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Biochemistry

Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/64090
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill
* These authors contributed equally

Summary

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Abstract

La maggior parte delle cellule può percepire e cambiare la propria forma per eseguire processi cellulari fondamentali. In molti eucarioti, il citoscheletro della settina è una componente integrante nel coordinare i cambiamenti di forma come la citochinesi, la crescita polarizzata e la migrazione. Le settine sono proteine che formano filamenti che si assemblano per formare diverse strutture di ordine superiore e, in molti casi, si trovano in diverse aree della membrana plasmatica, in particolare nelle regioni di curvatura positiva su scala micron. Il monitoraggio del processo di assemblaggio della settina in vivo è ostacolato dalle limitazioni della microscopia ottica nelle cellule, nonché dalla complessità delle interazioni sia con le membrane che con gli elementi citoscheletrici, rendendo difficile quantificare la dinamica della settina nei sistemi viventi. Fortunatamente, ci sono stati progressi sostanziali nell'ultimo decennio nella ricostituzione del citoscheletro della settina in un sistema privo di cellule per sezionare i meccanismi che controllano l'assemblaggio della settina ad alte risoluzioni spaziali e temporali. Le fasi principali dell'assemblaggio della settina includono l'associazione e la dissociazione dell'eterooligomero della settina con la membrana, la polimerizzazione in filamenti e la formazione di strutture di ordine superiore attraverso le interazioni tra i filamenti. Qui, presentiamo tre metodi per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste. Questi metodi possono essere utilizzati per determinare i parametri biofisici delle settine in diverse fasi di assemblaggio: come singoli ottameri che legano la membrana, come filamenti e come gruppi di filamenti. Utilizziamo questi parametri abbinati a misurazioni del campionamento della curvatura e dell'adsorbimento preferenziale per capire come funziona il rilevamento della curvatura in una varietà di scale di lunghezza e tempo.

Introduction

Le forme delle cellule e molti dei loro compartimenti interni dipendono dalle membrane lipidiche che le circondano. Le membrane sono strutture viscoelastiche che possono essere deformate attraverso interazioni con proteine, selezione lipidica e forze interne ed esterne che agiscono per generare una varietà di forme 1,2,3,4. Queste forme sono spesso descritte in termini di curvatura della membrana. Le cellule utilizzano una suite diversificata di proteine in grado di assemblarsi preferenzialmente su particolari curvature di membrana per garantire un controllo spazio-temporale definito su processi tra cui il traffico cellulare, la citochinesi e la migrazione 5,6. La dinamica dei macchinari cellulari sulla membrana è notevolmente difficile da osservare a causa della difficoltà di bilanciare il tempo e la risoluzione spaziale con la salute delle cellule. Mentre le tecniche di super-risoluzione possono offrire una visione dettagliata di tali strutture, richiedono lunghe acquisizioni che non sono suscettibili ai tempi di assemblaggio / smontaggio per la maggior parte dei macchinari. Inoltre, la complessità molecolare di questi assemblaggi nel loro ambiente nativo e la moltitudine di ruoli che un singolo componente può svolgere rendono i sistemi di ricostituzione minimi uno strumento prezioso per studiare la capacità funzionale delle molecole.

Sono stati sviluppati mimetici di membrana minimi per studiare le proprietà della membrana e le interazioni proteina-membrana al di fuori della cellula. I mimetici di membrana variano da doppi strati lipidici indipendenti, come liposomi o vescicole unilamellari giganti, a doppi strati lipidici supportati (SLB)7,8,9,10. Le SLB sono membrane biomimetiche ancorate al supporto sottostante, tipicamente composte da vetro, mica o silice11,12. È possibile utilizzare una varietà di geometrie, tra cui superfici planari, sfere, barre e persino substrati ondulati o micropatterati per sondare simultaneamente le interazioni proteina-membrana su curvature concave e convesse1 3,14,15,16,17,18 . La formazione di due strati inizia con l'adsorbimento delle vescicole su una superficie idrofila, seguita dalla fusione e dalla rottura per formare un doppio strato continuo (Figura 1)19. I doppi strati supportati sono particolarmente suscettibili alla microscopia ottica ed elettronica, fornendo sia una migliore risoluzione temporale che spaziale rispetto a quella spesso ottenibile nelle cellule. Le SLB curve forniscono in particolare un mezzo interessante per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in assenza di una significativa deformazione della membrana, consentendo di distinguere tra rilevamento della curvatura e induzione della curvatura, che sono spesso impossibili da separare nei sistemi indipendenti.

Le settine sono una classe di proteine citoscheletriche che formano filamenti ben note per la loro capacità di assemblarsi su membrane curve positive 6,18,20. Nel corso del ciclo cellulare nel lievito, le settine si assemblano in un anello e devono riorganizzarsi per formare le strutture a clessidra e a doppio anello associate all'emergenza delle gemme e alla citochinesi, rispettivamente21. Mentre un bel lavoro è stato fatto usando la microscopia elettronica replica al platino per osservare l'architettura della settina in vari stadi del ciclo cellulare22, guardare l'assemblaggio della settina nel tempo usando la microscopia ottica nel lievito ha incontrato una risoluzione spaziale limitata. Precedenti lavori sulle settine utilizzando monostrati lipidici visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati in grado di ricostituire diverse strutture di settina interessanti come anelli, fasci e garze23. Tuttavia, le tecniche EM sono anche limitate nella loro risoluzione temporale, a differenza della microscopia a fluorescenza. Al fine di risolvere meglio i parametri cinetici del processo multiscala di assemblaggio della settina, ci siamo rivolti alla mimetica di membrana supportata, dove è possibile controllare attentamente la geometria della membrana, le condizioni del campione e la modalità di imaging.

I protocolli qui descritti utilizzano SLB planari o curvi, proteine purificate e una combinazione di tecniche di microscopia. La microscopia confocale a fluorescenza quantitativa e la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM) sono state utilizzate sia per misurare il legame proteico di massa su varie curvature di membrana, sia per misurare la cinetica di legame di singole molecole. Inoltre, questo protocollo è stato adattato per essere utilizzato con la microscopia elettronica a scansione (SEM) per esaminare l'ultrastruttura proteica su diverse curvature della membrana. Mentre il focus di questi protocolli è sul citoscheletro della settina, i protocolli possono essere facilmente modificati per indagare la sensibilità alla curvatura di qualsiasi proteina che il lettore trova interessante. Inoltre, coloro che lavorano in campi come l'endocitosi o il traffico vescicolare possono trovare queste tecniche utili per sondare gli assemblaggi dipendenti dalla curvatura di complessi multi-proteici.

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Protocol

NOTA: la formazione di doppi strati lipidici supportati richiede la preparazione di piccole vescicole unilamellari monodisperse (SUV). Si prega di fare riferimento a un protocollo24 precedentemente pubblicato sulla formazione di SUV. In breve, tutti i SUV sono formati dalla sonicazione della sonda per 12 minuti in totale al 70% di ampiezza attraverso periodi di sonicazione di 4 minuti seguiti da periodi di riposo di 2 minuti in acqua ghiacciata. Le soluzioni SUV devono essere ben chiarite e monodisperse nelle dimensioni. Le distribuzioni dimensionali dei SUV possono essere misurate, ad esempio, mediante la diffusione dinamica della luce25.

1. Doppi strati lipidici planari

  1. Pulizia al plasma dei vetrini
    NOTA: La pulizia al plasma rimuove i contaminanti organici e aumenta l'idrofilia del vetro, garantendo un efficiente adsorbimento lipidico. I seguenti passaggi possono cambiare o devono essere ottimizzati a seconda del detergente al plasma e dei coperchi di vetro utilizzati.
    1. Spurgare il detergente al plasma per 5 minuti con ossigeno per rimuovere l'aria dalle linee e dalla camera. Questo per garantire che, quando il pulitore al plasma viene eseguito, ci sia principalmente ossigeno nelle linee e nella camera, fornendo preparazioni a doppio strato più coerenti.
    2. Durante lo spurgo, far scorrere un gas inerte, come N2 o Ar, sui vetrini di copertura micro per rimuovere polvere e particolato.
      OPZIONALE: I vetrini di copertura possono essere lavati spruzzando ciascun lato con isopropanolo al 100% seguito da acqua. Ripetere il lavaggio isopropanolo-acqua 3 volte e quindi asciugare con un flusso N2 .
    3. Disporre i vetrini di copertura asciutti in una culla in ceramica. Posizionare la culla sul retro della camera al plasma in modo che i coverslip siano paralleli al bordo lungo della camera (questo li mantiene in posizione durante la pulizia al plasma). Far funzionare il pulitore al plasma per 15 minuti con ossigeno alla massima potenza.
  2. Preparazione della camera
    NOTA: Il metodo qui descritto utilizza camere fatte in casa da tubi PCR in plastica per supportare i volumi di reazione, ma anche altri materiali a bassa adesione, come i pozzetti in silicone, possono essere adatti.
    1. Usando una lama di rasoio o forbici, tagliare il cappuccio appena sotto la parte smerigliata di un tubo PCR da 0,2 ml (Figura 2).
    2. Verniciare il bordo del tubo PCR con adesivo attivato dai raggi UV, evitando l'interno del tubo. Posizionare delicatamente la colla del tubo PCR al centro di una cartella pulita al plasma.
      NOTA: Per evitare la colla all'interno della camera, utilizzare la quantità minima di colla per ottenere una tenuta e trattare prontamente con UV senza urtare o disturbare la camera.
    3. Posizionare la camera sotto la luce UV a lunga lunghezza d'onda per 5-7 minuti per polimerizzare l'adesivo.
  3. Formazione di due strati
    NOTA: i SUV monodispersi devono essere utilizzati in questa fase per una formazione efficiente a doppio strato. La tabella 1 fornisce le ricette per tutti i tamponi utilizzati nella formazione del doppio strato, comprese le concentrazioni di scorte e tamponi finali.
    1. Aggiungere 40 μL di tampone lipidico a doppio strato supportato (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabella 1), 10 μL di SUV da 5 mM e 1 μL di 100 mM CaCl2 al pozzo. Agitare delicatamente le camere da un lato all'altro per interrompere i SUV, quindi incubare a 37 °C per 20 minuti.
      NOTA: Per limitare l'evaporazione, incubare in una capsula di Petri coperta con una salvietta umidificata.
  4. Lavare via i lipidi in eccesso
    NOTA: questo passaggio rimuove i SUV in eccesso e funge da passaggio di scambio del buffer. È molto importante non raschiare il doppio strato con la punta della pipetta durante il lavaggio; se il vetro è esposto, le settine e molte altre proteine si legano irreversibilmente, riducendo la concentrazione proteica effettiva.
    1. Dopo l'incubazione, sciacquare il doppio strato 6x con 150 μL di SLBB, pipettando su e giù per mescolare ogni volta evitando bolle.
      NOTA: Aggiungere 150 μL direttamente ai 50 μL di tampone e SUV già presenti per un totale di 200 μL nel pozzo di reazione.
    2. Quando si è pronti per iniziare l'incubazione con le settine o una proteina diversa di scelta, lavare il doppio strato 6x con 150 μL di tampone di reazione (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg / mL BSA, 0,14% metilcellulosa, 1 mM BME).
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, rendere fresco il tampone di reazione e fare molta attenzione mentre si mescola bene la reazione per evitare bolle.
    3. Nell'ultima fase di lavaggio, rimuovere 125 μL di tampone di reazione, lasciando 75 μL nel pozzo. Aggiungere 25 μL di settine diluite nel tampone di stoccaggio della settina (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) alla concentrazione desiderata e immagine mediante microscopia TIRF26.
      NOTA: Quando si imposta questo test per la prima volta o si incorpora una nuova composizione lipidica, è buona norma assicurarsi che i lipidi si diffondano liberamente sulla superficie utilizzando il recupero di fluorescenza dopo il fotosbiancamento (FRAP). Mentre il tasso di recupero sarà diverso per le diverse composizioni lipidiche e intrinsecamente inferiore rispetto ai sistemi indipendenti, i lipidi non dovrebbero essere immobili.

Tampone lipidico a doppio strato supportato (SLBB)
Ceppo Volume Concentrazione finale
2 M KCl 1,5 ml 300 metri quadrati
1 M HEPES 200 μL 20 mM
500 mM MgCl2 20 μL 1 mM
Acqua 8 ml
Tampone di pre-reazione (PRB)
Ceppo Volume Concentrazione finale
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 500 μL 50 metri quadrati
Acqua 9,33 ml
Tampone di reazione
Ceppo Volume Concentrazione finale
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 300 μL 50 metri quadrati
10 mg/mL BSA 1,39 ml 1,39 mg/ml
1% Metilcellulosa 1,39 ml 0.0014
Acqua Fino a 10 ml
Bme 0,7 μL 1 mM
Buffer di archiviazione septin (SSB)
Ceppo Volume Concentrazione finale
2 M KCl 1,5 ml 300 metri quadrati
1 M HEPES 500 μL 50 metri quadrati
Acqua Fino a 10 ml
Bme 0,7 μL 1 mM

Tabella 1: Componenti tampone per la preparazione di doppio strato lipidico supportato e reazioni. Vengono mostrati i volumi di soluzioni stock incorporate nei buffer e le concentrazioni finali di ciascun componente. SLB e PRB possono essere conservati a temperatura ambiente e riutilizzati tra gli esperimenti. Il buffer di reazione e l'SSB sono resi freschi per ogni esperimento.

2. Doppi strati lipidici supportati sferici

NOTA: Questo protocollo utilizza microsfere di silice sospese in acqua ultrapura al 10% di densità. Per qualsiasi lavoro sui parametri cinetici dell'assemblaggio delle proteine, è importante controllare rigorosamente l'area totale della superficie della membrana tra esperimenti e curvature. La tabella 2 mostra i volumi corretti di perline e tampone per mantenere 5 mm2 della superficie totale della membrana. Questo protocollo si espande su un metodo precedentemente pubblicato 8,18.

  1. Formazione di due strati
    NOTA: Per quanto riguarda i doppi strati planari, è importante disporre di SUV di alta qualità per una robusta formazione di due strati. La tabella 2 elenca il volume di perline da una soluzione a densità del 10% e i rispettivi volumi SLBB utilizzati per ottenere una superficie finale di 5 mm2 per un intervallo di diametri di perline.
    1. Le microsfere di silice (note anche come perline) tendono a depositarsi e raggrupparsi insieme; per mescolare le perline e rompere eventuali grappoli, vortice la bottiglia per 15 s, quindi bagno-sonicate per 1 minuto e vortice di nuovo per 15 s.
    2. Mescolare il volume appropriato di perline (Tabella 2) con il volume corrispondente di SLBB e 10 μL di SUV da 5 mM in un tubo microcentrifuga a bassa adesione da 0,5 mL.
    3. Cullare la miscela di perline-lipidi end-over-end per 1 ora a temperatura ambiente. Assicurarsi che questa incubazione avvenga su un rotatore per prevenire la sedimentazione.
  2. Preparare le camere su coverslip PEGylated
    NOTA: Per quanto riguarda i doppi strati planari, le camere fatte in casa da tubi PCR in plastica vengono utilizzate per supportare i volumi di reazione, ma altri materiali a bassa adesione, come i pozzetti in silicone, possono funzionare altrettanto bene.
    1. Mentre le perline oscillano, scongela una copertura PEGilata a temperatura ambiente. Tagliare un tubo PCR da 0,2 ml e incollarlo al coperchio come descritto al punto 1.2. Per guide da 24 mm x 50 mm, fino a 10 camere possono essere adattate in modo fattibile a una diapositiva.
      NOTA: questo protocollo utilizza coperture in vetro PEGilato da 24 mm x 50 mm preparate in anticipo. In breve, le coperture in vetro vengono accuratamente pulite attraverso la sonicazione in acetone, metanolo e 3 M KOH. I coverslip vengono quindi funzionalizzati con n-2-amminoetil-3-amminopropiltrimetossisilano e legati covalentemente al succinimidyl valerato di mPEG. I coperchi in PEGilati finiti vengono conservati sottovuoto a -80 °C. Per un protocollo di passivazione simile, si veda il lavoro di Gidi et al.27. Mentre i coverslip in vetro PEGilato sono suggeriti qui, altri mezzi di passivazione, come i metodi BSA o poli-L-lisina, possono essere efficaci.
  3. Lavare via i lipidi in eccesso
    NOTA: questo passaggio funziona per rimuovere i SUV in eccesso ed eseguire uno scambio di buffer. Le perline vengono lavate 4 volte in totale con tampone di pre-reazione (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). La tabella 3 elenca le velocità di rotazione in RCF per un intervallo di diametri di perline.
    1. Spin perline presso l'RCF designato per 30 s (Tabella 3). Se si utilizzano più dimensioni di perline, mantenere le perline a dondolo fino a quando non è il momento di essere lavate.
      NOTA: non vale la pena sedimentare perline più grandi nello stesso spin di perline più piccole con la velocità di sedimentazione delle perline più piccola per risparmiare tempo. Ciò può far sì che le perline si attacchino l'una all'altra e compromettano l'integrità del doppio strato.
    2. Dopo il primo giro, rimuovere 50 μL di surnatante e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il secondo e il terzo giro, rimuovere 200 μL e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il quarto giro, rimuovere 200 μL e aggiungere 220 μL di PRB. Pipetta vigorosamente per ogni lavaggio.
      NOTA: il volume finale di risospensione è diverso dai lavaggi. Non vorticare le perline dopo l'incubazione con i lipidi in quanto ciò può lasciare lacune nei doppi strati. Per evitare la sedimentazione mentre si lavora con le altre dimensioni di perline o si impostano altre parti del test, riposizionare le miscele di perline sul rotatore end-over-end.
  4. Preparare la reazione
    NOTA: Questa reazione è progettata per preservare l'area totale della superficie della membrana della reazione a 5 mm2 e per produrre una condizione di reazione finale di 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1% metilcellulosa e 1 mM BME.
    1. Se si esegue un test di competizione con più dimensioni di perline, creare una miscela 1: 1 mescolando volumi uguali di ciascuna dimensione di perline insieme. Quindi, mescolare 29 μL della miscela di perline desiderata (o di una singola perla) con 721 μL di tampone RXN.
      NOTA: È importante mescolare accuratamente le perline ad ogni passo con una pipetta per evitare densi gruppi di perline; ciò si tradurrà in una distribuzione delle perline più uniforme e in una superficie totale accurata.
    2. Mescolare 75 μL di perline diluite e 25 μL di proteine diluite in SSB ai pozzetti.
      NOTA: Gli autori in genere immaginano complessi di settina di lievito a 1-50 nM.
    3. Se si misurano le settine allo stato stazionario, incubare a temperatura ambiente per 1 ora e quindi l'immagine mediante quasi TIRF o microscopia confocale.
Diametro del tallone (μm) Volume di perline ben miscelate (μL) Volume del tampone SLB (μL) Volume dei SUV (μL)
6.46 8.94 61.1 10
5.06 7 63 10
3.17 4.39 65.6 10
0.96 1.33 68.7 10
0.54 0.75 69.3 10
0.31 0.43 69.6 10

Tabella 2: Volumi normalizzati di microsfere. Al fine di mantenere una superficie uguale di ciascuna dimensione del tallone e di mantenere la superficie totale della membrana coerente tra gli esperimenti, sono stati calcolati i volumi per ogni dimensione del tallone e il buffer che normalizzava la superficie totale.

Diametro del tallone (μm) Velocità di sedimentazione (RCF)
0.31 4.5
0.54 4.5
0.96 2.3
3.17 0.8
5.06 0.3

Tabella 3: Velocità di sedimentazione per microsfere di diametro variabile. Per ogni diametro di perline, le velocità minime di sedimentazione mostrate sono state utilizzate per pellettare le perline per lavare via i liposomi non legati.

3. Doppi strati lipidici supportati da bastoncelli

NOTA: A differenza degli altri saggi qui presentati, il test dell'asta non consente un attento controllo della superficie totale della membrana. Si può essere coerenti in quantità e volumi tra gli esperimenti, ma poiché questo si traduce in aste di diverse lunghezze e diametri, è difficile estrapolare l'area totale della superficie della membrana nella reazione. Pertanto, mentre questo è un test eccellente per esplorare il rilevamento della curvatura con più curvature su una singola superficie ed è stato utile per esplorare l'ultrastruttura della settina, non è raccomandato per le misurazioni cinetiche. Questo metodo è stato precedentemente segnalato18 e viene ampliato qui.

  1. Ottenere barre di borosilicato da filtri in microfibra di vetro
    1. Strappare un singolo filtro in microfibra di vetro GF/C da 42,5 mm in piccoli pezzi e metterli in un becher da 100 ml con 60 ml di etanolo al 100%. Bagno-sonicare fino a quando la soluzione diventa opaca; questo può richiedere solo 20-30 minuti con un filtro finemente triturato.
      NOTA: Sonicate accuratamente per rompere grossi pezzi; più dissociato/opaco, meglio è.
    2. Coprire la soluzione con pellicola e conservare la soluzione a temperatura ambiente durante la notte.
  2. Formatura di doppi strati sulle aste
    NOTA: questo passaggio viene eseguito con lipidi in eccesso per ottenere una copertura completa dell'asta in quanto è impossibile quantificare la superficie totale in questo metodo.
    1. Il giorno successivo la soluzione di etanolo verrà sistemata (passaggio 3.1.2.), quindi mescolarla bene prima dell'uso. Combinare 10 μL di soluzione di asta e 70 μL di SLBB.
    2. Ruotare alla massima velocità in una mini centrifuga per 30 s e rimuovere 50 μL del surnatante. Risospesare in altri 50 μL di SLBB e ripetere lo spin per un totale di quattro lavaggi per diluire l'etanolo.
      NOTA: i supporti dell'asta non formeranno un pellet solido sul fondo del tubo. Sono invece spalmati lungo il lato del tubo; questo li rende difficili da conservare completamente durante il lavaggio. Poiché la superficie totale in questo test non è controllata, va bene se sono disturbati.
    3. Combinare 10 μL di soluzione di asta ben miscelata con 50 μL di SUV da 5 mM e 20 μL di SLBB. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, ruotando end-over-end come quando si formano due strati sulle microsfere.
  3. Lavare via i lipidi in eccesso
    1. Analogamente al punto 3.2.2., far girare la soluzione di asta lipidica alla massima velocità in una mini centrifuga per 30 s per pellettizzare le aste rivestite a membrana fuori dalla soluzione.
    2. Dopo il primo giro, rimuovere 50 μL del surnatante e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il secondo e il terzo giro, rimuovere 200 μL e aggiungere 200 μL di PRB. Dopo il quarto giro, rimuovere 200 μL, aggiungere 220 μL di PRB e pipettare vigorosamente per mescolare.
  4. Preparare la reazione
    1. In un tubo microcentrifuga da 1,5 mL, mescolare 721 μL di tampone di reazione con 29 μL di soluzione di asta. Mescolare bene.
    2. In un tubo PCR da 0,2 mL, combinare 75 μL di barre in tampone di reazione e 25 μL di settine alla concentrazione desiderata, diluite in SSB. Lasciare incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
  5. Preparazione per la microscopia elettronica a scansione
    1. Dopo l'incubazione, aggiungere la miscela settina-asta da 100 μL su un coperchio rotondo da 12 mm rivestito con PEG e incubare a temperatura ambiente per 1 ora in una capsula di Petri chiusa.
    2. Fissare il campione riempiendo il fondo della capsula di Petri (10 ml dovrebbero essere sufficienti) con il 2,5% di glutaraldeide in cacodilato di sodio 0,05 M (NaCo), pH 7,4, per 30 minuti. Aspirare il liquido con una pipetta di vetro. Lavare il campione incubandolo con 10 ml di 0,05 M NaCo per 5 minuti e ripetere per un totale di due lavaggi.
    3. Postfix in 0,5% OsO4 tampone cacodilato per 30 min, quindi lavare 3x in 0,05 M NaCo (5 min/lavaggio).
    4. Incubare il campione con acido tannico all'1% per 15 minuti, quindi lavare in NaCo 3x. Incubare per 15 minuti in 0,5% OsO4 e lavare 3 volte con NaCo.
    5. Disidratare i campioni utilizzando concentrazioni crescenti di etanolo: 30% EtOH per 5 min, 2x; 50% EtOH per 5 min; 75% EtOH per 5 min; e 100% EtOH per 5 min, 2x. Seguire con un'altra incubazione di 10 minuti.
    6. Incubare in fluido di transizione (esametildilisilazane) 3x (5 min, 10 min, poi 5 min).
    7. Lasciare asciugare all'aria, quindi posizionare i campioni in un essiccatore fino a sputter-coating. Sputter-rivestire lo strato di 4 nm con una lega di oro / palladio e quindi l'immagine su un microscopio elettronico a scansione.

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Representative Results

Dopo la preparazione di ogni SLB, le settine o la proteina di interesse possono essere incubate con il supporto desiderato e fotografate tramite TIRFM, microscopia confocale o SEM. I risultati mostrati qui utilizzano settine espresse in modo ricombinante e purificate da E. coli17. Utilizzando TIRFM su SLB planari, è possibile determinare la lunghezza dei filamenti e la loro flessibilità, misurare i coefficienti di diffusione e osservare l'assemblaggio nel tempo28,29. Per raccogliere le misurazioni di altissima qualità, è innanzitutto necessario accertare la qualità dei doppi strati, specialmente quando li si prepara per la prima volta o quando si modificano le composizioni lipidiche. Un'ispezione visiva della distribuzione proteica sui doppi strati da parte di TIRFM può aiutare a identificare le regioni del doppio strato che sono state graffiate o malformate. La distribuzione delle proteine dovrebbe essere omogenea (Figura 3A) e non dovrebbero esserci buchi o lacune nel doppio strato (Figura 3B). È meglio evitare membrane con fori, che possono formarsi da contaminazione da polvere o macchie dalla manipolazione di vetrini, in quanto ciò può modificare la distribuzione delle proteine in altre aree del doppio strato. Per visualizzare la membrana stessa, la traccia rhodamine-PE può essere incorporata nei SUV per la formazione di due strati. Nei doppi strati di alta qualità, il campo apparirà uniforme (immagini non mostrate), ma se i liposomi sono vecchi o se i lavaggi non sono abbastanza rigorosi, i liposomi non eulati possono accumularsi sulla superficie (Figura 3C). Inoltre, mentre i supporti solidi ostacoleranno la libera diffusione dei lipidi8, i lipidi non dovrebbero essere immobili. Gli esperimenti FRAP possono essere utilizzati per valutare la mobilità dei lipidi su doppi strati planari, che possono variare in base alla composizione e dovrebbero mostrare tassi di recupero nell'ordine di secondi30.

I supporti sferici possono essere utilizzati per esaminare il legame proteico su membrane di curvature definite in isolamento (una curvatura) o con diverse curvature di membrana nello stesso pozzo per osservare la competizione tra le curvature 6,18. Quasi-TIRFM su perline >1 μm può anche essere usato per misurare il numero di eventi di associazione per una data area27. Come con i doppi strati planari, usiamo la rodamina-PE per cercare una deposizione a doppio strato liscia (Figura 4A), cioè nessun grumo lipidico, che indica liposomi multi-lamellarità o unburst (Figura 4B) e nessuna lacuna nel doppio strato (Figura 4C). Per misurare l'adsorbimento proteico totale o l'adsorbimento proteico nel tempo su superfici curve, è necessario isolare le singole perle l'una dall'altra al fine di creare un volume discreto per il quale misurare l'intensità lipidica e l'intensità della settina. Pertanto, le perline dovrebbero essere ben separate piuttosto che raggruppate insieme come nella Figura 4D. Nella sezione di discussione vengono illustrate le opzioni di risoluzione dei problemi relativi a tutti questi potenziali problemi.

Questo test SLB può essere applicato anche ai supporti delle aste, che offrono un ambiente in cui le proteine possono campionare più curvature su una singola superficie. L'abbinamento di questo test con la microscopia elettronica a scansione consente all'utente di esaminare la preferenza di curvatura, l'allineamento e la distribuzione della lunghezza delle settine18 o di altre proteine di interesse. Sebbene simile agli altri saggi qui presentati, il test dell'asta non consente un attento controllo della superficie totale della membrana a causa della natura eterogenea del substrato derivato dalla carta da filtro. Le proprietà del materiale della carta da filtro qui utilizzata si traducono in aste di diverse lunghezze e diametri (Figura 5A); questo è utile per esplorare il rilevamento e l'organizzazione della curvatura delle proteine su superfici curve (Figura 5B), ma poiché il rapporto tra proteine e membrana non può essere controllato, le barre sono di utilità limitata per generare curve di legame di saturazione o parametri di misurazione come le costanti di legame.

Figure 1
Figura 1: Panoramica della formazione di doppio strato lipidico supportato su supporti con varie curvature. I SUV vengono incubati con supporti solidi di diverse geometrie al fine di modificare le curvature disponibili per il campionamento su una determinata membrana. I SUV assorbono sulla superficie di supporto solida e si rompono per creare doppi strati lipidici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Schema di impostazione della camera di reazione. Per preparare camere personalizzate, viene tagliato un tubo PCR da 0,2 ml dove il tubo inizia a coniarsi e al tappo (linee tratteggiate rosse). Il bordo non tagliato del tubo tagliato viene quindi rivestito con un sottile strato di colla attivata dai raggi UV (blu) e posizionato con colla su un coperchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Micrografie TIRF rappresentative di doppi strati planari. (A) Un'immagine rappresentativa di un doppio strato lipidico di alta qualità (75% DOPC, 25% PI di soia) con settine non polimerizzabili legate (verde). Le proteine non si raggruppano in nessuna regione specifica e non ci sono liposomi attaccati alla membrana e nessun foro. (B) Questo doppio strato è stato realizzato con coperture di vetro scarsamente pulite e presenta quelli che sembrano essere "buchi" (frecce bianche) nella membrana dove ci sono meno settine. I settini possono essere visti affollati ai bordi di questi difetti nel doppio strato (indicati dalle frecce bianche nella regione ingrandita a destra). (C) Un'immagine rappresentativa di un doppio strato di bassa qualità utilizzando tracce di rodamina-PE. Liposomi e lipidi tubulati sono visibili sulla superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Micrografie rappresentative di microsfere rivestite di lipidi. Sono state miscelate immagini rappresentative da saggi di competizione in cui sono state miscelate perle rivestite di lipidi (75% DOPC, 25% Soy PI, 0,1% Rhodamine PE) con diametri di 0,3 μm, 0,5 μm, 1 μm, 3 μm e 5 μm. Tutte le immagini sono proiezioni Z massime. (A) Immagine rappresentativa di una miscela di alta qualità di microsfere rivestite di lipidi. I supporti sferici sono uniformemente rivestiti dalla membrana e ci sono pochi grappoli di perline. (B) Immagine rappresentativa del rivestimento irregolare della membrana, probabilmente causato da un lavaggio insufficiente dei lipidi in eccesso. (C) Immagine rappresentativa di perline con lacune nella copertura della membrana (frecce bianche) a causa di una manipolazione impropria. (D) Immagine rappresentativa di perline densamente raggruppate, probabilmente causate da una miscelazione insufficiente durante tutta la procedura, specialmente quando si combinano insieme le diverse perle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Micrografie elettroniche rappresentative di barre lipidiche e rivestite di settina. (A) Immagine SEM che mostra la distribuzione delle lunghezze e dei diametri delle aste rivestite di lipidi (75% DOPC, 25% PI di soia, 0,1% Rhodamine PE). (B) Il bordo di un'asta isolata rivestita di membrana con filamenti di settina allineati lungo l'asse di curvatura positiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le membrane cellulari assumono molte forme, curvature e proprietà fisico-chimiche diverse. Per studiare il meccanismo su scala nanometrica attraverso il quale le cellule costruiscono assemblaggi su scala micrometrica, è necessario progettare sistemi di ricostituzione minimi di mimetica a membrana. Questo protocollo presenta tecniche che controllano con precisione sia la curvatura della membrana che la composizione, consentendo all'utente di effettuare facilmente misurazioni quantitative di fluorescenza utilizzando tecniche di microscopia ampiamente disponibili.

I componenti più critici di questo protocollo sono l'assemblaggio di pozzetti sulla superficie appropriata e la gestione dei lipidi. I pozzetti qui descritti sono realizzati a mano utilizzando tubi PCR e adesivi attivati dai raggi UV; è importante non ottenere colla all'interno dell'area di reazione durante il montaggio. Questo può essere controllato durante l'esperimento mediante imaging lungo i bordi del pozzo e cercando un alto adsorbimento proteico sul vetro di copertura. L'utente può scegliere di utilizzare materiali alternativi per i pozzi, come il silicone, che possono essere ordinati commercialmente, ma il metodo presentato fornisce pozzi robusti che non si spostano o perdono e possono supportare volumi di reazione maggiori. La superficie del vetro di copertura, nelle nostre mani, è stata molto importante per formare doppi strati planari. L'ottimizzazione dei tempi di pulizia al plasma o anche la marca del vetro di copertura può essere necessaria per vedere anche la formazione dei doppi strati, poiché il trattamento superficiale e la carica appropriati sono fondamentali per l'adsorbimento e la fusione delle vescicole 31,32,33. Quando si impostano questi esperimenti per la prima volta o si lavora con nuove composizioni lipidiche, gli esperimenti di recupero della fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP) devono essere utilizzati per valutare la fluidità della membrana rispetto ai sistemi autoportanti30. Si prevede che i sistemi di supporto saranno meno fluidi delle loro controparti indipendenti, ma non immobili12.

Quando si valuta la qualità del doppio strato per fluorescenza, è importante cercare liposomi o difetti nel doppio strato (Figura 3C), in quanto questi possono alterare l'adsorbimento proteico locale. È possibile prendere in considerazione le seguenti opzioni di risoluzione dei problemi. a) Si può regolare la preparazione del SUV per migliorare la qualità del doppio strato. Sonicazione, congelamento-disgelo ed estrusione sono tutti metodi comunemente usati che possono variare in facilità e successo in base alle composizioni lipidiche. Nelle nostre mani, una soluzione SUV completamente chiarita con una distribuzione dimensionale monodispersa si traduce nei doppi strati più omogenei. La diffusione dinamica della luce (DLS) può essere utilizzata per valutare la distribuzione dimensionale25. b) Si può aumentare la differenza di concentrazione salina tra l'interno dei SUV e il buffer esterno. Riducendo la concentrazione di ioni interni (o aumentando quella esterna), lo stress osmotico sui SUV aumenta la probabilità di rottura31. In alternativa, alterare il catione monovalente presente può modificare la cinetica della formazione di SLB e aiutare a ottimizzare le SLB di nuove composizioni lipidiche34. c) Si può aumentare il numero o la forza dei lavaggi. Nell'esperienza degli autori, una miscelazione vigorosa durante i lavaggi porta a doppi strati più puliti e non sembra essere dirompente; invece, il problema più grande deriva dal raschiare accidentalmente il doppio strato con le punte delle pipette, che appariranno come uno squarcio nella membrana. Per i doppi strati curvi, è meglio ridurre al minimo la manipolazione con punte di pipette strette e mescolare delicatamente quando si eseguono le fasi di lavaggio, in particolare per perline più grandi (>1 μm), poiché la membrana può essere tranciata dalle perle di vetro. Se si osservano lacune persistenti nei doppi strati della membrana sferica (Figura 4C), aumentare la larghezza delle punte delle pipette (tagliando l'estremità della punta o acquistando punte larghe) e riducendo il più possibile la manipolazione, pur mescolando completamente le soluzioni di perline, può aiutare. Un problema tecnico comune con questa tecnica è la tendenza delle perline a raggrupparsi insieme (Figura 4D). Questo può essere parzialmente risolto aumentando il tempo di sonicazione prima della formazione del doppio strato; tuttavia, alcuni raggruppamenti sono inevitabili in quanto le perle rivestite di membrana possono anche tendere a raggrupparsi nel tempo nel pozzo. Le perle raggruppate dovrebbero essere evitate per le analisi quantitative.

Le limitazioni alle misurazioni quantitative della dinamica a singola molecola su doppi strati planari includono la necessità di rimanere a basse concentrazioni per tracciare e contare con precisione le particelle. Tuttavia, questo può essere corretto sotto-etichettando la proteina di interesse durante l'acquisizione per ridurre il numero di particelle visibili durante il tracciamento35. Inoltre, le SLB sferiche e a bastoncello sono state sviluppate specificamente per quantificare la sensibilità alla curvatura delle proteine su membrane su scala micrometrica e le microsfere di silice utilizzate qui sono disponibili solo fino a 100 nm di diametro, a quel punto sono puncta limitate alla diffrazione se visualizzate al microscopio ottico. Pertanto, coloro che cercano di valutare la specificità precisa della curvatura su diametri più piccoli non saranno in grado di farlo utilizzando questo metodo. Tuttavia, questa tecnica fornirà comunque preziose informazioni sull'andamento della preferenza di curvatura e consentirà la dissezione di assiemi dipendenti dalla curvatura.

Rispetto ai sistemi a doppio strato lipidico autoportanti, questa tecnica è suscettibile di una vasta gamma di condizioni tampone e non richiede un attento bilanciamento osmotico durante la preparazione. Inoltre, poiché utilizza supporti in vetro, i doppi strati affondano facilmente sul fondo del pozzo, eliminando la necessità di legatura o l'uso di saccarosio o altri agenti addensanti36. Mentre i sistemi a doppio strato lipidico autoportanti forniscono un mezzo utile per studiare la deformazione della membrana da parte delle proteine leganti la membrana, è difficile studiare la relazione tra curvatura della membrana e assemblaggio complesso. A differenza dei sistemi a membrana facilmente deformabili, questo approccio consente all'utente di utilizzare una varietà di composizioni lipidiche senza la forma intrinseca delle singole specie lipidiche che dettano la geometria globale della membrana. Infine, le SLB a forma di bastoncello consentono il campionamento di più curvature sulla stessa membrana continua per le proteine di interesse (Figura 5B), che è unicamente informativa per valutare gli assemblaggi dipendenti dalla curvatura o la colocalizzazione di più componenti.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) Grant no. R01 GM-130934 e National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. e K.S.C. sono stati sostenuti in parte da una sovvenzione del National Institute of General Medical Sciences con il premio T32 GM119999.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural Watson 137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes USA Scientific 1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips Thermo Scientific 152450 Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
Egg Liss Rhodamine PE Avanti Polar Lipids 810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade VWR 16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer VWR 11652
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-223EA
HEPES Sigma Aldrich H3375-1KG
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191
Magnesium chloride VWR 7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers Matsunami Discontinued 22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres Bangs Laboratories, Inc. Depends on size: SS0200*-SS0500* Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive Norland Thorlabs NOA 68 Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide Millipore Sigma 20816-12-0
Parafilm VWR 52858-000
Plasma Cleaner Plasma Etch PE-25 Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride VWR 0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm   VWR 64-0712
Sonicator bath Branson 1510R-MT Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI Avanti Polar Lipids 840044
Tabletop centrifuge Eppendorf 22331
UV Lamp Spectroline ENF-260C 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper VWR 28455-030 42.5 mm diameter, Grade GF/C

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References

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Biochimica Numero 185
Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche
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Curtis, B. N., Vogt, E. J. D., Cannon, K. S., Gladfelter, A. S. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (185), e64090, doi:10.3791/64090 (2022).

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