Summary
Бесклеточное восстановление было ключевым инструментом для понимания сборки цитоскелетов, и работа в последнее десятилетие установила подходы к изучению динамики септина в минимальных системах. Здесь представлены три взаимодополняющих метода наблюдения сборки септина в различных мембранных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры.
Abstract
Большинство клеток могут чувствовать и изменять свою форму для выполнения фундаментальных клеточных процессов. У многих эукариот цитоскелет септина является неотъемлемым компонентом в координации изменений формы, таких как цитокинез, поляризованный рост и миграция. Септины представляют собой нитеобразующие белки, которые собираются для формирования разнообразных структур более высокого порядка и, во многих случаях, обнаруживаются в разных областях плазматической мембраны, особенно в областях положительной кривизны микронного масштаба. Мониторинг процесса сборки септина in vivo затруднен ограничениями световой микроскопии в клетках, а также сложностью взаимодействий как с мембранами, так и с цитоскелетными элементами, что затрудняет количественную оценку динамики септина в живых системах. К счастью, за последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в воссоздании цитоскелета септина в бесклеточной системе для анализа механизмов, контролирующих сборку септина с высоким пространственным и временным разрешением. Основные этапы сборки септина включают ассоциацию гетероолигомера септина и диссоциацию с мембраной, полимеризацию в нити и образование структур более высокого порядка посредством взаимодействий между нитями. Здесь мы представляем три метода наблюдения сборки септина в разных контекстах: плоские бислои, сферические опоры и стержневые опоры. Эти методы могут быть использованы для определения биофизических параметров септинов на разных стадиях сборки: как одиночных октамеров, связывающих мембрану, как нитей, так и в виде сборок нитей. Мы используем эти параметры в сочетании с измерениями выборки кривизны и предпочтительной адсорбции, чтобы понять, как измерение кривизны работает в различных масштабах длины и времени.
Introduction
Формы клеток и многие из их внутренних компартментов зависят от липидных мембран, которые их окружают. Мембраны представляют собой вязкоупругие структуры, которые могут деформироваться посредством взаимодействия с белками, сортировки липидов и действующих внутренних и внешних сил для создания различных форм 1,2,3,4. Эти формы часто описываются в терминах кривизны мембраны. Клетки используют разнообразный набор белков, способных предпочтительно собираться или «ощущать» определенные кривизны мембраны для обеспечения определенного пространственно-временного контроля над процессами, включая клеточный трафик, цитокинез и миграцию 5,6. Динамику клеточного механизма на мембране особенно трудно наблюдать из-за сложности балансировки времени и пространственного разрешения со здоровьем клеток. Хотя методы сверхвысокого разрешения могут предложить подробное представление о таких структурах, они требуют длительных приобретений, которые не поддаются временным рамкам сборки / разборки для большинства машин. Кроме того, молекулярная сложность этих сборок в их родной среде и множество ролей, которые может играть один компонент, делают системы минимального восстановления ценным инструментом для изучения функциональной емкости молекул.
Минимальные мембранные миметики были разработаны для изучения свойств мембраны и белково-мембранных взаимодействий вне клетки. Мембранные миметики варьируются от отдельно стоящих липидных бислоев, таких как липосомы или гигантские одноцветные везикулы, до поддерживаемых липидных бислоев (SLB)7,8,9,10. SLB представляют собой биомиметические мембраны, прикрепленные к нижележащей опоре, обычно состоящие из стекла, слюды или кремнезема11,12. Различные геометрии могут быть использованы, включая плоские поверхности, сферы, стержни и даже волнообразные или микроструктурированные субстраты для зондирования белково-мембранных взаимодействий как на вогнутых, так и на выпуклых кривизнях одновременно1 3,14,15,16,17,18 . Образование бислоя начинается с адсорбции пузырьков на гидрофильной поверхности, за которой следует слияние и разрыв с образованием непрерывного бислоя (рисунок 1)19. Поддерживаемые бислои особенно поддаются световой и электронной микроскопии, обеспечивая как лучшее время, так и пространственное разрешение, чем это часто достигается в клетках. Изогнутые SLB особенно обеспечивают привлекательное средство для зондирования чувствительности к кривизне белка при отсутствии значительной деформации мембраны, позволяя различать зондирование кривизны и индукцию кривизны, которые часто невозможно разделить в отдельно стоящих системах.
Септины представляют собой класс нитеобразующих цитоскелетных белков, хорошо известных своей способностью собираться на положительно изогнутых мембранах 6,18,20. В течение клеточного цикла в дрожжах септины собираются в кольцо и должны перестраиваться, образуя песочные часы и двойные кольцевые структуры, связанные с появлением почек и цитокинезом, соответственно21. В то время как красивая работа была выполнена с использованием электронной микроскопии платиновой реплики для наблюдения архитектуры септина на различных стадиях клеточного цикла22, наблюдение за сборкой септина с течением времени с использованием световой микроскопии в дрожжах столкнулось с ограниченным пространственным разрешением. Предыдущая работа над септинами с использованием липидных монослоев, визуализированных с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), смогла воссоздать несколько интересных структур септина, таких как кольца, пучки и марля23. Однако методы ЭМ также ограничены по своему временному разрешению, в отличие от флуоресцентной микроскопии. Чтобы лучше разрешить кинетические параметры многомасштабного процесса сборки септина, мы обратились к поддерживаемой мембранной миметике, где можно тщательно контролировать геометрию мембраны, условия образца и модальность визуализации.
Протоколы, описанные здесь, используют плоские или изогнутые SLB, очищенный белок и комбинацию методов микроскопии. Количественная флуоресцентная конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения (TIRFM) использовались для измерения как объемного связывания белка на различных кривизнах мембраны, так и для измерения кинетики связывания отдельных молекул. Кроме того, этот протокол был адаптирован для использования со сканирующей электронной микроскопией (SEM) для изучения ультраструктуры белка на различных кривизнах мембраны. В то время как основное внимание в этих протоколах уделяется септиновому цитоскелету, протоколы могут быть легко изменены для исследования чувствительности к кривизне любого белка, который читатель находит интересным. Кроме того, те, кто работает в таких областях, как эндоцитоз или везикулярный трафик, могут найти эти методы полезными для зондирования зависимых от кривизны сборок мультибелковых комплексов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Формирование поддерживаемых липидных бислоев требует подготовки монодисперсных небольших одноламеллярных пузырьков (SUV). Пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованномупротоколу 24 о формировании внедорожников. Короче говоря, все внедорожники формируются зондовой обработкой ультразвуком в течение 12 мин в общей сложности с амплитудой 70% через 4-минутные периоды обработки ультразвуком с последующими 2-минутными периодами отдыха в ледяной воде. Растворы внедорожников должны быть хорошо осветлены и монодисперсированы по размеру. Распределение по размерам внедорожников может быть измерено, например, динамическим рассеянием света25.
1. Плоские липидные бислои
- Плазменная очистка слайдов
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазменная очистка удаляет органические загрязнения и повышает гидрофильность стекла, обеспечивая эффективную адсорбцию липидов. Следующие шаги могут измениться или должны быть оптимизированы в зависимости от используемого плазменного очистителя и стеклянных крышек.- Продувите плазмоочиститель на 5 мин кислородом, чтобы удалить воздух из линий и камеры. Это делается для обеспечения того, чтобы при работе плазменного очистителя в линиях и камере в основном находился кислород, обеспечивая более последовательные двухслойные препараты.
- Во время продувки пропустите инертный газ, такой как N2 или Ar, на стекла микрокрытой крышки, чтобы удалить пыль и твердые частицы.
ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Стеклянные горки можно мыть, опрыскивая каждую сторону 100% изопропанолом с последующей водой. Повторите промывку изопропанол-водой 3 раза, а затем высушите струейN2 . - Уложите стеклянные горки с сухим покрытием в керамическую колыбель. Поместите люльку в заднюю часть плазменной камеры так, чтобы крышки были параллельны длинному краю камеры (это удерживает их на месте во время плазменной очистки). Запустите плазмоочиститель в течение 15 минут с кислородом на максимальной мощности.
- Подготовка камеры
ПРИМЕЧАНИЕ: Способ, описанный здесь, использует самодельные камеры из пластиковых ПЦР-трубок для поддержки реакционных объемов, но другие материалы с низкой адгезией, такие как силиконовые колодцы, также могут быть подходящими.- С помощью лезвия бритвы или ножниц отрежьте колпачок чуть ниже матовой части трубки ПЦР объемом 0,2 мл (рисунок 2).
- Покрасьте ободок трубки ПЦР УФ-активированным клеем, избегая внутренней части трубки. Аккуратно поместите приклеенную трубку ПЦР в центр очищенной плазмой крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать клея внутри камеры, используйте минимальное количество клея, чтобы получить уплотнение, и своевременно обрабатывайте ультрафиолетовым излучением, не натыкаясь и не нарушая камеру. - Поместите камеру под длинноволновый ультрафиолетовый свет на 5-7 мин, чтобы вылечить клей.
- Двухслойное формирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Монодисперсные внедорожники должны использоваться на этом этапе для эффективного двухслойного формирования. В таблице 1 приведены рецептуры для всех буферов, используемых в двухслойной формации, включая запасы и конечные буферные концентрации.- Добавить 40 мкл поддерживаемого липидного двухслойного буфера (SLBB: 300 мМ KCl, 20 мМ HEPES, рН 7,4, 1 мМMgCl2; Таблица 1), 10 мкл внедорожников 5 мМ и 1 мкл 100 мМ CaCl2 в скважину. Осторожно встряхните камеры из стороны в сторону, чтобы нарушить работу внедорожников, а затем высиживайте при 37 °C в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ограничить испарение, инкубируйте в покрытой чашке Петри влажной салфеткой.
- Добавить 40 мкл поддерживаемого липидного двухслойного буфера (SLBB: 300 мМ KCl, 20 мМ HEPES, рН 7,4, 1 мМMgCl2; Таблица 1), 10 мкл внедорожников 5 мМ и 1 мкл 100 мМ CaCl2 в скважину. Осторожно встряхните камеры из стороны в сторону, чтобы нарушить работу внедорожников, а затем высиживайте при 37 °C в течение 20 минут.
- Вымывание избытка липидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг удаляет лишние внедорожники и действует как шаг буферного обмена. Очень важно не соскребать бислой наконечником пипетки во время стирки; если стекло подвергается воздействию, септины и многие другие белки будут связываться необратимо, снижая эффективную концентрацию белка.- После инкубации промойте бислой 6x 150 мкл SLBB, пипетируя вверх и вниз, чтобы каждый раз смешивать, избегая пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 150 мкл непосредственно к 50 мкл буфера и внедорожников, уже присутствующих в общей сложности 200 мкл в реакционной скважине. - Когда будете готовы начать инкубацию с септинами или другим белком по выбору, промыть бислой 6x 150 мкл реакционного буфера (RXN: 33,3 мМ KCl, 50 мМ HEPES, рН 7,4, 1,4 мг/мл BSA, 0,14% метилцеллюлозы, 1 мМ BME).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов сделайте реакционный буфер свежим и будьте очень осторожны при смешивании в реакционном колодце, чтобы избежать пузырьков. - На последней стадии промывки удалите 125 мкл реакционного буфера, оставив 75 мкл в лунке. Добавьте 25 мкл септинов, разбавленных в буфере хранения септина (SSB: 300 мМ KCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4, 1 мМ BME) при желаемой концентрации и изображении с помощью микроскопии TIRF26.
ПРИМЕЧАНИЕ: При настройке этого анализа в первый раз или включении новой липидной композиции рекомендуется обеспечить свободное диффузию липидов на поверхности с использованием флуоресцентного восстановления после фотоотбеливания (FRAP). Хотя скорость восстановления будет различной для разных липидных композиций и по своей сути ниже, чем для отдельно стоящих систем, липиды не должны быть неподвижными.
- После инкубации промойте бислой 6x 150 мкл SLBB, пипетируя вверх и вниз, чтобы каждый раз смешивать, избегая пузырьков.
| Поддерживаемый липидный двухслойный буфер (SLBB) | ||
| Запас | Том | Конечная концентрация |
| 2 млн кКл | 1,5 мл | 300 мМ |
| 1 М HEPES | 200 мкл | 20 мМ |
| 500 мМ MgCl2 | 20 мкл | 1 мМ |
| Вода | 8 мл | |
| Предреакционный буфер (PRB) | ||
| Запас | Том | Конечная концентрация |
| 2 млн кКл | 166 мкл | 33,3 мМ |
| 1 М HEPES | 500 мкл | 50 мМ |
| Вода | 9.33 мл | |
| Реакционный буфер | ||
| Запас | Том | Конечная концентрация |
| 2 млн кКл | 166 мкл | 33,3 мМ |
| 1 М HEPES | 300 мкл | 50 мМ |
| 10 мг/мл BSA | 1.39 мл | 1,39 мг/мл |
| 1% метилцеллюлоза | 1.39 мл | 0.0014 |
| Вода | До 10 мл | |
| БМЭ | 0.7 мкл | 1 мМ |
| Буфер хранения септина (SSB) | ||
| Запас | Том | Конечная концентрация |
| 2 млн кКл | 1,5 мл | 300 мМ |
| 1 М HEPES | 500 мкл | 50 мМ |
| Вода | До 10 мл | |
| БМЭ | 0.7 мкл | 1 мМ |
Таблица 1: Буферные компоненты для получения поддерживаемого липидного бислоя и реакций. Показаны объемы стоковых растворов, которые включены в буферы, и конечные концентрации каждого компонента. SLB и PRB могут храниться при комнатной температуре и повторно использоваться между экспериментами. Реакционный буфер и SSB становятся свежими для каждого эксперимента.
2. Сферические поддерживаемые липидные бислои
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются микросферы кремнезема, взвешенные в сверхчистой воде при плотности 10%. Для любой работы над кинетическими параметрами сборки белка важно строго контролировать общую площадь поверхности мембраны между экспериментами и кривизнами. В таблице 2 показаны скорректированные объемы шариков и буфера для поддержания 5мм2 общей площади поверхности мембраны. Этот протокол расширяет ранее опубликованный метод 8,18.
- Двухслойное формирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается планарных бислоев, важно иметь высококачественные внедорожники для прочного двухслойного формирования. В таблице 2 перечислены объем бусин из раствора с плотностью 10% и их соответствующие объемы SLBB, которые используются для получения конечной площади поверхности 5мм2 для диапазона диаметров шариков.- Микросферы кремнезема (также называемые бусинами), как правило, оседают и сливаются вместе; чтобы смешать бусины и разбить любые грозди, вихрьте бутылку в течение 15 с, затем втирайте в ванну в течение 1 мин и снова вихрь в течение 15 с.
- Смешайте соответствующий объем шариков (таблица 2) с соответствующим объемом SLBB и 10 мкл внедорожников 5 мМ в микроцентрифужной трубке с низкой адгезией объемом 0,5 мл.
- Размахните шариково-липидную смесь концом-концом в течение 1 ч при комнатной температуре. Убедитесь, что эта инкубация выполняется на ротаторе, чтобы предотвратить осаждение.
- Подготовка камер на полиэтиленовых крышках
ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается плоских бислоев, самодельные камеры из пластиковых ПЦР-трубок используются для поддержки реакционных объемов, но другие материалы с низкой адгезией, такие как силиконовые колодцы, могут работать так же хорошо.- Пока бусины качаются, разморозьте полиэтиленовый покров при комнатной температуре. Вырежьте ПЦР-трубку объемом 0,2 мл и приклейте ее к крышке, как описано на этапе 1.2. Для слайдов размером 24 мм x 50 мм на одном слайде может поместиться до 10 камер.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются стеклянные крышки диаметром 24 мм x 50 мм PEGylated, которые готовятся заранее. Вкратце, стеклянные крышки тщательно очищаются с помощью ультразвука в ацетоне, метаноле и 3 М КОН. Затем покровные листы функционализируют n-2-аминоэтил-3-аминопропилтриметоксисиланом и ковалентно связывают с mPEG сукцинимидилалератом. Готовые полиэтиленовые крышки хранятся в вакуумном уплотнении при −80 °C. Аналогичный протокол пассивации см. в работе Gidi et al.27. В то время как здесь предлагаются полиэтиленовые стеклянные крышки, другие средства пассивации, такие как методы BSA или поли-L-лизина, могут быть эффективными.
- Пока бусины качаются, разморозьте полиэтиленовый покров при комнатной температуре. Вырежьте ПЦР-трубку объемом 0,2 мл и приклейте ее к крышке, как описано на этапе 1.2. Для слайдов размером 24 мм x 50 мм на одном слайде может поместиться до 10 камер.
- Вымывание избытка липидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг функционирует для удаления лишних внедорожников и выполнения буферного обмена. Шарики промывают в общей сложности 4 раза с предреакционным буфером (PRB: 33,3 мМ KCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4). В таблице 3 перечислены скорости отжима в RCF для диапазона диаметров шариков.- Отжимают бусины по обозначенному RCF в течение 30 с (таблица 3). Если вы используете бусины нескольких размеров, держите бусины качающимися, пока их не придет время мыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не стоит откладывать более крупные бусины в том же спине, что и более мелкие бусины с меньшей скоростью осаждения бусин, чтобы сэкономить время. Это может привести к тому, что бусины будут прилипать друг к другу и поставить под угрозу целостность бислоя. - После первого спина удалите 50 мкл надосадочного вещества и добавьте 200 мкл PRB. После второго и третьего вращений удалите 200 мкл и добавьте 200 мкл PRB. После четвертого спина удалите 200 мкл и добавьте 220 мкл PRB. Пипетка энергично для каждой стирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем повторного суспендирования отличается от объема стирки. Не вращайте бусины после инкубации с липидами, так как это может оставить пробелы в бислоях. Чтобы избежать осаждения при работе с другими размерами бусин или настройке других частей анализа, поместите шариковые смеси обратно на торцевой ротатор.
- Отжимают бусины по обозначенному RCF в течение 30 с (таблица 3). Если вы используете бусины нескольких размеров, держите бусины качающимися, пока их не придет время мыть.
- Подготовка реакции
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта реакция предназначена для сохранения общей площади поверхности мембраны реакции на уровне 5мм2 и получения конечного состояния реакции 100 мМ KCl, 50 мМ HEPES, 1 мг/мл BSA, 0,1% метилцеллюлозы и 1 мМ BME.- Если вы проводите конкурсный анализ с несколькими размерами бусин, сделайте смесь 1: 1, смешивая равные объемы каждого размера бусины вместе. Затем смешайте 29 мкл желаемой бисерной смеси (или одного шарика) с 721 мкл буфера RXN.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно тщательно смешивать бусины на каждом этапе с пипеткой, чтобы избежать плотных скоплений бусин; это приведет к более равномерному распределению бусин и точной общей площади поверхности. - Смешайте с лунками 75 мкл разбавленных шариков и 25 мкл белка, разведенного в SSB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы обычно изображают дрожжевые септиновые комплексы при 1-50 нМ. - При измерении септинов в установившемся состоянии инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем снимают с помощью почти TIRF или конфокальной микроскопии.
- Если вы проводите конкурсный анализ с несколькими размерами бусин, сделайте смесь 1: 1, смешивая равные объемы каждого размера бусины вместе. Затем смешайте 29 мкл желаемой бисерной смеси (или одного шарика) с 721 мкл буфера RXN.
| Диаметр бусины (мкм) | Объем хорошо смешанных бусин (мкл) | Объем буфера SLB (мкл) | Объем внедорожников (мкл) |
| 6.46 | 8.94 | 61.1 | 10 |
| 5.06 | 7 | 63 | 10 |
| 3.17 | 4.39 | 65.6 | 10 |
| 0.96 | 1.33 | 68.7 | 10 |
| 0.54 | 0.75 | 69.3 | 10 |
| 0.31 | 0.43 | 69.6 | 10 |
Таблица 2: Нормализованные объемы микросфер. Чтобы сохранить одинаковую площадь поверхности каждого размера бусины и сохранить общую площадь поверхности мембраны согласованной между экспериментами, были рассчитаны объемы для каждого размера шарика и буфера, которые нормализовали общую площадь поверхности.
| Диаметр бусины (мкм) | Скорость осаждения (RCF) |
| 0.31 | 4.5 |
| 0.54 | 4.5 |
| 0.96 | 2.3 |
| 3.17 | 0.8 |
| 5.06 | 0.3 |
Таблица 3: Скорости осаждения для микросфер различного диаметра. Для каждого диаметра шарика показанные минимальные скорости осаждения использовались для гранулирования шариков для смывания несвязанных липосом.
3. Стержневые липидные бислои
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от других анализов, представленных здесь, стержневой анализ не позволяет тщательно контролировать общую площадь поверхности мембраны. Можно быть последовательным в количествах и объемах между экспериментами, но поскольку это приводит к стержням разной длины и диаметра, трудно экстраполировать общую площадь поверхности мембраны в реакции. Таким образом, хотя это отличный анализ для изучения зондирования кривизны с несколькими кривизнами на одной поверхности и был полезен для изучения ультраструктуры септина, он не рекомендуется для кинетических измерений. Этот метод был ранее сообщен18 и расширяется здесь.
- Получение боросиликатных стержней из стеклянных фильтров из микрофибры
- Разорвите один стеклянный фильтр из микрофибры марки GF/C толщиной 42,5 мм на мелкие кусочки и поместите их в стакан объемом 100 мл с 60 мл 100% этанола. Ванна-ультразвук до тех пор, пока раствор не станет непрозрачным; это может занять всего 20-30 минут с мелко измельченным фильтром.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно соник, чтобы разбить большие куски; чем больше диссоциированности/непрозрачности, тем лучше. - Накройте раствор пленкой и храните раствор при комнатной температуре в течение ночи.
- Разорвите один стеклянный фильтр из микрофибры марки GF/C толщиной 42,5 мм на мелкие кусочки и поместите их в стакан объемом 100 мл с 60 мл 100% этанола. Ванна-ультразвук до тех пор, пока раствор не станет непрозрачным; это может занять всего 20-30 минут с мелко измельченным фильтром.
- Формирование бислоев на стержнях
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с избытком липидов для достижения полного покрытия стержня, поскольку в этом методе невозможно количественно оценить общую площадь поверхности.- На следующий день раствор этанола будет оседать (этап 3.1.2.), поэтому хорошо перемешайте его перед использованием. Смешайте 10 мкл стержневого раствора и 70 мкл SLBB.
- Вращайтесь с максимальной скоростью в мини-центрифуге в течение 30 с и удаляйте 50 мкл супернатанта. Повторно суспендировать еще в 50 мкл SLBB и повторить отжим в общей сложности четыре промывки, чтобы разбавить этанол.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стержневые опоры не образуют твердой гранулы в нижней части трубки. Вместо этого их размазывают по бокам трубки; это затрудняет их полное сохранение при стирке. Поскольку общая площадь поверхности в этом анализе не контролируется, хорошо, если они нарушены. - Смешайте 10 мкл хорошо смешанного стержневого раствора с 50 мкл внедорожников 5 мМ и 20 мкл SLBB. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, вращая концом-концом как при образовании бислоев на микросферах.
- Вымывание избытка липидов
- Аналогично этапу 3.2.2, вращайте раствор липидного стержня на максимальной скорости в мини-центрифуге в течение 30 с для гранулирования стержней с мембранным покрытием из раствора.
- После первого спина удалите 50 мкл супернатанта и добавьте 200 мкл PRB. После второго и третьего вращений удалите 200 мкл и добавьте 200 мкл PRB. После четвертого спина удалите 200 мкл, добавьте 220 мкл PRB и энергично перемешайте пипетку.
- Подготовка реакции
- В микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл смешайте 721 мкл реакционного буфера с 29 мкл раствора стержня. Хорошо перемешать.
- В ПЦР-пробирке 0,2 мл соедините 75 мкл стержней в реакционном буфере и 25 мкл септинов в нужной концентрации, разведенной в SSB. Дайте ему инкубироваться при комнатной температуре не менее 1 ч.
- Подготовка к сканирующей электронной микроскопии
- После инкубации добавьте 100-мкл септин-стержневую смесь на круглый 12-миллиметровый покров с ПЭГ-покрытием и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч в закрытой чашке Петри.
- Зафиксируйте образец, заполнив дно чашки Петри (должно быть достаточно 10 мл) 2,5% глутаральдегида в 0,05 М какодилата натрия (NaCo), рН 7,4, в течение 30 мин. Аспирируйте жидкость стеклянной пипеткой. Промыть образец, инкубируя его с 10 мл 0,05 М NaCo в течение 5 мин и повторить в общей сложности две промывки.
- Постфиксировать в 0,5% osO4 какодилатный буфер в течение 30 мин, а затем промыть 3 раза в 0,05 М NaCo (5 мин/промывка).
- Инкубировать образец с 1% дубильной кислотой в течение 15 мин, а затем промыть в NaCo 3x. Инкубировать в течение 15 мин в 0,5% OsO4 и промыть 3 раза NaCo.
- Обезвоживать образцы с помощью повышения концентрации этанола: 30% EtOH в течение 5 мин, 2х; 50% EtOH в течение 5 мин; 75% EtOH в течение 5 мин; и 100% EtOH в течение 5 мин, 2x. Затем следует еще 10-минутная инкубация.
- Инкубировать в переходной жидкости (гексаметилдисилазан) 3x (5 мин, 10 мин, затем 5 мин).
- Дайте высохнуть на воздухе, затем поместите образцы в осушитель до распыления покрытия. Напыляйте слой 4 нм сплавом золота/палладия, а затем наносите изображение на сканирующий электронный микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После получения каждого SLB септины или интересующий белок могут быть инкубированы с желаемой поддержкой и визуализированы с помощью TIRFM, конфокальной микроскопии или SEM. Результаты, показанные здесь, используют септины, рекомбинантно экспрессированные и очищенные от E. coli17. С помощью TIRFM на плоских SLP можно определить длину нитей накала и их гибкость, измерить коэффициенты диффузии и наблюдать сборку с течением времени28,29. Для того чтобы собрать измерения высочайшего качества, сначала необходимо выяснить качество бислоев, особенно при их первом приготовлении или при изменении липидных композиций. Визуальный осмотр распределения белка на бислоях с помощью TIRFM может помочь идентифицировать области бислоя, которые были поцарапаны или деформированы. Распределение белка должно быть однородным (рисунок 3A), и в бислое не должно быть отверстий или зазоров (рисунок 3B). Лучше избегать мембран с отверстиями, которые могут образовываться от загрязнения пылью или пятен от обработки слайдов, так как это может изменить распределение белка в других областях бислоя. Чтобы визуализировать саму мембрану, след родамин-ПЭ может быть включен в внедорожники для двухслойного образования. В высококачественных бислоях поле будет выглядеть ровно (изображения не показаны), но если липосомы старые или если промывки недостаточно строгие, на поверхности могут скапливаться невспыхающие и трубчатые липосомы (рисунок 3C). Кроме того, в то время как твердые опоры будут препятствовать свободной диффузии липидов8, липиды не должны быть неподвижными. Эксперименты FRAP могут быть использованы для оценки подвижности липидов на плоских бислоях, которые могут варьироваться в зависимости от состава и должны показывать скорость восстановления порядка30 секунд.
Сферические опоры могут быть использованы для исследования связывания белка на мембранах определенных кривизн либо изолированно (одна кривизна), либо с несколькими кривизнами мембран в одном колодце для наблюдения конкуренции между кривизнами 6,18. Ближний TIRFM на шариках >1 мкм может также использоваться для измерения числа событий ассоциации для данной области27. Как и в случае с планарными бислоями, мы используем родамин-ПЭ для поиска гладкого двухслойного осаждения (рисунок 4А), т.е. отсутствия липидных сгустков, которые указывают на многоламеллярность или невзрывные липосомы (рисунок 4B), и отсутствия зазоров в бислое (рисунок 4C). Для измерения общей адсорбции белка или адсорбции белка с течением времени на изогнутых поверхностях необходимо выделить отдельные шарики друг от друга, чтобы создать дискретный объем, для которого можно измерить сумму липидной интенсивности и сумму интенсивности септина. Таким образом, бусины должны быть хорошо разделены, а не слипнуты вместе, как на рисунке 4D. Мы рассмотрим варианты устранения неполадок для всех этих потенциальных проблем в разделе обсуждения.
Этот анализ SLB также может быть применен к стержневым опорам, которые предлагают среду для белков для отбора проб нескольких кривизин на одной поверхности. Сопряжение этого анализа со сканирующей электронной микроскопией позволяет пользователю исследовать предпочтение кривизны, выравнивание и распределение по длине септинов18 или других интересующих белков. Несмотря на сходство с другими анализами, представленными здесь, стержневой анализ не позволяет тщательно контролировать общую площадь поверхности мембраны из-за гетерогенной природы подложки, полученной из фильтровальной бумаги. Свойства материала фильтровальной бумаги, используемой здесь, приводят к образованию стержней разной длины и диаметра (рисунок 5А); это полезно для изучения зондирования и организации кривизны белка на изогнутых поверхностях (рисунок 5B), но поскольку отношение белка к мембране невозможно контролировать, стержни имеют ограниченную полезность для генерации кривых насыщения-связывания или измерения таких параметров, как константы связывания.
Рисунок 1: Обзор поддерживаемого липидного бислоя образования на опорах с различными кривизнами. Внедорожники инкубируются с твердыми опорами различной геометрии, чтобы изменить кривизны, доступные для отбора проб на данной мембране. Внедорожники адсорбируются на твердой опорной поверхности и разрываются для создания липидных бислоев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схема установки реакционной камеры. Для подготовки пользовательских камер разрезается ПЦР-трубка объемом 0,2 мл там, где трубка начинает сужаться и на колпачке (красные пунктирные линии). Затем неразрезанный ободок разрезанной трубки покрывается тонким слоем УФ-активированного клея (синего цвета) и помещается клеем на крышку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные микроснимки TIRF планарных бислоев. (A) Репрезентативное изображение высококачественного липидного бислоя (75% DOPC, 25% Soy PI) с неполимеризуемыми септинами, связанными (зеленый). Белок не кластеризуется в каких-либо конкретных областях, и нет липосом, прикрепленных к мембране, и нет отверстий. (B) Этот бислой был сделан с плохо очищенными стеклянными крышками и демонстрирует то, что кажется «отверстиями» (белыми стрелками) в мембране, где меньше септинов. Септины можно увидеть переполненными по краям этих дефектов в бислое (обозначенных белыми стрелками в увеличенной области справа). (C) Репрезентативное изображение низкокачественного бислоя с использованием следов родамина-ПЭ. На поверхности видны невзрывные липосомы и трубчатые липиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные микроснимки микросфер с липидным покрытием. Репрезентативные изображения из конкурсных анализов, где были смешаны бусины с липидным покрытием (75% DOPC, 25% Соевого PI, 0,1% rhodamine PE) диаметром 0,3 мкм, 0,5 мкм, 1 мкм, 3 мкм и 5 мкм. Все изображения имеют максимальные Z-проекции. (A) Репрезентативное изображение высококачественной смеси микросфер с липидным покрытием. Сферические опоры равномерно покрыты мембраной, и есть несколько скоплений бусин. (B) Репрезентативное изображение неравномерного мембранного покрытия, вероятно, вызванного недостаточным вымыванием избыточных липидов. (C) Репрезентативное изображение бусин с зазорами в мембранном покрытии (белые стрелки) из-за неправильного обращения. (D) Репрезентативное изображение плотно сгруппированных бусин, вероятно, вызванное недостаточным перемешиванием на протяжении всей процедуры, особенно при объединении различных бусин вместе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные электронные микроснимки стержней с липидным и септиновым покрытием. (A) SEM-изображение, показывающее распределение длин и диаметров стержней с липидным покрытием (75% DOPC, 25% Soy PI, 0,1% Rhodamine PE). (B) Край изолированного стержня с мембранным покрытием с септиновыми нитями, выровненными вдоль оси положительной кривизны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клеточные мембраны приобретают множество различных форм, кривизн и физико-химических свойств. Для изучения нанометрового механизма, с помощью которого клетки строят микрометровые сборки, необходимо спроектировать минимальные системы восстановления мембранной миметики. Этот протокол представляет методы, которые точно контролируют как кривизну мембраны, так и состав, позволяя пользователю легко проводить количественные измерения флуоресценции с использованием широко доступных методов микроскопии.
Наиболее важными компонентами этого протокола являются сборка колодцев на соответствующей поверхности и обработка липидов. Скважины, описанные здесь, изготавливаются вручную с использованием ПЦР-трубок и УФ-активированных клеев; важно не попасть клеем внутрь реакционной зоны во время сборки. Это можно проверить во время эксперимента, визуализируя по краям скважины и ища высокую адсорбцию белка на покровном стекле. Пользователь может выбрать альтернативные материалы для скважин, такие как силикон, которые могут быть заказаны коммерчески, но представленный способ обеспечивает прочные скважины, которые не будут смещаться или протекать и могут поддерживать большие объемы реакции. Поверхность покровного стекла, в наших руках, была очень важна для формирования плоских бислоев. Оптимизация времени плазменной очистки или даже марки покровного стекла может потребоваться, чтобы увидеть равномерное образование бислоев, поскольку соответствующая обработка поверхности и заряд имеют решающее значение для адсорбции и плавленияпузырьков 31,32,33. При первой постановке этих экспериментов или работе с новыми липидными композициями для оценки текучести мембраны по сравнению с отдельно стоящими системами30 следует использовать флуоресцентное восстановление после фотоотбеливания (FRAP). Ожидается, что вспомогательные системы будут менее гибкими, чем их отдельно стоящие аналоги, но не неподвижными12.
При оценке двухслойного качества по флуоресценции важно искать невспыхающие липосомы или дефекты в бислое (рисунок 3C), так как они могут изменить местную адсорбцию белка. Можно рассмотреть следующие варианты устранения неполадок. a) Можно настроить подготовку внедорожника для улучшения двухслойного качества. Обработка ультразвуком, замораживание-оттаивание и экструзия являются широко используемыми методами, которые могут варьироваться по легкости и успеху в зависимости от липидных композиций. В наших руках полностью осветленный раствор внедорожника с монодисперсным распределением размеров приводит к наиболее однородным бислоям. Динамическое рассеяние света (DLS) может быть использовано для оценки распределения по размерам25. б) Можно увеличить разницу в концентрации соли между внутренней частью внедорожников и внешним буфером. За счет снижения концентрации внутренних ионов (или увеличения внешней) осмотическая нагрузка на внедорожники увеличивает вероятность разрыва31. Альтернативно, изменение присутствующего моновалентного катиона может изменить кинетику образования SLB и помочь в оптимизации SLB новых липидных композиций34. в) Можно увеличить количество или силу стирок. По опыту авторов, энергичное перемешивание во время стирки приводит к более чистым бислоям и не кажется разрушительным; вместо этого самая большая проблема возникает из-за случайного соскабливания бислоя с наконечниками пипеток, которые будут появляться в виде засорения в мембране. Для изогнутых бислоев лучше всего свести к минимуму обработку узкими наконечниками пипеток и осторожно смешивать при выполнении этапов стирки, особенно для более крупных (>1 мкм) бусин, так как мембрана может быть срезана со стеклянных шариков. Если наблюдаются постоянные зазоры в шаровидных мембранных бислоях (рисунок 4С), может помочь увеличение ширины кончиков пипетки (путем отсечения конца наконечника или покупки широких наконечников) и максимальное сокращение обработки, при этом все еще полностью перемешивая бисерный раствор. Одной из распространенных технических проблем с этой техникой является тенденция бусин слипаться вместе (рисунок 4D). Это может быть частично решено путем увеличения времени обработки ультразвуком до образования бислоя; однако некоторая кластеризация неизбежна, поскольку бусины с мембранным покрытием могут также иметь тенденцию сгущаться с течением времени в колодце. Для количественного анализа следует избегать слипшихся бусин.
Ограничения количественных измерений одномолекулярной динамики на плоских бислоях включают необходимость оставаться на низких концентрациях, чтобы точно отслеживать и подсчитывать частицы. Однако это может быть исправлено путем недостаточной маркировки белка, представляющего интерес во время приобретения, чтобы уменьшить количество частиц, видимых во время отслеживания35. Кроме того, сферические и стержневые SLB были разработаны специально для количественной оценки чувствительности к кривизне белков на мембранах микрометрового масштаба, а микросферы кремнезема, используемые здесь, доступны только до 100 нм в диаметре, и в этот момент они являются дифракционно-ограниченной пунктой при просмотре световой микроскопией. Таким образом, те, кто хочет оценить точную специфичность кривизны на меньших диаметрах, не смогут сделать это с помощью этого метода. Тем не менее, этот метод по-прежнему предоставит ценную информацию о тенденции предпочтения кривизны и позволит препарировать сборки, зависящие от кривизны.
По сравнению со отдельно стоящими липидными двухслойными системами, эта методика поддается широкому спектру буферных условий и не требует тщательной осмотической балансировки во время приготовления. Кроме того, поскольку в нем используются стеклянные опоры, бислои легко опускаются на дно колодца, устраняя необходимость в привязке или использовании сахарозы или других загустителей36. В то время как отдельно стоящие липидные двухслойные системы являются полезным средством исследования деформации мембраны мембраносвязывающими белками, трудно изучить взаимосвязь между кривизной мембраны и сложной сборкой. В отличие от легко деформируемых мембранных систем, этот подход позволяет пользователю использовать различные липидные композиции без внутренней формы отдельных липидных видов, диктующих глобальную геометрию мембраны. Наконец, палочковидные SLB позволяют проводить выборку множественных кривизн на одной и той же непрерывной мембране для интересующих белков (рисунок 5B), что является уникально информативным для оценки кривизнозависимых сборок или колокализации нескольких компонентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Грантом Национального института здравоохранения (NIH) No. R01 GM-130934 и грант Национального научного фонда (NSF) MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. и K.S.C. были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук в рамках премии T32 GM119999.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22x22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
- Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
- Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
- Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
- Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
- Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
- Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
- Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
- Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
- Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
- Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
- Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
- Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
- Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
- Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
- Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
- Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
- Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
- Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
- Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
- Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
- Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
- Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
- Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
- Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
- Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
- Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
