Summary
무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.
Abstract
대부분의 세포는 근본적인 세포 과정을 수행하기 위해 모양을 감지하고 변경할 수 있습니다. 많은 진핵생물에서, 셉틴 세포골격은 사이토카인증, 편광된 성장 및 이동과 같은 형태 변화를 조정하는데 필수적인 성분이다. 셉틴은 다양한 고차 구조를 형성하기 위해 조립하는 필라멘트 형성 단백질이며, 많은 경우 원형질막의 다른 영역, 특히 미크론 규모의 양성 곡률 영역에서 발견됩니다. 생체 내에서 셉틴 조립 과정을 모니터링하는 것은 세포의 광 현미경 검사의 한계뿐만 아니라 막 및 세포 골격 요소와의 상호 작용의 복잡성으로 인해 방해를 받아 살아있는 시스템에서 셉틴 역학을 정량화하기가 어렵습니다. 다행스럽게도, 지난 십 년 동안 높은 공간 및 시간적 해상도에서 셉틴 어셈블리를 제어하는 메커니즘을 해부하기 위해 세포없는 시스템에서 셉틴 세포 골격을 재구성하는 데 상당한 진전이있었습니다. 셉틴 조립의 핵심 단계는 셉틴 헤테로올리고머 회합 및 막과의 해리, 필라멘트로의 중합, 필라멘트 간의 상호작용을 통한 고차 구조의 형성을 포함한다. 여기에서는 다른 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 방법을 제시합니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대. 이러한 방법은 조립의 여러 단계에서 셉틴의 생물 물리학 적 매개 변수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 : 멤브레인을 결합하는 단일 옥타머로서, 필라멘트로서, 필라멘트의 어셈블리로. 우리는 곡률 샘플링 및 우대 흡착의 측정과 함께 이러한 매개 변수를 사용하여 곡률 감지가 다양한 길이 및 시간 척도에서 어떻게 작동하는지 이해합니다.
Introduction
세포의 모양과 많은 내부 구획은 그들을 둘러싸고있는 지질 막에 의존합니다. 막은 단백질과의 상호작용, 지질 분류 및 내외부 힘의 작용을 통해 변형되어 다양한 형상 1,2,3,4을 생성할 수 있는 점탄성 구조이다. 이러한 형상은 종종 막 곡률의 관점에서 설명된다. 세포는 세포 밀매, 사이토카인증 및 이동5,6을 포함하는 과정에 대해 정의된 시공간적 제어를 보장하기 위해, 특정 막 곡률에 우선적으로 조립하거나 "감지"할 수 있는 다양한 단백질 세트를 사용한다. 멤브레인에서 세포 기계의 역학은 시간과 공간 분해능과 세포 건강의 균형을 맞추는 것이 어렵 기 때문에 관찰하기가 특히 어렵습니다. 초분해능 기술은 이러한 구조에 대한 자세한 보기를 제공할 수 있지만, 대부분의 기계류에서 조립/분해의 시간 척도에 부합하지 않는 긴 인수가 필요합니다. 또한, 이러한 어셈블리의 기본 환경에서 분자 복잡성과 단일 구성 요소가 수행 할 수있는 다양한 역할은 최소한의 재구성 시스템을 분자의 기능적 능력을 연구하는 데 유용한 도구로 만듭니다.
세포 외부의 막 특성 및 단백질-막 상호작용을 연구하기 위해 최소한의 막 모조물이 개발되었다. 막 모조물은 리포솜 또는 거대한 유니라멜라 소포와 같은 독립형 지질 이중층으로부터 지지된 지질 이중층(SLBs)7,8,9,10에 이르기까지 다양하다. SLB는 기본 지지체에 앵커링된 생체모방 막으로, 전형적으로 유리, 운모 또는 실리카11,12로 구성된다. 평면 표면, 구체, 막대, 심지어 오목한 곡률과 볼록한 곡률 모두에서 단백질-막 상호작용을 동시에 조사하기 위해 기복 또는 미세패턴화된 기판을 포함한 다양한 형상을 사용할 수 있습니다1 3,14,15,16,17,18 . 이중층 형성은 친수성 표면 상에 소낭 흡착으로 시작하고, 이어서 융합 및 파열이 뒤이어 연속적인 이중층을 형성한다(도 1)19. 지지되는 이중층은 특히 빛과 전자 현미경에 적합하며, 세포에서 종종 달성할 수 있는 것보다 더 나은 시간과 공간 분해능을 제공한다. 곡선형 SLB는 특히 상당한 막 변형이 없을 때 단백질 곡률 감도를 프로브하는 매력적인 수단을 제공하여 곡률 감지와 곡률 유도를 구별할 수 있으며, 이는 종종 독립 시스템에서 분리할 수 없습니다.
셉틴은 필라멘트-형성 세포골격 단백질의 부류로서 양성 곡선 막(6,18,20)에 조립하는 능력으로 잘 알려져 있다. 효모에서 세포 주기의 과정에 걸쳐, 셉틴은 고리로 조립하고, 새싹 출현 및 사이토카인증과 관련된 모래시계 및 이중 고리 구조를 형성하기 위해 재배열되어야 한다(21). 다양한 세포주기 단계22에서 셉틴 구조를 관찰하기 위해 백금 복제 전자 현미경을 사용하여 아름다운 작업이 수행되었지만 효모에서 광 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 셉틴 조립을 관찰하는 것은 제한된 공간 해상도를 충족했습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 시각화 된 지질 단층을 사용하는 셉틴에 대한 이전의 연구는 고리, 번들 및 거즈23과 같은 몇 가지 흥미로운 셉틴 구조를 재구성 할 수있었습니다. 그러나, EM 기술은 형광 현미경과 달리 그들의 시간적 분해능에서 마찬가지로 제한된다. 셉틴 어셈블리의 다중 스케일 공정의 운동 파라미터를 더 잘 해결하기 위해, 우리는 멤브레인 지오메트리, 샘플 조건 및 이미징 양식을 신중하게 제어 할 수있는 지원되는 멤브레인 모방체로 전환했습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 평면 또는 곡선형 SLB, 정제된 단백질 및 현미경 기술의 조합을 사용합니다. 정량적 형광 공초점 현미경 및 총 내부 반사 형광 현미경 (TIRFM)을 사용하여 다양한 막 곡률에 대한 벌크 단백질 결합을 측정하고 단일 분자의 결합 동역학을 측정했습니다. 또한,이 프로토콜은 주사 전자 현미경 (SEM)과 함께 사용하여 다른 막 곡률에서 단백질 울트라 구조를 검사하도록 조정되었습니다. 이러한 프로토콜의 초점은 셉틴 세포 골격에 있지만, 프로토콜은 독자가 흥미를 느끼는 모든 단백질의 곡률 감도를 조사하기 위해 쉽게 변형 될 수 있습니다. 추가적으로, 엔도사이토시스 또는 수포 밀매와 같은 분야에서 일하는 사람들은 다중 단백질 복합체의 곡률 의존성 어셈블리를 프로빙하는데 유용한 이들 기술을 발견할 수 있다.
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Protocol
참고: 지지된 지질 이중층을 형성하려면 단분산 된 소형 일조기 소포 (SUV)를 준비해야합니다. SUV 형성에 대해 이전에 발표 된 프로토콜24를 참조하십시오. 간단히 말해서, 모든 SUV는 4 분 초음파 처리 기간을 통해 70 % 진폭에서 총 12 분 동안 프로브 초음파 처리에 의해 형성되고 얼음물에서 2 분의 휴식 기간이 뒤 따른다. SUV 솔루션은 크기가 잘 명확하고 단분산되어야합니다. SUV의 크기 분포는 예를 들어, 동적 광산란(25)에 의해 측정될 수 있다.
1. 평면 지질 이중층
- 슬라이드의 플라즈마 청소
참고: 플라즈마 세척은 유기 오염 물질을 제거하고 유리의 친수성을 증가시켜 효율적인 지질 흡착을 보장합니다. 다음 단계는 사용되는 플라즈마 클리너 및 유리 커버슬립에 따라 변경되거나 최적화될 필요가 있습니다.- 플라즈마 클리너를 산소로 5 분 동안 정화하여 라인과 챔버에서 공기를 제거하십시오. 이는 플라즈마 클리너가 실행될 때 라인과 챔버에 주로 산소가 존재하여보다 일관된 이중층 준비를 제공하도록하기위한 것입니다.
- 퍼징하는 동안N2 또는 Ar과 같은 불활성 가스를 마이크로 커버 유리 슬라이드 위로 흘려서 먼지와 미립자를 제거합니다.
선택 사항: 커버 글라스 슬라이드는 양쪽에 100% 이소프로판올을 뿌린 후 물을 뿌려 세척할 수 있습니다. 이소프로판올-물 세척을 3x 반복한 다음,N2 스트림으로 건조시킨다. - 드라이 커버 유리 슬라이드를 세라믹 크래들에 배치하십시오. 커버슬립이 챔버의 긴 가장자리와 평행하도록 플라즈마 챔버의 뒤쪽에 크래들을 놓습니다(플라즈마 세척 중에 제자리에 고정시킵니다). 최대 전력에서 산소로 15 분 동안 플라즈마 클리너를 실행하십시오.
- 챔버 준비
참고: 여기에 설명된 방법은 반응 부피를 지지하기 위해 플라스틱 PCR 튜브의 수제 챔버를 사용하지만, 실리콘 웰과 같은 다른 낮은 접착력 물질도 적합할 수 있습니다.- 면도날이나 가위를 사용하여 0.2mL PCR 튜브의 서리가 내린 부분 바로 아래에 있는 캡을 잘라냅니다(그림 2).
- PCR 튜브의 테두리를 UV 활성화 접착제로 페인트하여 튜브 내부를 피하십시오. PCR 튜브 접착제를 플라즈마 세척된 커버슬립의 중앙에 부드럽게 놓습니다.
참고 : 챔버 내부의 접착제를 피하려면 최소량의 접착제를 사용하여 씰을 얻고 챔버를 부딪 치거나 방해하지 않고 UV로 즉시 처리하십시오. - 챔버를 장파장 UV 광 아래에 5-7 분 동안 놓고 접착제를 경화시킵니다.
- 이중층 형성
참고: 효율적인 이중층 형성을 위해 이 단계에서 단일 분산 SUV를 사용해야 합니다. 표 1은 스톡 및 최종 버퍼 농도를 포함하여 이중층 형성에 사용되는 모든 완충제에 대한 레시피를 제공한다.- 추가로 40 μL의 지지된 지질 이중층 완충액 (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mMMgCl2; 표 1), 10 μL의 5 mM SUV, 및 1 μL의 100 mMCaCl2를 웰로 한다. 챔버를 좌우로 부드럽게 흔들어 SUV를 파괴한 다음, 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
참고: 증발을 제한하려면 젖은 물티슈로 덮인 페트리 접시에서 배양하십시오.
- 추가로 40 μL의 지지된 지질 이중층 완충액 (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mMMgCl2; 표 1), 10 μL의 5 mM SUV, 및 1 μL의 100 mMCaCl2를 웰로 한다. 챔버를 좌우로 부드럽게 흔들어 SUV를 파괴한 다음, 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- 과도한 지질을 씻어 내기
참고: 이 단계는 과도한 SUV를 제거하고 버퍼 교환 단계 역할을 합니다. 세척하는 동안 피펫 팁으로 이중층을 긁지 않는 것이 매우 중요합니다. 유리가 노출되면 셉틴과 다른 많은 단백질이 돌이킬 수 없게 결합하여 효과적인 단백질 농도를 줄입니다.- 인큐베이션 후, 이중층 6x를 150 μL의 SLBB로 헹구고, 기포를 피하면서 매번 혼합하기 위해 위아래로 피펫팅한다.
참고: 150 μL를 50 μL의 완충액에 직접 첨가하고 반응 웰에 이미 존재하는 SUV를 총 200 μL로 첨가한다. - 셉틴 또는 선택된 다른 단백질과 함께 인큐베이팅을 시작할 준비가 되면, 이중층을 150 μL의 반응 완충액 (RXN: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1.4 mg/mL BSA, 0.14% 메틸셀룰로스, 1 mM BME)으로 세척한다.
참고: 최상의 결과를 얻으려면 반응 버퍼를 신선하게 만들고 반응물을 잘 혼합하는 동안 기포를 피하기 위해 매우 조심하십시오. - 마지막 세척 단계에서 125 μL의 반응 완충액을 제거하고 75 μL를 웰에 남겨 둡니다. 셉틴 저장 완충액 (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME)에 희석된 셉틴 25 μL를 원하는 농도로 첨가하고 TIRF 현미경26으로 이미지화하였다.
참고: 이 분석을 처음 설정하거나 새로운 지질 조성물을 통합할 때는 광표백 후 형광 회수(FRAP)를 사용하여 지질이 표면에 자유롭게 확산되도록 하는 것이 좋습니다. 회복 속도는 상이한 지질 조성물에 대해 상이할 것이고 독립형 시스템에 대해 본질적으로 더 낮을 것이지만, 지질은 움직이지 않아야 한다.
- 인큐베이션 후, 이중층 6x를 150 μL의 SLBB로 헹구고, 기포를 피하면서 매번 혼합하기 위해 위아래로 피펫팅한다.
| 지원되는 지질 이중층 버퍼 (SLBB) | ||
| 주식 | 음량 | 최종 농도 |
| 2 엠 KCl | 1.5 mL | 300 밀리미터 |
| 1 M 헤페스 | 200 μL | 20 밀리지미터 |
| 500 mMMgCl2 | 20 μL | 1 밀리지미터 |
| 물 | 8 mL | |
| 사전 반응 완충액 (PRB) | ||
| 주식 | 음량 | 최종 농도 |
| 2 엠 KCl | 166 μL | 33.3 밀리지미터 |
| 1 M 헤페스 | 500 μL | 50 밀리지미터 |
| 물 | 9.33 mL | |
| 반응 완충액 | ||
| 주식 | 음량 | 최종 농도 |
| 2 엠 KCl | 166 μL | 33.3 밀리지미터 |
| 1 M 헤페스 | 300 μL | 50 밀리지미터 |
| 10 밀리그램/mL BSA | 1.39 mL | 1.39 밀리그램/mL |
| 1% 메틸셀룰로오스 | 1.39 mL | 0.0014 |
| 물 | 최대 10 mL | |
| 증권 시세 표시기 | 0.7 μL | 1 밀리지미터 |
| 셉틴 스토리지 버퍼(SSB) | ||
| 주식 | 음량 | 최종 농도 |
| 2 엠 KCl | 1.5 mL | 300 밀리미터 |
| 1 M 헤페스 | 500 μL | 50 밀리지미터 |
| 물 | 최대 10 mL | |
| 증권 시세 표시기 | 0.7 μL | 1 밀리지미터 |
표 1: 지지된 지질 이중층 및 반응의 제조를 위한 완충액 성분. 완충제에 혼입되는 스톡 용액의 부피와 각 성분의 최종 농도가 표시됩니다. SLB 및 PRB는 실온에서 저장되고 실험 사이에 재사용될 수 있다. 반응 완충액 및 SSB는 각 실험에 대해 신선하게 만들어진다.
2. 구형 지지형 지질 이중층
참고: 이 프로토콜은 10% 밀도의 초순수에 현탁된 실리카 미소 구체를 사용합니다. 단백질 어셈블리의 운동 매개 변수에 대한 모든 작업의 경우 실험과 곡률 사이의 전체 막 표면적을 엄격하게 제어하는 것이 중요합니다. 표 2는 총 막 표면적의 5mm2를 유지하는 비드 및 완충액의 보정된 부피를 나타낸다. 이 프로토콜은 이전에 공개된 방법8,18에서 확장됩니다.
- 이중층 형성
참고 : 평면 이중층의 경우 견고한 이중층 형성을 위해 고품질 SUV를 보유하는 것이 중요합니다. 표 2 는 비드 직경의 범위에 대해 5mm2 의 최종 표면적을 얻기 위해 사용되는 10% 밀도 용액으로부터의 비드의 부피 및 이들의 각각의 SLBB 부피를 열거한다.- 실리카 미소 구체 (비드라고도 함)는 함께 침전되고 응집되는 경향이 있습니다. 구슬을 혼합하고 클러스터를 분해하기 위해 병을 15 초 동안 소용돌이 치고, 1 분 동안 목욕 초음파 처리하고, 15 초 동안 다시 소용돌이친다.
- 적절한 부피의 비드(표 2)를 0.5 mL 저접착성 마이크로원심분리 튜브에 상응하는 부피의 SLBB 및 10 μL의 5 mM SUV와 혼합한다.
- 비드-지질 혼합물을 말단-오버-엔드-실온에서 1 h 동안 락한다. 침강을 방지하기 위해이 인큐베이션이 회전기에서 수행되는지 확인하십시오.
- PEGylated 커버 슬립에 챔버 준비
참고 : 평면 이중층의 경우 플라스틱 PCR 튜브의 수제 챔버가 반응 부피를 지원하는 데 사용되지만 실리콘 웰과 같은 다른 낮은 접착력 재료도 마찬가지로 작동 할 수 있습니다.- 비드가 흔들리는 동안, 실온에서 PEGylated 커버슬립을 해동시킨다. 0.2 mL PCR 튜브를 절단하고 이를 단계 1.2에 기재된 바와 같이 커버슬립에 붙인다. 24mm x 50mm 슬라이드의 경우 최대 10개의 챔버를 하나의 슬라이드에 장착할 수 있습니다.
참고: 이 프로토콜은 사전에 준비된 24mm x 50mm PEGylated 유리 커버슬립을 사용합니다. 간단히 말해서, 유리 커버 슬립은 아세톤, 메탄올 및 3 M KOH에서 초음파 처리를 통해 철저히 청소됩니다. 커버슬립은 이어서 n-2-아미노에틸-3-아미노프로필트리메톡시실란으로 작용되고 mPEG 숙신이미딜 발레레이트에 공유적으로 연결된다. 완성된 PEGylated 커버슬립은 -80°C에서 진공 밀봉되어 저장된다. 유사한 패시베이션 프로토콜에 대해서는 Gidi et al.27의 작업을 참조하십시오. PEGylated 유리 커버슬립이 여기에서 제안되는 반면, BSA 또는 폴리-L-리신 방법과 같은 다른 패시베이션 수단이 효과적일 수 있다.
- 비드가 흔들리는 동안, 실온에서 PEGylated 커버슬립을 해동시킨다. 0.2 mL PCR 튜브를 절단하고 이를 단계 1.2에 기재된 바와 같이 커버슬립에 붙인다. 24mm x 50mm 슬라이드의 경우 최대 10개의 챔버를 하나의 슬라이드에 장착할 수 있습니다.
- 과도한 지질을 씻어 내기
참고: 이 단계는 과도한 SUV를 제거하고 버퍼 교환을 수행하는 기능을 수행합니다. 비드는 예비반응 완충액 (PRB: 33.3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4)으로 총 4배 세척된다. 표 3 은 비드 직경의 범위에 대한 RCF의 스핀 속도를 나열한다.- 지정된 RCF에서 비드를 30초 동안 회전시킨다(표 3). 여러 비드 크기를 사용하는 경우 구슬을 씻을 때까지 흔들어 두십시오.
참고 : 시간을 절약하기 위해 더 작은 구슬 침강 속도로 작은 구슬과 같은 스핀으로 더 큰 구슬을 침전시키는 것은 가치가 없습니다. 이로 인해 구슬이 서로 달라 붙어 이중층의 무결성이 손상 될 수 있습니다. - 첫 번째 스핀 후, 50 μL의 상청액을 제거하고 200 μL의 PRB를 첨가한다. 두 번째 및 세 번째 스핀 후 200 μL를 제거하고 200 μL의 PRB를 첨가하십시오. 네 번째 스핀 후, 200 μL를 제거하고 220 μL의 PRB를 첨가한다. 각 세척마다 피펫을 격렬하게 사용하십시오.
참고: 최종 재현탁 부피는 세척과 다릅니다. 지질과 함께 인큐베이션 한 후에 비드를 와류하지 마십시오.이 이중층에 틈새를 남길 수 있습니다. 다른 비드 크기로 작업하거나 분석의 다른 부분을 설정하는 동안 침강을 피하려면 비드 혼합물을 엔드 오버 엔드 회전기에 다시 놓습니다.
- 지정된 RCF에서 비드를 30초 동안 회전시킨다(표 3). 여러 비드 크기를 사용하는 경우 구슬을 씻을 때까지 흔들어 두십시오.
- 반응물 준비
참고: 이 반응은 반응의 총 막 표면적을 5mm2로 보존하고 100mM KCl, 50mM HEPES, 1mg/mL BSA, 0.1% 메틸셀룰로오스 및1mM BME의 최종 반응 조건을 생성하도록 설계되었습니다.- 여러 비드 크기로 경쟁 분석을 수행하는 경우 각 비드 크기의 동일한 부피를 함께 혼합하여 1:1 혼합물을 만듭니다. 이어서, 29 μL의 원하는 비드 혼합물 (또는 단일 비드의)을 721 μL의 RXN 완충액과 혼합한다.
참고 : 구슬의 조밀 한 클러스터를 피하기 위해 각 단계에서 비드를 피펫과 철저히 혼합하는 것이 중요합니다. 이것은 더 균일 한 비드 분포와 정확한 전체 표면적을 초래할 것입니다. - 희석된 비드 75μL와 SSB에 희석된 단백질 25μL를 웰에 혼합한다.
참고: 저자들은 전형적으로 효모 셉틴 복합체를 1-50 nM로 이미지화한다. - 정상 상태에서 셉틴을 측정하는 경우, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 근-TIRF 또는 공초점 현미경으로 이미지를 촬영한다.
- 여러 비드 크기로 경쟁 분석을 수행하는 경우 각 비드 크기의 동일한 부피를 함께 혼합하여 1:1 혼합물을 만듭니다. 이어서, 29 μL의 원하는 비드 혼합물 (또는 단일 비드의)을 721 μL의 RXN 완충액과 혼합한다.
| 비드 직경 (μm) | 잘 혼합된 비드의 부피(μL) | SLB 버퍼의 부피 (μL) | SUV의 양 (μL) |
| 6.46 | 8.94 | 61.1 | 10 |
| 5.06 | 7 | 63 | 10 |
| 3.17 | 4.39 | 65.6 | 10 |
| 0.96 | 1.33 | 68.7 | 10 |
| 0.54 | 0.75 | 69.3 | 10 |
| 0.31 | 0.43 | 69.6 | 10 |
표 2: 미소 구체들의 정규화된 부피. 각 비드 크기의 동일한 표면적을 유지하고 실험 사이에 전체 막 표면적을 일관되게 유지하기 위해, 전체 표면적을 정규화하는 각 비드 크기 및 완충액에 대한 부피를 계산하였다.
| 비드 직경(μm) | 침강 속도 (RCF) |
| 0.31 | 4.5 |
| 0.54 | 4.5 |
| 0.96 | 2.3 |
| 3.17 | 0.8 |
| 5.06 | 0.3 |
표 3: 다양한 직경의 미소 구체들에 대한 침강 속도. 각각의 비드 직경에 대해, 도시된 최소 침강 속도는 결합되지 않은 리포솜을 세척하기 위해 비드를 펠릿화하기 위해 사용되었다.
3. 막대 지원 지질 이중층
참고: 여기에 제시된 다른 분석법과는 달리, 막대 분석은 전체 멤브레인 표면적을 신중하게 제어하는 것을 허용하지 않습니다. 하나는 실험 사이의 양과 부피에서 일관성이있을 수 있지만, 이로 인해 길이와 직경이 다른 막대가 생기기 때문에 반응에서 전체 막 표면적을 추정하기가 어렵습니다. 따라서, 이것은 단일 표면에서 여러 곡률로 곡률 감지를 탐구하기 위한 우수한 분석이고 셉틴 울트라 구조를 탐구하는 데 유용하지만, 운동 측정에는 권장되지 않는다. 이 방법은 이전에18 번보고되었으며 여기에서 확장되고 있습니다.
- 유리 마이크로 화이버 필터에서 붕규산 막대 얻기
- 단일 42.5mm 등급 GF/C 유리 극세사 필터를 작은 조각으로 찢어 100% 에탄올 60mL가 든 100mL 비이커에 넣습니다. 용액이 불투명해질 때까지 목욕 - 초음파 처리; 미세하게 파쇄 된 필터로 20-30 분 정도 걸릴 수 있습니다.
참고 : 큰 덩어리를 분해하기 위해 철저히 초음파 처리하십시오. 해리 / 불투명 할수록, 더 좋습니다. - 용액을 필름으로 덮고 용액을 실온에서 밤새 보관하십시오.
- 단일 42.5mm 등급 GF/C 유리 극세사 필터를 작은 조각으로 찢어 100% 에탄올 60mL가 든 100mL 비이커에 넣습니다. 용액이 불투명해질 때까지 목욕 - 초음파 처리; 미세하게 파쇄 된 필터로 20-30 분 정도 걸릴 수 있습니다.
- 막대에 이중층 형성
참고 :이 단계는이 방법에서 전체 표면적을 정량화하는 것이 불가능하기 때문에 완전한 막대 커버리지를 달성하기 위해 과도한 지질로 수행됩니다.- 다음날 에탄올 용액이 침전될 것이므로(단계 3.1.2.), 사용하기 전에 잘 섞는다. 10 μL의 막대 용액과 70 μL의 SLBB를 결합하십시오.
- 30초 동안 미니 원심분리기에서 최고 속도로 회전하고 상층액 50 μL를 제거하였다. 또 다른 50 μL의 SLBB에 재현탁하고, 에탄올을 희석하기 위해 총 네 번의 세척 동안 스핀을 반복한다.
참고 : 막대 지지대는 튜브 바닥에 단단한 펠렛을 형성하지 않습니다. 그들은 대신 튜브의 측면을 따라 번집니다. 이것은 씻을 때 완전히 보존하기가 어렵습니다. 이 분석의 전체 표면적은 제어되지 않기 때문에 방해를 받으면 괜찮습니다. - 10μL의 웰 혼합 로드 용액을 50μL의 5mM SUV 및 20μL의 SLBB와 결합합니다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 미소 구체 상에 이중층을 형성할 때와 같이 말단을 회전시킨다.
- 과도한 지질을 씻어 내기
- 단계 3.2.2.와 유사하게, 지질-막대 용액을 30초 동안 미니 원심분리기에서 최고 속도로 스핀하여 멤브레인 코팅된 막대를 용액 밖으로 펠릿화한다.
- 첫 번째 스핀 후, 상청액 50 μL를 제거하고 PRB 200 μL를 첨가한다. 두 번째 및 세 번째 스핀 후 200 μL를 제거하고 200 μL의 PRB를 첨가하십시오. 네 번째 스핀 후, 200 μL를 제거하고, 220 μL의 PRB를 첨가하고, 피펫을 격렬하게 혼합한다.
- 반응물 준비
- 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서, 721 μL의 반응 완충액과 29 μL의 막대 용액을 혼합한다. 잘 섞는다.
- 0.2 mL PCR 튜브에서, 75 μL의 막대를 반응 완충액에 결합시키고 원하는 농도로 25 μL의 셉틴을 SSB에 희석하였다. 실온에서 적어도 1 시간 동안 인큐베이션하도록 허용하십시오.
- 주사 전자 현미경 검사 준비
- 인큐베이션 후, 100 μL 셉틴-로드 혼합물을 둥글고 PEG가 코팅된 12 mm 커버슬립 상에 첨가하고, 밀폐된 페트리 디쉬에서 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다.
- 페트리 접시 바닥(10mL이면 충분해야 함)을 0.05M 소듐 카코딜레이트(NaCo), pH 7.4 중 2.5% 글루타르알데히드로 채워 샘플을 30분 동안 고정시킨다. 유리 피펫으로 액체를 흡인하십시오. 10 mL의 0.05 M NaCo로 인큐베이션하여 샘플을 5분 동안 세척하고 총 두 번의 세척을 반복한다.
- 30분 동안 0.5%OsO4 카코딜레이트 완충액에 접미사를 넣은 다음, 0.05M NaCo(5분/세척)로 3배 세척한다.
- 샘플을 15분 동안 1% 탄닌산으로 인큐베이션한 다음, NaCo 3x로 세척한다. 0.5%OsO4 에서 15분 동안 인큐베이션하고 NaCo로 3x 세척한다.
- 증가된 에탄올 농도를 사용하여 샘플을 탈수시킨다: 5분 동안 30% EtOH, 2x; 5분 동안 50% EtOH; 5분 동안 75% EtOH; 5 분 동안 100 % EtOH, 2x. 또 다른 10 분 인큐베이션을 따르십시오.
- 전이 유체 (헥사메틸디실라잔) 3x (5 분, 10 분, 그 후 5 분)에서 인큐베이션한다.
- 공기 건조를 허용한 다음, 스퍼터가 코팅될 때까지 샘플을 데시케이터에 넣습니다. 스퍼터는 4nm 층을 금/팔라듐 합금으로 코팅한 다음 주사 전자 현미경으로 이미지를 만듭니다.
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Representative Results
각각의 SLB의 제조에 이어서, 셉틴 또는 관심있는 단백질은 원하는 지지체와 함께 인큐베이션되고 TIRFM, 공초점 현미경 또는 SEM을 통해 영상화될 수 있다. 여기에 나타낸 결과는 대장균17로부터 재조합적으로 발현되고 정제된 셉틴을 사용한다. 평면 SLB에서 TIRFM을 사용하면 필라멘트의 길이와 유연성을 결정하고 확산 계수를 측정하며 시간28,29에 따른 조립을 관찰 할 수 있습니다. 최고 품질의 측정을 수집하기 위해서는 먼저 이중층의 품질을 확인해야하며, 특히 처음으로 준비하거나 지질 조성을 변경할 때 특히 그렇습니다. TIRFM에 의한 이중층에서의 단백질 분포를 육안으로 검사하면 긁혔거나 기형화된 이중층의 영역을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 분포는 균질해야 하며(그림 3A), 이중층에 구멍이나 틈이 없어야 합니다(그림 3B). 먼지 오염 또는 슬라이드 처리로 인한 얼룩으로 인해 형성 될 수있는 구멍이있는 멤브레인은 이중층의 다른 영역에서 단백질 분포를 바꿀 수 있으므로 피하는 것이 가장 좋습니다. 멤브레인 자체를 시각화하기 위해, 트레이스 로다민-PE는 이중층 형성을 위해 SUV에 통합될 수 있다. 고품질 이중층에서는 필드가 나타나지만(이미지는 표시되지 않음), 리포솜이 오래되었거나 세척이 충분히 엄격하지 않은 경우 파열되지 않고 세관된 리포솜이 표면에 축적될 수 있습니다(그림 3C). 추가적으로, 고체 지지체가 지질(8)의 자유로운 확산을 방해할 것이지만, 지질은 움직이지 않아야 한다. FRAP 실험은 평면 이중층 상의 지질의 이동성을 평가하는데 사용될 수 있으며, 이는 조성에 따라 변할 수 있고30초 단위로 회복률을 보여줘야 한다.
구형 지지체는 단리(하나의 곡률) 또는 동일한 웰에서 여러 막 곡률로 정의된 곡률의 막에 대한 단백질 결합을 검사하여 곡률 6,18 사이의 경쟁을 관찰하는 데 사용될 수 있다. 비드 >1 μm 상의 근-TIRFM은 또한 주어진 영역(27)에 대한 연관 이벤트의 수를 측정하는데 사용될 수 있다. 평면 이중층과 마찬가지로, 우리는 로다민-PE를 사용하여 매끄러운 이중층 증착 (그림 4A), 즉 다중 라멜라리티 또는 파열되지 않은 리포솜을 나타내는 지질 덩어리가 없으며 (그림 4B), 이중층에 틈이 없습니다 (그림 4C). 곡면에서 시간에 따른 총 단백질 흡착 또는 단백질 흡착을 측정하기 위해서는 지질 강도와 합 셉틴 강도를 측정 할 수있는 개별 부피를 만들기 위해 개별 비드를 서로 분리해야합니다. 따라서, 비드는 도 4D에서와 같이 함께 뭉치기보다는 잘 분리되어야 한다. 토론 섹션에서 이러한 모든 잠재적 문제에 대한 문제 해결 옵션을 다룹니다.
이 SLB 분석은 단백질이 단일 표면에서 여러 곡률을 샘플링 할 수있는 환경을 제공하는 막대 지지체에도 적용될 수 있습니다. 이 분석을 주사 전자 현미경과 페어링하면 사용자는 셉틴18 또는 관심있는 다른 단백질의 곡률 선호도, 정렬 및 길이 분포를 검사 할 수 있습니다. 여기에 제시된 다른 분석법과 유사하지만, 로드 분석은 여과지로부터 유래되는 기판의 이질적인 특성 때문에 전체 막 표면적의 신중한 제어를 허용하지 않는다. 여기에 사용된 여과지의 재료 특성은 길이와 직경이 다른 막대를 생성합니다(그림 5A). 이는 곡면에서의 단백질 곡률 감지 및 조직을 탐색하는 데 유용하지만(그림 5B), 막에 대한 단백질의 비율을 제어할 수 없기 때문에 막대는 포화 결합 곡선을 생성하거나 결합 상수와 같은 파라미터를 측정하는 데 제한된 유용성을 가지고 있습니다.
그림 1: 다양한 곡률을 가진 지지체에서 지지되는 지질 이중층 형성의 개요. SUV는 주어진 멤브레인에서 샘플링 할 수있는 곡률을 변경하기 위해 다른 형상의 고체 지지대와 함께 인큐베이션됩니다. SUV는 고체지지 표면에 흡착하고 파열되어 지질 이중층을 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 반응 챔버 설정의 개략도. 맞춤형 챔버를 준비하기 위해 튜브가 테이퍼되기 시작하는 곳과 캡 (빨간색 점선)에서 0.2mL PCR 튜브를 절단합니다. 그런 다음 절단 튜브의 절단되지 않은 림을 UV 활성화 접착제 (파란색)의 얇은 층으로 코팅하고 커버 슬립에 접착제를 내려 놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 평면 이중층의 대표적인 TIRF 현미경 사진. (A) 비중합성 셉틴 결합(녹색)을 갖는 고품질 지질 이중층(75% DOPC, 25% 대두 PI)의 대표적인 이미지. 단백질은 어떤 특정 영역에도 군집되지 않으며, 막에 부착된 리포솜이 없고 구멍도 없다. (B) 이 이중층은 제대로 청소되지 않은 유리 커버 슬립으로 만들어졌으며 셉틴이 적은 멤브레인에 "구멍"(흰색 화살표)으로 보이는 것을 보여줍니다. 셉틴은 이중층에서 이러한 결함의 가장자리에서 붐비는 것을 볼 수 있습니다 (오른쪽의 확대 된 영역에서 흰색 화살표로 표시됨). (c) 미량 로다민-PE를 이용한 저품질 이중층의 대표적인 이미지. 폭발되지 않은 리포솜과 튜불레이션된 지질이 표면에 보인다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 지질 코팅된 미소 구체들의 대표적인 현미경 사진. 0.3 μm, 0.5 μm, 1 μm, 3 μm 및 5 μm의 직경을 갖는 지질 코팅된 비드 (75% DOPC, 25% 대두 PI, 0.1% 로다민 PE)를 혼합한 경쟁 분석으로부터의 대표적인 이미지. 모든 이미지는 최대 Z 투영입니다. (a) 지질 코팅된 미소 구체들의 고품질 혼합물의 대표적인 이미지. 구형 지지체는 멤브레인에 의해 고르게 코팅되어 있으며 비드 클러스터는 거의 없습니다. (B) 과도한 지질의 불충분 한 세척으로 인해 발생할 가능성이있는 고르지 않은 막 코팅의 대표적인 이미지. (C) 부적절한 취급으로 인해 멤브레인 커버리지에 틈새가있는 비드의 대표적인 이미지 (흰색 화살표). (d) 치밀하게 클러스터링된 비드의 대표적인 이미지는, 특히 상이한 비드들을 함께 조합할 때 절차 전반에 걸쳐 불충분한 혼합에 의해 야기될 가능성이 높다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 지질 및 셉틴 코팅 막대의 대표적인 전자 현미경 사진 . (A) 지질 코팅 (75% DOPC, 25% 대두 PI, 0.1% 로다민 PE) 막대 길이 및 직경의 분포를 보여주는 SEM 이미지. (B) 포지티브 곡률의 축을 따라 정렬된 셉틴 필라멘트가 있는 분리막으로 코팅된 막대의 가장자리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세포막은 다양한 모양, 곡률 및 물리 화학적 특성을 취합니다. 세포가 마이크로미터 규모의 어셈블리를 구축하는 나노미터 규모의 기계를 연구하기 위해서는 멤브레인 모방체의 최소 재구성 시스템을 설계할 필요가 있다. 이 프로토콜은 막 곡률과 조성을 정밀하게 제어하면서 사용자가 널리 이용 가능한 현미경 기술을 사용하여 정량적 형광 측정을 쉽게 수행 할 수있게 해주는 기술을 제시합니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 구성 요소는 적절한 표면에 우물을 조립하고 지질을 처리하는 것입니다. 여기에 설명 된 웰은 PCR 튜브 및 UV 활성화 접착제를 사용하여 수작업으로 제작되었습니다. 조립 중에 반응 영역 내부에 접착제가 생기지 않는 것이 중요합니다. 이것은 우물의 가장자리를 따라 이미징하고 커버 글라스 상에 고단백질 흡착을 찾음으로써 실험 중에 확인할 수 있습니다. 사용자는 상업적으로 주문할 수 있는 실리콘과 같은 웰에 대체 재료를 사용하도록 선택할 수 있지만, 제시된 방법은 이동하거나 누출되지 않고 더 큰 반응 부피를 지원할 수 있는 튼튼한 웰을 제공한다. 우리 손에있는 커버 글라스의 표면은 평면 이중층을 형성하는 데 매우 중요했습니다. 플라즈마 세정 시간 또는 심지어 커버 글라스의 브랜드의 최적화는 이중층의 형성을 보기 위해 필요할 수 있으며, 적절한 표면 처리 및 전하가 소포 흡착 및 융합에 매우 중요하기 때문에 31,32,33. 이러한 실험을 처음으로 설정하거나 새로운 지질 조성물로 작업할 때, 광표백(FRAP) 실험 후의 형광 회수는 독립형 시스템(30)과 비교하여 멤브레인의 유동성을 평가하기 위해 사용되어야 한다. 지원 시스템은 독립형 대응 시스템보다 덜 유동적이지만 움직이지 않을 것으로 예상됩니다12.
형광에 의해 이중층 품질을 평가할 때, 이중층에서 파열되지 않은 리포솜 또는 결함을 찾는 것이 중요합니다 (그림 3C), 이들은 국소 단백질 흡착을 변화시킬 수 있기 때문입니다. 다음 문제 해결 옵션을 고려할 수 있습니다. a) 이중층 품질을 향상시키기 위해 SUV 준비를 조정할 수 있습니다. 초음파 처리, 동결 해동 및 압출은 모두 지질 조성에 따라 용이성과 성공도가 다를 수있는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 우리 손에는 단일 분산 된 크기 분포를 가진 완전히 명확한 SUV 솔루션이 가장 균질 한 이중층을 초래합니다. 동적 광산란(DLS)은 크기 분포(25)를 평가하는데 사용될 수 있다. b) SUV 내부와 외부 버퍼 사이의 염분 농도 차이를 증가시킬 수 있습니다. 내부 이온 농도를 감소시킴으로써(또는 외부 이온 농도를 증가시킴으로써), SUV에 대한 삼투 응력은 파열(31)의 가능성을 증가시킨다. 대안적으로, 존재하는 일가 양이온을 변경시키는 것은 SLB 형성의 동역학을 변화시키고 새로운 지질 조성물(34)의 SLBs를 최적화하는데 도움을 줄 수 있다. c) 세척의 수 또는 힘을 증가시킬 수 있습니다. 저자의 경험에 비추어 볼 때, 세척 중 격렬한 혼합은 더 깨끗한 이중층으로 이어지고 파괴적인 것처럼 보이지 않습니다. 대신, 가장 큰 문제는 실수로 피펫 팁으로 이중층을 긁어 모으는 데서 비롯되며, 이는 멤브레인에 가스로 나타납니다. 곡선 이중층의 경우, 좁은 피펫 팁으로 취급을 최소화하고 세척 단계를 수행 할 때, 특히 더 큰 (>1 μm) 비드의 경우 멤브레인이 유리 비드에서 전단 될 수 있으므로 부드럽게 혼합하는 것이 가장 좋습니다. 구형 멤브레인 이중층에서 지속적인 틈새가 관찰되는 경우(그림 4C), 피펫 팁의 폭을 늘리고(팁의 끝을 잘라내거나 넓은 팁을 구입하여) 비드 용액을 완전히 혼합하면서 취급을 최대한 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 일반적인 기술적 문제 중 하나는 비드가 함께 뭉치는 경향입니다 (그림 4D). 이것은 이중층 형성 전에 초음파 처리 시간을 증가시킴으로써 부분적으로 해결 될 수있다; 그러나, 일부 클러스터링은 멤브레인 코팅된 비드가 또한 웰 내에서 시간이 지남에 따라 함께 뭉치는 경향이 있기 때문에 불가피하다. 덩어리진 구슬은 정량적 분석을 위해 피해야합니다.
평면 이중층에서 단일 분자 역학의 정량적 측정에 대한 한계는 입자를 정확하게 추적하고 계수하기 위해 낮은 농도로 유지해야 할 필요성을 포함합니다. 그러나, 이것은 추적(35) 동안 보이는 입자의 수를 감소시키기 위해 획득 동안 관심있는 단백질을 언더라벨링함으로써 정류될 수 있다. 추가적으로, 구형 및 막대 SLB는 마이크로미터 규모의 멤브레인에서 단백질의 곡률 감도를 정량화하기 위해 특별히 개발되었으며, 여기에 사용된 실리카 미소 구체는 직경이 100nm까지만 사용할 수 있으며, 이 시점에서 광 현미경으로 볼 때 회절 제한 누자입니다. 따라서 더 작은 직경에서 정확한 곡률 특이성을 평가하려는 사람들은이 방법을 사용하여 그렇게 할 수 없습니다. 그러나이 기술은 곡률 선호도의 추세에 대한 귀중한 정보를 제공하고 곡률 종속 어셈블리의 해부를 허용합니다.
독립형 지질 이중층 시스템과 비교하여, 이 기술은 광범위한 완충 조건에 적합하며 준비 중에 신중한 삼투압 균형을 필요로 하지 않는다. 추가적으로, 유리 지지체를 사용하기 때문에, 이중층은 웰의 바닥으로 쉽게 가라앉고, 테더링의 필요성 또는 수크로오스 또는 다른 증점제(36)의 사용을 제거한다. 독립형 지질 이중층 시스템은 막 결합 단백질에 의한 막 변형을 조사하는 유용한 수단을 제공하지만, 막 곡률과 복잡한 조립 사이의 관계를 연구하는 것은 어렵다. 쉽게 변형가능한 막 시스템과는 달리, 이 접근법은 사용자가 멤브레인의 전역 기하학적 구조를 지시하는 개별 지질 종의 고유 형상 없이 다양한 지질 조성물을 사용할 수 있게 한다. 마지막으로, 막대 모양의 SLB는 관심있는 단백질에 대해 동일한 연속 멤브레인에서 여러 곡률의 샘플링을 허용하며(그림 5B), 이는 곡률 의존적 어셈블리 또는 여러 성분의 공동 현지화를 평가하는 데 고유하게 유익합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 (NIH) 그랜트 No의 지원을 받았다. R01 GM-130934 및 NSF (National Science Foundation) 그랜트 MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., K.S.C.는 T32 GM119999 어워드에 따라 국립 일반 의료 과학 연구소의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural | Watson | 137-211C(EX) | |
| 0.5 mL low adhesion tubes | USA Scientific | 1405-2600 | |
| Beta mercaptoethanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4612-25G | |
| Coverglass for making PEGylated coverslips | Thermo Scientific | 152450 | Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Egg Liss Rhodamine PE | Avanti Polar Lipids | 810146 | |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade | VWR | 16220 | |
| EMS Sodium Cacodylate Buffer | VWR | 11652 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-223EA | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-1KG | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | |
| Magnesium chloride | VWR | 7791-18-6 | |
| Methyl cellulose 4000cp | Sigma-Aldrich | M052-100G | |
| Microglass coverslips for planar bilayers | Matsunami | Discontinued | 22x22 |
| Mini centrifuge | |||
| Non-Functionalized Silica Microspheres | Bangs Laboratories, Inc. | Depends on size: SS0200*-SS0500* | Silica in aqueous suspension |
| Optical Adhesive | Norland Thorlabs | NOA 68 | Flexible adhesive for glass or plastics |
| Osmium tetroxide | Millipore Sigma | 20816-12-0 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Plasma Cleaner | Plasma Etch | PE-25 | Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS |
| Potassium chloride | VWR | 0395-1kg | |
| Round coverglass, #1.5 12mm | VWR | 64-0712 | |
| Sonicator bath | Branson | 1510R-MT | Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W |
| Soy PI | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| UV Lamp | Spectroline | ENF-260C | 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS |
| WhatmanGlass Microfiber Filter Paper | VWR | 28455-030 | 42.5 mm diameter, Grade GF/C |
References
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