Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Abstract

Met een sombere mediane overlevingstijd in echte populaties - tussen 6 en 15 maanden - is glioblastoom (GBM) de meest verwoestende kwaadaardige hersentumor. Falen van de behandeling is voornamelijk te wijten aan de invasiviteit van GBM-cellen, wat spreekt voor de behoefte aan een beter begrip van GBM-beweeglijke eigenschappen. Om het moleculaire mechanisme ter ondersteuning van GBM-invasie te onderzoeken, zijn nieuwe fysiologische modellen nodig die een diepgaande karakterisering van eiwitdynamiek tijdens de invasie mogelijk maken. Deze observaties zouden de weg vrijmaken voor de ontdekking van nieuwe doelen om tumorinfiltratie te blokkeren en de resultaten voor patiënten te verbeteren. Dit artikel meldt hoe een orthotopisch xenograft van GBM-cellen in de hersenen van zebravissen subcellulaire intravitale live beeldvorming mogelijk maakt. Gericht op microtubuli (MT's), beschrijven we een procedure voor MT-etikettering in GBM-cellen, micro-injectie van GBM-cellen in de transparante hersenen van 3 dagen na bevruchting (dpf) zebravislarven, intravitale beeldvorming van MT's in de verspreidende xenografts, het veranderen van MT-dynamiek om hun rol tijdens GBM-invasie te beoordelen en het analyseren van de verkregen gegevens.

Introduction

Celmotiliteit is een stereotiep proces dat polariteitsasvorming en krachtgenererende cytoskeletale herschikkingen vereist. Actinepolymerisatie en de associatie met myosine worden erkend als de belangrijkste bijdragen aan uitsteek- en contractiele krachten die nodig zijn voor celbeweging1. Microtubuli worden beschouwd als de belangrijkste actoren in celpolarisatie en directionele persistentie tijdens migratie2. In de afgelopen jaren is ook aangetoond dat MT's uitsteeksels creëren en stabiliseren om mechanocompressieve krachten te ondersteunen tijdens celinvasie in 3D3. Meer recent zijn MT's direct betrokken geweest bij mechanotransductie bij focale verklevingen en mechanosensitive migration4. De dynamische instabiliteit die MT-plus einddynamica kenmerkt, bestaat uit herhaalde fasen van polymerisatie (groei) en depolymerisatie (krimp), die worden gecontroleerd door een overvloed aan microtubule-bindende eiwitten en intracellulaire signaleringscascades, zoals die worden geregeld door RHO-GTPases 5,6,7. De rol van het MT-netwerk in celmigratie en invasie heeft het onderzoek naar MT-dynamiek tot een belangrijk element gemaakt om de mechanismen van immuuncel homing, wondgenezing en kankerinvasie beter te begrijpen.

Het vermogen van kankercellen om te ontsnappen aan de primaire tumorkern, zich te verspreiden in de weefsels en secundaire tumoren te genereren, is een cruciale stap in het voorkomen van wereldwijd succes in de oorlog tegen kanker die 50 jaar geleden 8,9 werd verklaard. Een van de grootste obstakels is het begrijpen hoe kankercellen actief het weefsel binnendringen. Belangrijke invasiemechanismen vertrouwen op dezelfde principes als die voor niet-tumorachtige celmigratie10. Er zijn echter specifieke kenmerken van kankercelmigratie naar vorengekomen 11, waardoor de behoefte aan een betere karakterisering van dit type migratie is ontstaan. In het bijzonder, omdat de tumormicro-omgeving verschijnt als een belangrijke speler in kankerprogressie12, is het observeren en analyseren van kankercelinvasie in een relevante fysiologische context essentieel om de mechanismen van kankercelverspreiding te ontrafelen.

MT's staan centraal in de progressie van kanker, om zowel proliferatie als invasie in stand te houden. Nauwkeurige analyse van MT-dynamica in situ kan helpen bij het identificeren van MT-veranderende agentia (MTA) in beide processen. MT-dynamiek varieert drastisch bij een verandering in de omgeving. In vitro voorkomt behandeling met MT-destabiliserende middelen zoals nocodazol de vorming van celuitsteeksels wanneer cellen zijn ingebed in gels in 3D, terwijl het weinig effect heeft op 2D-celmigratie13,14. Hoewel technisch uitdagend, maakt vooruitgang in intravitale beeldvorming in vivo analyse van MT-dynamiek tijdens invasie van kankercellen mogelijk. De observatie van MT's in subcutaan xenogetransplanteerde fibrosarcoomcellen bij muizen onthulde bijvoorbeeld dat tumor-geassocieerde macrofagen de MT-dynamiek in tumorcellen beïnvloeden15. Deze muismodellen omvatten echter uitgebreide chirurgische procedures en blijven onbevredigend voor minder toegankelijke kankers, zoals de zeer invasieve hersentumor GBM.

Ondanks een sombere gemiddelde overlevingstijd van15 maanden 16, is er weinig bekend over de verspreidingswijze van GBM in het hersenparenchym of de belangrijkste moleculaire elementen die GBM-celinvasie in het hersenweefsel ondersteunen. Verbetering van het muis orthotopisch xenograft (PDX) model en de oprichting van schedelvensters boden nieuwe perspectieven voor GBM celinvasiestudies17,18. Vanwege de suboptimale beeldvormingskwaliteit heeft dit model echter meestal longitudinale beeldvorming van oppervlakkige xenografts mogelijk gemaakt en is het tot nu toe niet met succes gebruikt om subcellulaire beeldvorming van cytoskeleteiwitten te bestuderen. Bovendien zijn in de nasleep van het "3Rs" -bevel om het gebruik van knaagdieren te verminderen en te vervangen door lagere gewervelde dieren, alternatieve modellen opgesteld.

Gebruikmakend van de primitieve immuniteit waargenomen bij zebravis (Danio rerio) larven, werd orthotopische injectie van GBM-cellen in het visbrein ontwikkeld 19,20,21. Injectie in de buurt van de ventrikels in de zich ontwikkelende middenhersenenvatvatting het grootste deel van de menselijke GBM-pathofysiologie21, en hetzelfde voorkeurspatroon van GBM-invasie als bij menselijke co-optie wordt waargenomen22. Dankzij de transparantie van de vislarven maakt dit model de visualisatie mogelijk van GBM-cellen die de hersenen binnendringen vanuit de peri-ventriculaire gebieden waar de meeste GBM's worden verondersteld te ontstaan23.

Omdat MT's essentieel zijn voor GBM-celinvasie in vitro24,25, is een betere karakterisering van MT-dynamica en de identificatie van belangrijke regulatoren tijdens celinvasie nodig. Tot op heden hebben de gegevens die zijn gegenereerd met het orthotopische model van zebravissen echter geen subcellulaire analyse van MT-dynamiek tijdens het invasieproces opgenomen. Dit artikel biedt een protocol om MT-dynamiek in vivo te bestuderen en de rol ervan tijdens de invasie van hersenkanker te bepalen. Na stabiele microtubule-etikettering worden GBM-cellen micro geïnjecteerd met 3 dpf in de hersenen van zebravislarven en in realtime in beeld gebracht met een hoge spatio-temporele resolutie tijdens hun progressie in het hersenweefsel. Live beeldvorming van fluorescerende MT's maakt de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van MT plus-end dynamica mogelijk. Bovendien maakt dit model het mogelijk om het effect van MTA's op MT-dynamica en op de invasieve eigenschappen van GBM-cellen in realtime te beoordelen. Dit relatief niet-invasieve protocol in combinatie met een groot aantal larven dat tegelijkertijd wordt behandeld en het gemak van medicijntoepassing (in het viswater) maakt het model een aanwinst voor preklinisch testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Europese Unie voor het omgaan met proefdieren. Alle protocollen zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van het Institut Pasteur - CEEA 89 en het Franse Ministerie van Onderzoek en Onderwijs (vergunning #01265.03). Tijdens injecties of live beeldvormingssessies werden dieren verdoofd met Tricaine.At het einde van de experimentele procedures werden ze geëuthanaseerd door een overdosis anestheticum. Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebruikt. De algemene workflow van het protocol wordt beschreven in figuur 1.

1. Generatie van glioblastoomcellen die stabiel tot expressie komen α-tubuline-mKate2

OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast BSL2+.

  1. Produceer lentivirale deeltjes die mKate2-tubuline tot expressie brengen met behulp van de calciumfosfaatmethode voor de transfectie van 7 × 106 HEK-293T-cellen.
    1. Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 10 μg2e generatie verpakkingsplasmide psPAX2, 5 μg virale enveloppeplasmide pMD2.G en 10 μg van het plasmide van belang, pGK-mKate2-humaan tubuline α1a met 50 μL CaCl2 (2,5 M bouillon) toe. Stel in op 500 μL met steriele DNAse-vrije H2O.
      OPMERKING: Het is belangrijk om CaCl2 als laatste toe te voegen.
    2. Meng door de buis een paar keer om te keren en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Bereid tijdens de incubatie nog een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 500 μL HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS), pH 7,0 (2x).
    4. Voeg na 20 mindruppelsgewijs de CaCl 2/DNA-mix toe aan de HBS (2x) oplossing. Meng door de buis een paar keer om te keren. Incubeer gedurende 12 minuten bij RT.
    5. Voeg na 12 min voorzichtig de CaCl2/DNA gemengd met HBS toe aan een 70% confluente schaal van 10 cm HEK-293T cellen, druppel voor druppel.
    6. Laat de cellen in de bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 36-48 uur.
    7. Verzamel het supernatant en draai het gedurende 5 minuten op 3.000 × g om cellulair puin te verwijderen.
    8. Om de virale deeltjes te concentreren, laadt u het supernatant in een ultracentrifugebuis en draait u het af op 47.508 × g gedurende 90 minuten bij 4 °C.
    9. Gooi het supernatant weg en plaats de buis ondersteboven op papier om de binnenkant van de buis te drogen.
    10. Voeg 30 μL PBS toe aan de virale pellet. Resuspendeer de pellet niet. Laat 2 uur bij 4 °C staan.
    11. Resuspendeer de virale deeltjes voorzichtig door op en neer te pipetteren. Vermijd het maken van bubbels. Bewaren bij -80 °C.
      OPMERKING: Grotere hoeveelheden virale deeltjes kunnen worden geproduceerd door meerdere platen hek-2-93T-cellen te transfecteren.
  2. Infecteer glioblastoomcellen met lentivirale deeltjes.
    OPMERKING: Dit protocol is geschreven voor commerciële glioblastoomcellijnen zoals U-87 MG, U-373 MG of T98. Om primaire patiënt-afgeleide glioblastoomcellen te gebruiken, gebruikt u een specifieke coating van de platen en niet op serum gebaseerd medium26.
    1. Bereid een 70% confluent 10 cm schaal van U-87 MG glioblastoomcellen gekweekt in Eagle's minimum essential medium (MEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml eindconcentratie voor penicilline en 100 μg / ml voor streptomycine) en niet-essentiële aminozuren (1x).
    2. Voeg de virale deeltjes toe bij een verdunning van 1 op 5.000 rechtstreeks op de cellen. Meng met een zachte werveling. Laat de virussen de cellen niet langer dan 20 uur infecteren.
    3. Verwijder het virusbevattende medium en vervang het door vers kweekmedium. Laat de expressie van de gelabelde tubuline gedurende 48-72 uur toe.
      OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast BSL2.
    4. FACS-sorteer de cellen om de helderste 15% van de mKate2+ cellen te selecteren. Nadat u vuil en doubletcellen hebt verwijderd met behulp van de voorwaartse en zijverstrooiing (FCS versus SSC) gating, past u nog een gating toe op de helderste 30% mKate2 + -cellen om de bovenste 15% te behouden.
    5. Versterk de MT-gelabelde cellen.
      OPMERKING: Als alternatief kan klonale selectie op basis van hoge niveaus van tubuline-mKate2 worden uitgevoerd onder een epifluorescentiemicroscoop.

2. Bereid zebravislarven voor op micro-injectie

  1. Genereer zebraviseieren.
    1. Plaats drie mannetjes en vier vrouwtjes van de gewenste zebravissoort in een paringstank aangevuld met knikkers 4 dagen voor de xenotransplantatie, laat in de middag.
      OPMERKING: De Tg (fli1a: gfp), Tg (gfap: gfp) of Tg (Huc: gfp) lijnen worden gebruikt om respectievelijk endogene bloedvaten, neurale stamcellen / astrocyten en neuronen te markeren.
    2. Verzamel de eieren die worden geproduceerd door marmer-geïnduceerde spawning de ochtend erna.
    3. Reinig de eieren door ze over te brengen naar een centrifugebuis van 50 ml gevuld met mineraalwater27 aangevuld met bleekmiddel (0,004% finale). Keer de buis voorzichtig om gedurende 5 minuten. Was twee keer met alleen mineraalwater.
    4. Breng de eieren over in een petrischaal met daarin het mineraalwater aangevuld met 0,28 mg/ml ethyleenblauw.
    5. Verwijder de onbevruchte en ontwikkelingsgevangen eieren. Incubeer de embryo's bij 28 °C.
  2. Maak transparante larven.
    1. Breng N-fenylthiourea (PTU) (0,003% finale) 8 uur later in het medium, om melaninepigmentatie te voorkomen en optische transparantie te garanderen. Houd PTU in het medium voor de rest van het protocol.
      OPMERKING: Omdat PTU-behandeling ontwikkelingsstoornissen kan veroorzaken, selecteert u alleen de normaal ontwikkelde larven voor xenotransplantatie. Als alternatief voor chemische behandeling kan men de gemuteerde zebravisstam casper (nacre en roy orbison double mutant) gebruiken, waarbij pigmentatie afwezig is28.
    2. Verhoog de broedtemperatuur tot 29 °C.
    3. Verhoog de temperatuur elke dag met 1 °C zodat de 3 dpf larven 32 °C bereiken op de dag van injectie.
  3. Bereid de micro-injectieplaat voor.
    1. Bereid 20 ml 1% agarose + 0,28 mg / ml ethyleenblauw met mineraalwater.
    2. Giet de agarose in een petrischaaltje van 10 cm en breng de microinjectie plastic mal snel ondersteboven aan om 2,5 mm brede V-vormige greppels te creëren (figuur 2B).
      OPMERKING: De plastic mal is in de handel verkrijgbaar of kan in eigen huis worden gebouwd volgens het ontwerp dat wordt beschreven in het Zebrafish Book29.
    3. Verwijder voorzichtig de plastic mal wanneer de agarose is gestold.
      OPMERKING: Micro-injectie gegoten platen kunnen worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
  4. Bereid de larven voor op xenotransplantatie.
    1. Screen op de dag van injectie op geselecteerde fluorescerende transgene expressie in de 3 dpf-larven. Verwijder de niet-fluorescerende, abnormaal uitziende dieren.
    2. Dechorioneer de larven handmatig met een horlogemakertang met fijne punt. Prik of scheur bij 3 dpf voorzichtig de chorionen open met twee paar fijne tangen om de larven van het chorion te bevrijden.
      OPMERKING: Als alternatief kan enzymatische behandeling met pronase A worden gebruikt om larven te dechorioneren, meestal bij 24 hpf.
    3. Onderhoud de gederonieerde larven in mineraalwatermedium met methyleenblauw (0,28 mg / ml) en PTU (0,003% definitief).

3. Xenotransplantatieprocedure

  1. Bereid micro-injectienaalden voor.
    1. Neem een capillair van borosilicaatglas zonder centrale gloeidraad en plaats deze in een verticale naaldtrekker.
    2. Gebruik de volgende instellingen - verhoog 8,5 en verwarm 3-stretch het capillair om er een micro-injectienaald van te maken.
  2. Stel de micro-injectctor in.
    1. Laad minerale olie in een handmatige micro-injector. Verwijder luchtbellen.
    2. Sluit een universele capillaire houder aan op de micro-injector en bevestig deze stevig aan een mechanische micromanipulator (figuur 2A).
  3. Oogst de glioblastoomcellen.
    OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast BSL2.
    1. Bereid een plaat van 10 cm glioblastoomcellen voor, zodat ze op de dag van transplantatie 80% samenvloeiing bereiken.
    2. (Optioneel) Label de celkernen tijdelijk door Hoechst 35480 (200 ng/ml) aan de cellen toe te voegen. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C in de bevochtigde celincubator en was 2x met PBS.
    3. Haal het bord cellen uit de couveuse en was het eenmaal met PBS. Maak de cellen los door 1 ml 0,05% trypsine-EDTA toe te voegen en gedurende 5-10 minuten bij 37 °C in de celincubator te broeden totdat alle cellen volledig zijn losgemaakt.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang omdat slechte trypsinisatie ertoe zal leiden dat celaggregaten in de naald blijven steken.
    4. Resuspendeer de cellen in 5 ml volledig glioblastoomcelmedium in een centrifugebuis van 50 ml. Voeg 45 ml ijskoude PBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 134 × g .
    5. Gooi het supernatant weg en resuspensieer de cellen met 1 ml ijskoude PBS door grondig op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Deze stap van mechanische dissociatie helpt enorm om het risico op verstopping in het capillair tijdens micro-injectie te voorkomen.
    6. Voeg 49 ml ijskoude PBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 134 × g . Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in 200 μL ijskoude PBS. Bewaar op ijs voor de duur van de transplantatieprocedure.
  4. Microjecteer de glioblastoomcellen in de zebravislarven middenhersenen.
    1. Vul een micro-injectie gegoten plaat met 6 ml E3-medium30 aangevuld met 160 mg /L tricaïne.
    2. Breng een dozijn gedechorioneerde larven over in de micro-injectieplaat. Zodra ze niet reageren om aan te raken, lijn je ze uit in de loopgraven op hun zij, hoofd omhoog en de dooierzak tegen de muur van de geul geduwd, met een verfkwast van maat 00 (figuur 2B, C).
    3. Resuspend de glioblastoomcellen. Laad 5 μL cellen in het microcapillair met behulp van microloading tips en plaats het capillair in de universele capillaire houder.
    4. Plaats de micro-injectieplaat met de niet-reagerende larven onder de stereomicroscoop. Plaats de punt van het microcapillair op de rand van de microinjectieplaat met behulp van de micromanipulatorknoppen. Breek het met een scalpel om een scherp toegangspunt te creëren, ongeveer de grootte van de diameter van een cel.
    5. Controleer of cellen uit het capillair stromen door de olie voorzichtig in de micro-injector te laten lopen en de punt van de naald in het medium te steken. Concentreer de cellen aan de punt van het capillair om het aantal geïnjecteerde cellen per uitgeworpen volume te maximaliseren en te voorkomen dat het hersenweefsel wordt gevuld met PBS (figuur 2C).
    6. Onderzoek zorgvuldig de cellen die uit het microcapillair komen terwijl olie handmatig in de injector wordt ingebracht. Definieer empirisch hoeveel draaiing nodig is op de handmatige knop om 20 tot 50 cellen te leveren. Typisch, als cellen voldoende geconcentreerd zijn, is één zachte draai voldoende om ~ 10 cellen uit te werpen.
      OPMERKING: Als de vloeistof niet goed uit het microcapillair stroomt, probeer dan de bevestiging van het microcapillair in de capillaire houder los te maken. Door dit te doen, kan olie lekken en langs het capillair naar beneden druppelen.
    7. Benader de punt van het capillair tegen het linker Optische Tectum (OT), net boven de middelste hersenader (MCeV, figuur 2F).
    8. Druk het capillair voorzichtig tegen de larven totdat het huidmembraan breekt (figuur 2D,E).
      OPMERKING: Duw niet te hard, want dit zal resulteren in het injecteren van de cellen te diep in de hersenen, waar de lagere optische helderheid het observeren van MT's in detail zal voorkomen. De beeldvormende techniek is mogelijk voor een diepte van 250-300 μm. Het wordt echter aanbevolen om niet dieper dan 100 μm van het visoppervlak te injecteren.
    9. Zodra een geschikte positie in de OT is bereikt, werpt u de cellen uit. Observeer zorgvuldig de punt van het capillair om de stroom cellen in het dier te visualiseren, waardoor een succesvolle injectie wordt gegarandeerd.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet in de ventrikels injecteert (figuur 2E). Eenmaal in de ventrikels hebben de cellen de neiging zich op te hopen en vast te komen te zitten in plaats van het weefsel te infiltreren (figuur 2I). Ventrikelinjectie wordt gekenmerkt door intense zwelling van de hersenen en waarneembare verspreiding van geïnjecteerde cellen naar de voorhersenen en de achterhersenen (figuur 2J).
    10. Herhaal de procedure uit stap 3.4.9 tot en met 3.4.11 voor zoveel dieren als nodig is. Ga snel te werk om samenklontering van cellen in het capillair te voorkomen.
      OPMERKING: Afhankelijk van hoe snel de experimentator is bij het injecteren, kan elke 10 tot 20 larven een verandering van naald nodig zijn.
    11. Zodra de xenotransplantatie is voltooid, verwijdert u de larven van de micro-injectieplaat en selecteert u ze in een 24-wellsplaat gevuld met mineraalwater + PTU + methyleenblauw medium.
    12. Valideer succesvolle injectie door de larven te observeren onder een fluorescerende stereomicroscoop (figuur 2G). Selecteer alleen xenografts die een enkele tumormassa bevatten die wordt gevormd door 20-50 cellen in de bovenste 200 μm (in z) van de OT (figuur 2H versus mislukte injectie in figuur 2I-K).
      OPMERKING: De opbrengst van succesvol gelokaliseerde xenografts varieert van 10% in het begin tot bijna 100% met oefening.
    13. Laat de larven minstens 4 uur bij 32 °C herstellen voordat ze in beeld worden gebracht.
      OPMERKING: Het toevoegen van antibiotica in het medium verhoogt de overlevingskans van de larven niet. In dit stadium, als micro-injectie correct is uitgevoerd, overleeft bijna 100% van de vissen.

4. Intravitale beeldvorming van de glioblastoom xenografts

  1. Monteer de larven voor live beeldvorming.
    OPMERKING: Larven kunnen vanaf 4 uur na injectie (hpi) in beeld worden gebracht. Live beeldvorming van MT wordt meestal uitgevoerd vanaf 20 hpi, wanneer invasieve GBM-cellen zijn begonnen met het uitbreiden van uitsteeksels en migreren weg van de tumormassa.
    1. Bereid een 1% laagsmeltende agarose-oplossing. Breng 500 μL gekookte 1% laagsmeltende agarose-oplossing over naar een centrifugebuis van 1,5 ml en laat deze afkoelen bij 37 °C op een warmteblok. Voeg tricaine (112 μg/ml) toe aan de agarose en meng goed.
    2. Breng één tot vier xenogegrafeerde larven over in een petrischaaltje van 3,5 cm gevuld met mineraalwater + PTU + methyleenmedium aangevuld met tricaïne (112 μg/ml). Zodra de larven niet reageren om aan te raken, breng ze dan voorzichtig over in de buis met de agarose en de tricaine met behulp van een pipet met fijne puntoverdracht.
      OPMERKING: Beperk het volume van het medium tot een minimum om het verdunnen van de agarose te beperken.
    3. Meng de larven voorzichtig met de agarose. Plaats met behulp van een normale (grote bol) transferpipet de larven gemengd in de agarose op het midden van een 3,5 cm videobeeldvormingsschaal met glazen bodem. Plaats de larven onder een stereomicroscoop snel op zijn rug met behulp van een microloading-tip om de vis te manipuleren.
      OPMERKING: Omdat een omgekeerde spinschijf confocale microscoop wordt gebruikt voor intravitale beeldvorming van de hersenen in dit protocol, worden de larven dorsaal gemonteerd. Pas de positionering van de larven dienovereenkomstig aan als u een rechtopstaande confocale microscoop gebruikt.
    4. Verwijder extra agarose om de dunst mogelijke agaroselaag te behouden. Zodra de agarose is gestold, voegt u 2,5 ml mineraalwater + PTU + 0,2x tricaïne (beeldmedium) toe en gaat u verder met de volgende stap.
  2. In vivo live beeldvorming van MT-dynamica in binnendringende glioblastoomcellen
    OPMERKING: De optische kwaliteit van de beelden hangt sterk af van de prestaties van de microscoop die wordt gebruikt. Het protocol is geschreven voor een omgekeerde spin-disk confocale microscoop uitgerust met een sCMOS-camera (pixelgrootte 6,5 μm, 2048 x 2044 pixels), lange werkafstandsdoelstelling en temperatuurgecontroleerde omgevingskamer.
    1. Plaats de videobeeldvormingsschaal met de in agarose ingebedde xenogetransplanteerde larven in de omgevingskamer van een omgekeerde confocale microscoop, met de temperatuur ingesteld op 32 °C. Vind de larven in de video-imaging schotel met een 10x objectief, met behulp van een gemotoriseerd XY-stadium.
    2. Druk op ESC om de richtkoepel te verlagen, voeg minerale olie toe aan een olieobjectief van 60x (1,4 NA, werkafstand: 0,13 mm) en druk op ESC om terug te gaan naar de oorspronkelijke brandpuntspositie.
    3. Observeer de binnendringende glioblastoomcellen in het rode kanaal (561 nm laserbron, 20% laservermogen, tijdsblootstelling: 200 ms) en selecteer een cel met een verspreid MT-netwerk en gemakkelijk te onderscheiden MT-filamenten (figuur 3B).
    4. Stel de instellingen van de z-serie in. Selecteer met behulp van een piëzotrap met een bereik van 200 μm de bovenste en onderste posities van het MT-netwerk: een 10-30 μm diepe z-stack is voldoende om het microtubulenetwerk in het uitsteeksel van de migrerende cel te visualiseren, met een z-slice stap van 0,3 μm.
    5. Stel time-lapse-acquisitie-instellingen in om een optimale balans mogelijk te maken tussen de snelheid van acquisitie, z-stackdiepte en fluorescerend signaal om snel fotobleachen te voorkomen. Verkrijg afbeeldingen van MT's om de 5-10 s gedurende enkele minuten. Verkrijg en bewaar de 5D (x,y,z,t,c) hyperstack.
      OPMERKING: Om driften in z tijdens de acquisitie te voorkomen, gebruikt u een microscoop die is uitgerust met een perfect scherpstelsysteem als hardwarefocusstabilisatie.
  3. (Optioneel) Bepaal de effecten van de microtubule-altering agents (MTA's) op MT's.
    OPMERKING: De volgende stappen maken het mogelijk om de effecten van de MTA's op een MT-netwerk in migrerende glioblastoomcellen in realtime te testen.
    1. Verwijder het beeldmedium voorzichtig uit de videobeeldvormingsschaal. Raak de bodem van de schaal niet aan, omdat de xyz-positie verloren gaat.
    2. Bereid een nieuw beeldvormend medium voor dat de MTA in verschillende concentraties bevat. Voeg het MTA-bevattende medium voorzichtig druppelsgewijs toe aan de videobeeldvormingsschaal.
    3. Koop langetermijnfilms (2-16 uur, één beeld per 10-20 minuten) om de effecten van elke concentratie van de MTA op het MT-netwerk en de celmigratie te observeren (figuur 4A).
    4. (Optioneel) Was de MTA uit door het medium voorzichtig te verwijderen en 2,5 ml vers beeldmedium toe te voegen zonder de MTA. Herhaal de washoutprocedure 3x om elk spoor van MTA in het medium te verwijderen.
    5. (Optioneel) Koop een vergelijkbare langetermijnfilm als in 4.3.3 (figuur 4B).
      OPMERKING: De bovenstaande stappen bepalen de minimale concentratie die het MT-netwerk verandert zonder de overleving van de larven te beïnvloeden. De uitspoelstappen bepalen of het effect van het medicijn omkeerbaar is.
  4. Beoordeel de MTA-impact op glioblastoominvasie door sequentiële beeldvorming.
    1. Volg de stappen 4.1 tot 4.2.1 4 uur na micro-injectie.
      OPMERKING: Dit deel van het protocol kan ook worden bereikt met andere fluorescerend gelabelde glioblastoomcellijnen. Idealiter co-label de GBM met een cytosolische tag en een nucleus tag om detectie van de globale morfologie van de cel te garanderen.
    2. Schakel over op een lange werkafstand van 40x waterpreguur (NA:1.15, WD: 0,6 mm).
    3. Stel het bereik van de z-serie in om de OT-regio te verwerven. Verkrijg de z-stack met behulp van een sCMOS-camera met hoge gevoeligheid (pixelgrootte 11 μm, 1.200 x 1.200 pixels, kwantumefficiëntie 95%).
      OPMERKING: De z-stack begint meestal bij het meest dorsale deel van de OT (dicht bij het oppervlak) en eindigt diep genoeg in de hersenen om de hele tumorcelmassa op te nemen.
    4. Verwijder de videobeeldvormingsschaal uit de microscoop. Bevrijd de larven van de agarose door een microloading tip te gebruiken en de agarose voorzichtig rond het dier te prikken.
      OPMERKING: Aangezien 3 dpf-larven nog steeds erg kwetsbaar zijn, moet u voorzichtig zijn bij het verwijderen van de agarose.
    5. Zodra het dier is bevrijd van de agarose, breng het dan voorzichtig over in een enkele put van een 24-well plaat gevuld met mineraalwater + methyleenblauw + PTU-medium. Markeer de put om de larven te identificeren voor latere beeldvorming.
    6. Voeg de in het medium relevante MTA toe bij de eerder bepaalde concentratie (stap 4.3.3). Ververs het medium aangevuld met het medicijn elke dag. Herhaal de beeldvormingsprocedure van stap 4.4.1 tot 4.4.5 elke dag gedurende 3-4 dagen.

5. Beeldanalyse

  1. Analyseer MT-dynamiek met vrij beschikbare FIJI-plug-ins.
    OPMERKING: Veel beoordelingen en protocollen beschrijven de methoden van MT-dynamicaanalyse in cellen 31,32,33,34 en kunnen in dit stadium worden toegepast. Dit protocol verwijst kort naar twee methoden om elementaire MT dynamische eigenschappen te meten.
    1. Open de 5D-hyperstack en genereer een 4D-stack waarbij de z-slices in één vlak zijn geprojecteerd om een mip (maximum intensity projection) in z te creëren (Image | Stapels | Z project | Maximale intensiteit) (figuur 3B).
    2. Open de 4D MIP-stack en volg handmatig het einde van een op uitsteeksels gebaseerd MT met behulp van de handmatige trackingfunctie in FIJI (Plugins | | Handmatige tracking). (Figuur 3D). Extraheer de parameters van MT-dynamiek zoals groeisnelheid, krimpsnelheid, reddingsfrequentie en catastrofefrequentie.
    3. U kunt ook een gesegmenteerde lijn van 10 pixels breed langs het MT tekenen om te analyseren (figuur 3B). Gebruik de multi-kymograaffunctie (analyseren | Multi Kymograaf) (Figuur 3C) in FIJI. Observeer en meet de MT-groeifasen (G), de lengte van de pauzes (P) en de frequentie van MT-catastrofes.
  2. Analyse van langdurige glioblastoominvasie
    OPMERKING: Deze analyse vereist het gebruik van 4D-visualisatie en -analyse met bioimaging-software.
    1. Converteer de raw 4D z-stack uit stap 4.4.3 (4 hpi) naar het juiste softwareformaat, met behulp van de File Converter-software.
    2. Open de software en importeer het geconverteerde z-stack bestand in de weergave Overtreffen (figuur 5A).
    3. Om de tumorcellen te segmenteren en irrelevante autofluorescentie in het rode kanaal te verwijderen, klikt u op Nieuwe oppervlakken toevoegen en volgt u het 5-stappenproces.
      1. Valideer de standaardinstellingen door op de volgende pijl te klikken zodra het venster verschijnt. Ga verder met stap 2/5.
        OPMERKING: Als het fluorescerende signaal wordt verkregen in het 561-kanaal, kan autofluorescentie van resterende pigmentatie in het oog sterk zijn en het automatische segmentatieproces veranderen. Dit is problematisch als het xenograft zich dicht bij het oog bevindt. In dat geval moet de segmentatie handmatig worden voltooid door niet-glioblastoomcelsignalen te snijden en te verwijderen.
      2. Navigeer naar bronkanaal | 561-kanaal. Maak de afbeelding vloeiender (Gaussisch filter) door 1,50 μm toe te voegen in Surfaces Detail en door 2,5 μm toe te voegen voor de diameter van de bollen in Substract-achtergrond. Klik op de volgende pijl en ga verder met stap 3/5.
      3. Afhankelijk van de intensiteit van het signaal, past u de drempel (achtergrondsubsectie) handmatig aan om elk celproces op te nemen. Ga verder met stap 4/5.
      4. Filter het gesegmenteerde signaal door de gebeurtenissen te verwijderen die geen deel van een cel vertegenwoordigen (bijvoorbeeld puin, autofluorescentie). Klik op Filtertype | volume en pas de drempel handmatig aan om alle gebeurtenissen onder het kleinste volume dat een deel van een cel vertegenwoordigt uit te sluiten. Ga verder met stap 5/5.
        OPMERKING: Als de autofluorescentiesignalen groter zijn in volume dan het kleinste celgedeelte, ga dan toch verder en verwijder de ongewenste signalen handmatig door met de linkermuisknop te klikken en ze te verwijderen .
      5. Verwijder de classificatiestap en voltooi de segmentatiewizard door op de dubbele groene pijl te klikken om een Surface-weergave van de tumorcellen te maken (figuur 5B).
    4. Als de gesegmenteerde cellen elkaar niet raken en geen uniek object vormen, voeg ze dan kunstmatig samen tot een tumorcelmassaobject. Kortom, klik op Statistieken | gedetailleerde | specifieke waarden | volume. Selecteer alle gebeurtenissen door met de linkermuisknop op de bovenste te klikken en vervolgens Shift ingedrukt te houden en met de linkermuisknop op de laatste te klikken. Navigeer om | selectie te bewerken | te verenigen.
    5. Definieer het centroïde van de tumorcelmassa. Klik op Nieuwe spots toevoegen | Automatisch aanmaken overslaan | Toevoegen (cursor kruist met) | Middelpunt van object. Houd shift ingedrukt en klik met de linkermuisknop om de plek te maken, die het middelpunt is van de gesegmenteerde tumorcelmassa.
    6. Meet de 3D-afstand tussen elke GBM-cel en het centroïde van de tumormassa. Om dit te doen, maakt u een afstand tot het centroïde kanaal door in de spotweergave te blijven en het gereedschapspictogram te selecteren | Afstandstransformatie. Wacht tot er een nieuwe afstand tot het centroïde kanaal wordt gecreëerd, naast het 488- en het 561-kanaal (in blauw, figuur 5C).
      OPMERKING: De intensiteit van elke voxel in dit kanaal komt overeen met de 3D-afstand tussen de voxel en het centroïde van de tumorcelmassa.
    7. Meet de 3D-afstand tot het middelpunt van elke gesegmenteerde cel door te klikken op Nieuwe vlekken toevoegen | Automatisch aanmaken overslaan | Toevoegen (cursor kruist met) | specifiek kanaal 561. Houd shift ingedrukt en klik met de linkermuisknop op het celkerngebied. Voer deze taak uit voor elke cel (afbeelding 5D).
      OPMERKING: Verwijder de Surface-weergave om het fluorescentiesignaal van de cellen beter te waarderen. Als alternatief, indien aanwezig, gebruik het kernsignaal (405 nm of 647 nm signaal) voor een betere nauwkeurigheid.
    8. Klik op statistieken | Gedetailleerde | Specifieke waarden | intensiteit gemiddelde Ch=afstand tot centroïde.
      OPMERKING: De waarde van de intensiteit is de 3D-afstand in μm tussen het celkerngebied en het centroïde.
    9. Gemiddelde deze intensiteiten om de straal van de tumormassa bij 4 hpi te berekenen. Herhaal de procedure voor elk tijdstip van de analyse (24 hpi, 48 hpi en 72 hpi).
      OPMERKING: Meet alleen de 10 of 20 meest verspreide cellen om te voorkomen dat celinvasie wordt onderschat. Inderdaad, de geforceerde verdichting van de cellen tijdens de injectie kan voorkomen dat cellen in het midden van de tumormassa migreren.
    10. Bereken de invasie-index (II) als de verhouding tussen de gemiddelde 3D-afstanden bij t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi van de meest verspreide cellen over de gemiddelde straal van de tumormassa bij t = 4 hpi (figuur 5E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de rol van MT's tijdens in vivo GBM-invasie te analyseren, beschrijven we hier de belangrijkste stappen om stabiele MT-etikettering in GBM-cellen uit te voeren door lentivirale infectie, orthotopische xenotransplantatie van GBM-cellen in 3 dpf zebravislarven, intravitale beeldvorming met hoge resolutie van MT-dynamiek, MTA-behandeling en de effecten ervan op GBM-invasie, en beeldanalyse van MT-dynamiek en in vivo invasie (figuur 1). MT-dynamiek wordt gemeten door kymografen te bouwen langs groeiende en krimpende MT's (figuur 3C) of door handmatig individuele MT-randen in de loop van de tijd te volgen (figuur 3D). Een voorbeeld van medicamenteuze behandeling toegediend in het larvenmedium en het omkeerbare effect ervan op de MT-netwerkorganisatie wordt gegeven in figuur 4. Behandeling met een lage dosis nocodazol (200 nM) leidt tot progressieve krimp van het MT-netwerk en verdwijning van glioblastoomceluitsteeksel 4 uur later (figuur 4A). Het uitwassen van het medicijn herstelde de capaciteit van glioblastoomcellen om uitsteeksels te vormen. De cellen migreerden 12 uur na de uitspoeling weer langs de vasculatuur (figuur 4B). Deze gegevens suggereren dat behandeling met 200 nM nocodazol voldoende is om het MT-netwerk te verstoren en in vivo glioblastoomcelinvasie snel blokkeert. Een 3 dagen durende analyse van dezelfde behandeling bij wereldwijde glioblastoomcelinvasie onthult dat nocodazol 200 nM de invasie van glioblastoomcellen op lange termijn in vivo stopt, zonder de algemene gezondheid van de vissen te beïnvloeden, vergeleken met een controle (figuur 4C).

Figure 1
Figuur 1: Protocol workflow diagram. Afkortingen: dpf = dagen na de bevruchting; hpi = uren na injectie; MT = microtubuli; MTA = microtubuli-veranderend middel; GBM = glioblastoom multiforme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Micro-injecteren van glioblastoomcellen in 3 dpf zebravislarvenheren. (A) Foto van de apparatuur die wordt gebruikt voor xenotransplantatie: 1, oliemicro-injector; 2, mechanische micromanipulator; 3, universele capillaire houder; 4, glazen capillair. De micro-injectieplaat bevindt zich onder een stereomicroscoop. (B) Foto van verdoofde 3 dfp zebravislarven uitgelijnd in een geul en klaar om te worden gemicro-geïnjecteerd. De punt van een microcapillair geladen met een rode kleurstof is zichtbaar aan de rechterkant van de foto. Details van de patroonsleuven gebouwd in de agarose plaat zijn te zien in de inzet in de rechterbenedenhoek. Schaalbalk = 3 mm. (C) Schema van een representatieve microinjectieplaat. Kant-en-klare larven worden lateraal (midden van de plaat) geplaatst. Merk op dat cellen geconcentreerd zijn aan de punt van de microcapillaire (zwarte pijl) voordat ze doorgaan met de injectie. Geïnjecteerde larven worden rechts van de plaat getoond, ventraal geplaatst. (D) Schema van een dwarsplakje in de micro-injectieplaat (langs de zwarte stippellijn in C) met de sleuven waar de larven tijdens de injectie worden geplaatst. (E) Foto waarop de punt van het capillair te zien is, klaar om het optische tectum (stippellijn) te penetreren. De ventrikels worden afgebakend door de witte lijnen. Schaalbalk = 150 μm. (F) Schema van een larve van 3 dpf fli1a:gfp die gfp tot expressie brengt in de endotheelcellen, wat het OT-gebied aangeeft waar de cellen worden geïnjecteerd, net boven de middelste hersenader. (G) Fluorescentiebeeld van een 3 dpf gfap:gfp larve (gfp tot expressie gebracht in neurale stamcellen) lateraal geplaatst na micro-injectie van U87-mkate2-cellen (witte cirkel en witte pijl). Hoge autofluorescentie in rood wordt veroorzaakt door de iridoforen in de ogen. Schaalbalk = 100 μm. (H) Confocale fluorescentiebeeld van een succesvol geïnjecteerde fli1a:gfp-larve bij 16 hpi. Schaalbalk: 50 μm. (I-K) Confocale fluorescentiebeelden van tevergeefs geïnjecteerde fli1a:gfp-larven bij 96 hpi (I) en 4 hpi (J,K). GBM-cellen zijn geïnjecteerd in ventrikels (I,J) of in meerdere foci in de hersenen (K). Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: dpf = dagen na de bevruchting; OT = optische tectum; MCeV = middelste cerebrale ader; gfp = groen fluorescerend eiwit; gfap = glial fibrillary acidic protein; hpi = uren na injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Visualisatie van in vivo microtubulidynamica in glioblastoomcellen. (A) Representatief fluorescentiebeeld van xenogetransplanteerde U87-cellen die tubuline-α1-mkaat2 tot expressie brengen in het OT van een fli1a:GFP zebravislarve bij 20 hpi. (B) Maximale intensiteit geprojecteerd fluorescentiebeeld van het MT-netwerk in een enkele xenogetransplanteerde U87-cel. (C) Kymograaf langs de rode stippellijn in B, die de groei-, pauze- en catastrofefasen van mt-dynamische instabiliteit laat zien. (D) Time-lapse-volgorde van het ingepakte gebied in B met de nadruk op het volgen van drie MT + uiteinden. Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: OT = optic tectum; GFP = groen fluorescerend eiwit; hpi = uren na injectie; MT = microtubuli; G = groeifase; P = pauzefase; C = catastrofefase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Visualisatie van de effecten van het microtubuliverandermiddel op glioblastoominvasie in vivo. (A) Time-lapse-sequentie van U87-cellen die tubuline-α1a-mkaat2 tot expressie brengen in zebravislarven behandeld met nocadazol (200 nM). Pijlen wijzen naar het uiteinde van het uitsteeksel in twee verschillende cellen die de hersenen langs een bloedvat binnendringen. Let op de terugtrekking van het uitsteeksel bij behandeling met nocodazol. Schaalbalk = 10 μm. (B) Time-lapse-sequentie die het effect van nocodazolafspoeling op U87-celinvasie vertegenwoordigt. Op 500 minuten na de uitspoeling verlengt de cel gemarkeerd met het witte sterretje een MT-gebaseerd uitsteeksel (witte pijl), waardoor de invasie langs een bloedvat kan worden hervat. Schaalbalk = 20 μm. (C) 3D-representaties van een xenogetransplanteerd larvenbrein behandeld met DMSO of nocodazol (200 nM) gedurende 72 uur. Het signaal van de U87-cellen is gesegmenteerd (in rood) en geïntegreerd in het fli1a-GFP-fluorescentiesignaal (in wit). Let op de verminderde verspreiding van U87-cellen behandeld met nocodazol. Schaalbalk = 30 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; hpi = uren na injectie; MT = microtubuli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Beeldanalyse van in vivo glioblastoominvasie. (A) Fluorescerende beelden van xenogetransplanteerde U87-cellen die cytosolische mKate2 tot expressie brengen in fli1a-GFP zebravislarven, 4 hpi. Witte sterretjes onderstrepen typische autofluorescentie van oogiridoforen. Schaalbalk = 40 μm. (B) Fluorescerend beeld van fli1a-GFP-larven in combinatie met het gesegmenteerde oppervlak dat overeenkomt met het signaal van de U87-cellen in A. Het centroïde van de tumormassa lijkt groen. Schaalbalk = 40 μm. (C) Fluorescerend beeld dat het rode kanaalsignaal in A en het nieuw gedefinieerde "afstand tot centroïde" kanaal (in blauw) vertegenwoordigt. Schaalbalk = 30 μm. (D) Rood kanaalfluorescentiebeeld gesuperponeerd met gekleurde vlekken, waarvan de kleur de afstand van de cel tot het centroïde (in het groen) vertegenwoordigt, waarbij violet het dichtst bij het centroïde is en wit het verst uit elkaar ligt. Schaalbalk = 20 μm. (E) Een voorbeeld van sequentiële analyse van wereldwijde GBM-invasie. 3D-afstanden worden bepaald bij 4 hpi en 72 hpi, en de invasie-index (II) wordt berekend volgens de formule in de inbox. Schaalbalk = 20 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; hpi = uren na injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het in beeld brengen van tumor xenografts met eencellige resolutie zal waarschijnlijk een onmisbaar hulpmiddel worden om ons begrip van GBM-biologie te verbeteren. Live beeldvorming in PDX-modellen van muizen heeft geleid tot waardevolle ontdekkingen over hoe GBM collectief het hersenweefsel binnendringt18. Tot op heden is de spatiotemporale resolutie echter niet hoog genoeg om de dynamiek van eiwitten die de GBM-invasie beheersen te onthullen. We redeneerden dat door de orthotopische engrafting van GBM-cellen in transparante zebravislarven te koppelen aan intravitale beeldvorming met hoge resolutie, cytoskeletale eiwitten zoals MT's in voldoende detail konden worden geanalyseerd om hun dynamiek tijdens in situ GBM-invasie te analyseren.

De kritische stappen van de methodologie liggen in de voorbereiding van de GBM-cellen en de micro-injectieprocedure. Ongezonde en onvoldoende gedissocieerde cellen blijven aan elkaar plakken of aan de capillaire randen en blokkeren de injectiestroom. Bovendien moeten cellen voldoende geconcentreerd zijn in het capillair om het geïnjecteerde volume te minimaliseren en ze in bulk te implanteren. Het injecteren van een groter volume van meer verdunde cellen zal resulteren in meerdere, soms gemengde tumorhaarden, waarvan de invasieve indexen moeilijk te meten zijn. In onze handen zorgt handmatige hantering van de micro-injector op oliebasis voor een betere controle van de injectiestroom dan een elektronische micro-injector op basis van lucht onder druk die eerder is gebruikt in een vergelijkbaar model19. Dit is van cruciaal belang om overmatige stroomdruk in de hersenen te voorkomen, waardoor latere weefselschade en ventriculaire aggregatie van de geïnjecteerde cellen worden vermeden.

Enkele beperkingen van dit model zijn de noodzaak om het experiment uit te voeren bij suboptimale temperaturen voor beide soorten. Zebravissen worden meestal gekweekt bij 28 °C, terwijl menselijke cellen worden gekweekt bij 37 °C. Boven 32 °C is de embryo-ontwikkeling van zebravissen veranderd en deze veranderingen kunnen dodelijk zijn35. Echter, vergelijkbaar met wat wordt gedaan in volwassen zebravis xenograft modellen36, verhoogt het sequentieel acclimatiseren van de zebravislarven tot een temperatuur van 32 °C de overleving van getransplanteerde dieren in vergelijking met de snelle verandering in temperatuur na transplantatie van 28 °C naar 32 °C. Het verhogen van de temperatuur leidt echter verder tot een toename van de diersterfte in overeenstemming met de gevoeligheid van zebravisembryo's voor temperaturen boven 32 °C35.

Het interpreteren van de in vivo MT-dynamicagegevens moet zorgvuldig worden uitgevoerd, aangezien de MT-dynamiek verandert wanneer de temperatuur onder 37 °C37 daalt. Parallelle in vitro meting van MT-dynamica bij 37 °C en 32 °C in dezelfde GBM-cellen met dezelfde MTA-behandeling zal helpen bij het valideren van de verschillen tussen verschillende GBM-cellen of tussen in vivo behandelingen. Het moet helpen bevestigen dat de verschillen niet worden veroorzaakt door variatie in temperatuurgevoeligheid, maar door verschillende regulatieroutes (voor GBM-vergelijkingsanalyse) of door MTA-behandeling (voor MTA-effectanalyse). Dit zal van belang zijn als de MT-dynamiek heterogeniteiten worden gekoppeld aan verschillende invasiecapaciteiten.

Een andere beperking is het korte tijdvenster waarin invasie kan worden gevolgd (72 tot 96 uur), waardoor de meting van invasieplasticiteit wordt voorkomen, aangedreven door potentiële veranderingen in MT-dynamiek38. Na 96 uur merkten we een sterke afname van GBM-celinvasie. 6 dagen na injectie nam het aantal GBM-cellen snel af, vermoedelijk als gevolg van een immuunrespons van de gastheer veroorzaakt door de accumulatie van neutrofielen en macrofagen in de tumormicro-omgeving39. Het leveren van MTA's aan de hele hersenen heeft waarschijnlijk invloed op nabijgelegen neuronale gastheercellen, die afhankelijk zijn van MT's voor hun activiteit en waarvan de verandering vervolgens GBM-invasie kan beïnvloeden40. Deze aanpak moet worden aangevuld met shRNA- of optogenetische assays die MT-verandering beperken tot de GBM-cellen, maar blijft een goed platform om te screenen op nieuwe anti-invasieve verbindingen.

De orthotopische injectie van MT-gelabelde GBM-cellen in de hersenen van zebravissen is van bijzonder belang om de rol van MT's tijdens de invasie van kankercellen te ontcijferen, omdat zeer weinig diermodellen in situ subcellulaire beeldvorming van kankercelmigratie in hun weefsel van oorsprong toestaan15. Tot op heden zijn studies van MT-functies tijdens GBM-migratie voornamelijk gebaseerd op in vitro en ex vivo assays en ontbreekt het aan in vivo validatie 24,41,42,43. In combinatie met gene-of-interest knock-down of een onbevooroordeelde gengebaseerde screeningsbenadering, zal de hier gepresenteerde test helpen nieuwe MT-regulatoren te onthullen die belangrijk zijn voor GBM-invasie in vivo.

GBM's zijn zeer heterogene tumoren waarvan de invasieve eigenschappen sterk verschillen tussen specimens44. Het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan hun verschillende invasiemethoden zal helpen bij het definiëren van ad hoc therapeutische behandelingen om GBM-verspreiding te blokkeren. Systematische meting van de invasieve index, invasiewijze en cytoskeletale eigenschappen zoals MT-dynamica in verschillende GBM-monsters zal nieuwe correlaties onthullen tussen frequente genomische mutatieprofielen en celinvasiepatronen die afhankelijk zijn van specifieke cytoskeletale eigenschappen. Onthullen hoe deze mutaties de verandering in MT-dynamiek beïnvloeden, zou niet alleen bijdragen aan onze kennis over MT-regulatie tijdens celmigratie45,46, maar zou ook kunnen leiden tot langverwachte patiëntspecifieke, anti-invasieve therapieën.

Het relatieve gemak van micro-injectie bij zebravissen in combinatie met het hoge aantal beschikbare larven en het gemak van injectie van geneesmiddelen maken deze procedure geschikt voor gepersonaliseerde geneeskunde47,48. Bovendien, in tegenstelling tot intravitale beeldvorming van GBM-xenografts bij muizen, die alleen voorkomt in het bovenste 500 μm-deel van de cortex 49,50, maakt het gebruik van zebravissen de visualisatie van GBM-infiltratie in het hele CZS mogelijk. Het hier gepresenteerde model voldoet aan de criteria om een waardevol hulpmiddel te worden voor snelle analyse van de invasieve capaciteiten van glioblastoom en de reactie op behandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

We zijn Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrijk) en zijn laboratorium, in het bijzonder Valérie Briolat, en Emma Colucci-Guyon zeer dankbaar voor het leveren van de zebravislijnen en de plastic mal voor micro-injectieplaten, en voor hun waardevolle expertise over experimentele procedures voor zebravissen. We bedanken dankbaar de UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, ondersteund door het Franse nationale onderzoeksbureau France BioImaging, en ANR-10-INBS-04; Investeringen voor de toekomst). Dit werk werd ondersteund door de Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), het Centre National de la Recherche Scientifique, en Institut Pasteur en door de gulle giften van mevrouw Marguerite MICHEL en de heer Porquet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Biologie Orthotopisch xenograft PDX Zebrafish Danio rerio Glioblastoma Subcellulaire intravitale beeldvorming 5D beeldanalyse
Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter