Оптическая прозрачность является основным преимуществом для биологической и физиологической работы клеток у рыбок данио. Описаны надежные методы измерения роста клеток у отдельных животных, которые позволяют по-новому взглянуть на то, как рост скелетных мышц и соседних тканей интегрирован с ростом всего тела.
Ряд методов может быть использован для визуализации отдельных клеток по всему телу живых эмбриональных, личиночных или молодых рыбок данио. Показано, что живые рыбы с флуоресцентно-маркированными плазматическими мембранами могут быть отсканированы в конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с целью определения объема мышечной ткани и количества присутствующих мышечных волокон. Эффективные подходы к измерению количества и размера клеток у живых животных с течением времени описываются и проверяются с помощью более сложных методов сегментации. Описаны методы, позволяющие контролировать электрическую и, следовательно, сократительную активность мышц. Потеря сократительной активности скелетных мышц значительно снижает рост мышц. У личинок описан протокол, позволяющий повторно вводить узорчатую электрическую сократительную активность. Описанные методы минимизируют влияние межиндивидуальной изменчивости и позволят проанализировать влияние электрических, генетических, лекарственных или экологических стимулов на различные клеточные и физиологические параметры роста в контексте живого организма. Впоследствии может быть выполнено долгосрочное наблюдение за измеренными эффектами определенного вмешательства в раннем возрасте на людей.
Регулируемый рост тканей, включающий увеличение количества клеток (гиперплазия) и / или размера клеток (гипертрофия), является решающим фактором развития, регенерации и экологической и эволюционной адаптации. Несмотря на огромные успехи в молекулярно-генетическом понимании как клеточной биологии, так и биологии развития за последние десятилетия, механистическое понимание регуляции размера тканей и органов все еще находится в зачаточном состоянии. Одной из причин этого пробела в знаниях является сложность количественной оценки роста тканей в живых организмах с необходимой пространственной и временной точностью.
Различные аспекты роста целых организмов могут быть измерены многократно с течением времени, выявляя кривые роста для каждого отдельного 1,2,3,4,5. Все более сложные методы сканирования, такие как двойная рентгеновская абсорбциометрия (DXA), компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), позволяют отслеживать рост целых органов и других областей тела (например, отдельных идентифицированных скелетных мышц) у отдельных людей, как человека, так и в модельных организмах 6,7,8,9,10 . Тем не менее, эти методы еще не имеют разрешения для выявления отдельных клеток, и, таким образом, связи между клеточным поведением и ростом на уровне тканей было трудно различить. Чтобы установить такие связи, традиционные исследования часто опирались на когорты похожих отдельных животных, некоторые из которых приносятся в жертву в последовательные моменты времени, а затем анализируются в цитологических деталях. Такие подходы требуют усреднения наблюдаемых изменений по группам (предпочтительно похожих, но, тем не менее, переменных) людей и, таким образом, страдают от отсутствия временного и пространственного разрешения, что затрудняет поиск коррелированных событий на клеточном уровне, наводящих на мысль о причине и следствии.
Исследования на модельных организмах беспозвоночных, первоначально у C. elegans и D. melanogaster, обошли эти проблемы, разработав оптическую микроскопию для достижения клеточного разрешения и точного измерения роста с течением времени у отдельных особей. Такие исследования выявили поразительно инвариантное поведение клеточной линии в росте этих небольших модельных организмов 11,12,13,14,15,16,17. Тем не менее, многие животные, включая всех позвоночных, имеют неопределенные клеточные линии и контролируют рост тканей с помощью таинственных процессов обратной связи, которые служат для превращения генетически закодированной программы роста в функциональный трехмерный организм со всеми составляющими его тканями и органами, соответствующим образом подобранными по размеру. Чтобы понять эти сложные процессы роста, желательно изобразить целые ткани или органы с течением времени у отдельных людей, которыми можно экспериментально манипулировать с помощью генетических, фармакологических или других вмешательств в выбранное время и последующего анализа эффекта.
Каждая скелетная мышца позвонка имеет определенный размер, форму и функцию, а также хорошо охарактеризованные взаимодействия с соседними тканями, такими как кости, сухожилия и нервы. Некоторые мышцы маленькие, лежат прямо под кожей и поэтому являются хорошими кандидатами для исследований с высоким разрешением. Подобно большинству органов, каждая мышца растет на протяжении всей эмбриональной, постнатальной и ювенильной жизни, прежде чем достичь стабильного взрослого размера. Мышцы, однако, также обладают уникальной способностью изменять размер во взрослой жизни, в зависимости от использования и питания18, и это свойство оказывает серьезное влияние на физическую форму организма, спортивные результаты и независимую жизнь. Потеря мышечной массы и функции в пожилом возрасте, саркопения, является проблемой растущей обеспокоенности для обществ, сталкивающихся со старением населения 19,20,21.
Мы и другие сосредоточились на росте определенных блоков скелетной мышечной ткани в сегментно-повторяющемся теле личинок рыбок данио, как внешне замкнутой системы, содержащей несколько сотен клеток, в которых можно наблюдать рост, поддержание и восстановлениетканей и манипулировать 22,23,24,25,26. В то время как ранее сообщалось онекоторых количественных работах 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, нет подробного и проверенного метода измерения роста мышц в клеточных деталях у отдельных организмов позвоночных с течением времени. Здесь описан эффективный протокол выполнения таких повторных измерений наряду с валидацией и приведен пример его использования для анализа изменений как гипертрофического, так и гиперпластического роста в ответ на измененную электрическую активность.
Здесь мы сообщаем о методе точной и эффективной оценки мышечного объема живых личинок рыбок данио на стадиях или в генетических вариантах, в которых пигментация не является большим препятствием для визуализации и когда транзиторная анестезия и / или иммобилизация хорошо переносятся. ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы глубоко обязаны усилиям членов лаборатории Хьюза докторов Ситарамайи Аттили, Яны Кот, Фернанды Баянки, Виктории С. Уильямс, Янива Хиниц, Джорджии Бергамин и Владимира Снеткова по разработке описанных протоколов, а также Генри Рёлю, Кристине Хаммонд, Дэвиду Лангенау и Питеру Карри за совместное использование плазмид или линий рыбок данио. SMH является научным сотрудником Совета по медицинским исследованиям (MRC) с программным грантом G1001029, MR/N021231/1 и MR/W001381/1support. Ma провела mrc doctoral training program PhD Studentship от Королевского колледжа Лондона. Эта работа выиграла от тригонометрического вклада Дэвида М. Робинсона, ученого, наставника и друга.
Adhesive, Blu Tack | Bostik | – | – |
Aerosol vacuum | – | – | – |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | – |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | – |
BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
Crocodile clips and wires | – | – | – |
Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | – | – |
Fish medium, Fish water | – | – | Circulating system water collected from the fish facility. |
Fish medium, E3 medium | – | – | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | – |
Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | – |
Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | – | – |
Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | – |
Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | – |
Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | – |
Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | – | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | – |
Soldering iron | – | – | – |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | – |
Watchmaker forceps, No. 5 | – | – | – |
Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | – | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | – | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | – | – | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
ZEN software | Zeiss | – | – |