Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekonstitution af Septin-samling ved membraner for at studere biofysiske egenskaber og funktioner

Published: July 28, 2022 doi: 10.3791/64090
Automatic Translation
*1, *2, 1,3, 1,2,3
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill
* These authors contributed equally

Summary

Cellefri rekonstitution har været et vigtigt værktøj til at forstå cytoskeletsamlingen, og arbejdet i det sidste årti har etableret tilgange til at studere septindynamik i minimale systemer. Præsenteret her er tre komplementære metoder til at observere septinsamling i forskellige membrankontekster: plane dobbeltlag, sfæriske understøtninger og stangstøtter.

Abstract

De fleste celler kan sanse og ændre deres form for at udføre grundlæggende celleprocesser. I mange eukaryoter er septincytoskelettet en integreret komponent i koordinering af formændringer som cytokinese, polariseret vækst og migration. Septiner er filamentdannende proteiner, der samles for at danne forskellige højere ordensstrukturer og i mange tilfælde findes i forskellige områder af plasmamembranen, især i områder med mikronskala positiv krumning. Overvågning af processen med septinsamling in vivo hindres af begrænsningerne ved lysmikroskopi i celler samt kompleksiteten af interaktioner med både membraner og cytoskeletale elementer, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere septindynamik i levende systemer. Heldigvis har der været betydelige fremskridt i det sidste årti med at rekonstituere septincytoskelettet i et cellefrit system for at dissekere de mekanismer, der styrer septinsamling ved høje rumlige og tidsmæssige opløsninger. Kernetrinnene i septinsamling inkluderer septin heterooligomerassocilation og dissociation med membranen, polymerisation i filamenter og dannelse af højere ordensstrukturer gennem interaktioner mellem filamenter. Her præsenterer vi tre metoder til at observere septinsamling i forskellige sammenhænge: plane dobbeltlag, sfæriske understøtninger og stangstøtter. Disse metoder kan anvendes til at bestemme de biofysiske parametre for septiner på forskellige stadier af samlingen: som enkeltoktomerer, der binder membranen, som filamenter og som samlinger af filamenter. Vi bruger disse parametre parret med målinger af krumningsprøvetagning og præferenceadsorption for at forstå, hvordan krumningsføling fungerer i forskellige længder og tidsskalaer.

Introduction

Cellernes former og mange af deres indre rum er afhængige af lipidmembranerne, der omgiver dem. Membraner er viskoelastiske strukturer, der kan deformeres gennem interaktioner med proteiner, lipidsortering og virkende interne og eksterne kræfter for at generere en række forskellige former 1,2,3,4. Disse former beskrives ofte med hensyn til membrankrumning. Celler bruger en forskelligartet række proteiner, der er i stand til fortrinsvis at samle sig på eller "sensere" bestemte membrankrumninger for at sikre defineret spatio-temporal kontrol over processer, herunder cellehandel, cytokinese og migration 5,6. Dynamikken i cellemaskiner ved membranen er især vanskelig at observere på grund af vanskeligheden ved at afbalancere tid og rumlig opløsning med cellesundhed. Mens superopløsningsteknikker kan give et detaljeret overblik over sådanne strukturer, kræver de lange erhvervelser, der ikke er modtagelige for tidsskalaerne for montering / demontering for de fleste maskiner. Derudover gør den molekylære kompleksitet af disse samlinger i deres oprindelige miljø og de mange roller, som en enkelt komponent kan spille, minimale rekonstitutionssystemer til et værdifuldt værktøj til at studere molekylernes funktionelle kapacitet.

Minimal membranmimetik er udviklet til at studere membranegenskaber og protein-membran-interaktioner uden for cellen. Membranmimetik varierer fra fritstående lipiddobbeltlag, såsom liposomer eller gigantiske unilamellare vesikler, til understøttede lipiddobbeltlag (SLB'er)7,8,9,10. SLB'er er biomimetiske membraner forankret til underliggende støtte, typisk sammensat af glas, glimmer eller silica11,12. En række geometrier kan anvendes, herunder plane overflader, kugler, stænger og endda bølgende eller mikropatternede substrater til at sonde protein-membraninteraktioner på både konkave og konvekse krumninger samtidigt1 3,14,15,16,17,18 . Dannelse af dobbeltlag begynder med vesikeladsorption på en hydrofil overflade efterfulgt af fusion og brud til dannelse af et kontinuerligt dobbeltlag (figur 1)19. Understøttede dobbeltlag er særligt modtagelige for lys og elektronmikroskopi, hvilket giver både bedre tid og rumlig opløsning, end det ofte kan opnås i celler. Buede SLB'er giver især et attraktivt middel til at undersøge proteinkrumningsfølsomhed i fravær af signifikant membrandeformation, hvilket gør det muligt at skelne mellem krumningsføler og krumningsinduktion, som ofte er umulige at adskille i fritstående systemer.

Septiner er en klasse af filamentdannende cytoskeletale proteiner, der er kendt for deres evne til at samle sig på positivt buede membraner 6,18,20. I løbet af cellecyklussen i gær samles septiner til en ring og skal omarrangeres for at danne timeglas- og dobbeltringstrukturer forbundet med henholdsvis knopspiring og cytokinese21. Mens smukt arbejde er blevet udført ved hjælp af platin replika elektronmikroskopi til at observere septin arkitektur på varierende cellecyklus trin22, har se septin samling over tid ved hjælp af lysmikroskopi i gær mødt med begrænset rumlig opløsning. Tidligere arbejde med septiner ved hjælp af lipidmonolag visualiseret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) var i stand til at rekonstruere flere interessante septinstrukturer såsom ringe, bundter og gasbind23. Imidlertid er EM-teknikker ligeledes begrænset i deres tidsmæssige opløsning, i modsætning til fluorescensmikroskopi. For bedre at løse de kinetiske parametre for septinsamlingsprocessen i flere skalaer vendte vi os til understøttet membranmimetik, hvor man omhyggeligt kan kontrollere membrangeometri, prøvebetingelser og billeddannelsesmodalitet.

Protokollerne beskrevet her bruger plane eller buede SLB'er, renset protein og en kombination af mikroskopiteknikker. Kvantitativ fluorescens konfokal mikroskopi og total intern refleksion fluorescensmikroskopi (TIRFM) blev brugt til at måle både bulkproteinbinding på forskellige membrankrumninger samt til at måle bindingskinetikken af enkeltmolekyler. Desuden er denne protokol blevet tilpasset til brug med scanningselektronmikroskopi (SEM) til at undersøge protein ultrastruktur på forskellige membrankrumninger. Mens fokus for disse protokoller er på septincytoskelettet, kan protokollerne let ændres for at undersøge krumningsfølsomheden for ethvert protein, som læseren finder interessant. Derudover kan de, der arbejder inden for områder som endocytose eller vesikulær handel, finde disse teknikker nyttige til sondering af krumningsafhængige samlinger af multiproteinkomplekser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Dannelse af understøttede lipiddobbeltlag kræver fremstilling af monodisperserede små unilamellare vesikler (SUV'er). Der henvises til en tidligere offentliggjort protokol24 om SUV-dannelse. Kort fortalt dannes alle SUV'er ved sondesonikering i 12 minutter i alt ved 70% amplitude via 4 minutters sonikeringsperioder efterfulgt af 2 minutters hvileperioder i isvand. SUV-løsninger skal være godt afklaret og monodisperseret i størrelse. Størrelsesfordelinger af SUV'er kan måles, for eksempel ved dynamisk lysspredning25.

1. Plane lipid dobbeltlag

  1. Plasmarensning af diasene
    BEMÆRK: Plasmarensning fjerner organiske forurenende stoffer og øger glassets hydrofilicitet, hvilket sikrer effektiv lipidadsorption. Følgende trin kan ændre sig eller skal optimeres afhængigt af den anvendte plasmarenser og de anvendte glasovertræk.
    1. Rens plasmarenseren i 5 minutter med ilt for at fjerne luft fra linjerne og kammeret. Dette er for at sikre, at når plasmarenseren køres, er der primært ilt i linjerne og kammeret, hvilket giver mere ensartede dobbeltlagspræparater.
    2. Under rensning skal du streame en inert gas, såsom N2 eller Ar, over mikrodækselglasset glider for at fjerne støv og partikler.
      VALGFRIT: Dækglasglas kan vaskes ved at sprøjte hver side med 100% isopropanol efterfulgt af vand. Gentag isopropanol-vandvask 3x og tør derefter med en N2-strøm .
    3. Arranger tørt dækglas glider ind i en keramisk vugge. Placer holderen på bagsiden af plasmakammeret, så dækslerne er parallelle med kammerets lange kant (dette holder dem på plads under plasmarensning). Kør plasmarenseren i 15 minutter med ilt ved maksimal effekt.
  2. Forberedelse af kammeret
    BEMÆRK: Metoden beskrevet her bruger hjemmelavede kamre fra plast-PCR-rør til at understøtte reaktionsvolumenerne, men andre materialer med lav vedhæftning, såsom silikonebrønde, kan også være egnede.
    1. Brug et barberblad eller en saks til at afskære hætten lige under den frostede del af et 0,2 ml PCR-rør (figur 2).
    2. Mal kanten af PCR-røret med UV-aktiveret klæbemiddel, undgå indersiden af røret. Placer forsigtigt PCR-røret lim ned i midten af en plasmarenset dækslip.
      BEMÆRK: For at undgå lim inde i kammeret skal du bruge den mindste mængde lim til at få en tætning og straks behandle med UV uden at støde eller forstyrre kammeret.
    3. Placer kammeret under UV-lys med lang bølgelængde i 5-7 minutter for at hærde klæbemidlet.
  3. Dannelse af dobbeltlag
    BEMÆRK: Monodisperserede SUV'er skal bruges i dette trin til effektiv dobbeltlagsdannelse. Tabel 1 indeholder opskrifter på alle buffere, der anvendes i dobbeltlagsdannelsen, herunder lager- og slutbufferkoncentrationer.
    1. Der tilsættes 40 μL understøttet lipid dobbeltlagsbuffer (SLBB: 300 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM MgCl2; Tabel 1), 10 μL 5 mM SUV'er og 1 μL 100 mM CaCl2 til brønden. Ryst forsigtigt kamrene fra side til side for at forstyrre SUV'erne, og inkuber derefter ved 37 ° C i 20 min.
      BEMÆRK: For at begrænse fordampningen skal du inkubere i en overdækket petriskål med en vådserviet.
  4. Vask væk overskydende lipider
    BEMÆRK: Dette trin fjerner overskydende SUV'er og fungerer som et bufferudvekslingstrin. Det er meget vigtigt ikke at skrabe dobbeltlaget med pipettespidsen under vask; hvis glasset udsættes, vil septiner og mange andre proteiner binde irreversibelt, hvilket reducerer den effektive proteinkoncentration.
    1. Efter inkubation skylles dobbeltlaget 6x med 150 μL SLBB, pipetteres op og ned for at blande hver gang, samtidig med at bobler undgås.
      BEMÆRK: Tilsæt 150 μL direkte til 50 μL buffer og SUV'er, der allerede er til stede for i alt 200 μL i reaktionsbrønden.
    2. Når du er klar til at begynde at inkubere med septinerne eller et andet protein efter eget valg, vaskes dobbeltlaget 6x med 150 μL reaktionsbuffer (RXN: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1,4 mg / ml BSA, 0,14% methylcellulose, 1 mM BME).
      BEMÆRK: For de bedste resultater skal du gøre reaktionsbufferen frisk og være meget forsigtig, mens du blander reaktionen godt for at undgå bobler.
    3. På det sidste vasketrin fjernes 125 μL reaktionsbuffer, så der efterlades 75 μL i brønden. Der tilsættes 25 μL septin fortyndet i septinopbevaringsbuffer (SSB: 300 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM BME) ved den ønskede koncentration og billede ved TIRF-mikroskopi26.
      BEMÆRK: Når du opretter dette assay for første gang eller inkorporerer en ny lipidsammensætning, er det god praksis at sikre, at lipider frit diffunderer på overfladen ved hjælp af fluorescensgenvinding efter fotobleaching (FRAP). Mens genopretningshastigheden vil være forskellig for forskellige lipidsammensætninger og iboende lavere end for fritstående systemer, bør lipiderne ikke være ubevægelige.

Understøttet Lipid Bilayer Buffer (SLBB)
Lager Lydstyrke Endelig fusion
2 M KCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 200 μL 20 mM
500 mM MgCl2 20 μL 1 mM
Vand 8 ml
Præreaktionsbuffer (PRB)
Lager Lydstyrke Endelig fusion
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 500 μL 50 mM
Vand 9,33 ml
Reaktionsbuffer
Lager Lydstyrke Endelig fusion
2 M KCl 166 μL 33,3 mM
1 M HEPES 300 μL 50 mM
10 mg/ml BSA 1,39 ml 1,39 mg/ml
1% methylcellulose 1,39 ml 0.0014
Vand Op til 10 ml
Bme 0,7 μL 1 mM
Septin-lagerbuffer (SSB)
Lager Lydstyrke Endelig fusion
2 M KCl 1,5 ml 300 mM
1 M HEPES 500 μL 50 mM
Vand Op til 10 ml
Bme 0,7 μL 1 mM

Tabel 1: Bufferkomponenter til fremstilling af understøttet lipid dobbeltlag og reaktioner. Mængder af stamopløsninger, der er inkorporeret i buffere, og de endelige koncentrationer af hver komponent er vist. SLB og PRB kan opbevares ved stuetemperatur og genbruges mellem eksperimenter. Reaktionsbuffer og SSB fremstilles frisk for hvert eksperiment.

2. Sfæriske understøttede lipid dobbeltlag

BEMÆRK: Denne protokol bruger silicamikrosfærer suspenderet i ultrarent vand med 10% densitet. For ethvert arbejde med de kinetiske parametre for proteinsamling er det vigtigt at strengt kontrollere det samlede membranoverfladeareal mellem eksperimenter og krumninger. Tabel 2 viser de korrigerede mængder af perler og buffer for at opretholde 5 mm2 af det samlede membranoverfladeareal. Denne protokol bygger videre på en tidligere offentliggjort metode 8,18.

  1. Dannelse af dobbeltlag
    BEMÆRK: Hvad angår plane dobbeltlag, er det vigtigt at have SUV'er af høj kvalitet til robust dobbeltlagsdannelse. Tabel 2 viser volumenet af perler fra en 10% densitetsopløsning og deres respektive SLBB-volumener, der bruges til at opnå et endeligt overfladeareal på 5 mm2 for en række perlediametre.
    1. Silicamikrosfærer (også kaldet perler) har tendens til at slå sig ned og klumpe sammen; for at blande perlerne og bryde eventuelle klynger op, hvirvel flasken i 15 s, derefter bade-sonicate i 1 min og hvirvel igen i 15 s.
    2. Bland det passende volumen perler (tabel 2) med det tilsvarende volumen SLBB og 10 μL 5 mM SUV'er i et 0,5 ml mikrocentrifugerør med lav vedhæftning.
    3. Rock perle-lipidblandingen ende-over-ende i 1 time ved stuetemperatur. Sørg for, at denne inkubation udføres på en rotator for at forhindre sedimentering.
  2. Forbered kamre på PEGylated coverslips
    BEMÆRK: Hvad angår plane dobbeltlag, bruges hjemmelavede kamre fra plast-PCR-rør til at understøtte reaktionsvolumenerne, men andre materialer med lav vedhæftning, såsom silikonebrønde, kan fungere lige så godt.
    1. Mens perlerne gynger, skal du tø et PEGylated coverslip ved stuetemperatur. Der skæres et 0,2 ml PCR-rør, og det limes på dækslen som beskrevet i trin 1.2. For 24 mm x 50 mm dias kan op til 10 kamre passe på et dias.
      BEMÆRK: Denne protokol bruger 24 mm x 50 mm PEGylated glasdæksler, der er forberedt på forhånd. Kort fortalt rengøres glasdæksler grundigt gennem sonikering i acetone, methanol og 3 M KOH. Coverslips funktionaliseres derefter med n-2-aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan og kovalent bundet til mPEG succinimidylvalerat. Færdige PEGylaterede dæksler opbevares vakuumforseglet ved -80 °C. For en lignende passiveringsprotokol, se Gidi et al.27's arbejde. Mens PEGylated glas coverslips er foreslået her, andre midler til passivering, såsom BSA eller poly-L-lysin metoder, kan være effektive.
  3. Vask væk overskydende lipider
    BEMÆRK: Dette trin fungerer til at fjerne overskydende SUV'er og udføre en bufferudveksling. Perler vaskes 4x i alt med præreaktionsbuffer (PRB: 33,3 mM KCl, 50 mM HEPES, pH 7,4). Tabel 3 viser omdrejningshastighederne i RCF for en række perlediametre.
    1. Spinperler ved den udpegede RCF i 30 s (tabel 3). Hvis du bruger flere perlestørrelser, skal du holde perlerne gyngende, indtil det er tid til at blive vasket.
      BEMÆRK: Det er ikke værd at sedimentere større perler i samme spin som mindre perler med den mindre perlesedimenteringshastighed for at spare tid. Dette kan få perler til at klæbe til hinanden og kompromittere dobbeltlagets integritet.
    2. Efter det første spin fjernes 50 μL supernatant og tilsættes 200 μL PRB. Efter den anden og tredje spins skal du fjerne 200 μL og tilføje 200 μL PRB. Efter det fjerde spin fjernes 200 μL og tilsættes 220 μL PRB. Pipetter kraftigt for hver vask.
      BEMÆRK: Den endelige genoplivningsvolumen er anderledes end vaskene. Hvirvl ikke perlerne efter inkubation med lipiderne, da dette kan efterlade huller i dobbeltlaget. For at undgå sedimentering, mens du arbejder med de andre perlestørrelser eller opsætter andre dele af analysen, skal du placere perleblandingerne tilbage på ende-over-end rotatoren.
  4. Forberedelse af reaktionen
    BEMÆRK: Denne reaktion er designet til at bevare reaktionens samlede membranoverfladeareal ved 5 mm2 og til at frembringe en endelig reaktionstilstand på 100 mM KCl, 50 mM HEPES, 1 mg / ml BSA, 0,1% methylcellulose og 1 mM BME.
    1. Hvis du laver et konkurrenceassay med flere perlestørrelser, skal du lave en 1: 1 blanding ved at blande lige store mængder af hver perlestørrelse sammen. Bland derefter 29 μL af den ønskede perleblanding (eller af en enkelt perle) med 721 μL RXN buffer.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at blande perlerne grundigt ved hvert trin med en pipette for at undgå tætte klynger af perler; dette vil resultere i en mere jævn perlefordeling og nøjagtigt samlet overfladeareal.
    2. 75 μL fortyndede perler og 25 μL protein fortyndet i SSB blandes til brøndene.
      BEMÆRK: Forfatterne afbilder typisk gærseptinkomplekser ved 1-50 nM.
    3. Hvis du måler septiner i en steady-state, inkuberes ved stuetemperatur i 1 time, og derefter billede ved enten nær-TIRF eller konfokal mikroskopi.
Perle diameter (μm) Volumen af velblandede perler (μL) Volumen af SLB-buffer (μL) Volumen af SUV'er (μL)
6.46 8.94 61.1 10
5.06 7 63 10
3.17 4.39 65.6 10
0.96 1.33 68.7 10
0.54 0.75 69.3 10
0.31 0.43 69.6 10

Tabel 2: Normaliserede mængder af mikrosfærer. For at opretholde et lige overfladeareal af hver perlestørrelse og for at holde det samlede membranoverfladeareal konsistent mellem eksperimenter blev der beregnet volumener for hver perlestørrelse og buffer, der normaliserede det samlede overfladeareal.

Perle diameter (μm) Sedimentationshastighed (RCF)
0.31 4.5
0.54 4.5
0.96 2.3
3.17 0.8
5.06 0.3

Tabel 3: Sedimentationshastigheder for mikrosfærer med varierende diametre. For hver perlediameter blev de viste mindste sedimenteringshastigheder brugt til at pelletere perlerne til vask af ubundne liposomer.

3. Stangunderstøttede lipid dobbeltlag

BEMÆRK: I modsætning til de andre assays, der præsenteres her, tillader stangassayet ikke omhyggelig kontrol af det samlede membranoverfladeareal. Man kan være konsistent i mængder og volumener mellem eksperimenter, men fordi dette resulterer i stænger af forskellig længde og diametre, er det vanskeligt at ekstrapolere det samlede membranoverfladeareal i reaktionen. Selvom dette er et fremragende assay til udforskning af krumningsføling med flere krumninger på en enkelt overflade og har været nyttigt til at udforske septin ultrastruktur, anbefales det ikke til kinetiske målinger. Denne metode blev tidligere rapporteret18 og udvides her.

  1. Opnåelse af borosilikatstænger fra glasmikrofiberfiltre
    1. Riv et enkelt GF/C-glasmikrofiberfilter af 42,5 mm kvalitet i små stykker, og læg dem i et 100 ml bægerglas med 60 ml 100 % ethanol. Bath-sonicate indtil opløsningen bliver uigennemsigtig; dette kan tage så lidt som 20-30 minutter med et fint makuleret filter.
      BEMÆRK: Soniker grundigt for at bryde store bidder op; jo mere dissocieret / uigennemsigtig, jo bedre.
    2. Dæk opløsningen med film og opbevar opløsningen ved stuetemperatur natten over.
  2. Danner dobbeltlag på stængerne
    BEMÆRK: Dette trin udføres med overskydende lipider for at opnå fuldstændig stangdækning, da det er umuligt at kvantificere det samlede overfladeareal i denne metode.
    1. Den næste dag bundfældes ethanolopløsningen (trin 3.1.2), så bland den godt inden brug. Kombiner 10 μL stangopløsning og 70 μL SLBB.
    2. Centrifuger med tophastighed i en minicentrifuge i 30 s, og fjern 50 μL af supernatanten. Resuspend i yderligere 50 μL SLBB og gentag centrifugeringen i alt fire vaske for at fortynde ethanolen.
      BEMÆRK: Stangstøtter danner ikke en fast pille i bunden af røret. De smøres i stedet langs siden af røret; dette gør dem vanskelige at bevare fuldstændigt, når de vaskes. Da det samlede overfladeareal i dette assay ikke kontrolleres, er det fint, hvis de forstyrres.
    3. Kombiner 10 μL godt blandet stangopløsning med 50 μL 5 mM SUV'er og 20 μL SLBB. Inkuberes i 1 time ved stuetemperatur, roterende ende-over-ende som ved dannelse af dobbeltlag på mikrosfærerne.
  3. Vask væk overskydende lipider
    1. I lighed med trin 3.2.2 drejes lipidstangopløsningen ved tophastighed i en minicentrifuge i 30 s for at pille de membranbelagte stænger ud af opløsningen.
    2. Efter det første spin fjernes 50 μL af supernatanten og tilsættes 200 μL PRB. Efter den anden og tredje spins skal du fjerne 200 μL og tilføje 200 μL PRB. Efter det fjerde centrifugering fjernes 200 μL, der tilsættes 220 μL PRB, og der pipetteres kraftigt for at blande.
  4. Forberedelse af reaktionen
    1. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør blandes 721 μL reaktionsbuffer med 29 μL stangopløsning. Bland godt.
    2. I et 0,2 ml PCR-rør kombineres 75 μL stænger i reaktionsbuffer og 25 μL septiner i den ønskede koncentration fortyndet i SSB. Lad det inkubere ved stuetemperatur i mindst 1 time.
  5. Forberedelse til scanning elektronmikroskopi
    1. Efter inkubation tilsættes 100 μL septinstangsblandingen på en rund, PEG-belagt 12 mm dækslip og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time i en lukket petriskål.
    2. Prøven fikses ved at fylde bunden af petriskålen (10 ml bør være nok) med 2,5% glutaraldehyd i 0,05 M natriumcacodylat (NaCo), pH 7,4, i 30 min. Opsuge væsken med en glaspipette. Prøven vaskes ved at inkubere den med 10 ml 0,05 M NaCo i 5 minutter, og den gentages i alt to vaske.
    3. Læg den i 0,5 % OsO 4-cacodylatbuffer i 30 minutter, og vask derefter 3x på 0,05 M NaCo (5 min/vask).
    4. Prøven inkuberes med 1% garvesyre i 15 minutter, og derefter vaskes i NaCo 3x. Der inkuberes i 15 min. i 0,5% OsO4 og vaskes 3x med NaCo.
    5. Dehydrere prøverne ved hjælp af stigende ethanolkoncentrationer: 30% EtOH i 5 minutter, 2x; 50% EtOH i 5 minutter; 75% EtOH i 5 minutter; og 100% EtOH i 5 min, 2x. Følg med yderligere 10 minutters inkubation.
    6. Inkuberes i overgangsvæske (hexamethyldisilazan) 3x (5 min, 10 min, derefter 5 min).
    7. Lad det lufttørre, og læg derefter prøverne i en ekssikkator, indtil de er spruttebelægning. Sputter-coat 4 nm laget med en guld / palladium legering og derefter billede på et scanning elektronmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter fremstillingen af hver SLB kan septiner eller proteinet af interesse inkuberes med den ønskede støtte og afbildes via TIRFM, konfokal mikroskopi eller SEM. Resultaterne vist her bruger septiner rekombinant udtrykt og renset fra E. coli17. Ved hjælp af TIRFM på plane SLB'er er det muligt at bestemme længden af filamenter og deres fleksibilitet, måle diffusionskoefficienterne og observere samling over tid28,29. For at indsamle målinger af højeste kvalitet er det først nødvendigt at fastslå kvaliteten af dobbeltlag, især når man forbereder dem for første gang eller ved ændring af lipidsammensætninger. En visuel inspektion af proteinfordelingen på dobbeltlagene af TIRFM kan hjælpe med at identificere områder af dobbeltlaget, der er blevet ridset eller er misdannet. Proteinfordelingen skal være homogen (figur 3A), og der bør ikke være huller eller huller i dobbeltlaget (figur 3B). Det er bedst at undgå membraner med huller, som kan dannes af støvforurening eller pletter fra glidehåndtering, da dette kan ændre proteinfordelingen i andre områder af dobbeltlaget. For at visualisere selve membranen kan spor rhodamin-PE inkorporeres i SUV'er til dannelse af dobbeltlag. I dobbeltlag af høj kvalitet vises feltet jævnt (billeder ikke vist), men hvis liposomer er gamle, eller hvis vaske ikke er strenge nok, kan der ophobes ubelastede og tubulerede liposomer på overfladen (figur 3C). Derudover, mens faste understøtninger vil hæmme den frie diffusion af lipider8, bør lipiderne ikke være ubevægelige. FRAP-eksperimenter kan bruges til at vurdere mobiliteten af lipider på plane dobbeltlag, som kan variere efter sammensætning og skal vise genopretningshastigheder i størrelsesordenen sekunder30.

Sfæriske understøtninger kan anvendes til at undersøge proteinbinding på membraner af definerede krumninger enten isoleret (en krumning) eller med flere membrankrumninger i samme brønd for at observere konkurrence mellem krumninger 6,18. Nær-TIRFM på perler >1 μm kan også bruges til at måle antallet af foreningsarrangementer for et givet område27. Som med plane dobbeltlag bruger vi rhodamin-PE til at lede efter glat dobbeltlagsaflejring (figur 4A), dvs. ingen lipidklumper, som indikerer multi-lamellaritet eller unburst liposomer (figur 4B) og ingen huller i dobbeltlaget (figur 4C). Til måling af den samlede proteinadsorption eller proteinadsorptionen over tid på buede overflader er det nødvendigt at isolere individuelle perler fra hinanden for at skabe et diskret volumen, for hvilket sumlipidintensitet og sumseptinintensitet kan måles. Perlerne skal således være godt adskilt i stedet for at klumpe sig sammen som i figur 4D. Vi behandler fejlfindingsmuligheder for alle disse potentielle problemer i diskussionsafsnittet.

Dette SLB-assay kan også anvendes på stangstøtter, som tilbyder et miljø for proteiner til at prøve flere krumninger på en enkelt overflade. Parring af dette assay med scanningselektronmikroskopi giver brugeren mulighed for at undersøge krumningspræference, justering og længdefordeling af septiner18 eller andre proteiner af interesse. Mens det ligner de andre assays, der præsenteres her, tillader stangassayet ikke omhyggelig kontrol af det samlede membranoverfladeareal på grund af den heterogene karakter af substratet, der er afledt af filterpapir. Materialeegenskaberne for det filterpapir, der anvendes her, resulterer i stænger af forskellig længde og diameter (figur 5A); dette er nyttigt til at udforske proteinkrumningsføling og organisering på buede overflader (figur 5B), men fordi forholdet mellem protein og membranen ikke kan kontrolleres, er stængerne af begrænset nytte til at generere mætningsbindende kurver eller måle parametre såsom bindingskonstanter.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over understøttet lipid dobbeltlag dannelse på understøtninger med forskellige krumninger. SUV'er inkuberes med faste understøtninger af forskellige geometrier for at ændre de krumninger, der er tilgængelige til prøveudtagning på en given membran. SUV'er adsorberer på den faste støtteflade og brister for at skabe lipiddobbeltlag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk opsætning af reaktionskammer. For at forberede brugerdefinerede kamre skæres et 0,2 ml PCR-rør, hvor røret begynder at tilspidse og ved hætten (røde stiplede linjer). Den uskårne kant af det afskårne rør belægges derefter med et tyndt lag UV-aktiveret lim (blå) og placeres lim-ned på en dækslip. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative TIRF-mikrografer af plane dobbeltlag. (A) Et repræsentativt billede af et lipiddobbeltlag af høj kvalitet (75% DOPC, 25% soja PI) med ikke-polymeriserbare septiner bundet (grøn). Protein grupperer ikke i nogen bestemte regioner, og der er ingen liposomer fastgjort til membranen og ingen huller. (B) Dette dobbeltlag blev lavet med dårligt rengjorte glasdæksler og udviser, hvad der ser ud til at være "huller" (hvide pile) i membranen, hvor der er færre septiner. Septiner kan ses overfyldte i kanterne af disse defekter i dobbeltlaget (betegnet med de hvide pile i det zoomede område til højre). (C) Et repræsentativt billede af et dobbeltlag af lav kvalitet, der anvender spor rhodamin-PE. Unburst liposomer og tubulerede lipider er synlige på overfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative mikrografer af lipidbelagte mikrosfærer. Repræsentative billeder fra konkurrenceassays, hvor lipidbelagte perler (75% DOPC, 25% soja PI, 0,1% Rhodamin PE) med diametre på 0,3 μm, 0,5 μm, 1 μm, 3 μm og 5 μm blev blandet. Alle billeder er maksimale Z-fremskrivninger. (A) Repræsentativt billede af en blanding af lipidbelagte mikrosfærer af høj kvalitet. De sfæriske understøtninger er jævnt belagt af membranen, og der er få perleklynger. (B) Repræsentativt billede af ujævn membranbelægning, sandsynligvis forårsaget af utilstrækkelig vask af overskydende lipider. (C) Repræsentativt billede af perler med huller i membrandækningen (hvide pile) på grund af forkert håndtering. (D) Repræsentativt billede af tæt grupperede perler, sandsynligvis forårsaget af utilstrækkelig blanding under hele proceduren, især når de forskellige perler kombineres sammen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative elektronmikrografer af lipid- og septinbelagte stænger. (A) SEM-billede, der viser fordelingen af lipidbelagte (75% DOPC, 25% soja PI, 0,1% Rhodamin PE) stanglængder og diametre. B) Kanten af en isoleret membranbelagt stang med septinfilamenter, der er justeret langs den positive krumningsakse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellemembraner antager mange forskellige former, krumninger og fysisk-kemiske egenskaber. For at studere det nanometer-skala maskineri, hvorigennem celler bygger mikrometerskalasamlinger, er det nødvendigt at designe minimale rekonstitutionssystemer af membranmimetik. Denne protokol præsenterer teknikker, der præcist styrer både membrankrumning og sammensætning, samtidig med at brugeren let kan foretage kvantitative fluorescensmålinger ved hjælp af bredt tilgængelige mikroskopiteknikker.

De mest kritiske komponenter i denne protokol er at samle brønde på den passende overflade og håndtere lipiderne. Brøndene beskrevet her er håndlavet ved hjælp af PCR-rør og UV-aktiverede klæbemidler; det er vigtigt ikke at få lim inde i reaktionsområdet under montering. Dette kan kontrolleres under eksperimentet ved at billeddanne sig langs brøndens kanter og lede efter høj proteinadsorption på dækglasset. Brugeren kan vælge at bruge alternative materialer til brønde, såsom silikone, som kan bestilles kommercielt, men den præsenterede metode giver robuste brønde, der ikke skifter eller lækker og kan understøtte større reaktionsvolumener. Overfladen af dækglasset i vores hænder har været meget vigtig for dannelsen af plane dobbeltlag. Optimering af plasmarensningstider eller endda mærket af dækglas kan være nødvendig for at se jævn dannelse af dobbeltlaget, da passende overfladebehandling og ladning er afgørende for vesikeladsorption og fusion 31,32,33. Ved opsætning af disse eksperimenter for første gang eller arbejde med nye lipidsammensætninger bør fluorescensgenvinding efter fotobleaching (FRAP) eksperimenter anvendes til at vurdere membranens fluiditet sammenlignet med fritstående systemer30. Det forventes, at støttesystemer vil være mindre flydende end deres fritstående modstykker, men ikke ubevægelige12.

Ved vurdering af dobbeltlagets kvalitet ved fluorescens er det vigtigt at kigge efter ubesmittede liposomer eller defekter i dobbeltlaget (figur 3C), da disse kan ændre lokal proteinadsorption. Følgende fejlfindingsmuligheder kan overvejes. a) Man kan justere SUV-forberedelsen for at forbedre dobbeltlagskvaliteten. Sonikering, fryse-optøning og ekstrudering er alle almindeligt anvendte metoder, der kan variere i lethed og succes baseret på lipidsammensætninger. I vores hænder resulterer en fuldt afklaret SUV-løsning med en monodisperseret størrelsesfordeling i de mest homogene dobbeltlag. Dynamisk lysspredning (DLS) kan bruges til at vurdere størrelsesfordeling25. b) Man kan øge forskellen i saltkoncentration mellem indersiden af SUV'erne og den eksterne buffer. Ved at reducere den interne ionkoncentration (eller øge den eksterne) øger osmotisk stress på SUV'erne sandsynligheden for brud31. Alternativt kan ændring af den monovalente kation, der er til stede, ændre kinetikken ved SLB-dannelse og hjælpe med at optimere SLB'er af nye lipidsammensætninger34. c) Man kan øge antallet eller kraften af vaske. Efter forfatternes erfaring fører kraftig blanding under vask til renere dobbeltlag og ser ikke ud til at være forstyrrende; i stedet kommer det største problem fra ved et uheld at skrabe dobbeltlaget med pipettespidser, som vises som en gash i membranen. For buede dobbeltlag er det bedst at minimere håndtering med smalle pipettespidser og blande forsigtigt, når vasketrinnene udføres, især for større (>1 μm) perler, da membranen kan klippes fra glasperlerne. Hvis der observeres vedvarende huller i de sfæriske membran dobbeltlag (figur 4C), kan det hjælpe at øge pipettespidsernes bredde (ved at afskære enden af spidsen eller købe brede spidser) og reducere håndteringen så meget som muligt, mens du stadig blander perleopløsningerne fuldstændigt. Et almindeligt teknisk problem med denne teknik er perlernes tendens til at klumpe sammen (figur 4D). Dette kan delvist løses ved at øge sonikeringstiden før dobbeltlagsdannelse; nogle klynger er dog uundgåelige, da membranbelagte perler også kan have en tendens til at klumpe sammen over tid i brønden. Klumpede perler bør undgås til kvantitative analyser.

Begrænsninger for kvantitative målinger af enkeltmolekyledynamik på plane dobbeltlag inkluderer behovet for at forblive i lave koncentrationer for nøjagtigt at spore og tælle partiklerne. Dette kan dog afhjælpes ved at undermærke proteinet af interesse under erhvervelse for at reducere antallet af partikler, der er synlige under sporing35. Derudover blev sfæriske og stang-SLB'er udviklet specifikt til at kvantificere krumningsfølsomheden af proteiner på membraner i mikrometerskala, og silicamikrosfærerne, der anvendes her, er kun tilgængelige ned til 100 nm i diameter, på hvilket tidspunkt de er diffraktionsbegrænsede puncta, når de ses ved lysmikroskopi. Således vil de, der ønsker at vurdere præcis krumningsspecificitet på mindre diametre, ikke være i stand til at gøre det ved hjælp af denne metode. Denne teknik vil dog stadig give værdifuld information om tendensen med krumningspræference og give mulighed for dissektion af krumningsafhængige samlinger.

Sammenlignet med fritstående lipid dobbeltlagssystemer er denne teknik modtagelig for en lang række bufferbetingelser og kræver ikke omhyggelig osmotisk afbalancering under forberedelsen. Da der anvendes glasstøtter, synker dobbeltlagene desuden let til bunden af brønden, hvilket fjerner behovet for tøjring eller anvendelse af saccharose eller andre fortykningsmidler36. Mens fritstående lipid dobbeltlagssystemer giver et nyttigt middel til at undersøge membrandeformation af membranbindende proteiner, er det vanskeligt at studere forholdet mellem membrankrumning og kompleks samling. I modsætning til let deformerbare membransystemer giver denne tilgang brugeren mulighed for at anvende en række lipidsammensætninger uden den iboende form af individuelle lipidarter, der dikterer membranens globale geometri. Endelig tillader stangformede SLB'er prøveudtagning af flere krumninger på den samme kontinuerlige membran for proteiner af interesse (figur 5B), hvilket er unikt informativt til evaluering af krumningsafhængige samlinger eller kolonisering af flere komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) Grant nr. R01 GM-130934 og National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. og K.S.C. blev delvist støttet af et tilskud fra National Institute of General Medical Sciences under tildeling T32 GM119999.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR Tubes with flat cap, Natural Watson 137-211C(EX)
0.5 mL low adhesion tubes USA Scientific 1405-2600
Beta mercaptoethanol (BME) Sigma-Aldrich M6250-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4612-25G
Coverglass for making PEGylated coverslips Thermo Scientific 152450 Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5
DOPC Avanti Polar Lipids 850375
Egg Liss Rhodamine PE Avanti Polar Lipids 810146
EMS Glutaraldehyde Aqueous 25%, EM Grade VWR 16220
EMS Sodium Cacodylate Buffer VWR 11652
Ethanol, 200 proof Fisher Scientific 04-355-223EA
HEPES Sigma Aldrich H3375-1KG
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191
Magnesium chloride VWR 7791-18-6
Methyl cellulose 4000cp Sigma-Aldrich M052-100G
Microglass coverslips for planar bilayers Matsunami Discontinued 22x22
Mini centrifuge
Non-Functionalized Silica Microspheres Bangs Laboratories, Inc. Depends on size: SS0200*-SS0500* Silica in aqueous suspension
Optical Adhesive Norland Thorlabs NOA 68 Flexible adhesive for glass or plastics
Osmium tetroxide Millipore Sigma 20816-12-0
Parafilm VWR 52858-000
Plasma Cleaner Plasma Etch PE-25 Voltage: 120V, 60Hz. Current: 15 AMPS
Potassium chloride VWR 0395-1kg
Round coverglass, #1.5 12mm   VWR 64-0712
Sonicator bath Branson 1510R-MT Bransonic Ultrasonic cleaner. 50-60 Hz. Output: 70W
Soy PI Avanti Polar Lipids 840044
Tabletop centrifuge Eppendorf 22331
UV Lamp Spectroline ENF-260C 115 Volts, 60 Hz, 0.20 AMPS
WhatmanGlass Microfiber Filter Paper VWR 28455-030 42.5 mm diameter, Grade GF/C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).
  2. Parthasarathy, R., Groves, J. T. Curvature and spatial organization in biological membranes. Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).
  3. Mao, Y., Baum, B. Tug of war-The influence of opposing physical forces on epithelial cell morphology. Developmental Biology. 401 (1), 92-102 (2015).
  4. Ranganathan, R., Alshammri, I., Peric, M. Lipid organization in mixed lipid membranes driven by intrinsic curvature difference. Biophysical Journal. 118 (8), 1830-1837 (2020).
  5. Bigay, J., Casella, J. -F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  6. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 5-6 (2016).
  7. Picard, F., Paquet, M. -J., Dufourc, ÉJ., Auger, M. Measurement of the lateral diffusion of dipalmitoylphosphatidylcholine adsorbed on silica beads in the absence and presence of melittin: A 31P two-dimensional exchange solid-state NMR study. Biophysical Journal. 74 (2), 857-868 (1998).
  8. Fu, R., et al. Spherical nanoparticle supported lipid bilayers for the structural study of membrane geometry-sensitive molecules. Journal of the American Chemical Society. 137 (44), 14031-14034 (2015).
  9. Vanni, S., Hirose, H., Barelli, H., Antonny, B., Gautier, R. A sub-nanometre view of how membrane curvature and composition modulate lipid packing and protein recruitment. Nature Communications. 5 (1), 4916 (2014).
  10. Gill, R. L., et al. Structural basis for the geometry-driven localization of a small protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (15), 1908-1915 (2015).
  11. Pan, J., Dalzini, A., Song, L. Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).
  12. Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).
  13. Lee, A. A., et al. Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118 (2021).
  14. Ferhan, A. R., et al. Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions. Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).
  15. Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  16. Lou, H. -Y., et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  17. Bridges, A. A., et al. Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).
  18. Cannon, K. S., Woods, B. L., Crutchley, J. M., Gladfelter, A. S. An amphipathic helix enables septins to sense micrometer-scale membrane curvature. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1128-1137 (2019).
  19. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  20. Lobato-Márquez, D., et al. Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution. Nature Communications. 12 (1), 4511 (2021).
  21. Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. The septin cortex at the yeast mother-bud neck. Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).
  22. Ong, K., Wloka, C., Okada, S., Svitkina, T., Bi, E. Architecture and dynamic remodelling of the septin cytoskeleton during the cell cycle. Nature Communications. 5, 1-10 (2014).
  23. Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
  24. Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers. Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).
  25. Hupfeld, S., Holsæter, A. M., Skar, M., Frantzen, C. B., Brandl, M. Liposome size analysis by dynamic/static light scattering upon size exclusion-/field flow-fractionation. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9), 3025-3031 (2006).
  26. Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29 (2012).
  27. Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).
  28. Woods, B. L., et al. Biophysical properties governing septin assembly. bioRxiv. , (2021).
  29. Cannon, K. S., et al. A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism. bioRxiv. , (2021).
  30. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLOS One. 11 (7), 0158457 (2016).
  31. Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure. Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).
  32. Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction. Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).
  33. Andrews, J. T., et al. Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts. Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).
  34. Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).
  35. Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).
  36. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).

Tags

Biokemi udgave 185
Rekonstitution af Septin-samling ved membraner for at studere biofysiske egenskaber og funktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D.,… More

Curtis, B. N., Vogt, E. J. D., Cannon, K. S., Gladfelter, A. S. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (185), e64090, doi:10.3791/64090 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter