Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Levende avbildning av mikrotubulidynamikk i glioblastomceller som invaderer sebrafiskhjernen

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

Vi rapporterer en teknikk som tillater levende avbildning av mikrotubulidynamikk i glioblastom (GBM) celler som invaderer et vertebrat hjernevev. Kobling av ortotopisk injeksjon av fluorescerende merkede GBM-celler til en gjennomsiktig sebrafiskhjerne med høyoppløselig intravital avbildning gjør det mulig å måle cytoskelettdynamikk under in situ kreftinvasjon.

Abstract

Med en dyster median overlevelsestid i virkelige populasjoner - mellom 6 og 15 måneder - er glioblastom (GBM) den mest ødeleggende ondartede hjernesvulsten. Behandlingssvikt skyldes hovedsakelig invasiviteten til GBM-celler, noe som taler for behovet for en bedre forståelse av GBM motile egenskaper. For å undersøke den molekylære mekanismen som støtter GBM-invasjon, er det nødvendig med nye fysiologiske modeller som muliggjør grundig karakterisering av proteindynamikk under invasjon. Disse observasjonene vil bane vei for oppdagelsen av nye mål for å blokkere tumorinfiltrasjon og forbedre pasientresultatene. Denne artikkelen rapporterer hvordan en ortotopisk xenograft av GBM-celler i sebrafiskhjernen tillater subcellulær intravital levende avbildning. Med fokus på mikrotubuli (MT), beskriver vi en prosedyre for MT-merking i GBM-celler, mikroinjisering av GBM-celler i den gjennomsiktige hjernen 3 dager etter befruktning (dpf) sebrafisklarver, intravital avbildning av MT i de formidlende xenograftene, endring av MT-dynamikk for å vurdere deres rolle under GBM-invasjon, og analyse av de oppkjøpte dataene.

Introduction

Cellemotilitet er en stereotyp prosess som krever etablering av polaritetsakser og kraftgenererende cytoskeletale omorganiseringer. Actinpolymerisasjon og dets tilknytning til myosin er anerkjent som de viktigste bidragsyterne til fremspringende og kontraktile krefter som kreves for cellebevegelse1. Mikrotubuli anses å være hovedaktørene i cellepolarisering og retningsbestemt utholdenhet under migrasjon2. I de senere år har MT-er også vist seg å skape og stabilisere fremspring for å støtte mekanokomprimerende krefter under celleinvasjon i 3D3. Mer nylig har MTs vært direkte involvert i mekanotransduksjon ved fokale adhesjoner og mekanosensitiv migrasjon4. Den dynamiske ustabiliteten som karakteriserer MT-pluss endedynamikk er laget av gjentatte faser av polymerisasjon (vekst) og depolymerisering (krymping), som styres av en mengde mikrotubulibindende proteiner og intracellulære signalkaskader, som de som styres av RHO-GTPases 5,6,7. MT-nettverkets rolle i cellemigrasjon og invasjon har gjort undersøkelsen av MT-dynamikk til et nøkkelelement for bedre å forstå mekanismene for immuncelle homing, sårheling og kreftinvasjon.

Kreftcellenes evne til å unnslippe den primære tumorkjernen, spre seg i vevet og generere sekundære svulster er et kritisk skritt for å forhindre global suksess i krigen mot kreft som ble erklært for 50 år siden 8,9. En av de største hindringene har vært å forstå hvordan kreftceller aktivt invaderer vevet. Viktige invasjonsmekanismer er avhengige av de samme prinsippene som de som styrer ikke-tumorcellemigrasjon10. Imidlertid har kreftcellemigrasjonsspesifikasjoner dukket opp11, noe som utløser behovet for bedre karakterisering av denne typen migrasjon. Spesielt fordi tumormikromiljøet fremstår som en nøkkelspiller i kreftprogresjon12, er det viktig å observere og analysere kreftcelleinvasjon i en relevant fysiologisk sammenheng for å avdekke mekanismene for kreftcellespredning.

MTs er sentrale for kreftprogresjon, for å opprettholde både spredning og invasjon. Presis analyse av MT-dynamikk in situ kan bidra til å identifisere MT-altering agents (MTA) i begge prosesser. MT-dynamikken varierer drastisk på en endring i miljøet. In vitro forhindrer behandling med MT-destabiliserende midler som nocodazol dannelse av cellefremspring når celler er innebygd i geler i 3D, mens det har liten effekt på 2D-cellemigrasjon13,14. Selv om det er teknisk utfordrende, tillater fremskritt innen intravital bildebehandling in vivo-analyse av MT-dynamikk under kreftcelleinvasjon. For eksempel viste observasjonen av MTs i subkutant xenograferte fibrosarkomceller hos mus at tumorassosierte makrofager påvirker MT-dynamikken i tumorceller15. Imidlertid involverer disse musemodellene omfattende kirurgiske prosedyrer og forblir utilfredsstillende for mindre tilgjengelige kreftformer, for eksempel den svært invasive hjernesvulsten, GBM.

Til tross for en dyster 15 måneders gjennomsnittlig overlevelsestid16, er lite kjent om GBMs spredningsmåte i hjernens parenchyma eller de viktigste molekylære elementene som opprettholder GBM-celleinvasjon i hjernevevet. Forbedring i mus ortotopisk xenograft (PDX) modell og etablering av kraniale vinduer ga nye muligheter for GBM celle invasjonsstudier17,18. På grunn av suboptimal bildekvalitet har denne modellen imidlertid stort sett tillatt langsgående avbildning av overfladiske xenotransplantater og har ikke blitt brukt til å studere subcellulær avbildning av cytoskelettproteiner så langt. Videre, i kjølvannet av "3Rs" -påbudet for å redusere bruken av gnagere og erstatte dem med lavere vertebrater, er det etablert alternative modeller.

Ved å dra nytte av den primitive immuniteten observert i sebrafisk (Danio rerio) larver, ble ortotopisk injeksjon av GBM-celler i fiskehjernen utviklet 19,20,21. Injeksjon i nærheten av ventriklene i den utviklende midthjernen rekapitulerer det meste av human GBM-patofysiologi21, og det samme foretrukne mønsteret av GBM-invasjon som hos mennesker - fartøy co-option - observeres22. Takket være gjennomsiktigheten til fiskelarvene, tillater denne modellen visualisering av GBM-celler som invaderer hjernen fra de peri-ventrikulære områdene der de fleste GBM antas å oppstå23.

Fordi MT-er er avgjørende for GBM-celleinvasjon in vitro24,25, er det nødvendig med en bedre karakterisering av MT-dynamikk og identifisering av nøkkelregulatorer under celleinvasjon. Dataene som genereres med sebrafiskens ortotopiske modell har imidlertid til dags dato ikke inkludert subcellulær analyse av MT-dynamikk under invasjonsprosessen. Dette papiret gir en protokoll for å studere MT-dynamikk in vivo og bestemme dens rolle under hjernekreft invasjon. Etter stabil mikrotubulimerking blir GBM-celler mikroinjisert ved 3 dpf i sebrafisklarvens hjerner og avbildet i sanntid ved høy spatio-temporal oppløsning under deres progresjon i hjernevevet. Live imaging av fluorescerende MT-er tillater kvalitativ og kvantitativ analyse av MT plus-end-dynamikk. Videre gjør denne modellen det mulig å vurdere effekten av MTA-er på MT-dynamikk og på de invasive egenskapene til GBM-celler i sanntid. Denne relativt ikke-invasive protokollen kombinert med et stort antall larver som håndteres om gangen og den enkle legemiddelapplikasjonen (i fiskevannet) gjør modellen til en ressurs for preklinisk testing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøk ble utført i henhold til EUs retningslinjer for håndtering av forsøksdyr. Alle protokoller ble godkjent av Etisk komité for dyreforsøk ved Institut Pasteur - CEEA 89 og det franske forsknings- og utdanningsdepartementet (tillatelse #01265.03). Under injeksjoner eller levende bildebehandlingsøkter ble dyrene bedøvet med Tricaine.At slutten av eksperimentelle prosedyrer, ble de avlivet ved bedøvelsesoverdosering. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen. Den generelle arbeidsflyten til protokollen er beskrevet i figur 1.

1. Generering av glioblastomceller som stabilt uttrykker α-tubulin-mKate2

MERK: Følgende trinn utføres i et biosikkerhetsskap BSL2+.

  1. Produser lentivirale partikler som uttrykker mKate2-tubulin ved bruk av kalsiumfosfatmetoden for transfeksjon av 7 × 106 HEK-293T-celler.
    1. I et 1,5 ml mikrosentrifugerør tilsettes 10 μg 2. generasjons emballasjeplasmid psPAX2, 5 μg viralt konvoluttplasmid pMD2.G og 10 μg av plasmidet av interesse, pGK-mKate2-humant tubulin α1a med 50 μL CaCl 2 (2,5 M lager). Juster til 500 μL med steril DNAse-fri H2O.
      MERK: Det er viktig å legge til CaCl2 sist.
    2. Bland ved å snu røret noen ganger og inkubere i 20 minutter ved romtemperatur (RT).
    3. Under inkubasjonen, lag et annet 1,5 ml mikrosentrifugerør med 500 μL HEPES-bufret saltvann (HBS), pH 7,0 (2x).
    4. Etter 20 min, tilsett CaCl2 / DNA-blandingen dråpe for dråpe i HBS (2x) -løsningen. Bland ved å snu røret noen ganger. Inkuber i 12 min ved RT.
    5. Etter 12 min, tilsett forsiktig CaCl2 / DNA blandet med HBS direkte på en 70% sammenflytende 10 cm tallerken med HEK-293T-celler, dråpe for dråpe.
    6. La cellene ligge i den fuktede inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2 i 36-48 timer.
    7. Samle supernatanten og spinn den ned ved 3000 × g i 5 minutter for å fjerne cellulært rusk.
    8. For å konsentrere viruspartiklene, last supernatanten inn i et ultracentrifugerør og spinn det ned ved 47 508 × g i 90 minutter ved 4 ° C.
    9. Kast supernatanten og legg røret opp ned på papir for å tørke innsiden av røret.
    10. Tilsett 30 μL PBS på viral pellet. Ikke resuspender pelleten. La stå ved 4 °C i 2 timer.
    11. Resuspender viruspartiklene forsiktig ved pipettering opp og ned. Unngå å lage bobler. Oppbevares ved -80 °C.
      MERK: Større mengder viruspartikler kan produseres ved å transfektere flere plater av HEK-2-93T-celler.
  2. Infisere glioblastomceller med lentivirale partikler.
    MERK: Denne protokollen er skrevet for kommersielle glioblastomcellelinjer som U-87 MG, U-373 MG eller T98. For å bruke primære pasientavledede glioblastomceller, bruk spesifikt belegg av platene og ikke-serumbasert medium26.
    1. Forbered en 70% konfluent 10 cm tallerken med U-87 MG glioblastomceller dyrket i Eagles minste essensielle medium (MEM) supplert med 10% føtalt kalveserum, penicillin-streptomycin (100 enheter / ml endelig konsentrasjon for penicillin og 100 μg / ml for streptomycin) og ikke-essensielle aminosyrer (1x).
    2. Tilsett viruspartiklene ved en 1 av 5000 fortynning direkte på cellene. Bland med en mild virvel. La virusene infisere cellene i ikke mer enn 20 timer.
    3. Fjern det virusholdige mediet og erstatt det med ferskkulturmedium. Tillat uttrykket til den merkede tubulinen i 48-72 timer.
      MERK: Følgende trinn skal utføres i et biosikkerhetsskap BSL2.
    4. FACS-sorter cellene for å velge de lyseste 15 % av mKate2+ -cellene. Etter å ha fjernet rusk og dobbeltceller ved hjelp av fremre og sidespredning (FCS vs SSC) gating, bruk en annen gating på de lyseste 30% mKate2 + -cellene for å holde de øverste 15%.
    5. Forsterk de MT-merkede cellene.
      MERK: Alternativt kan klonal seleksjon basert på høye nivåer av tubulin-mKate2 utføres under et epifluorescensmikroskop.

2. Forbered sebrafisklarver til mikroinjeksjon

  1. Generer sebrafiskegg.
    1. Plasser tre hanner og fire hunner av ønsket sebrafiskstamme i en parringstank supplert med klinkekuler 4 dager før xenotransplantasjonen, sent på ettermiddagen.
      MERK: Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) eller Tg(Huc:gfp)-linjene brukes til å markere henholdsvis endogene kar, nevrale stamceller/astrocytter og nevroner.
    2. Samle eggene som produseres ved marmorindusert gyting morgenen etter.
    3. Rengjør eggene ved å overføre dem til et 50 ml sentrifugerør fylt med mineralkildevann27 supplert med blekemiddel (0,004% endelig). Vend røret forsiktig i 5 min. Vask to ganger kun med mineralvann.
    4. Overfør eggene til en petriskål som inneholder mineralvann tilsatt 0,28 mg/ml metylenblått.
    5. Fjern de ubefruktede og utviklingsarresterte eggene. Inkuber embryoene ved 28 °C.
  2. Lag gjennomsiktige larver.
    1. Introduser N-fenylthiourea (PTU) (0,003% endelig) til mediet 8 timer senere, for å forhindre melaninpigmentering og sikre optisk gjennomsiktighet. Hold PTU i mediet for resten av protokollen.
      MERK: Fordi PTU-behandling kan forårsake utviklingsdefekter, velg bare de normalt utviklede larvene for xenotransplantasjon. Som et alternativ til kjemisk behandling kan man bruke den muterte sebrafiskstammen casper (nacre og roy orbison dobbeltmutant), der pigmentering er fraværende28.
    2. Øk inkubasjonstemperaturen til 29 °C.
    3. Øk temperaturen hver dag med 1 °C slik at larvene på 3 dpf når 32 °C på injeksjonsdagen.
  3. Forbered mikroinjeksjonsplaten.
    1. Forbered 20 ml 1% agarose + 0,28 mg / ml metylenblå med mineralvann.
    2. Hell agarosen i en 10 cm petriskål og påfør raskt mikroinjeksjonsplastformen opp ned for å lage 2,5 mm brede V-formede grøfter (figur 2B).
      MERK: Plastformen er tilgjengelig kommersielt eller kan bygges internt etter designet beskrevet i Sebrafiskbok29.
    3. Fjern plastformen forsiktig når agarosen har størknet.
      MERK: Støpte mikroinjeksjonsplater kan oppbevares ved 4 °C i opptil 2 måneder.
  4. Forbered larver for xenotransplantasjon.
    1. På injeksjonsdagen, skjerm for valgt fluorescerende transgenuttrykk i 3 dpf larver. Fjern de ikke-fluorescerende, unormale dyrene.
    2. Dekorioner larvene manuelt med fintippede urmakertang. Ved 3 dpf, stikk eller riv forsiktig opp korionene med to par finspissede tang for å frigjøre larvene fra korionen.
      MERK: Alternativt kan enzymatisk behandling med pronase A brukes til å dekorionere larver, vanligvis ved 24 hpf.
    3. Vedlikehold de dekorionerte larvene i mineralvannsmedium med metylenblått (0,28 mg/ml) og PTU (0,003 % endelig).

3. Xenotransplantasjon prosedyre

  1. Forbered mikroinjeksjonsnåler.
    1. Ta en borosilikatglasskapillær uten et sentralt filament og legg det i en vertikal nåletrekker.
    2. Bruk følgende innstillinger - øk 8,5 og varmeapparatet 3 - strekk kapillæren for å gjøre den om til en mikroinjeksjonsnål.
  2. Sett opp mikroinjektoren.
    1. Legg mineralolje i en manuell mikroinjektor. Fjern luftbobler.
    2. Koble en universell kapillærholder til mikroinjektoren og fest den godt til en mekanisk mikromanipulator (figur 2A).
  3. Høst glioblastomcellene.
    MERK: Følgende trinn utføres i et biosikkerhetsskap BSL2.
    1. Forbered en 10 cm plate av glioblastomceller slik at de når 80% sammenløp på transplantasjonsdagen.
    2. (Valgfritt) Merk cellekjernene midlertidig ved å tilsette Hoechst 35480 (200 ng/ml) til cellene. Inkuber i 20 minutter ved 37 °C i den fuktede celleinkubatoren og vask 2x med PBS.
    3. Ta celleplaten ut av inkubatoren og vask en gang med PBS. Løsne cellene ved å tilsette 1 ml 0,05% trypsin-EDTA og inkubere i 5-10 minutter ved 37 °C i celleinkubatoren til alle cellene er helt løsrevet.
      MERK: Dette trinnet er kritisk, da dårlig trypsinisering vil føre til at celleaggregater forblir fast i nålen.
    4. Resuspender cellene i 5 ml komplett glioblastomcellemedium i et 50 ml sentrifugerør. Tilsett 45 ml iskald PBS og sentrifuge ved 134 × g i 5 min.
    5. Kast supernatanten og resuspender cellene med 1 ml iskald PBS ved å pipettere grundig opp og ned.
      MERK: Dette trinnet med mekanisk dissosiasjon bidrar sterkt til å forhindre risikoen for tilstopping i kapillæren under mikroinjeksjon.
    6. Tilsett 49 ml iskald PBS og sentrifuge ved 134 × g i 5 min. Kast supernatanten og resuspender cellene i 200 μL iskald PBS. Oppbevares på is i løpet av transplantasjonsprosedyren.
  4. Mikroinjiser glioblastomcellene i sebrafisklarvene midt i hjernen.
    1. Fyll en mikroinjeksjonsstøpeplate med 6 ml E3-medium30 supplert med 160 mg / L tricaine.
    2. Overfør et dusin dekorionerte larver inn i mikroinjeksjonsplaten. Når de ikke reagerer på berøring, juster dem i grøftene på siden, hodet opp og eggeplommesekken presset mot veggen i grøften, med en størrelse 00 pensel (figur 2B, C).
    3. Resuspendere glioblastomcellene. Last 5 μL celler inn i mikrokapillæren ved hjelp av mikrobelastningsspisser og sett kapillæren inn i den universelle kapillærholderen.
    4. Plasser mikroinjeksjonsplaten som inneholder larvene som ikke reagerer, under stereomikroskopet. Plasser spissen av mikrokapillæren på grensen til mikroinjeksjonsplaten ved hjelp av mikromanipulatorknappene. Bryt den med en skalpell for å skape et skarpt inngangspunkt, omtrent på størrelse med diameteren på en celle.
    5. Kontroller at celler strømmer ut av kapillæren ved forsiktig å kjøre olje i mikroinjektoren og kaste spissen av nålen inn i mediet. Konsentrer cellene på tuppen av kapillæren for å maksimere antall celler injisert per volum kastet ut og unngå å fylle hjernevevet med PBS (figur 2C).
    6. Undersøk nøye cellene som kommer ut av mikrokapillæren når olje manuelt føres inn i injektoren. Definer empirisk hvor mye sving som trengs på den manuelle knappen for å levere 20 til 50 celler. Vanligvis, hvis cellene er konsentrert nok, er en mild sving nok til å kaste ut ~ 10 celler.
      MERK: Hvis væske ikke strømmer ordentlig ut av mikrokapillæren, kan du prøve å løsne festingen av mikrokapillæren i kapillærholderen. Ved å gjøre det, kan olje lekke og dryppe ned langs kapillæren.
    7. Nærme seg spissen av kapillæren mot venstre optiske tektum (OT), like over midtre cerebrale vene (MCeV, figur 2F).
    8. Press kapillæren forsiktig mot larvene til hudmembranen brister (figur 2D,E).
      MERK: Ikke press for hardt, da dette vil resultere i å injisere cellene for dypt i hjernen der den lavere optiske klarheten vil forhindre å observere MT-er i detalj. Avbildningsteknikken er mulig for en dybde som når 250-300 μm. Det anbefales imidlertid ikke å injisere dypere enn 100 μm fra fiskeoverflaten.
    9. Når en passende posisjon i OT er nådd, må du kaste ut cellene. Nøye observere spissen av kapillæren for å visualisere strømmen av celler som går inn i dyret, og dermed sikre vellykket injeksjon.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke injiserer i ventriklene (figur 2E). En gang i ventriklene har cellene en tendens til å akkumulere og bli sittende fast i stedet for å infiltrere vevet (figur 2I). Ventrikkelinjeksjon kjennetegnes av intens hevelse i hjernen og observerbar spredning av injiserte celler til forhjernen og bakhjernen (figur 2J).
    10. Gjenta prosedyren fra trinn 3.4.9-3.4.11 for så mange dyr som nødvendig. Fortsett raskt for å forhindre klumping av celler i kapillæren.
      MERK: Avhengig av hvor raskt eksperimentøren injiserer, kan det være nødvendig med et nålskifte hver 10. til 20. larver.
    11. Når xenotransplantasjonen er fullført, fjern larvene fra mikroinjeksjonsplaten og sett dem ut i en 24-brønns plate fylt med mineralkildevann + PTU + metylenblått medium.
    12. Valider vellykket injeksjon ved å observere larvene under et fluorescerende stereomikroskop (figur 2G). Velg bare xenotransplantater som inneholder en enkelt tumormasse dannet av 20-50 celler plassert i de øverste 200 μm (i z) av OT (figur 2H vs mislykket injeksjon i figur 2I-K).
      MERK: Utbyttet av vellykkede lokaliserte xenotransplantater varierer fra 10% i begynnelsen til nesten 100% med praksis.
    13. La larvene komme seg i minst 4 timer ved 32 °C før avbildning.
      MERK: Tilsetning av antibiotika i mediet øker ikke overlevelsesraten til larvene. På dette stadiet, hvis mikroinjeksjon er riktig utført, overlever nesten 100% av fisken.

4. Intravital avbildning av glioblastom xenografts

  1. Monter larvene for levende bildebehandling.
    MERK: Larver kan avbildes fra 4 timer etter injeksjon (hpi). Live imaging av MT utføres vanligvis fra 20 hpi, når invasive GBM-celler har begynt å utvide fremspring og migrere bort fra tumormassen.
    1. Forbered en 1% lavsmeltende agaroseløsning. Overfør 500 μL kokt 1% lavsmeltende agaroseløsning til et 1,5 ml sentrifugerrør og la det avkjøles ved 37 ° C på en varmeblokk. Tilsett trikain (112 μg / ml) til agarosen og bland godt.
    2. Overfør en til fire xenotransplanterte larver i en 3,5 cm petriskål fylt med mineralkildevann + PTU + metylenmedium komplementert med trikain (112 μg / ml). Når larvene ikke reagerer på berøring, overfør dem forsiktig inn i røret som inneholder agarose og tricaine ved hjelp av en finspissoverføringspipette.
      MERK: Hold volumet av medium til et minimum for å begrense fortynning av agarose.
    3. Bland larvene forsiktig med agarose. Bruk en normal (stor pære) overføringspipette, plasser larvene blandet i agarose på midten av en glassbunnet 3,5 cm videobildebehandlingsfat. Under et stereomikroskop plasserer du larvene raskt på ryggen ved hjelp av en mikrolastspiss for å manipulere fisken.
      MERK: Fordi et omvendt konfokalt mikroskop for spinningskive brukes til intravital hjerneavbildning i denne protokollen, er larvene montert dorsalt. Juster plasseringen av larvene tilsvarende hvis du bruker et oppreist konfokalt mikroskop.
    4. Fjern ekstra agarose for å opprettholde det tynneste mulige agaroselaget. Når agarosen har størknet, tilsett 2,5 ml mineralkildevann + PTU + 0,2x tricaine (bildemedium) og fortsett til neste trinn.
  2. In vivo levende avbildning av MT-dynamikk i invaderende glioblastomceller
    MERK: Den optiske kvaliteten på bildene avhenger i stor grad av ytelsen til mikroskopet som brukes. Protokollen er skrevet for et omvendt konfokalt mikroskop på spinningskive utstyrt med et sCMOS-kamera (pikselstørrelse 6,5 μm, 2048 x 2044 piksler), mål med lang arbeidsavstand og temperaturkontrollert miljøkammer.
    1. Plasser videoavbildningsfatet som inneholder de agaroseinnstøpte xenotransplanterte larvene i miljøkammeret i et omvendt konfokalt mikroskop, med temperaturen satt til 32 °C. Finn larvene i videobildeparabolen med et 10x mål, ved hjelp av et motorisert XY-trinn.
    2. Trykk på ESC for å senke måltårnet, tilsett mineralolje på et 60x oljemål (1,4 NA, arbeidsavstand: 0,13 mm), og trykk ESC for å gå tilbake til den opprinnelige fokusposisjonen.
    3. Vær oppmerksom på de invaderende glioblastomcellene i den røde kanalen (561 nm laserkilde, 20% lasereffekt, tidseksponering: 200 ms) og velg en celle med et spredt MT-nettverk og lett gjenkjennelige MT-filamenter (figur 3B).
    4. Angi innstillingene for z-serien. Ved å bruke et 200 μm piezo-stadium, velg topp- og bunnposisjonene til MT-nettverket: en 10-30 μm dyp z-stack er nok til å visualisere mikrotubulinettverket i fremspringet av den migrerende cellen, med et z-skivetrinn på 0,3 μm.
    5. Angi innstillinger for time-lapse-innhenting for å gi en optimal balanse mellom innsamlingshastighet, z-stackdybde og fluorescerende signal for å unngå rask fotobleking. Skaff bilder av MT-er hver 5-10 s i flere minutter. Skaff og lagre hyperstakken 5D (x,y,z,t,c).
      MERK: For å unngå drift i z under anskaffelse, bruk et mikroskop utstyrt med et perfekt fokussystem som maskinvarefokusstabilisering.
  3. (Valgfritt) Bestem effekten av mikrotubuli-altering agenter (MTA) på MTs.
    MERK: Følgende trinn tillater testing av effekten av MTAene på et MT-nettverk i migrerende glioblastomceller i sanntid.
    1. Fjern bildemediet forsiktig fra videoavbildningsfatet. Ikke berør bunnen av parabolen, da xyz-posisjonen vil gå tapt.
    2. Forbered nytt bildemedium som inneholder MTA i forskjellige konsentrasjoner. Tilsett det MTA-holdige mediet forsiktig i videobildeparabolen dråpe for dråpe.
    3. Skaff langsiktige filmer (2-16 timer, ett bilde hver 10-20 min) for å observere effekten av hver konsentrasjon av MTA på MT-nettverket og cellemigrasjon (figur 4A).
    4. (Valgfritt) Vask ut MTA ved å forsiktig fjerne mediet og tilsette 2,5 ml friskt bildemedium uten MTA. Gjenta utvaskingsprosedyren 3x for å fjerne spor av MTA i mediet.
    5. (Valgfritt) Skaff deg en lignende langtidsfilm som i 4.3.3 (figur 4B).
      MERK: Trinnene ovenfor bestemmer den minimale konsentrasjonen som endrer MT-nettverket uten å påvirke larvenes overlevelse. Utvaskingstrinnene definerer om effekten av stoffet er reversibel.
  4. Vurder MTA-innvirkning på glioblastominvasjon ved sekvensiell avbildning.
    1. Følg trinn 4,1 til 4,2,1 4 timer etter mikroinjeksjon.
      MERK: Denne delen av protokollen kan også oppnås med andre fluorescerende merkede glioblastomcellelinjer. Ideelt sett kan du merke GBM med en cytosolisk tag og en kjernekode for å sikre deteksjon av cellens globale morfologi.
    2. Bytt til en lang arbeidsavstand 40x vannmål (NA: 1,15, WD: 0,6 mm).
    3. Angi z-serien for å anskaffe OT-regionen. Skaff deg z-stacken ved hjelp av et høysensitivt sCMOS-kamera (pikselstørrelse 11 μm,1,200 x 1,200 piksler, kvanteeffektivitet 95%).
      MERK: Z-stack starter vanligvis på den mest dorsale delen av OT (nær overflaten) og slutter dypt nok i hjernen til å inkludere hele tumorcellemassen.
    4. Fjern videobildeparabolen fra mikroskopet. Frigjør larvene fra agarosen ved å bruke en mikrobelastningsspiss og forsiktig stikke agarosen rundt dyret.
      MERK: Siden 3 dpf larver fortsatt er svært skjøre, vær forsiktig når du fjerner dem fra agarose.
    5. Når dyret er frigjort fra agarose, overfør det forsiktig til en enkelt brønn på en 24-brønns plate fylt med mineralkildevann + metylenblått + PTU-medium. Merk brønnen for å identifisere larver for etterfølgende avbildning.
    6. Legg til MTA av interesse for mediet ved konsentrasjonen bestemt tidligere (trinn 4.3.3). Oppdater mediet supplert med stoffet hver dag. Gjenta bildebehandlingsprosedyren fra trinn 4.4.1 til 4.4.5 hver dag i 3-4 dager.

5. Bildeanalyse

  1. Analyser MT-dynamikk med fritt tilgjengelige FIJI-plugins.
    MERK: Mange vurderinger og protokoller beskriver metodene for MT-dynamikkanalyse i celler31,32,33,34 og kan brukes på dette stadiet. Denne protokollen vil kort referere til to metoder for å måle grunnleggende MT dynamiske egenskaper.
    1. Åpne 5D-hyperstakken og generer en 4D-stakk der z-skivene er projisert i ett enkelt plan for å opprette en maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) i z (Image | Stabler | Z-prosjekt | Maks intensitet) (figur 3B).
    2. Åpne 4D MIP-stakken og spor manuelt enden av en fremspringbasert MT ved hjelp av den manuelle sporingsfunksjonen i FIJI (Plugins | Sporing | Manuell sporing). (Figur 3D). Trekk ut parametrene for MT-dynamikk som veksthastighet, krympingshastighet, redningsfrekvens og katastrofefrekvens.
    3. Alternativt kan du tegne en segmentert linje på 10 piksler bredt langs MT for å analysere (figur 3B). Bruk Multi Kymograph-funksjonen (Analyser | Multi Kymograph) (figur 3C) i FIJI. Observer og mål MT-vekstfasene (G), lengden på pausene (P) og hyppigheten av MT-katastrofer.
  2. Analyse av langvarig glioblastominvasjon
    MERK: Denne analysen krever bruk av 4D-visualisering og analyse med bioimaging-programvare.
    1. Konverter rå 4D z-stack fra trinn 4.4.3 (4 hpi) til riktig programvareformat, ved hjelp av File Converter programvare.
    2. Åpne programvaren og importer den konverterte z-stack-filen i Surpass-visningen (figur 5A).
    3. For å segmentere tumorcellene og kaste bort irrelevant autofluorescens i den røde kanalen, klikk på Legg til nye overflater og følg 5-trinns prosessen.
      1. Valider standardinnstillingene ved å klikke på neste pil når vinduet dukker opp. Fortsett til trinn 2/5.
        MERK: Hvis fluorescerende signal er anskaffet i 561-kanalen, kan autofluorescens fra gjenværende pigmentering i øyet være sterk og endre den automatiske segmenteringsprosessen. Dette er problematisk hvis xenograften ligger nær øyet. I så fall må segmentering fullføres manuelt ved å kutte og slette ikke-glioblastomcellesignaler.
      2. Naviger til kildekanal | 561-kanal. Gjør bildet (Gauss-filteret) jevnere ved å legge til 1,50 μm i Surfaces Detail og ved å legge til 2,5 μm for diameteren på kulene i Substract background. Klikk på neste pil og fortsett til trinn 3/5.
      3. Avhengig av intensiteten til signalet, justerer du terskelen (bakgrunnsunderstraksjonen) manuelt for å inkludere hver celleprosess. Fortsett til trinn 4/5.
      4. Filtrer det segmenterte signalet ved å fjerne hendelsene som ikke representerer en del av en celle (f.eks. rusk, autofluorescens). Klikk på Filtertype | volum og juster terskelen manuelt for å ekskludere alle hendelsene under det minste volumet som representerer en del av en celle. Fortsett til trinn 5/5.
        MERK: Hvis autofluorescenssignalene er større i volum enn den minste celledelen, fortsett uansett og fjern de uønskede signalene manuelt ved å venstreklikke og slette dem.
      5. Forkast klassifiseringstrinnet og fullfør segmenteringsveiviseren ved å klikke på den doble grønne pilen for å fullføre opprettingen av en overflatevisning av tumorcellene (figur 5B).
    4. Hvis de segmenterte cellene ikke berører hverandre og ikke danner et unikt objekt, slå dem sammen kunstig for å skape et tumorcellemasseobjekt. Kort sagt, klikk på Statistikk | detaljert | spesifikke verdier | volum. Velg alle hendelser ved å venstreklikke på den øverste og deretter holde Shift og venstreklikke på den siste. Naviger for å redigere | utvalg | samle.
    5. Definer sentroiden av tumorcellemassen. Klikk på Legg til nye flekker | Hopp over automatisk oppretting | Legg til (markøren krysser med) | Sentrum av objektet. Hold skift og venstre klikk for å opprette stedet, som er sentroiden til den segmenterte tumorcellemassen.
    6. Mål 3D-avstanden mellom hver GBM-celle og sentroiden av tumormassen. For å gjøre det, opprett en avstand til sentroidkanalen ved å forbli i spotvisningen og velge verktøyikonet | Avstand Transformasjon. Vent til en ny avstand til sentroidkanalen opprettes, sammen med 488 og 561-kanalen (i blått, figur 5C).
      MERK: Intensiteten til hver voxel i denne kanalen tilsvarer 3D-avstanden mellom voxel til sentroiden til tumorcellemassen.
    7. Mål 3D-avstanden til sentroiden til hver segmentert celle ved å klikke på Legg til nye flekker | Hopp over automatisk oppretting | Legg til (markøren krysser med) | spesifikk kanal 561. Hold shift og venstreklikk på cellekjerneområdet. Utfør denne oppgaven for hver celle (figur 5D).
      MERK: Fjern Surface-visningen for å sette pris på fluorescenssignalet til cellene. Alternativt, hvis det er til stede, bruk kjernesignalet (405 nm eller 647 nm signal) for bedre nøyaktighet.
    8. Klikk på Statistikk | Detaljert | Bestemte verdier | intensitet betyr Ch = avstand til sentroid.
      MERK: Verdien av intensiteten er 3D-avstanden i μm mellom cellekjerneområdet og sentroiden.
    9. Gjennomsnittlig disse intensitetene for å beregne radiusen til tumormassen ved 4 hpi. Gjenta prosedyren for hvert tidspunkt i analysen (24 hpi, 48 hpi og 72 hpi).
      MERK: Mål bare de 10 eller 20 mest spredte cellene for å unngå å undervurdere celleinvasjon. Faktisk kan tvungen komprimering av cellene under injeksjon forhindre at celler i midten av tumormassen migrerer.
    10. Beregn invasjonsindeksen (II) som forholdet mellom gjennomsnittlige 3D-avstander ved t = 24 hpi / 48 hpi / 72 hpi av de mest spredte cellene over gjennomsnittlig radius av tumormassen ved t = 4 hpi (figur 5E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å analysere rollen som MT-er spiller under in vivo GBM-invasjon, beskriver vi her de viktigste trinnene for å utføre stabil MT-merking i GBM-celler ved lentiviral infeksjon, ortotopisk xenotransplantasjon av GBM-celler i 3 dpf sebrafisklarver, høyoppløselig intravital avbildning av MT-dynamikk, MTA-behandling og dens effekter på GBM-invasjon, og bildeanalyse av MT-dynamikk og in vivo-invasjon (figur 1). MT-dynamikk måles enten ved å bygge kymografer langs voksende og krympende MT-er (figur 3C) eller ved å manuelt spore individuelle MT-kanter over tid (figur 3D). Et eksempel på medikamentell behandling gitt i larvemediet og reversibel effekt på MT-nettverksorganisering er gitt i figur 4. Behandling med lav dose nokodazol (200 nM) fører til progredierende krymping av MT-nettverket og forsvinning av glioblastomcellefremspring 4 timer senere (figur 4A). Vasking av stoffet gjenopprettet kapasiteten til glioblastomceller for å danne fremspring. Cellene fortsatte å migrere langs vaskulaturen 12 timer etter utvaskingen (figur 4B). Disse dataene antyder at behandling med 200 nM nokodazol er tilstrekkelig til å forstyrre MT-nettverket og blokkerer raskt in vivo glioblastomcelleinvasjon. En 3 dager lang analyse av samme behandling på global glioblastomcelleinvasjon viser at nokodazol 200 nM stopper langvarig glioblastomcelleinvasjon in vivo, uten å påvirke fiskens generelle helse, sammenlignet med en kontroll (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Diagram over protokollarbeidsflyt. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; hpi = timer etter injeksjon; MT = mikrotubuli; MTA = mikrotubuli-altering agent; GBM = glioblastom multiforme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Mikroinjisering av glioblastomceller i 3 dpf sebrafisklarver. (A) Fotografi av utstyret som brukes til xenotransplantasjon: 1, oljemikroinjektor; 2, mekanisk mikromanipulator; 3, universell kapillærholder; 4, glass kapillær. Mikroinjeksjonsplaten er under et stereomikroskop. (B) Fotografi som viser bedøvede 3 dfp sebrafisklarver justert i en grøft og klar til å bli mikroinjisert. Spissen av en mikrokapillær lastet med et rødt fargestoff er synlig til høyre for fotografiet. Detaljer om de mønstrede grøftene som er bygget i agaroseplaten, ses i innfellingen nederst til høyre. Skalastang = 3 mm. (C) Skjema for en representativ mikroinjeksjonsplate. Klar-til-å-bli-injisert larver plasseres lateralt (midten av platen). Legg merke til at cellene er konsentrert på tuppen av mikrokapillæren (svart pil) før de går videre til injeksjonen. Injiserte larver er vist til høyre for platen, plassert ventralt. (D) Skjema for en tverrgående skive i mikroinjeksjonsplaten (langs den svarte stiplede linjen i C) som viser grøftene der larvene er plassert under injeksjonen. (E) Fotografi som viser spissen av kapillæren klar til å trenge inn i optisk tectum (stiplet linje). Ventriklene er avgrenset av de hvite linjene. Skala bar = 150 μm. (F) Skjema av en 3 dpf fli1a: gfp larve som uttrykker gfp i endotelcellene, som indikerer OT-regionen der cellene injiseres, like over den midterste hjernevenen. (G) Fluorescensbilde av en 3 dpf gfap: gfp larve (gfp uttrykt i nevrale stamceller) plassert lateralt etter mikroinjeksjon av U87-mkate2-celler (hvit sirkel og hvit pil). Høy autofluorescens i rødt er forårsaket av iridoforer i øynene. Skala bar = 100 μm. (H) Konfokal fluorescensbilde av en vellykket injisert fli1a: gfp larve ved 16 hpi. Skala bar: 50 μm. (I-K) Konfokal fluorescens bilder av mislykket injisert fli1a: gfp larver på 96 hpi (I) og 4 hpi (J, K). GBM-celler har blitt injisert i ventrikler (I, J) eller i flere foci i hjernen (K). Skala barer = 50 μm. Forkortelser: dpf = dager etter befruktning; OT = optisk tectum; MCeV = midtre cerebral vene; GFP = grønt fluorescerende protein; gfap = glial fibrillær surt protein; hpi = timer etter injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Visualisering in vivo mikrotubulidynamikk i glioblastomceller. (A) Representativt fluorescensbilde av xenograferte U87-celler som uttrykker tubulin-α1-mkate2 i OT av en fli1a: GFP sebrafisklarve ved 20 hpi. (B) Maksimal intensitet projisert fluorescensbilde av MT-nettverket i en enkelt xenografert U87-celle. (C) Kymograph langs den røde stiplede linjen i B, som viser veksten, pausen og katastrofefasene av MT dynamisk ustabilitet. (D) Time-lapse-sekvens for det boksede området i B som fremhever sporingen av tre MT +-ender. Skala barer = 10 μm. Forkortelser: OT = optisk tectum; GFP = grønt fluorescerende protein; hpi = timer etter injeksjon; MT = mikrotubuli; G = vekstfase; P = pause fase; C = katastrofefase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Visualisere effekten av mikrotubuliendringsmiddelet på glioblastominvasjon in vivo. (A) Time-lapse-sekvens av U87-celler som uttrykker tubulin-α1a-mkate2 i sebrafisklarver behandlet med nocadazol (200 nM). Piler peker på ekstremiteten av fremspringet i to forskjellige celler som invaderer hjernen langs et blodkar. Legg merke til tilbaketrekning av fremspringet ved behandling med nocodazol. Skala bar = 10 μm. (B) Time-lapse sekvens som representerer effekten av nocodazol utvasking på U87 celle invasjon. Ved 500 minutter etter utvaskingen forlenger cellen merket med den hvite stjernen et MT-basert fremspring (hvit pil), som tillater gjenopptakelse av invasjonen langs et blodkar. Skala bar = 20 μm. (C) 3D-representasjoner av en xenografert larverhjerne behandlet med DMSO eller nocodazol (200 nM) i 72 timer. U87-cellesignalet er segmentert (i rødt) og integrert med fli1a-GFP-fluorescenssignalet (i hvitt). Legg merke til redusert spredning av U87-celler behandlet med nokodazol. Skala bar = 30 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; hpi = timer etter injeksjon; MT = mikrotubuli. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Bildeanalyse av in vivo glioblastom invasjon. (A) Fluorescerende bilder av xenograferte U87-celler som uttrykker cytosolisk mKate2 i fli1a-GFP sebrafisklarver, 4 hpi. Hvite stjerner understreker typisk autofluorescens fra øye iridophorer. Skala bar = 40 μm. (B) Fluorescerende bilde av fli1a-GFP larver kombinert med den segmenterte overflaten som tilsvarer U87-cellesignalet i A. Sentroiden av tumormassen ser grønn ut. Skalalinje = 40 μm. (C) Fluorescerende bilde som representerer det røde kanalsignalet i A og den nylig definerte "avstand til centroid" -kanalen (i blått). Skala bar = 30 μm. (D) Rød kanal fluorescensbilde lagt over med fargede flekker, hvis farge representerer avstanden til cellen til sentroiden (i grønt), fiolett er nærmest sentroiden og hvitt er lengst fra hverandre. Skala bar = 20 μm. (E) Et eksempel på sekvensiell analyse av global GBM invasjon. 3D-avstander bestemmes ved 4 hpi og 72 hpi, og invasjonsindeksen (II) beregnes i henhold til formelen i innboksen. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; hpi = timer etter injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avbildning av tumorxenotransplantater ved encellet oppløsning vil sannsynligvis bli et uunnværlig verktøy for å forbedre vår forståelse av GBM-biologi. Live imaging i mus PDX-modeller har ført til verdifulle funn om hvordan GBM kollektivt invaderer hjernevevet18. Til dags dato er imidlertid den spatiotemporale oppløsningen ikke høy nok til å avsløre dynamikken til proteiner som kontrollerer GBM-invasjon. Vi resonnerte at ved å koble den ortotopiske engraftingen av GBM-celler i gjennomsiktige sebrafisklarver med høyoppløselig intravital avbildning, kunne cytoskeletale proteiner som MT analyseres i tilstrekkelig detalj for å analysere deres dynamikk under in situ GBM-invasjon.

De kritiske trinnene i metodikken ligger i forberedelsen av GBM-cellene og mikroinjeksjonsprosedyren. Usunne og utilstrekkelig dissosierte celler vil holde seg sammen eller til kapillærgrensene og blokkere injeksjonsstrømmen. I tillegg må cellene være tilstrekkelig konsentrert i kapillæren for å minimere det injiserte volumet og implantere dem i bulk. Injisering av et høyere volum av mer fortynnede celler vil resultere i flere, noen ganger blandede tumorfoci, hvis invasive indekser blir vanskelige å måle. I våre hender gir manuell håndtering av den oljebaserte mikroinjektoren bedre kontroll over injeksjonsstrømmen enn en trykkluftbasert elektronisk mikroinjektor som tidligere har blitt brukt i en lignende modell19. Dette er avgjørende for å forhindre overflødig strømningstrykk inne i hjernen, og dermed unngå påfølgende vevskader og ventrikulær aggregering av de injiserte cellene.

Noen begrensninger i denne modellen inkluderer nødvendigheten av å utføre forsøket ved suboptimale temperaturer for begge arter. Sebrafisk dyrkes vanligvis ved 28 °C, mens menneskeceller dyrkes ved 37 °C. Over 32 °C endres utviklingen av sebrafiskembryoer, og disse endringene kan være dødelige35. I likhet med det som gjøres i xenograftmodeller for voksne sebrafisk36, øker imidlertid sekvensielt akklimatisering av sebrafisklarvene til en temperatur på 32 °C overlevelsen til transplanterte dyr sammenlignet med den raske temperaturendringen etter transplantasjonen fra 28 °C til 32 °C. Å øke temperaturen fører imidlertid ytterligere til økt dyredød i samsvar med følsomheten til sebrafiskembryoer for temperaturer over 32 ° C35.

Tolkning av in vivo MT-dynamikkdata må gjøres nøye ettersom MT-dynamikken endres når temperaturen synker under 37 °C37. Parallell in vitro-måling av MT-dynamikk ved 37 °C og 32 °C i de samme GBM-cellene med samme MTA-behandling vil bidra til å validere forskjellene sett mellom forskjellige GBM-celler eller mellom in vivo-behandlinger . Det skal bidra til å bekrefte at forskjellene ikke skyldes variasjon i temperaturfølsomhet, men av forskjellige reguleringsveier (for GBM-sammenligningsanalyse) eller ved MTA-behandling (for MTA-effektanalyse). Dette vil være av interesse dersom MT-dynamikkens heterogeniteter knyttes til ulike invasjonsevner.

En annen begrensning er det korte tidsvinduet der invasjon kan overvåkes (72 til 96 timer), og forhindrer måling av invasjonsplast drevet av potensielle endringer i MT-dynamikk38. Etter 96 timer la vi merke til en kraftig nedgang i GBM-celleinvasjon. Ved 6 dager etter injeksjon falt antall GBM-celler raskt, antagelig på grunn av en vertsimmunrespons forårsaket av akkumulering av nøytrofiler og makrofager i tumormikromiljøet39. Å levere MTAer til hele hjernen vil sannsynligvis påvirke nærliggende nevronale vertsceller, som er avhengige av MT for deres aktivitet, og hvis endring senere kan påvirke GBM-invasjonen40. Denne tilnærmingen må suppleres med shRNA- eller optogenetikkanalyser som begrenser MT-endring til GBM-cellene, men er fortsatt en god plattform for å skjerme for nye antiinvasive forbindelser.

Den ortotopiske injeksjonen av MT-merkede GBM-celler i sebrafiskhjernen er av spesiell interesse for å dechiffrere MTs rolle under kreftcelleinvasjon, da svært få dyremodeller tillater in situ subcellulær avbildning av kreftcellemigrasjon i deres opprinnelsesvev15. Til dags dato er studier av MT-funksjoner under GBM-migrering hovedsakelig avhengig av in vitro- og ex vivo-analyser og mangler in vivo-validering 24,41,42,43. Sammen med gen-of-interest knock down eller en upartisk genbasert screening tilnærming, vil analysen som presenteres her bidra til å avsløre nye MT-regulatorer som er viktige for GBM-invasjon in vivo.

GBM er svært heterogene svulster hvis invasive egenskaper varierer sterkt mellom prøver44. Å forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn for deres forskjellige invasjonsmodus, vil bidra til å definere ad hoc terapeutiske behandlinger for å blokkere GBM-spredning. Systematisk måling av invasiv indeks, invasjonsmåte og cytoskeletale egenskaper som MT-dynamikk i ulike GBM-prøver vil avsløre nye korrelasjoner mellom hyppige genomiske mutasjonsprofiler og celleinvasjonsmønstre avhengig av spesifikke cytoskeletale egenskaper. Å avsløre hvordan disse mutasjonene påvirker endringen i MT-dynamikk, vil ikke bare legge til vår kunnskap om MT-regulering under cellemigrasjon45,46, men kan også føre til etterlengtede pasientspesifikke, antiinvasive terapier.

Den relativt enkle mikroinjiseringen i sebrafisk kombinert med det høye antallet larver som er tilgjengelig og enkel injeksjon av legemidler, gjør denne prosedyren egnet for personlig medisin47,48. Videre, i motsetning til intravital avbildning av GBM-xenotransplantater hos mus, som bare forekommer i den øvre 500 μm-delen av cortex49,50, tillater bruk av sebrafisk visualisering av GBM-infiltrasjon i hele CNS. Modellen som presenteres her oppfyller kriteriene for å bli et uvurderlig verktøy for rask analyse av glioblastomens invasive kapasiteter og dens respons på behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Vi er svært takknemlige til Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrike) og hans laboratorium, spesielt Valérie Briolat, og Emma Colucci-Guyon for å gi oss sebrafisklinjene og plastformen for mikroinjeksjonsplater, og for deres verdifulle ekspertise på sebrafiskeksperimentelle prosedyrer. Vi anerkjenner takknemlig UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, støttet av det franske nasjonale forskningsbyrået France BioImaging, og ANR-10-INBS-04; investeringer for fremtiden). Dette arbeidet ble støttet av Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique, og Institut Pasteur og ved generøse donasjoner fra fru Marguerite MICHEL og Mr. Porquet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Biologi utgave 185 Ortotopisk xenograft PDX Sebrafisk Danio rerio Glioblastom Subcellulær intravital avbildning 5D bildeanalyse
Levende avbildning av mikrotubulidynamikk i glioblastomceller som invaderer sebrafiskhjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter