XY 图像的体长测量值。 请点击此处下载此文件。
补充文件： 显示从 ZEN 中提取 YZ 图像校准参数的屏幕截图。 请点击此处下载此文件。
补充文件6： 屏幕截图显示了斐济/ImageJ中 YZ 图像的校准。 请点击此处下载此文件。
补充文件7： 屏幕截图显示了斐济/ImageJ中 YZ 图像的CSA测量结果。 请点击此处下载此文件。
补充文件8： 代表性视频显示了由三卡因麻醉的 3 dpf 幼虫的直接电刺激（长度 1 s）引起的肌肉收缩。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
在这里，我们报告了一种准确有效地估计活斑马鱼幼虫肌肉体积的方法，在阶段或遗传变异中，色素沉着不是成像的一大障碍，并且当短暂麻醉和/或固定耐受性良好时。虽然我们采用了激光扫描共聚焦显微镜，但所描述的方法适用于转盘共聚焦或光片显微镜以及在不同焦平面上创建图像堆栈的任何其他方法。描述了一系列越来越复杂的组织大小和细胞含量估计方法。每种方法都有优点和局限性，我们展示了可以量化的优点和局限性。研究组织生长的一个主要限制是难以实时分析生长变化，因为生长速率响应由急性施用刺激催化的一系列分子或亚细胞事件而变化。此外，当比较不同的个体时，个体差异会产生问题。目前的方法允许在不到一天的时间内测量单个活体个体的组织生长。可以设想在分钟时间尺度上应用这种方法。
所描述的方法允许进行迄今为止不切实际的分析。使用4切片方法，训练有素的操作员可以在一小时内对大约20条鱼的样本量完成肌肉生长测定的成像部分。这与传统的全栈方法形成鲜明对比，传统的全栈方法对于相同数量的鱼（即三倍长）至少需要 3 小时。如果后续的亚细胞分析需要高分辨率图像，则全栈方法很容易需要每条鱼30分钟，这使得处于类似发育阶段的动物队列的生长测定变得不可能。相比之下，2 层或 4 层方法可实现快速的高质量图像捕获。考虑到图像分析，与全栈方法相比，2 层或 4 层方法在节省操作员时间（在没有自动图像分割的情况下）方面的优势是巨大的。每条鱼大约需要 20 分钟进行全栈分析，但 4 切片分析只需要 3-4 分钟。使用几乎同样精确的 2 层方法可以进一步节省操作员时间。因此，所描述的方法是有效的，从而增加了实验设计的灵活性。
4 切片或 2 切片方法的主要限制是，由于体细胞的重叠 V 形（例如，两个相邻体细胞的区域体积（例如，肌多米 16 和 17），这两种方法都是估计值。结果表明，这可能会将实际的肌切片 17 体积高估约 2%，具体取决于 YZ 切片的精确选择位置。此外，在测量期间手动追踪体细胞边界可能会导致估计值的变化，尽管实验者之间的差异很小（数据未显示）。可以使用阈值、滤波和分割算法来解决测量误差，以更客观和可重现的方式获取表面积。然而，仍然需要定制来解释背景荧光的变化（例如由于LMA的嵌入和/或厚度）和单个幼虫荧光蛋白的表达水平随时间的变化。请注意，如果使用非肌肉特异性报告基因，例如 β-肌动蛋白：HRAS-EGFP 线，这种自动测量将更具挑战性。然而，在许多情况下，例如，当比较经受不同处理的鱼之间的操作效果时，预计会影响所有肌肉组织，这种不准确性可能是无关紧要的。但是，例如，如果需要与仅从肌球17计数的纤维或核数进行比较时具有最大的精度，则可以改进“切片”方法。这可以通过使用艰巨的全栈方法，通过将测量的 4 层体积乘以 0.98 进行数学校正，或者通过将 YZ CSA 扫描的位置向后移动以更准确地反映肌切片 17 的真实 CSA 来实现。
该方法的第二个限制是它对鱼的安装方向的敏感性。在实践中，熟练的操作员可以在大多数时间将鱼定向到合理的范围内，即使在快速工作以嵌入许多样品时也是如此。可以设想对显微镜载物台上的设备进行修改，以便在扫描之前校正偏航和滚动。如果没有这种设备，将描述一种量化定向错误的方法，然后可用于校正测量的体积。此外，即使定向错误会增加测量体积的变异性，从而减少观察到小效应量的机会，在许多情况下，这种变化也会类似地影响对照和实验样品。因此，如果操作员意识到该问题，则不太可能出现误报结果。
所描述的方法最初已应用于分析电活动在肌肉生长中的作用，这是一个在各种物种中具有悠久分析历史的主题（在18中回顾）。为此，详细描述了阻断内源性触发活动的简单方法，并用斑马鱼幼虫中的受控模式电刺激代替。这种方法的优点是消除了神经反馈控制40，消除了营养改变的影响以及分析昼夜节律对生长本身的影响的能力，而不是对生长代理的影响，例如蛋白质周转26。由于不同的电活动模式触发不同的肌肉反应，调节纤维类型，大小和新陈代谢41，42，43，44，45，46，47，48，目前的方法为斑马鱼打开了这种分析。
所描述的方法提供了一套技术，通过利用相对未开发的斑马鱼，可以以前所未有的时间和空间分辨率分析肌肉生理学，细胞生物学和病理学的许多方面。目前的方法显然可以应用于其他物种、身体区域和发育阶段。斑马鱼幼虫的快速早期生长使得检测操作对组织生长和形态发生的急性影响成为特别有吸引力的研究领域。此外，斑马鱼肌肉被证明与哺乳动物共享各种生长机制和控制。虽然斑马鱼是脊椎动物，与人类一起保存了肌肉分子遗传学、细胞和发育生物学的许多方面，但在控制肌肉生长方面也存在显着差异。例如，慢纤维和快纤维类型在鱼类中在空间上更明显地分离，肌肉的神经支配显示出差异。此外，必须记住，到目前为止，我们只能分析发展的早期阶段。设想在以后阶段进行类似的分析。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
作者非常感谢Hughes实验室成员Seetharamaiah Attili，Jana Koth，Fernanda Bajanca，Victoria C. Williams，Yaniv Hinits，Giorgia Bergamin和Vladimir Snetkov博士为开发所述协议所做的努力，以及Henry Roehl，Christina Hammond，David Langenau和Peter Currie共享质粒或斑马鱼系。SMH是医学研究委员会（MRC）科学家，计划资助G1001029，MR / N021231 / 1和MR / W001381 / 1支持。MA拥有伦敦国王学院的MRC博士培训计划博士生奖学金。这项工作得益于学者、导师和朋友大卫·M·罗宾逊（David M. Robinson）的三角输入。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
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