Summary
Оптическая прозрачность является основным преимуществом для биологической и физиологической работы клеток у рыбок данио. Описаны надежные методы измерения роста клеток у отдельных животных, которые позволяют по-новому взглянуть на то, как рост скелетных мышц и соседних тканей интегрирован с ростом всего тела.
Abstract
Ряд методов может быть использован для визуализации отдельных клеток по всему телу живых эмбриональных, личиночных или молодых рыбок данио. Показано, что живые рыбы с флуоресцентно-маркированными плазматическими мембранами могут быть отсканированы в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с целью определения объема мышечной ткани и количества присутствующих мышечных волокон. Эффективные подходы к измерению количества и размера клеток у живых животных с течением времени описываются и проверяются с помощью более сложных методов сегментации. Описаны методы, позволяющие контролировать электрическую и, следовательно, сократительную активность мышц. Потеря сократительной активности скелетных мышц значительно снижает рост мышц. У личинок описан протокол, позволяющий повторно вводить узорчатую электрическую сократительную активность. Описанные методы минимизируют влияние межиндивидуальной изменчивости и позволят проанализировать влияние электрических, генетических, лекарственных или экологических стимулов на различные клеточные и физиологические параметры роста в контексте живого организма. Впоследствии может быть выполнено долгосрочное наблюдение за измеренными эффектами определенного вмешательства в раннем возрасте на людей.
Introduction
Регулируемый рост тканей, включающий увеличение количества клеток (гиперплазия) и / или размера клеток (гипертрофия), является решающим фактором развития, регенерации и экологической и эволюционной адаптации. Несмотря на огромные успехи в молекулярно-генетическом понимании как клеточной биологии, так и биологии развития за последние десятилетия, механистическое понимание регуляции размера тканей и органов все еще находится в зачаточном состоянии. Одной из причин этого пробела в знаниях является сложность количественной оценки роста тканей в живых организмах с необходимой пространственной и временной точностью.
Различные аспекты роста целых организмов могут быть измерены многократно с течением времени, выявляя кривые роста для каждого отдельного 1,2,3,4,5. Все более сложные методы сканирования, такие как двойная рентгеновская абсорбциометрия (DXA), компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволяют отслеживать рост целых органов и других областей тела (например, отдельных идентифицированных скелетных мышц) у отдельных людей, как человека, так и в модельных организмах 6,7,8,9,10 . Тем не менее, эти методы еще не имеют разрешения для выявления отдельных клеток, и, таким образом, связи между клеточным поведением и ростом на уровне тканей было трудно различить. Чтобы установить такие связи, традиционные исследования часто опирались на когорты похожих отдельных животных, некоторые из которых приносятся в жертву в последовательные моменты времени, а затем анализируются в цитологических деталях. Такие подходы требуют усреднения наблюдаемых изменений по группам (предпочтительно похожих, но, тем не менее, переменных) людей и, таким образом, страдают от отсутствия временного и пространственного разрешения, что затрудняет поиск коррелированных событий на клеточном уровне, наводящих на мысль о причине и следствии.
Исследования на модельных организмах беспозвоночных, первоначально у C. elegans и D. melanogaster, обошли эти проблемы, разработав оптическую микроскопию для достижения клеточного разрешения и точного измерения роста с течением времени у отдельных особей. Такие исследования выявили поразительно инвариантное поведение клеточной линии в росте этих небольших модельных организмов 11,12,13,14,15,16,17. Тем не менее, многие животные, включая всех позвоночных, имеют неопределенные клеточные линии и контролируют рост тканей с помощью таинственных процессов обратной связи, которые служат для превращения генетически закодированной программы роста в функциональный трехмерный организм со всеми составляющими его тканями и органами, соответствующим образом подобранными по размеру. Чтобы понять эти сложные процессы роста, желательно изобразить целые ткани или органы с течением времени у отдельных людей, которыми можно экспериментально манипулировать с помощью генетических, фармакологических или других вмешательств в выбранное время и последующего анализа эффекта.
Каждая скелетная мышца позвонка имеет определенный размер, форму и функцию, а также хорошо охарактеризованные взаимодействия с соседними тканями, такими как кости, сухожилия и нервы. Некоторые мышцы маленькие, лежат прямо под кожей и поэтому являются хорошими кандидатами для исследований с высоким разрешением. Подобно большинству органов, каждая мышца растет на протяжении всей эмбриональной, постнатальной и ювенильной жизни, прежде чем достичь стабильного взрослого размера. Мышцы, однако, также обладают уникальной способностью изменять размер во взрослой жизни, в зависимости от использования и питания18, и это свойство оказывает серьезное влияние на физическую форму организма, спортивные результаты и независимую жизнь. Потеря мышечной массы и функции в пожилом возрасте, саркопения, является проблемой растущей обеспокоенности для обществ, сталкивающихся со старением населения 19,20,21.
Мы и другие сосредоточились на росте определенных блоков скелетной мышечной ткани в сегментно-повторяющемся теле личинок рыбок данио, как внешне замкнутой системы, содержащей несколько сотен клеток, в которых можно наблюдать рост, поддержание и восстановлениетканей и манипулировать 22,23,24,25,26. В то время как ранее сообщалось онекоторых количественных работах 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, нет подробного и проверенного метода измерения роста мышц в клеточных деталях у отдельных организмов позвоночных с течением времени. Здесь описан эффективный протокол выполнения таких повторных измерений наряду с валидацией и приведен пример его использования для анализа изменений как гипертрофического, так и гиперпластического роста в ответ на измененную электрическую активность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные исследования проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и под соответствующими лицензиями Министерства внутренних дел Великобритании в соответствии с Законом о животных (научные процедуры) 1986 года и последующими изменениями. Эмбрионы/личинки следует выращивать при 28,5 °C до завершения гаструляции, но затем их можно держать при 22-31 °C для контроля скорости развития. Рыбу можно сканировать или стимулировать при комнатной температуре.
1. Обезболивание личинок рыбок данио
- Скрещивайте подходящих флуоресцентных репортерных взрослых рыб, таких как Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg reference36 или Tg(α-actin:mCherry-CAAX)pc22Tg reference37 и собирайте эмбрионы, как описано38.
- В момент выбора, например, через 2 дня после оплодотворения (dpf), ненадолго обезболивайте эмбрионы, используя трикаинсодержащую рыбью среду (либо рыбью воду, либо среду E3), и экранируйте EGFP или mCherry под флуоресцентным микроскопом, таким как Leica MZ16F. Если у вас много эмбрионов, выберите эмбрионы с самым ярким сигналом. Верните эмбрионы в нормальную рыбью среду сразу после скрининга.
2. Крепление рыбы для конфокального сканирования
- Включите конфокальную лазерную сканирующую систему и лазеры, чтобы система стабилизировалась в течение 30-60 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы использовали микроскоп Zeiss LSM 5 Exciter с вертикальной подставкой для материалов (которая увеличивает рабочее расстояние), оснащенную водоиммерным объективом 20x/1.0 W. - Приготовьте 1% низкоплавкой агарозы (LMA) и храните в тепловом блоке при температуре 37 °C для повторного использования в пробирке объемом 1,5 мл. Чтобы избежать теплового удара, удалите аликвоту LMA из теплового блока и дайте ей остыть до уровня чуть выше установки перед нанесением на личинку, тестируя кожу, чтобы судить о соответствующей температуре, как при оценке температуры молочных смесей.
- Выберите рыбу для установки и временно обезболивайте каждую рыбу по очереди трикаином (0,6 мМ в рыбной среде).
- Возьмите чашку Петри диаметром 60 мм, покрытую слоем 1% агарозы, и поместите на сцену рассекающего микроскопа.
- Переложите личинку пластиковой пипеткой Пастера объемом 1 мл на чашку Петри с покрытием 60 мм и удалите как можно больше переносимой среды. Затем, все еще используя пипетку Пастера, поместите от 5 до 10 капель LMA на рыбу и быстро расположите горизонтально в боковом виде с щипцами (или огнеполированной тонкой стеклянной иглой) до того, как LMA установится. Для оптимальной визуализации желательно расположить личинку близко к верхней поверхности LMA.
- Альтернативно, используя пластиковую пипетку Пастера объемом 1 мл, соберите личинку с как можно меньшим количеством рыбьей среды и перенесите личинку в аликвоту охлажденного LMA. Дайте личинке опуститься на 5 секунд, чтобы полностью окружиться LMA. Затем извлеките личинку и перенесите ее в капле LMA на чашку Петри, покрытую агарозой. Быстро ориентируйтесь и позиционируйте личинку, как описано выше.
- Ориентируйте личинку как переднезадней, так и дорсовентральной осями в пределах 10° от горизонтали (см. примечание «Об ошибке и ее исправлении» в пункте 4.6 ниже).
- Если личинка неправильно закреплена горизонтально вблизи поверхности агарозной капли, удаляют и повторно встраивают. Личинки могут быть легко извлечены путем мягкого всасывания с использованием микротонкой пластиковой пипетки Пастера объемом 1 мл, а LMA может быть аккуратно удалена с помощью Kimwipes. Практика действительно делает совершенным в процедуре монтажа; проведите день, встраивая некоторых неважных личинок, прежде чем попробовать это в реальном эксперименте.
ПРИМЕЧАНИЕ: О конструкции микроскопа: Многие лаборатории используют инвертированные конфокальные микроскопы для визуализации через крышку. Мы обнаружили, что повторное внедрение и удаление рыбы, содержащейся в агарозе под покровом для наблюдения в перевернутом микроскопе, приводит к большей потере образцов при повторном сканировании, чем в описанной процедуре с помощью вертикального микроскопа. По этой причине рекомендуется использовать вертикальную систему, если таковая имеется. Тем не менее, ключом к высокому качеству данных является правильный выбор и использование объективных и сканирующих параметров, тема, слишком большая для обсуждения здесь.
- Если личинка неправильно закреплена горизонтально вблизи поверхности агарозной капли, удаляют и повторно встраивают. Личинки могут быть легко извлечены путем мягкого всасывания с использованием микротонкой пластиковой пипетки Пастера объемом 1 мл, а LMA может быть аккуратно удалена с помощью Kimwipes. Практика действительно делает совершенным в процедуре монтажа; проведите день, встраивая некоторых неважных личинок, прежде чем попробовать это в реальном эксперименте.
3. Конфокальное сканирование
- Когда LMA установится, наполните блюдо около 10 мл рыбной среды, содержащей трикаин. Если планируется захват конфокальных стеков, дайте конной рыбе отдохнуть не менее 10 минут, прежде чем приступить к сканированию, так как возникает некоторое набухание агарозы.
- Загрузите блюдо с образцом на стадию конфокальной системы, найдите личинку и сосредоточьтесь на нужном сомите. Somite 17 может быть выбран из-за его легкости локализации вблизи анального отверстия и легкости визуализации. Проверьте, отсчитывая сомиты спереди.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первый сомит слит за ухом и не имеет передней границы, но можно легко наблюдать за поперечно-полосатыми мышечными волокнами. - Настройтесь так, как если бы захватывали Z-стек, определяя верх (т.е. чуть выше кожи) и низ (т.е. чуть ниже нотохорды, чтобы включить весь сомит, даже если рыба смонтирована слегка перекошенной). Как левая, так и правая стороны могут быть захвачены по желанию. Это гарантирует, что все быстрые сканирования YZ захватывают желаемые области.
- Запишите XY-образ следующим образом. Ориентируйте область сканирования по отношению к рыбе, как позволяет конфокальное программное обеспечение. Расположите рыбу с переднезадней осью, параллельной изображенной оси X , и дорсовентральной осью параллельно оси Y с сомитом 17 в центре поля, как показано в дополнительном файле 1. Сосредоточьтесь на плоскости среднего уровня в самом верхнем миотоме, в которой видны целые половинки эпаксиального и гипаксиального сомита вместе с вертикальной и горизонтальной миосептой, и захватывайте изображение высокого разрешения XY . Не забудьте назвать и сохранить изображение.
- Захватите одно или несколько изображений YZ следующим образом. В репрезентативных результатах (ниже) сравнивается точность 2-срезовых и 4-срезовых методов. В 2-срезовом подходе используются одиночные сканирования XY и YZ . В 4-срезовом подходе три сканирования YZ усредняются, чтобы дать более точную оценку объема миотомы. Если это требуется конфокальным программным обеспечением, переориентируйте поле сканирования.
- Нарисуйте точно дорсальную и вентральную линию через выбранный сомит перпендикулярно переднезадней оси рыбы в выбранном переднезаднем положении. Выполните сканирование линии Z-стека.
- Повторите сканирование линии YZ три раза в определенных переднезадних положениях вдоль выбранного миотома, чтобы захватить YZa, YZm и YZp. Репрезентативные результаты показаны на рисунке 2А. Назовите и сохраните эти изображения вместе с соответствующим изображением XY .
ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе плоскостей YZ : Миотома имеет V-образную форму и ее форма изменяется во время роста. Для получения наиболее точной оценки объема миотомы 17 методом 4 слайса позиционируют YZa на переднем кончике миотомы, YZp на задних кончиках миотомы в дорсальном и вентральном крайних точках и YZm на полпути между YZa и YZp. Предполагая, что сомит сужается равномерно, среднее значение измерений из каждого участка YZ будет представлять миотому в целом. Для 2-срезового метода одно сканирование YZ должно быть расположено на заднем конце горизонтального миосептума, что примерно соответствует переднезаднему центру интересующей миотомы (например, YZm). Альтернативно, набор из трех секций YZ может быть взят в передней, средней и задней части горизонтального миосектума, но, как показано ниже, такое измерение будет немного завышать или недооценивать объем миотомы (для ростральных и каудальных сомитов, соответственно, из-за сужения миотомы). По сути, последовательность в позиционировании плоскости (плоскостей) среза YZ между рыбами и экспериментами является ключом к воспроизводимости.
4. Анализ
- Поскольку миотома меняет размер вдоль рыбы градуированным образом, всегда работайте с одним и тем же сомитом в сравнительных исследованиях.
- Чтобы измерить и рассчитать объем миотомы, используйте конфокальное программное обеспечение (например, файлы .lsm, созданные с помощью программного обеспечения Zeiss ZEN microscope) или универсальное программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом, такое как Fiji / ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: При изменении форматов файлов убедитесь, что размер Z-шага передан правильно, так как не все программы могут правильно читать проприетарные конфокальные форматы файлов. Например, чтобы импортировать изображение сканирования строки ZEN на Фиджи, сначала используйте команду Файл/Экспорт для экспорта в качестве .tif в окне Изображение с полным разрешением - одноплоскостной формат, а затем импортируйте в Фиджи. Хотя YZ scan.lsm можно открыть непосредственно на Фиджи, результирующие изображения YZ обычно сжимаются в измерении Z из-за неправильной оценки размера шага Z . - Анализ с использованием ZEN
- Сначала откройте файлы XY scan.lsm в ZEN. Перейдите на вкладку Графика и выберите инструмент «Линия». Проведите линию между двумя вертикальными миозептами сомита 17, охватывающую всю длину миотомы (параллельную переднезадней оси рыбы). Установите флажок M, чтобы показать значения измерения (Длина = 89,71 мкм, см. Дополнительный файл 2).
- Откройте файлы YZ scan.lsm. На вкладке Графика выберите инструмент Закрытый Безье . Нарисуйте по периметру миотомы. После завершения установите флажок M, это покажет значение измерения (Площадь = 11980,01 мкм2, см. Дополнительный файл 3).
- Запишите значения каждого измерения вручную в электронную таблицу. Усредните измерения CSA по мере необходимости. Объем миотомы может быть рассчитан как Объем = Длина миотома x CSA, т.е. 89,71 мкм x 11980,01 мкм2 = 1,075 x 106 мкм3.
- Анализ с использованием Fiji/ImageJ
- Откройте файлы XY scan.lsm на Фиджи/ImageJ. Проверьте, правильно ли откалиброваны изображения XY , непосредственно открытые на Фиджи, по шкале, как это и должно быть.
- Выберите инструмент «Прямая линия » из значков. Проведите линию по длине сомита 17, как описано в шаге 4.3.1. Задайте параметры измерения, перейдя в раздел Анализ, затем выберите Установить измерения..., и установите следующие флажки Область и Метка дисплея. Чтобы измерить, просто нажмите горячую клавишу M или перейдите в меню Анализ и выберите Измерить. В результате появится всплывающее окно со списком всех значений измерений (например, Длина = 90,023 мкм; см. Дополнительный файл 4). Результаты могут быть сохранены в виде .csv и открыты в Microsoft Excel или аналогичном для последующего анализа.
- Чтобы измерить CSA на изображениях YZ , откройте изображения YZ в формате .tif, как описано в шаге 4.2.
- Откалибруйте изображения YZ .tif, так как они не калибруются при экспорте. Параметры калибровки можно получить в ZEN, перейдя в раздел Информация выбранных изображений: запишите значения Scaling X (0,489 мкм) и Scaling Z (0,890 мкм; см. Дополнительный файл 5). Затем, когда изображения открыты на Фиджи, перейдите в раздел Изображение и выберите Свойства.... Введите 0,489 мкм для ширины пикселя и высоты пикселя и 0,890 мкм для глубины вокселя. Установите флажок Глобальный , чтобы применить калибровку повсеместно, если предполагается повторное измерение изображений YZ (см. Дополнительный файл 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все изображения YZ сняты с использованием одних и тех же параметров сканирования; перезапустите Fiji/ImageJ или измените значения калибровки, если требуется новый набор калибровки. - Чтобы измерить CSA калиброванных изображений YZ , выберите инструмент «Выделение полигонов» на значках. Нарисуйте по периметру сомита и нажмите клавишу M , чтобы показать значения измерения (Площадь = 11980,395 мкм2; см. Дополнительный файл 7). Объем миотомы может быть рассчитан как Объем = Длина миотома x CSA, т.е. 90,023 мкм x 11980,395 мкм2 = 1,079 x 106 мкм3.
- Повторите измерения на других изображениях XY и YZ . Рекомендуется использовать одно и то же программное обеспечение для всех измерений в экспериментальной серии для согласованности. Оценка объема по каждому программному обеспечению одинакова, но не идентична из-за различных инструментов рисования, т.е. ZEN = 1,074 × 106 мкм3 и Fiji/ImageJ = 1,079 × 106 мкм3. Рост миотомы между двумя временными точками (т.е. от 3 до 4 dpf) может быть рассчитан как: (Том 4 dpf - Том 3 dpf)/ Том 3 dpf × 100%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Об ошибке и ее исправлении. Во время монтажа рыба должна быть ориентирована своей сагиттальной плоскостью (т.е. переднезадней и дорсовентральной осями) как можно ближе к горизонтали, чтобы избежать рыскания и крена соответственно. Это связано с тем, что как длина миотомы L, измеренная при сканировании XY , так и CSA, измеренная при сканировании YZ , будут переоценены, если рыба показывает рыскание (вращение вокруг дорсовентральной оси) из-за наклонного переднезадней установки. Ни тангаж, ни крен во время монтажа не должны влиять на измерения после сканирования, как описано в разделе 3. Тем не менее, дорсовентральное вращение (рулон) ухудшает качество изображения. Простая тригонометрия показывает, что до 10° рыскания даст 3% погрешность измерения объема, так как измеренные L и CSA увеличиваются пропорционально (cosq)-1, где q - угол в сторону от переднезадней горизонтали (рыскание). 15° и 20° отключения дадут 7% и 13% завышенных оценок объема соответственно.
Поскольку нотохорда является цилиндрической, включение всей нотохорды в сканирование YZ может быть использовано для расчета угла и степени наклона от ориентации и величины большой и малой осей и тем самым корректировки измеренных L и CSA для максимальной точности. Скорректированный CSA = Измеренный CSA x Нотохорд минорная ось/Нотохорд большая ось. Скорректированная L = Измеренная малая ось L x Нотохорда/Нотохорда в направлении Z микроскопа.
Дальнейшее рассмотрение позволяет дополнительно исправить L. По мере роста миотомы она наклоняется в корональной плоскости (нормальной для дорсовентральной оси) так, что медиальная миотома слегка предшествует боковой миотоме. Если смотреть со спины, вертикальная миозепта с левой и правой сторон образуют широкий шеврон, указывающий спереди. Если рыскание низкое, эта морфология не влияет на измерение L. Но если фрамбезия значительна, тригонометрическая коррекция становится сложной, и лучшим подходом является измерение истинного L непосредственно путем оценки координат XYZ двух точек, где передняя и задняя вертикальная миозепта встречаются с нотохордой в горизонтальном миосекте. Простая тригонометрия позволяет вычислить True L из этих координат как L = SQRT[(X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2 + (Z2 - Z1)2]. Недостатки этого последнего подхода заключаются в том, что а) выбор точек может варьироваться в зависимости от оператора и б) не сохраняется визуальная запись выбранных точек. Это соображение не влияет на коррекцию CSA.
5. Необязательный метод: удалите и повторно введите электрическую активность мышц
- Создайте стимулирующую камеру.
- Возьмите плиту скважины размером 6 х 35 мм, создайте два небольших отверстия (диаметром <5 мм, на расстоянии 1 см друг от друга) с каждой стороны каждого колодца (см. Рисунок 1) с помощью узкого паяльника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с горячим паяльником с осторожностью и работайте в вытяжном шкафу, если это необходимо, чтобы избежать вдыхания пара. - Проденьте пару серебряных или платиновых проволок (длиной ~20 см) через отверстия каждой скважины (см. Рисунок 1). Многоразовый клейкий материал (например, BluTack) можно наносить вблизи отверстий, чтобы удерживать провода на месте и обеспечивать расстояние между проводами в 1 см (см. Рисунок 1).
- Возьмите плиту скважины размером 6 х 35 мм, создайте два небольших отверстия (диаметром <5 мм, на расстоянии 1 см друг от друга) с каждой стороны каждого колодца (см. Рисунок 1) с помощью узкого паяльника.
- При 3 dpf разделите рыбу на три условия: контроль рыбы, неактивный и неактивный + стим.
- Для неактивных и неактивных + стим групп обезболивают личинок через 72 часа после оплодотворения (hpf) трикаином (0,6 мММ).
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии со ссылкой38 замороженные аликвоты трикаина размораживают и разбавляют (40 мкл/мл рыбной среды до конечной концентрации 0,6 мМ) перед добавлением в рыбу. Не добавляйте трикаин прямо в воду, содержащую рыбу, так как некоторые рыбы могут получать высокие дозы. Запас трицина следует использовать в течение месяца и никогда не замораживать повторно. - Для рыбной среды Контролируйте рыб, оставьте их без анестезии.
- Для неактивных и неактивных + стим групп обезболивают личинок через 72 часа после оплодотворения (hpf) трикаином (0,6 мММ).
- В выбранное время (ы) после начала воздействия трицина (т.е. при 80 л.с.ф.) подготовьте группу Inactive+Stim для стимуляции.
- Приготовьте 60 мл 2% агарозы (1,2 г порошка агарозы в 60 мл рыбьей среды) и полностью расплавите с помощью микроволновой печи, охладите, добавьте трикаин и налейте 4 мл в каждую лунку стимулирующей камеры (рисунок 1).
- Немедленно добавьте изготовленные на заказ 4-луночные гребни между электродами (созданные путем вырезания пластмасс (например, полипропилена) желаемых размеров и склеивания с помощью Superglue; см. Рисунок 1). Дайте 10 минут для схватывания геля. Аккуратно удалите гребни, чтобы создать четыре прямоугольных колодца.
- Наполните каждую лунку трикаиновой водой и поместите одну анестезированную личинку Inactive+Stim в каждую лунку, используя микропипетку, с их переднезадней осью, перпендикулярной электродам (см. Рисунок 1).
- Проверьте под рассекающим флуоресцентным микроскопом, полностью ли обезличена каждая рыба в каждой лунке камеры.
- Подключите регулируемый стимулятор электрофизиологической картины к камере через контроллер полярности, используя крокодиловые зажимы, соединенные с каждым из электродов с одной стороны камеры (см. Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Контроллер полярности используется для изменения полярности каждые 5 с, чтобы предотвратить электролиз и коррозию электродов. - Стимулируйте рыбу. Например, 1s с поездом импульсов 200, 20 В, с длительностью импульса 0,5 мс и разделением импульсов 4,5 мс, один раз в 5 с дает эффективный режим сопротивления многократному сокращению.
- Регулярно проверяйте под микроскопом, чтобы убедиться, что рыбы стимулируются; пример электрического стимула должен вызывать видимое двустороннее сокращение и легкое движение, один раз в 5 с.
- Для режима сопротивления /высокой силы стимулируйте рыбу на высокой частоте в течение схватки 5 мин, три раза, причем каждый бой отделяется 5 мин отдыха.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как рыбы на одной стороне камеры отдыхают, крокодиловые зажимы могут быть подключены к паре электродов на другой стороне камеры, и эти дополнительные рыбы стимулируются. - После стимуляции осторожно извлеките рыбу из каждой лунки, аккуратно смыв ее пластиковой пипеткой и верните в инкубатор в свежей рыбьей среде, содержащей трикан.
- Вылейте трикановую воду из камеры и используйте щипцы, чтобы разрезать и удалить агарозу из каждого колодца. Лунки промойте водопроводной водой и дайте высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электродов из серебряной проволоки иногда оксид серебра может накапливаться на поверхности проволоки после эксперимента по стимуляции. Поскольку оксид серебра менее проводящий, чем серебро, для поддержания воспроизводимости тщательно втирайте оксид серебра с проволоки с помощью Kimwipes перед повторным использованием установки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Быстрое и точное измерение объема сомита
Описан метод пробоподготовки, сбора данных и объемного анализа, позволяющий быстро измерить рост мышц у личинок рыбок данио. Размер мышц может быть измерен у живых животных с использованием рыбы, меченной на их плазматических мембранах мембранным GFP (β-актин: HRAS-EGFP) или mCherry (α-актин: mCherry-CAAX). Личинки были временно обезболены с использованием трикаина, установлены в агарозе с низкой температурой плавления и визуализированы с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Somite 17 был выбран для анализа размера мышцы, учитывая его доступность на границе31 туловища и хвоста. На практике, как и в теории, объем миотомы может быть рассчитан как произведение длины миотомы (L) и среднего значения трех мер площади поперечного сечения (CSA) (рисунок 2A, который называется 4-срезовым методом).
Для проверки этого метода были получены целые миотомные конфокальные Z-стеки живых личинок рыбок данио (рисунок 2B), а объем сомита был рассчитан путем умножения суммы сомитовых 17 областей профиля в каждом срезе (80-100 ломтиков) на межсрезовое расстояние (1-1,2 мкм). Наблюдалась сильная корреляция между 4-срезовым и полным стековым методами расчета (рисунок 2С). Тем не менее, метод 4-среза обычно давал немного большую оценку объема (~ 2% больше в среднем) (рисунок 2D). Это различие может быть связано либо с а) наклоном образцов, дающих ошибочно большое измерение объема, либо б) наблюдением, что миотомы рыбок данио сужаются вдоль переднезадней оси, будучи меньше к хвосту животного. Поскольку измерения YZa, YZm и YZp CSA относятся к передней части шеврона somite 17 myotome (рисунок 2A), последняя интерпретация была проверена объемным анализом миотом сомитов 16 и 18. Каждый сомит был примерно на 7% больше, чем тот, что позади (рисунок 2E). Дальнейший анализ показал, что 2-срезовый метод, требующий только одного измерения YZ , расположенный в середине сомита, где эпаксиальная и гипаксиальная половины встречаются в горизонтальном миосекте (YZm), а срез XY , дает достаточно точную оценку объема миотомы (рисунок 2F, G). 2-срезовый подход позволяет быстрее собирать данные, когда временные ограничения ограничивают количество рыб, которые могут быть отсканированы. Таким образом, эти данные показывают, что объем миотомы может быть измерен быстро и точно у живых личинок рыбок данио. Одиночные личинки были успешно, неоднократно, измерены в течение 6-дневного периода с помощью этого метода.
Для сравнительного изучения роста идентифицированной тканевой единицы описанный метод обеспечивает достоверные и точные оценки объема. Однако для получения точных абсолютных объемов может быть применен ряд модификаций. Во-первых, исправление ошибок, вызванных наклонным креплением либо путем наклона тарелки или ступени микроскопа для получения лучших поперечных срезов YZ и парасагиттальных XY во время визуализации, либо путем использования нотохордного профиля в срезах YZ ; малая ось поперечного сечения показывает истинный диаметр цилиндрической нотохорды, тогда как ее большая ось показывает угол и величину наклона (см. Примечание в пункте 4.6 выше). Во-вторых, местоположение сечения XY и YZ во время сканирования должно быть выбрано для точного отражения желаемого миотома (ов). (См. примечание в пункте 4.6 выше). Обратите внимание, однако, что форма миотомных шевронов меняется в зависимости от стадии развития, и это необходимо учитывать при выборе сканирования YZ . Наконец, чтобы определить, отражают ли изменения в миотоме 17 рост мышц по всей оси, миотомы дальше в области туловища или хвоста могут быть измерены описанным методом.
Повторные измерения показывают рост сомита
Преимуществом описанного метода является легкость повторного анализа на одиночных рыбах. Отдельные эмбрионы и личинки могут быть многократно внедрены, измерены и выпущены без очевидных долгосрочных последствий (рисунок 2H). Миотома заметно растет как в L, так и в CSA между 2 и 5 dpf, что приводит к устойчивому увеличению объема (рисунок 2H). Рост был изображен таким образом между 1 и 8 dpf, и личинки также были выпущены после визуализации и выросли до взрослой жизни. Ожидается, что дальнейшие анализы в позднем личиночном периоде будут возможны, хотя влияние повторной визуализации на пищевое поведение необходимо будет тщательно контролировать при сравнении с братьями и сестрами, которые не изображены. Важно отметить, что развитие пигментации может скрывать визуализацию. В то время как пигментация не является проблемой у правильно ориентированных рыб, так как меланофорные полосы не препятствуют необходимым измерениям, пигмент может быть более проблематичным в наклонно установленных образцах. Ожидается использование мутантных линий пигментации, таких как roy;mitfa39, что продлит временное окно измерений роста до тех пор, пока не будут достигнуты пределы практически осуществимой глубины конфокального сканирования.
Еще одним преимуществом описываемой процедуры является простота детального анализа роста единичных волокон в сравнении со всем их миотомом за короткие периоды. Путем мозаичной маркировки волокон посредством инъекции ДНК был разработан метод обнаружения ядерного приобретения и роста в отдельных идентифицированных волокнах в течение 4 ч, а затем для повторного анализа в более поздние сроки (рисунок 2I). Более того, рост всей миотомы может быть измерен в течение 12 ч или менее26 (и данные не показаны). При многократном измерении одной и той же рыбы устраняется межиндивидуальная изменчивость, и небольшое количество животных может дать статистически достоверные результаты26.
Манипуляции, изменяющие объем сомита, могут быть легко обнаружены
Текущий протокол позволяет исследовать изменения в росте мышц при различных биологических и физиологических условиях, таких как измененная физическая инертность. Анестетик трикаин, который блокирует потенциалы нервного действия путем ингибирования каналов Na+ с напряжением40, использовался для индуцирования мышечной неактивности у личинок β-актин:HRAS-EGFP . Как показано ранее26, бездействие в течение 24 ч между третьим и четвертым dpf значительно уменьшало объем миотома, указывая на то, что рост личиночной мышцы зависит от активности (рисунок 3A). Эффект бездействия также может быть исследован с использованием других методов обнаружения, которые выявляют структуру сомита, таких как mCherry-CAAX (либо в трансгенной линии, либо путем инъекции мРНК) или путем ночного погружения личинок в краситель BODIPY (рисунок 3A). Последний подход, устраняя необходимость скрещивания рыб на трансгенный фон или инъекции эмбрионов, не может быть использован для повторных измерений из-за токсичности BODIPY. Таким образом, современный метод позволяет воспроизводимо измерить изменения объема мышечной ткани.
Как описано выше, методы генетической маркировки могут быть использованы для повторных измерений объема миотомы, что позволяет отслеживать изменение размера мышц в течение последовательных дней у отдельных рыб. Поскольку отдельные рыбы и целые кладки на одной и той же стадии развития различаются по абсолютному объему миотомы (рисунок 3А; возможно, из-за размера или здоровья икры), способность измерять рост каждой особи уменьшает эффекты индивидуальных вариаций, позволяя проводить парный статистический анализ выборки. Многократное измерение одной и той же рыбы уменьшает количество рыбы, необходимое для надежного обнаружения эффектов. Чтобы проиллюстрировать этот эффект, результаты анализа роста каждой особи от 3 до 4 dpf в популяциях активных и неактивных личинок сравнивали с анализом тех же двух популяций с использованием только одного измерения размера миотомы, сделанного при 4 dpf. От постели к постели наблюдалось большее изменение видимого уменьшения размера миотомы при измерении объема миотомы только при 4 dpf по сравнению с измерением объема 4/3 dpf для каждого человека (рисунок 3B). Обратите внимание на больший диапазон снижения (68%-91%) в измерениях только 4 dpf по сравнению с методом 4/3 dpf (78%-89%) и слабую корреляцию между двумя показателями. Хотя, как и ожидалось, среднее снижение по всем 13 биологическим репликатам было одинаковым в каждой оценке (рисунок 3C) и составило 82,62 ± 1,01% (среднее ± SEM, n = 13) для метода 4/3 dpf и 82,31 ± 1,92% для метода только 4 dpf, оценочная погрешность с методом 4 dpf only была почти вдвое выше, чем при методе 4/3 dpf. Таким образом, количественная оценка индивидуального роста путем повторного измерения является более точным методом, устраняя изменчивость размера между рыбами в пределах одной и той же укладки, как было продемонстрировано ранее26. Тем не менее, поскольку при измерении объема миотомы при измерении объема миотомы при измерении объема миотомы только при 4 dpf (рисунок 3C) не наблюдалось существенной разницы в уменьшении объема миотомы, вызванной бездействием, для усреднения межиндивидуальной разницы в размерах в пределах укладки. Очевидно, что при небольших изменениях размера предпочтительнее метод 4/3 dpf.
Анализ клеточной основы роста
Миотома CSA определяется количеством мышечных волокон и размером волокна. Количество волокон можно оценить, подсчитав количество быстрых и медленных волокон на трех участках YZ (YZa, YZm, YZp). Хотя области двух соседних миотом содержатся в таких участках YZ , о чем свидетельствует наличие вертикальной миосепты (VM) в большинстве участков (рисунок 2A), эти подсчеты точно отражают количество волокон. Пересчет происходит на виртуальных машинах из-за сужения пар волокон из каждого соседнего сегмента на виртуальной машине (рисунок 4A). Такое пересчет может быть объяснено с помощью следующего уравнения: Число волокон = Общее количество волокон - (волокна, контактирующие с ВМ) / 2 ссылка33. Кроме того, средний объем клетчатки может быть определен путем деления объема миотомы на количество волокон. Мы использовали эти анализы, чтобы показать, что активность контролирует оба клеточных аспекта роста (рисунок 4B, C).
Из рисунка 2А видно, что волокна различаются по размеру по всему миотому, реальность, которая не отражается в расчетных измерениях среднего объема волокон. Путем рисования вокруг каждого волокна сомита 17 из двух рыб было показано, что измеренная площадь поперечного сечения волокна колеблется от28 мкм 2 до 217мкм2 (рисунок 4D). В действительности, однако, многие волокна наклонены наклонно в пределах миотомы, поэтому такие показатели CSA не отражают истинный CSA волокна, перпендикулярный его длинной оси. И наоборот, из-за различных углов волокон внутри миотомы все волокна, идущие в ориентациях, которые не выровнены переднезадне, имеют длину, отличную от длины миотомы. Несмотря на эти предостережения, которые могут быть обойдены только путем полной сегментации миотомы в отдельные объемы волокна или путем расчета после измерения угла наклона каждого волокна, измеренные CSA дают оценку разнообразия размеров волокон у каждой рыбы. Например, отдельные волокна уменьшались в CSA при бездействии, что приводило к смещению влево в кумулятивной кривой частоты по отношению к активным (необезболизированным) контрольным личинкам (рисунок 4E). Поскольку неактивные рыбы имеют ~ 10 меньше волокон, чем активные рыбы (рисунок 4B), либо 10 мельчайших волокон от активных необезболенных рыб (при условии, что они являются новыми), либо 10 крупнейших (в качестве альтернативной крайности) были опущены из сравнения, которое показало, что большая часть потери объема миотомы связана с отсутствием роста клетчатки, а не отказ от образования нового волокна (рисунок 4F). Взятые вместе эти данные показывают, что описанный метод позволяет детально исследовать роль физической активности на формирование и рост мышечной ткани.
Реимпозиция активности с помощью электростимуляции
Физическая активность необходима для роста мышц (рисунок 3А). Описан способ повторного наложения мышечных сокращений путем электрической стимуляции в неактивные личинки, вызывающие сильную сократительную реакцию (рисунок 5А, дополнительный файл 8). Хотя точные параметры стимуляции описаны здесь (рисунок 5B) для максимальной активации мускулатуры, протокол может быть изменен (путем изменения амплитуды тока, частоты, продолжительности импульса и т. Д.), Чтобы контролировать активацию мышц и дозировку упражнений. Таким образом, современный метод обеспечивает контролируемый стимул активности со стандартизированным поведением между приступами активности, преодолевая важное ограничение современных животных моделей упражнений18.
Описанные методы демонстрируют потенциал использования личинок рыбок данио для изучения различных аспектов роста мышц (например, гиперплазии и гипертрофии). В частности, показано, что миогенез у личинок рыбок данио поддается анализу благодаря фармакологически индуцированной неактивности и электрически индуцированной сократимости. Подход позволяет изучать молекулярные механизмы, с помощью которых физическая активность приводит к росту мышц in vivo.
Рисунок 1: Конструкция стимулирующей камеры для повторного введения мышечной электрической активности личинкам рыбок данио. 6-луночная пластина для культивирования клеток, снабженная электродами, позволяет поддерживать личинки в лунках, изготовленных в пределах 2% агарозного геля. Изготовленные на заказ 4-луночные гребни изготавливаются для создания прямоугольных колодцев (размеров, как указано) в агарозе для поддержания положения и ориентации отдельных личинок рыб и предотвращения их контакта с серебряными проводами во время энергичного подергивания при электрической стимуляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Измерение объема мышц у живых рыбок данио α-актин:mCherry-CAAX (A,B,E) или β-актин:HRAS-EGFP трансгенные личинки (H,I). Личинки сфотографированы с бокового вида и показаны дорсально вверху, спереди слева на верхних панелях (A, B, E). (A) В 4-срезовом методе объем миотомы рассчитывался путем умножения длины сомита 17 (L), измеренной между вертикальными миосептами (VM) на плоскости XY (синяя стрелка), на среднее значение трех областей поперечного сечения (CSA), измеренных на плоскостях YZ (YZm, YZa и YZp; пунктирные желтые линии). (B) В методе Full Stack площадь миотомы сомита 17 измеряли (примеры выделены желтым цветом) в каждом срезе целого Z-стека живой личинки рыбки данио, а сумму миотомальных площадей умножали на расстояние между срезами. (C) Высокое соответствие между методами 4-среза и методом Full Stack. Цвета обозначают отдельные β-актин:HRAS-EGFP (квадраты) или α-актин:mCherry-CAAX (круги) рыбы. (D) Объем миотома немного, но значительно больше при расчете с использованием 4-срезового метода. (E) У сужающихся личинок рыбок данио больше передних сомитов крупнее задних сомитов, что измерено методом 4 срезов. (Ф,Г) Сильная корреляция между объемными измерениями, выполненными с использованием в среднем трех секций CSA (4-срезовый метод) или одного YZm CSA (2-срезовый метод). p-значения показывают результаты двух хвостатых t-тестов с равной дисперсией (D,G) или односторонних ANOVA с bonferroni post hoc тестов (E). ns, не значительный. (H) Измерение объема миотомы 16, длины (L) и площади поперечного сечения (CSA) от 2 до 5 dpf у трех отдельных рыб (цветов), выражающих β-актин:HRAS-EGFP и миог:H2B-mRFP. Изображения YZm зеленого индивидуума в каждой точке времени показаны выше. (I) Рост одного волокна, измеренный с помощью автоматизированной сегментации с постоянным порогом. Рыба β-актин:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP, мозаично меченая инъекцией плазмиды ЦМВ:Церулеан на стадии 1-2 клеток. Одно волокно с маркировкой Cerulean в somite 10 было многократно отсканировано с помощью полных стеков XYZ высокого разрешения на Zeiss LSM880. Показаны изображения репрезентативных одиночных срезов (слева) и проекция трехмерного сегментированного объема (справа). Каждая точка данных на графике представляет собой одно сканирование одного и того же волокна при 3 dpf (0 ч), через 4 ч и при 5 dpf (54 ч). Были сделаны и сегментированы тройные сканы по временным точкам, чтобы показать воспроизводимость. Белые наконечники стрел указывают на ядра волокон; Обратите внимание, что два ядра добавляются между 3 и 5 dpf. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Активностно-зависимый рост мышц у сомита 17. (А) Ингибирование активности в течение 24 ч путем применения трицина (розового) между 3 и 4 dpf уменьшает объем миотомы как в трансгенных линиях, так и у нетрансгенных рыб, окрашенных BODIPY, по сравнению с контролем транспортных средств на братьях и сестрах (синий). Объем количественно определяется 4-срезовым методом. Форма символа указывает на реплицированные эксперименты с различными пластами (биологическими репликами). Большие символы обозначают средние значения ± SEM. Небольшие слабые символы показывают объем отдельных реплицированных личинок. (B) Сравнение уменьшения объема миотомы у неактивных рыб по сравнению с контрольными братьями и сестрами, определяемое путем однократного измерения объема миотомы при 4 dpf (только 4 dpf, верхняя схема) или изменения объема миотома между 3 и 4 dpf (4/3 dpf, нижняя схема). Каждый символ представляет собой средний объем миотома 17 в ~5 неактивных рыб из одной кладки, деленный на средний объем миотома 17 ~ 5 активных контрольных братьев и сестер. (C) Не наблюдалось различий в среднем снижении мышечного роста у неактивных рыб при измерении методами только 4 dpf или 4/3 dpf. Цифры в барах представляют общее количество проанализированных рыб. p-значения показывают результаты двухсторонней ANOVA с пост-специальными тестами Бонферрони (A) или двуххвостого t-теста с неравной дисперсией (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изменения клеточного уровня в росте мышц, вызванные бездействием. (A) Схема, показывающая, как происходит пересчет на виртуальных машинах из-за двойного подсчета сужающихся волокон, где встречаются синие и красные миотомы. Обратите внимание, что среднее количество волокон равно 6, но истинное среднее значение составляет 5,5. Скорректированное количество дает лучшее приближение. (В,С) Количество волокон (B) и средний объем клетчатки (C) уменьшаются у неактивных (розовых) по сравнению с активными (bue) личинками. Форма символа указывает на реплицированные эксперименты с различными пластами (биологическими репликами). Большие символы обозначают средние значения ± SEM. Меньшие слабые символы показывают ценность отдельных реплицированных личинок. Цифры в барах представляют общее количество проанализированных рыб. (D) У одиночных личинок был очерчен профиль каждого волокна в миотоме 17 и определен CSA. Квадраты показывают среднее ± SEM. p-значения показывают результаты двустороннего ANOVA с пост-специальными тестами Бонферрони (B, C) или двуххвостого t-теста с равной дисперсией (D). (Э,Ф) Кумулятивные частотные кривые, показывающие распределение волокон по размерам в активных контрольных (голубых) и неактивных (розовых) личинках. Сравнение всех волокон (E) или после пропуска предполагаемых-зарождающихся мелких или, в альтернативном крайнем случае, крупных волокон (F) показывает, что увеличение размера волокон, а не увеличение количества волокон, в первую очередь объясняет рост миотомы, обусловленный активностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Краткая электрическая стимуляция вызывает сокращения тетановых мышц у анестезируемых личинок рыбок данио. (A) Последовательные изображения (снятые из видео в дополнительном файле 8), показывающие, как электрическая стимуляция вызывает максимальные сокращения обезболенной личинки при 3 dpf. Временная шкала в секундах. Красные поля указывают на движения в начале трех последовательных 1-секундных стимулирующих поездов. Каждое изображение имеет экспозицию 40 мс. (B) Схема, показывающая режим электрической стимуляции, в котором 1 с поезд из 200 высокочастотных электрических импульсов 20 В подается каждые 5 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Схемы снятых изображений идеально (вверху слева) и несовершенно смонтированных личинок относительно системы отсчета микроскопа XYZ (черные оси). Миотома (зеленый), нотохорд (желтый), нервная трубка (загар), измеренные миотомальные параметры (красный), измеренные параметры нотохорды (черные стрелки) и возможные или фактические вращения рыб (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Снимок экрана, показывающий измерение длины сомита по изображениям XY в ZEN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3: Снимок экрана, показывающий измерение CSA по изображениям YZ в ZEN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 4: Снимок экрана, показывающий измерение длины сомита из изображений XY на Фиджи/ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл: Снимок экрана, показывающий извлечение калибровочных параметров для изображений YZ из ZEN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 6: Снимок экрана, показывающий калибровку изображений YZ на Фиджи/ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 7: Снимок экрана, показывающий измерение CSA из изображений YZ на Фиджи / ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 8: Репрезентативное видео, показывающее сокращение мышц, вызванное прямой электрической стимуляцией (длина 1 с) личинки 3 dpf, обезболенной трицетом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы сообщаем о методе точной и эффективной оценки мышечного объема живых личинок рыбок данио на стадиях или в генетических вариантах, в которых пигментация не является большим препятствием для визуализации и когда транзиторная анестезия и / или иммобилизация хорошо переносятся. В то время как мы использовали лазерную сканирующую конфокальную микроскопию, описанные подходы применимы к вращающейся дисковой конфокальной или световой листовой микроскопии и к любому другому методу, который создает стопки изображений в различных фокальных плоскостях. Описан ряд все более изощренных подходов к оценке размера тканей и содержания клеток. Каждый метод имеет преимущества и ограничения, которые, как мы показываем, могут быть количественно определены. Основным ограничением в изучении роста тканей является сложность анализа изменений роста в режиме реального времени, поскольку темпы роста изменяются в ответ на серию молекулярных или субклеточных событий, катализируемых остро вводимыми стимулами. Более того, индивидуальная изменчивость может создавать проблемы при сравнении отдельных людей. Современный подход позволяет измерять рост тканей в течение периодов менее суток у одиноких живых особей. Применение подхода может быть предусмотрено в минутной шкале времени.
Описанные методы позволяют проводить анализы, которые до сих пор были неосуществимы. Используя 4-срезовый метод, визуализационная часть анализа роста мышц может быть завершена на выборке размером около 20 рыб в течение часа обученным оператором. Это резко контрастирует с обычным методом Full Stack, который занимает не менее 3 часов для того же количества рыбы (то есть в три раза дольше). Если для последующих субклеточных анализов требуются изображения с высоким разрешением, метод Full Stack может легко потребовать 30 минут на рыбу, что делает невозможным анализы роста когорт животных на аналогичной стадии развития. Напротив, 2- или 4-срезовые методы обеспечивают быструю высококачественную съемку изображения. Переходя к рассмотрению анализа изображений, преимущества 2- или 4-срезового метода в экономии времени оператора (при отсутствии автоматизированной сегментации изображения) перед методом Full Stack огромны. Каждой рыбе требуется около 20 минут для анализа Full Stack, но только 3-4 минуты для 4-срезового анализа. Время оператора может быть дополнительно сэкономлено с помощью почти максимально точного 2-срезового метода. Таким образом, описанный способ является эффективным и тем самым повышает гибкость в экспериментальном проектировании.
Основным ограничением 4- или 2-срезовых методов является то, что оба метода являются оценками из-за перекрывающейся формы шеврона сомитов (например, объема областей двух соседних сомитов (например, миотома 16 и 17). Показано, что это может переоценить фактический объем миотомы 17 примерно на 2%, в зависимости от того, где именно были выбраны срезы YZ . Кроме того, ручная трассировка границ сомита в ходе измерений может способствовать изменению оценок, хотя разница между экспериментаторами была незначительной (данные не показаны). Ошибки измерения могут быть устранены с помощью алгоритмов пороговых значений, фильтрации и сегментации для получения площади поверхности более объективным и воспроизводимым способом. Тем не менее, по-прежнему потребуются настройки для учета изменений в фоновой флуоресценции (например, из-за встраивания и / или толщины LMA) и уровня экспрессии флуоресцентных белков отдельных личинок с течением времени. Обратите внимание, что такие автоматизированные измерения будут еще более сложными, если используется репортер, не специфичный для мышц, такой как линия β-actin:HRAS-EGFP . Тем не менее, при многих обстоятельствах, например, при сравнении эффектов манипуляций между рыбами, подвергнутыми различным обработкам, которые, как ожидается, повлияют на всю мышечную ткань, неточность может быть несущественной. Однако, если для сравнения с волоконными или ядерными числами, отсчитываемыми исключительно из миотома 17, требуется максимальная точность, например, методы «среза» могут быть улучшены. Это может быть достигнуто либо с помощью трудного метода Full Stack, либо путем математической коррекции путем умножения измеренных объемов 4-слайса на 0,98, либо путем перемещения местоположения сканов YZ CSA сзади, чтобы более точно отразить истинный CSA миотомы 17.
Вторым ограничением метода является его чувствительность к монтажной ориентации рыбы. На практике опытные операторы могут ориентировать рыбу в разумных пределах большую часть времени, даже при быстрой работе по встраиванию большого количества образцов. Можно предусмотреть модификации оборудования на ступени микроскопа, которые позволили бы корректировать рыскание и крен перед сканированием. Без такого аппарата описан метод количественной оценки дезориентации, который затем может быть использован для коррекции измеренных объемов. Более того, даже если дезориентация увеличивает изменчивость измеряемого объема и, таким образом, снижает вероятность наблюдения небольших размеров эффекта, во многих ситуациях такая вариация будет одинаково влиять на контрольные и экспериментальные образцы. Таким образом, ложноположительные результаты маловероятны, если операторы знают о проблеме.
Описанные методы первоначально были применены для анализа роли электрической активности в росте мышц, предмет с длительной историей анализа в широком спектре видов (рассмотрен в18). С этой целью подробно описаны простые методы блокирования эндогенно вызванной активности и заменены контролируемой узорчатой электрической стимуляцией у личинок рыбок данио. Преимуществами этого подхода являются удаление нейронных элементов управления обратной связью40, устранение эффектов измененного питания и возможность анализировать циркадные эффекты на сам рост, а не на прокси роста, такие как оборот белка26. Поскольку различные паттерны электрической активности вызывают различные мышечные реакции, регулируя тип волокна, размер и метаболизм 41,42,43,44,45,46,47,48, современные методы открывают рыбок данио для таких анализов.
Описанные методы предлагают набор методов, с помощью которых многие аспекты мышечной физиологии, клеточной биологии и патологии могут быть проанализированы в беспрецедентном временном и пространственном разрешении, используя преимущества относительно неисследованных рыбок данио. Современные подходы могут быть явно применены к другим видам, областям тела и стадиям развития. Быстрый ранний рост личинок рыбок данио делает выявление острых последствий манипуляций на рост тканей и морфогенез особенно привлекательными участками исследования. Кроме того, показано, что мышцы рыбок данио разделяют различные механизмы роста и контроля с млекопитающими. В то время как рыбки данио являются позвоночными, которые сохраняют многие аспекты молекулярной генетики мышц, клеточной биологии и биологии развития с людьми, существуют также значительные различия в контроле роста мышц. Например, медленные и быстрые типы волокон более четко пространственно разделены у рыб, и иннервация мышц показывает различия. Кроме того, следует иметь в виду, что до сих пор нам удавалось анализировать только ранние этапы развития. Предусматривается проведение аналогичного анализа на более поздних этапах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы глубоко обязаны усилиям членов лаборатории Хьюза докторов Ситарамайи Аттили, Яны Кот, Фернанды Баянки, Виктории С. Уильямс, Янива Хиниц, Джорджии Бергамин и Владимира Снеткова по разработке описанных протоколов, а также Генри Рёлю, Кристине Хаммонд, Дэвиду Лангенау и Питеру Карри за совместное использование плазмид или линий рыбок данио. SMH является научным сотрудником Совета по медицинским исследованиям (MRC) с программным грантом G1001029, MR/N021231/1 и MR/W001381/1support. Ma провела mrc doctoral training program PhD Studentship от Королевского колледжа Лондона. Эта работа выиграла от тригонометрического вклада Дэвида М. Робинсона, ученого, наставника и друга.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
