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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/64090
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill
* These authors contributed equally

Summary

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Abstract

A maioria das células pode sentir e mudar sua forma para realizar processos celulares fundamentais. Em muitos eucariotes, o citoesqueleto de septina é um componente integral na coordenação de mudanças de forma como citocinese, crescimento polarizado e migração. Os septinas são proteínas formadoras de filamentos que se reúnem para formar diversas estruturas de alta ordem e, em muitos casos, são encontradas em diferentes áreas da membrana plasmática, mais notavelmente em regiões de curvatura positiva em escala de mícon. O monitoramento do processo de montagem de septina in vivo é dificultado pelas limitações da microscopia de luz nas células, bem como pela complexidade das interações com membranas e elementos citoesqueléticos, dificultando a quantificação da dinâmica do septino nos sistemas vivos. Felizmente, houve progressos substanciais na última década na reconstituição do citoesqueleto de septina em um sistema livre de células para dissecar os mecanismos que controlam a montagem de septinas em altas resoluções espaciais e temporais. Os passos centrais da montagem de septina incluem associação de heterooligomeres de septina e dissociação com a membrana, polimerização em filamentos, e a formação de estruturas de alta ordem através de interações entre filamentos. Aqui, apresentamos três métodos para observar a montagem de septina em diferentes contextos: bicamadas de planar, suportes esféricos e suportes de hastes. Esses métodos podem ser usados para determinar os parâmetros biofísicos dos septinos em diferentes estágios de montagem: como octamers únicos que ligam a membrana, como filamentos, e como conjuntos de filamentos. Utilizamos esses parâmetros emparelhados com medidas de amostragem de curvatura e adsorção preferencial para entender como o sensor de curvatura opera em uma variedade de escalas de comprimento e tempo.

Introduction

As formas das células e muitos de seus compartimentos internos dependem das membranas lipídicas que as cercam. As membranas são estruturas viscoelásticas que podem ser deformadas através de interações com proteínas, triagem lipídica e atuação de forças internas e externas para gerar uma variedade de formas 1,2,3,4. Essas formas são frequentemente descritas em termos de curvatura de membrana. As células utilizam um conjunto diversificado de proteínas capazes de se reunir preferencialmente, ou "sensoriamento", curvaturas de membrana específicas para garantir o controle espátula-temporal definido sobre processos como tráfico celular, citocinas e migração 5,6. A dinâmica do maquinário celular na membrana é notavelmente difícil de observar devido à dificuldade de equilibrar o tempo e a resolução espacial com a saúde celular. Embora as técnicas de superrespeição possam oferecer uma visão detalhada de tais estruturas, elas exigem aquisições longas que não são favoráveis às escalas de tempo de montagem/desmontagem para a maioria das máquinas. Além disso, a complexidade molecular desses conjuntos em seu ambiente nativo e a multiplicidade de papéis que um único componente pode desempenhar fazem dos sistemas mínimos de reconstituição uma ferramenta valiosa para estudar a capacidade funcional das moléculas.

A mímética de membrana mínima foi desenvolvida para estudar propriedades de membrana e interações proteína-membrana fora da célula. Os miméticos de membrana variam de bicamadas lipídicas de pé livre, como lipossomos ou vesículas unilamellar gigantes, até bicamadas lipídicas suportadas (SLBs)7,8,9,10. SLBs são membranas biomiméticas ancoradas ao suporte subjacente, tipicamente composto de vidro, mica ou sílica 11,12. Uma variedade de geometrias pode ser usada, incluindo superfícies planares, esferas, hastes e até substratos ondulantes ou micropatterados para sondar interações proteína-membrana em curvaturas côncavas e convexas simultaneamente1 3,14,15,16,17,18 . A formação de bicamadas começa com a adsorção de vesículas em uma superfície hidrofílica, seguida de fusão e ruptura para formar uma bicamada contínua (Figura 1)19. Bicamadas suportadas são particularmente favoráveis à microscopia de luz e elétrons, fornecendo melhor tempo e resolução espacial do que muitas vezes é alcançável nas células. Os SLBs curvos fornecem especialmente um meio atraente para sondar a sensibilidade à curvatura da proteína na ausência de deformação significativa da membrana, permitindo que se distingue entre sensor de curvatura e indução de curvatura, que muitas vezes são impossíveis de separar em sistemas autônomos.

Os septinos são uma classe de proteínas citoesqueletal formadoras de filamentos bem conhecidas por sua capacidade de se reunir em membranas positivamente curvas 6,18,20. Ao longo do ciclo celular na levedura, os septinos se reúnem em um anel e devem reorganizar-se para formar as estruturas de ampulheta e anel duplo associadas ao surgimento de brotos e citocinese, respectivamente21. Embora belo trabalho tenha sido feito usando microscopia eletrônica de réplica de platina para observar a arquitetura de septina em diferentes estágios de ciclo celular22, assistir ao conjunto de septina ao longo do tempo usando microscopia de luz na levedura encontrou-se com resolução espacial limitada. Trabalhos anteriores em septinas usando monocamadas lipídicas visualizadas pela microscopia eletrônica de transmissão (TEM) foi capaz de reconstituir várias estruturas de septina interessantes, como anéis, feixes e gazes23. No entanto, as técnicas EM também são limitadas em sua resolução temporal, ao contrário da microscopia de fluorescência. A fim de melhor resolver os parâmetros cinéticos do processo multies em escala da montagem de septina, recorremos a miméticas de membrana suportadas, onde podemos controlar cuidadosamente a geometria da membrana, as condições amostrais e a modalidade de imagem.

Os protocolos descritos aqui usam SLBs planar ou curvos, proteína purificada e uma combinação de técnicas de microscopia. A microscopia de fluorescência quantitativa e a microscopia total de fluorescência interna (TIRFM) foram utilizadas para medir tanto a ligação de proteína a granel em várias curvaturas de membrana, quanto para medir a cinética vinculante de moléculas únicas. Além disso, este protocolo foi adaptado para ser usado com microscopia eletrônica de varredura (SEM) para examinar a ultraestrutura proteica em diferentes curvaturas de membrana. Embora o foco desses protocolos esteja no citoesqueleto septino, os protocolos podem ser facilmente modificados para investigar a sensibilidade da curvatura de qualquer proteína que o leitor ache interessante. Além disso, aqueles que trabalham em áreas como endocitose ou tráfico vesicular podem achar essas técnicas úteis para sondar os conjuntos dependentes da curvatura de complexos multiprofissionais.

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Protocol

NOTA: Formar bicamadas lipídicas suportadas requer a preparação de pequenas vesículas unilamellar monodisperadas (SUVs). Consulte um protocolo24 publicado anteriormente na formação de SUV. Resumidamente, todos os SUVs são formados por sônica de sonda por 12 min no total a 70% de amplitude através de períodos de sônica de 4 min seguidos por períodos de descanso de 2 min em água gelada. As soluções de SUV devem ser bem esclarecidas e monodisperadas em tamanho. As distribuições de tamanho dos SUVs podem ser medidas, por exemplo, por dispersão dinâmica de luz25.

1. Bicamas lipídicas de Planar

  1. Limpeza plasmática dos slides
    NOTA: A limpeza plasmática remove contaminantes orgânicos e aumenta a hidrofilialidade do vidro, garantindo uma adsorção lipídica eficiente. As etapas a seguir podem mudar ou precisam ser otimizadas dependendo do limpador de plasma e das tampas de vidro utilizadas.
    1. Limpe o limpador de plasma por 5 minutos com oxigênio para remover o ar das linhas e da câmara. Isto é para garantir que, quando o limpador de plasma é executado, há principalmente oxigênio nas linhas e câmara, fornecendo preparações bicamadas mais consistentes.
    2. Durante a purga, flua um gás inerte, como n2 ou Ar, sobre as lâminas de vidro de micro tampa para remover poeira e partículas.
      OPCIONAL: As lâminas de vidro podem ser lavadas pulverizando cada lado com isopropanol 100%, seguido de água. Repita a lavagem isopropanol-água 3x e depois seque com um fluxo N2 .
    3. Disponha deslizamentos de vidro de cobertura seca em um berço de cerâmica. Coloque o berço na parte de trás da câmara de plasma para que as manchas sejam paralelas à borda longa da câmara (isso as mantém no lugar durante a limpeza do plasma). Execute o limpador de plasma por 15 minutos com oxigênio na potência máxima.
  2. Preparação da câmara
    NOTA: O método descrito aqui utiliza câmaras caseiras de tubos de PLÁSTICO PCR para suportar os volumes de reação, mas outros materiais de baixa adesão, como poços de silicone, também podem ser adequados.
    1. Usando uma lâmina de barbear ou uma tesoura, corte a tampa logo abaixo da parte foscarada de um tubo PCR de 0,2 mL (Figura 2).
    2. Pinte a borda do tubo PCR com adesivo ativado por UV, evitando o interior do tubo. Coloque suavemente a cola do tubo PCR no centro de uma mancha de cobertura limpa por plasma.
      NOTA: Para evitar cola dentro da câmara, use a quantidade mínima de cola para obter um selo e trate prontamente com UV sem bater ou perturbar a câmara.
    3. Coloque a câmara sob luz UV de comprimento de onda longa por 5-7 min para curar o adesivo.
  3. Formação de bicamadas
    NOTA: Os SUVs monodispersados devem ser usados nesta etapa para uma formação de bicamadas eficiente. A Tabela 1 fornece receitas para todos os buffers usados na formação de bicamadas, incluindo estoque e concentrações finais de buffer.
    1. Adicionar 40 μL de tampão bicamado lipídeca suportado (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM MgCl2; Tabela 1), 10 μL de SUVs de 5 mM e 1 μL de 100 mM CaCl2 para o poço. Agite suavemente as câmaras de um lado para o outro para interromper os SUVs e, em seguida, incubar a 37 °C por 20 min.
      NOTA: Para limitar a evaporação, incubar em uma placa de Petri coberta com um lenço molhado.
  4. Lavar o excesso de lipídios
    NOTA: Esta etapa remove o excesso de SUVs e atua como uma etapa de troca de buffer. É muito importante não raspar a bicameta com a ponta da pipeta durante a lavagem; se o vidro for exposto, septinas e muitas outras proteínas se ligarão irreversivelmente, reduzindo a concentração proteica eficaz.
    1. Após a incubação, enxágue o bicamado 6x com 150 μL de SLBB, pipetando para cima e para baixo para misturar cada vez, evitando bolhas.
      NOTA: Adicione 150 μL diretamente aos 50 μL de buffer e SUVs já presentes para um total de 200 μL na reação bem.
    2. Quando estiver pronto para começar a incubar com os septinos ou uma proteína diferente de escolha, lave a bicamada 6x com 150 μL de tampão de reação (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1,4 mg/mL BSA, 0,14% metilcelulose, 1 mM BME).
      NOTA: Para obter melhores resultados, faça o tampão de reação fresco e tenha muito cuidado ao misturar bem a reação para evitar bolhas.
    3. Na última etapa de lavagem, remova 125 μL de tampão de reação, deixando 75 μL no poço. Adicione 25 μL de septinas diluídas no tampão de armazenamento de septina (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM BME) na concentração e imagem desejadas pela microscopia TIRF26.
      NOTA: Ao configurar este ensaio pela primeira vez ou incorporar uma nova composição lipídica, é uma boa prática garantir que os lipídios estejam se difundindo livremente na superfície usando recuperação de fluorescência após fotobleaching (FRAP). Embora a taxa de recuperação seja diferente para diferentes composições lipídicas e inerentemente inferiores aos sistemas autônomos, os lipídios não devem ser imóveis.

Tampão de bicamada lipídica suportado (SLBB)
Estoque Volume Concentração final
2 M KCl 1,5 mL 300 mM
1 M HEPES 200 μL 20 mM
500 mM MgCl2 20 μL 1 mM
Água 8 mL
Tampão de pré-reação (PRB)
Estoque Volume Concentração final
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 500 μL 50 mM
Água 9,33 mL
Tampão de reação
Estoque Volume Concentração final
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 300 μL 50 mM
10 mg/mL BSA 1,39 mL 1,39 mg/mL
1% metilcelulose 1,39 mL 0.0014
Água Até 10 mL
Bme 0,7 μL 1 mM
Tampão de armazenamento de septina (SSB)
Estoque Volume Concentração final
2 M KCl 1,5 mL 300 mM
1 M HEPES 500 μL 50 mM
Água Até 10 mL
Bme 0,7 μL 1 mM

Tabela 1: Componentes tampão para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e reações. Volumes de soluções de estoque que são incorporadas em buffers e as concentrações finais de cada componente são mostrados. SLB e PRB podem ser armazenados à temperatura ambiente e reutilizados entre experimentos. Tampão de reação e SSB são frescos para cada experimento.

2. Bicamas lipídicas suportadas esféricas

NOTA: Este protocolo utiliza microesferas de sílica suspensas em água ultrauso com 10% de densidade. Para qualquer trabalho sobre os parâmetros cinéticos da montagem de proteínas, é importante controlar estritamente a área total da superfície da membrana entre experimentos e curvaturas. A Tabela 2 mostra os volumes corrigidos de contas e tampão para manter 5 mm2 da superfície total da membrana. Este protocolo se expande em um método publicado anteriormente 8,18.

  1. Formação de bicamadas
    NOTA: Quanto às bicamadas planar, é importante ter SUVs de alta qualidade para formação robusta de bicamadas. A Tabela 2 lista o volume de contas de uma solução de densidade de 10% e seus respectivos volumes SLBB que são usados para obter uma área de superfície final de 5 mm2 para uma gama de diâmetros de contas.
    1. Microesferas de sílica (também referidas como contas) tendem a se estabelecer e se agrupar; para misturar as contas e quebrar quaisquer aglomerados, vórtice da garrafa para 15 s, depois banho-sonicato por 1 min, e vórtice novamente para 15 s.
    2. Misture o volume apropriado de contas (Tabela 2) com o volume correspondente de SLBB e 10 μL de SUVs de 5 mM em um tubo de microcentrifuge de baixa adesão de 0,5 mL.
    3. Balance a mistura de lipídios por 1h à temperatura ambiente. Certifique-se de que esta incubação seja feita em uma rotadora para evitar sedimentação.
  2. Prepare câmaras em tampas PEGylated
    NOTA: Quanto às bicamadas planar, câmaras caseiras de tubos PCR de plástico são usadas para suportar os volumes de reação, mas outros materiais de baixa adesão, como poços de silicone, podem funcionar tão bem.
    1. Enquanto as contas estão balançando, descongele uma tampa pegylated à temperatura ambiente. Corte um tubo PCR de 0,2 mL e cole-o no deslizamento de tampas conforme descrito na etapa 1.2. Para lâminas de 24 mm x 50 mm, até 10 câmaras podem caber de forma viável em um slide.
      NOTA: Este protocolo utiliza tampas de vidro pegylated de 24 mm x 50 mm que são preparadas com antecedência. Resumidamente, as tampas de vidro são completamente limpas através da sônica em acetona, metanol e 3 M KOH. As manchas são então funcionalizadas com n-2-aminoetil-3-aminopropyltrimethoxysilane e covalently ligadas ao valerate de succinimidyl mPEG. As tampas pegylated terminadas são armazenadas a vácuo seladas a −80 °C. Para um protocolo de passivação semelhante, consulte o trabalho de Gidi et al.27. Embora as tampas de vidro PEGylated sejam sugeridas aqui, outros meios de passivação, como os métodos BSA ou poli-L-lysine, podem ser eficazes.
  3. Lavar o excesso de lipídios
    NOTA: Esta etapa funciona para remover SUVs em excesso e realizar uma troca de buffer. As contas são lavadas 4x no total com tampão de pré-reação (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7.4). A Tabela 3 lista as velocidades de giro em RCF para uma gama de diâmetros de contas.
    1. Gire contas no RCF designado para 30 s (Tabela 3). Se usar vários tamanhos de contas, mantenha as contas balançando até que seja a hora de serem lavadas.
      NOTA: Não vale a pena sedimentar contas maiores no mesmo giro que contas menores com a menor velocidade de sedimentação de contas para economizar tempo. Isso pode fazer com que as contas grudem umas nas outras e comprometam a integridade da bicameta.
    2. Após o primeiro giro, remova 50 μL de supernascente e adicione 200 μL de PRB. Após a segunda e terceira rodadas, remova 200 μL e adicione 200 μL de PRB. Após o quarto giro, remova 200 μL e adicione 220 μL de PRB. Pipeta vigorosamente para cada lavagem.
      NOTA: O volume final de resuspensão é diferente das lavagens. Não vórtice as contas após a incubação com os lipídios, pois isso pode deixar lacunas nas bicamadas. Para evitar a sedimentação enquanto trabalha com os outros tamanhos de contas ou configuração de outras partes do ensaio, coloque as misturas de contas de volta no rotador end-over-end.
  4. Preparando a reação
    NOTA: Esta reação foi projetada para preservar a área total da superfície da membrana da reação em 5 mm2 e produzir uma condição de reação final de 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg/mL BSA, 0,1% de metilcelulose e 1 mM BME.
    1. Se fizer um ensaio de competição com vários tamanhos de contas, faça uma mistura de 1:1 misturando volumes iguais de cada tamanho de contas juntos. Em seguida, misture 29 μL da mistura de contas desejada (ou de uma única conta) com 721 μL de tampão RXN.
      NOTA: É importante misturar completamente as contas em cada etapa com uma pipeta para evitar agrupamentos densos de contas; isso resultará em uma distribuição mais uniforme e área de superfície total precisa.
    2. Misture 75 μL de contas diluídas e 25 μL de proteína diluída em SSB para os poços.
      NOTA: Os autores tipicamente imagem complexos de septina de levedura a 1-50 nM.
    3. Se medir septinas em estado estável, incubar à temperatura ambiente por 1h e, em seguida, imagem por microscopia próxima de TIRF ou confocal.
Diâmetro da contas (μm) Volume de contas bem misturadas (μL) Volume de tampão SLB (μL) Volume de SUVs (μL)
6.46 8.94 61.1 10
5.06 7 63 10
3.17 4.39 65.6 10
0.96 1.33 68.7 10
0.54 0.75 69.3 10
0.31 0.43 69.6 10

Tabela 2: Volumes normalizados de microesferas. A fim de manter uma área de superfície igual de cada tamanho de contas e manter a área total da superfície da membrana consistente entre experimentos, foram calculados volumes para cada tamanho de contas e tampão que normalizou a área total da superfície.

Diâmetro da conta (μm) Velocidade de sedimentação (RCF)
0.31 4.5
0.54 4.5
0.96 2.3
3.17 0.8
5.06 0.3

Tabela 3: Velocidades de sedimentação para microesferas de diâmetros variados. Para cada diâmetro das contas, as velocidades mínimas de sedimentação foram utilizadas para pastar as contas para lavar lipossomos não ligados.

3. Rod suportava bicamadas lipídicas

NOTA: Em contraste com os outros ensaios aqui apresentados, o ensaio da haste não permite um controle cuidadoso da área total da superfície da membrana. Pode-se ser consistente em quantidades e volumes entre experimentos, mas como isso resulta em varas de diferentes comprimentos e diâmetros, é difícil extrapolar a área total da superfície da membrana na reação. Assim, embora este seja um excelente ensaio para explorar a curvatura com múltiplas curvaturas em uma única superfície e tenha sido útil para explorar a ultraestrutura de septina, não é recomendado para medidas cinéticas. Este método foi relatado anteriormente18 e está sendo expandido aqui.

  1. Obtenção de hastes borossilicatos a partir de filtros de microfibra de vidro
    1. Rasgue um único filtro de microfibra de vidro GF/C de 42,5 mm em pedaços pequenos e coloque-os em um béquer de 100 mL com 60 mL de 100% de etanol. Banho-sonicate até que a solução se torne opaca; isso pode levar apenas 20-30 min com um filtro finamente desfiado.
      NOTA: Sonicate completamente para quebrar grandes pedaços; quanto mais dissociado/opaco, melhor.
    2. Cubra a solução com filme e armazene a solução à temperatura ambiente durante a noite.
  2. Formando bicamadas nas hastes
    NOTA: Esta etapa é realizada com excesso de lipídios para alcançar a cobertura completa da haste, pois é impossível quantificar a área total da superfície neste método.
    1. No dia seguinte, a solução de etanol será resolvida (etapa 3.1.2.), por isso misture-a bem antes de usar. Combine 10 μL de solução de haste e 70 μL de SLBB.
    2. Gire em velocidade máxima em uma mini centrífuga para 30 s e remova 50 μL do supernatante. Resuspend em outros 50 μL de SLBB e repita o giro para um total de quatro lavagens para diluir o etanol.
      NOTA: Os suportes da haste não formarão uma pelota sólida na parte inferior do tubo. Em vez disso, eles são manchados ao longo da lateral do tubo; isso os torna difíceis de preservar completamente ao lavar. Uma vez que a área total da superfície neste ensaio não é controlada, é bom se eles são perturbados.
    3. Combine 10 μL de solução de haste bem mista com 50 μL de SUVs de 5 mM e 20 μL de SLBB. Incubar por 1h à temperatura ambiente, girando de ponta a ponta como ao formar bicamadas nas microesferas.
  3. Lavar o excesso de lipídios
    1. Semelhante ao passo 3.2.2., gire a solução de varídio em velocidade máxima em uma mini centrífuga por 30 s para pellet as hastes revestidas de membrana fora da solução.
    2. Após o primeiro giro, remova 50 μL do supernante e adicione 200 μL de PRB. Após a segunda e terceira rodadas, remova 200 μL e adicione 200 μL de PRB. Após o quarto giro, remova 200 μL, adicione 220 μL de PRB e pipeta vigorosamente para misturar.
  4. Preparando a reação
    1. Em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL, misture 721 μL de tampão de reação com 29 μL de solução de haste. Misture bem.
    2. Em um tubo PCR de 0,2 mL, combine 75 μL de hastes em tampão de reação e 25 μL de septinas na concentração desejada, diluída em SSB. Deixe incubar à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.
  5. Preparando-se para a microscopia eletrônica de varredura
    1. Após a incubação, adicione a mistura de 100 μL de septin-rod em uma tampa redonda de 12 mm revestida de PEG e incubar à temperatura ambiente por 1h em uma placa de Petri fechada.
    2. Fixar a amostra preenchendo o fundo da placa de Petri (10 mL deve ser suficiente) com 2,5% de glutaraldeído em 0,05 M de cacodilato de sódio (NaCo), pH 7,4, por 30 min. Aspire o líquido com uma pipeta de vidro. Lave a amostra incubando-a com 10 mL de 0,05 M NaCo por 5 min e repita para um total de duas lavagens.
    3. Postfix em 0,5% Tampão de cacodilato OsO4 por 30 min e, em seguida, lave 3x em 0,05 M NaCo (5 min/lavagem).
    4. Incubar a amostra com 1% de ácido tânnico por 15 minutos e depois lavar em NaCo 3x. Incubar por 15 min em 0,5% OsO4 e lavar 3x com NaCo.
    5. Desidratar as amostras utilizando concentrações crescentes de etanol: 30% EtOH por 5 min, 2x; 50% EtOH por 5 min; 75% EtOH por 5 min; e 100% EtOH por 5 min, 2x. Siga com mais 10 minutos de incubação.
    6. Incubar em fluido de transição (hexametiledisilazane) 3x (5 min, 10 min, depois 5 min).
    7. Deixe secar o ar e coloque as amostras em um desiccador até o revestimento de sputter. Sputter-coat a camada de 4 nm com uma a totalidade de ouro/paládio e, em seguida, imagem em um microscópio eletrônico de varredura.

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Representative Results

Após a preparação de cada SLB, os septinos ou a proteína de interesse podem ser incubados com o suporte desejado e imageados via TIRFM, microscopia confocal ou SEM. Os resultados aqui apresentados utilizam septinas recombinantemente expressas e purificadas de E. coli17. Utilizando o TIRFM em SLBs planar, é possível determinar o comprimento dos filamentos e sua flexibilidade, medir os coeficientes de difusão e observar a montagem ao longo do tempo 28,29. Para coletar as medidas de alta qualidade, é primeiro necessário verificar a qualidade das bicamadas, especialmente ao prepará-las pela primeira vez ou ao alterar composições lipídicas. Uma inspeção visual da distribuição de proteínas nas bicamadas pela TIRFM pode ajudar a identificar regiões da bicamada que foram arranhadas ou malformadas. A distribuição de proteínas deve ser homogênea (Figura 3A), e não deve haver buracos ou lacunas na bicamada (Figura 3B). É melhor evitar membranas com orifícios, que podem se formar a partir da contaminação do pó ou manchas de manuseio de lâminas, pois isso pode alterar a distribuição de proteínas em outras áreas da bicamadas. Para visualizar a membrana em si, o trace rhodamine-PE pode ser incorporado em SUVs para formação de bicamadas. Em bicamadas de alta qualidade, o campo aparecerá mesmo (imagens não mostradas), mas se os lipossomos forem velhos ou se as lavagens não forem rigorosas o suficiente, lipossomos inexplorosos e tubulados podem se acumular na superfície (Figura 3C). Além disso, enquanto os suportes sólidos dificultarão a difusão livre dos lipídios8, os lipídios não devem ser imóveis. Os experimentos FRAP podem ser usados para avaliar a mobilidade de lipídios em bicamadas planares, que podem variar de acordo com a composição e devem mostrar taxas de recuperação na ordem dos segundos30.

Suportes esféricos podem ser usados para examinar a ligação proteica em membranas de curvaturas definidas isoladamente (uma curvatura) ou com várias curvaturas de membrana no mesmo poço para observar a competição entre curvaturas 6,18. Near-TIRFM em contas > 1 μm também podem ser usados para medir o número de eventos de associação para uma determinada área27. Assim como nas bicamadas do planar, usamos rhodamine-PE para procurar a deposição de bicamadas lisa (Figura 4A), ou seja, sem aglomerados lipídicos, que indicam liposezas multi-lamelaridade ou lipossomos desexplosos (Figura 4B), e sem lacunas na bicamada (Figura 4C). Para medir a adsorção total de proteínas ou a adsorção de proteínas ao longo do tempo em superfícies curvas, é necessário isolar contas individuais umas das outras, a fim de criar um volume discreto para o qual a intensidade lipídica e a intensidade da soma do septino podem ser medidas. Assim, as contas devem ser bem separadas em vez de agrupadas como na Figura 4D. Abordamos opções de solução de problemas para todas essas questões potenciais na seção de discussão.

Este ensaio SLB também pode ser aplicado aos suportes de haste, que oferecem um ambiente para proteínas provarem múltiplas curvaturas em uma única superfície. Emparelhar este ensaio com a microscopia eletrônica de varredura permite que o usuário examine a preferência de curvatura, alinhamento e distribuição de comprimento das septinas18 ou outras proteínas de interesse. Embora semelhante aos outros ensaios aqui apresentados, o ensaio da haste não permite um controle cuidadoso da área total da superfície da membrana devido à natureza heterogênea do substrato derivado do papel filtro. As propriedades materiais do papel filtro utilizado aqui resultam em hastes de diferentes comprimentos e diâmetros (Figura 5A); isso é útil para explorar a detecção e organização da curvatura proteica em superfícies curvas (Figura 5B), mas como a razão da proteína com a membrana não pode ser controlada, as hastes são de utilidade limitada para gerar curvas de ligação de saturação ou parâmetros de medição, como constantes de ligação.

Figure 1
Figura 1: Visão geral da formação de bicamadas lipídicas suportadas em suportes com várias curvaturas. Os SUVs são incubados com suportes sólidos de diferentes geometrias, a fim de alterar as curvaturas disponíveis para amostragem em uma determinada membrana. SUVs adsorb na superfície de suporte sólido e ruptura para criar bicamadas lipídicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema de câmara de reação montada. Para preparar câmaras personalizadas, um tubo PCR de 0,2 mL é cortado onde o tubo começa a afunilar e na tampa (linhas vermelhas tracejadas). A borda sem cortes do tubo de corte é então revestida com uma fina camada de cola ativada por UV (azul) e colocada cola para baixo em um deslizamento de tampa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Micrografias representativas da TIRF de bicamadas planares. (A) Uma imagem representativa de uma bicamheira lipídica de alta qualidade (75% DOPC, 25% Soy PI)com septinas não polimerizáveis ligadas (verde). A proteína não está agrupando em nenhuma região específica, e não há lipossomos ligados à membrana e nenhum orifício. (B) Esta bicamada foi feita com tampas de vidro mal limpas e exibe o que parecem ser "buracos" (setas brancas) na membrana onde há menos septinas. Os septins podem ser vistos lotados nas bordas desses defeitos na bicamada (denotadas pelas setas brancas na região ampliada à direita). (C) Uma imagem representativa de um bicamheiro de baixa qualidade usando traço rhodamine-PE. Lipossomos e lipossos tubulados são visíveis na superfície. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Micrografias representativas de microesferas revestidas de lipídios. Imagens representativas de ensaios de competição onde foram misturadas contas revestidas de lipídios (75% DOPC, 25% Soy PI, 0,1% Rhodamine PE)com diâmetros de 0,3 μm, 0,5 μm, 1 μm, 3 μm e 5 μm. Todas as imagens são projeções máximas de Z. (A) Imagem representativa de uma mistura de alta qualidade de microesferas revestidas de lipídios. Os suportes esféricos são uniformemente revestidos pela membrana, e há poucos aglomerados de contas. (B) Imagem representativa do revestimento de membrana irregular, provavelmente causada pela lavagem insuficiente de lipídios em excesso. (C) Imagem representativa de contas com lacunas na cobertura da membrana (setas brancas) devido ao manuseio inadequado. (D) Imagem representativa de contas densamente agrupadas, provavelmente causadas pela mistura insuficiente ao longo do procedimento, especialmente quando combinam as diferentes contas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Micrografias eletrônicas representativas de hastes revestidas de lipídio e septina. (A) Imagem SEM mostrando a distribuição de comprimentos e diâmetros da haste revestida de lipídio (75% DOPC, 25% Soy PI, 0,1% Rhodamine PE) comprimentos e diâmetros. (B) A borda de uma haste isolada revestida de membrana com filamentos de septina alinhados ao longo do eixo da curvatura positiva. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As membranas celulares assumem muitas formas diferentes, curvaturas e propriedades físico-químicas. Para estudar o maquinário em escala de nanômetros através do qual as células constroem conjuntos em escala de micrômetros, é necessário projetar sistemas mínimos de reconstituição de mimetéticas de membrana. Este protocolo apresenta técnicas que controlam precisamente a curvatura e a composição da membrana, permitindo ao usuário facilmente tomar medidas quantitativas de fluorescência usando técnicas de microscopia amplamente disponíveis.

Os componentes mais críticos deste protocolo são a montagem de poços na superfície apropriada e o manuseio dos lipídios. Os poços descritos aqui são feitos à mão usando tubos PCR e adesivos ativados por UV; é importante não colocar cola dentro da área de reação durante a montagem. Isso pode ser verificado durante o experimento por meio de imagens ao longo das bordas do poço e procurando alta adsorção de proteínas no vidro de cobertura. O usuário pode optar por usar materiais alternativos para poços, como o silicone, que pode ser encomendado comercialmente, mas o método apresentado fornece poços resistentes que não mudarão ou vazam e podem suportar volumes de reação maiores. A superfície do vidro de cobertura, em nossas mãos, tem sido muito importante para formar bicamadas planares. A otimização dos tempos de limpeza do plasma ou até mesmo da marca de vidro de cobertura pode ser necessária para ver até mesmo a formação das bicamadas, pois o tratamento e a carga adequados da superfície são fundamentais para a adsorção de vesículas e fusão 31,32,33. Ao configurar esses experimentos pela primeira vez ou trabalhar com novas composições lipídicas, a recuperação da fluorescência após experimentos de fotobleaching (FRAP) deve ser usada para avaliar a fluidez da membrana em comparação com sistemas autônomos30. Espera-se que os sistemas de suporte sejam menos fluidos do que seus homólogos autônomos, mas não imóveis12.

Ao avaliar a qualidade do bicamado por fluorescência, é importante procurar lipossomos ou defeitos desexplorados na bicamada (Figura 3C), pois estes podem alterar a adsorção de proteína local. As seguintes opções de solução de problemas podem ser consideradas. a) Pode-se ajustar a preparação do SUV para melhorar a qualidade do bicamador. Sonicação, congelamento e extrusão são métodos comumente usados que podem variar em facilidade e sucesso com base em composições lipídicas. Em nossas mãos, uma solução suv totalmente esclarecida com distribuição de tamanho monodispersed resulta nas bicamadas mais homogêneas. A dispersão dinâmica de luz (DLS) pode ser usada para avaliar a distribuição de tamanho25. b) Pode-se aumentar a diferença na concentração de sal entre o interior dos SUVs e o tampão externo. Ao reduzir a concentração de íons internos (ou aumentar a externa), o estresse osmótico nos SUVs aumenta a probabilidade de ruptura31. Alternativamente, alterar a cátion monovalente presente pode alterar a cinética da formação de SLB e auxiliar na otimização de SLBs de novas composições lipídicas34. c) Pode-se aumentar o número ou a força das lavagens. Na experiência dos autores, a mistura vigorosa durante as lavagens leva a bicamadas mais limpas e não parece ser disruptiva; em vez disso, o maior problema vem de raspar acidentalmente a bicamadas com pontas de pipeta, que aparecerão como um corte na membrana. Para bicamadas curvas, é melhor minimizar o manuseio com pontas estreitas de pipeta e misturar suavemente ao realizar as etapas de lavagem, especialmente para contas maiores (> 1 μm), pois a membrana pode ser enrolada das contas de vidro. Se forem observadas lacunas persistentes nas bicamadas de membrana esférica (Figura 4C), aumentar a largura das pontas da pipeta (cortando a ponta da ponta ou comprando pontas largas) e reduzindo o manuseio o máximo possível, enquanto ainda mistura completamente as soluções de contas, pode ajudar. Uma questão técnica comum com esta técnica é a tendência das contas se agruparem (Figura 4D). Isso pode ser parcialmente resolvido aumentando o tempo de sonicação antes da formação de bicamadas; no entanto, alguns agrupamentos são inevitáveis, pois contas revestidas de membrana também podem tender a se agrupar ao longo do tempo no poço. Contas agrupadas devem ser evitadas para análises quantitativas.

Limitações às medições quantitativas da dinâmica de molécula única em bicamadas planares incluem a necessidade de permanecer em baixas concentrações, a fim de rastrear e contar com precisão as partículas. No entanto, isso pode ser corrigido pela sub-rotulagem da proteína de interesse durante a aquisição para reduzir o número de partículas visíveis durante o rastreamento35. Além disso, os SLBs esféricos e de haste foram desenvolvidos especificamente para quantificar a sensibilidade da curvatura das proteínas em membranas de escala de micrômetros, e as microesferas de sílica utilizadas aqui só estão disponíveis até 100 nm de diâmetro, momento em que são puncta limitada à difração quando vistas por microscopia leve. Assim, aqueles que procuram avaliar a especificidade precisa da curvatura em diâmetros menores não poderão fazê-lo usando este método. No entanto, essa técnica ainda fornecerá informações valiosas sobre a tendência da preferência de curvatura e permitirá a dissecção de conjuntos dependentes da curvatura.

Em comparação com sistemas de bicamadas lipídicas autônomos, esta técnica é agradável a uma ampla gama de condições tampão e não requer equilíbrio osmótico cuidadoso durante a preparação. Além disso, por utilizar suportes de vidro, as bicamadas afundam prontamente no fundo do poço, removendo a necessidade de amarração ou o uso de sacarose ou outros agentes de espessamento36. Embora os sistemas de bicamadas lipídicas autônomos forneçam um meio útil de investigar a deformação da membrana por proteínas de ligação de membrana, é difícil estudar a relação entre a curvatura da membrana e a montagem complexa. Ao contrário de sistemas de membrana facilmente deformáveis, essa abordagem permite que o usuário use uma variedade de composições lipídicas sem a forma intrínseca de espécies lipídicas individuais ditando a geometria global da membrana. Por fim, os SLBs em forma de haste permitem a amostragem de múltiplas curvaturas na mesma membrana contínua para proteínas de interesse (Figura 5B), que é exclusivamente informativa para avaliar conjuntos dependentes da curvatura ou a colocalização de múltiplos componentes.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (NIH) Grant no. R01 GM-130934 e Fundação Nacional de Ciência (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V., e K.S.C. foram apoiados em parte por uma bolsa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais sob o prêmio T32 GM1199999.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural Watson 137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes USA Scientific 1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips Thermo Scientific 152450 Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
Egg Liss Rhodamine PE Avanti Polar Lipids 810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade VWR 16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer VWR 11652
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-223EA
HEPES Sigma Aldrich H3375-1KG
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191
Magnesium chloride VWR 7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers Matsunami Discontinued 22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres Bangs Laboratories, Inc. Depends on size: SS0200*-SS0500* Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive Norland Thorlabs NOA 68 Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide Millipore Sigma 20816-12-0
Parafilm VWR 52858-000
Plasma Cleaner Plasma Etch PE-25 Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride VWR 0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm   VWR 64-0712
Sonicator bath Branson 1510R-MT Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI Avanti Polar Lipids 840044
Tabletop centrifuge Eppendorf 22331
UV Lamp Spectroline ENF-260C 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper VWR 28455-030 42.5 mm diameter, Grade GF/C

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References

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Bioquímica Edição 185
Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas
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Curtis, B. N., Vogt, E. J. D., Cannon, K. S., Gladfelter, A. S. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (185), e64090, doi:10.3791/64090 (2022).

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