Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Levande avbildning av mikrotubulidynamik i glioblastomceller som invaderar zebrafiskhjärnan

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

Vi rapporterar en teknik som möjliggör levande avbildning av mikrotubulidynamik i glioblastom (GBM) celler som invaderar en ryggradsdjurs hjärnvävnad. Att koppla den ortotopiska injektionen av fluorescerande märkta GBM-celler till en transparent zebrafiskhjärna med högupplöst intravital avbildning möjliggör mätning av cytoskelettdynamik under in situ cancerinvasion.

Abstract

Med en dyster medianöverlevnadstid i verkliga populationer - mellan 6 och 15 månader - är glioblastom (GBM) den mest förödande maligna hjärntumören. Behandlingssvikt beror främst på invasiviteten hos GBM-celler, vilket talar för behovet av en bättre förståelse för GBM-rörliga egenskaper. För att undersöka den molekylära mekanismen som stöder GBM-invasion krävs nya fysiologiska modeller som möjliggör fördjupad karakterisering av proteindynamik under invasion. Dessa observationer skulle bana väg för upptäckten av nya mål för att blockera tumörinfiltration och förbättra patientresultaten. Detta dokument rapporterar hur en ortotopisk xenograft av GBM-celler i zebrafiskhjärnan tillåter subcellulär intravital levande avbildning. Med fokus på mikrotubuli (MTs) beskriver vi ett förfarande för MT-märkning i GBM-celler, mikroinjicering av GBM-celler i den transparenta hjärnan på 3 dagar efter befruktning (dpf) zebrafisklarver, intravital avbildning av MTs i de spridande xenografterna, förändring av MT-dynamik för att bedöma deras roll under GBM-invasion och analys av förvärvade data.

Introduction

Cellmotilitet är en stereotyp process som kräver etablering av polaritetsaxeln och kraftgenererande cytoskelettomläggningar. Aktinpolymerisation och dess koppling till myosin erkänns som de viktigaste bidragsgivarna till utskjutande och kontraktila krafter som krävs för cellrörelse1. Mikrotubuli anses vara huvudaktörerna i cellpolarisering och riktningsbeständighet under migration2. Under de senaste åren har MTs också visat sig skapa och stabilisera utsprång för att stödja mekanokompressiva krafter under cellinvasion i 3D3. På senare tid har maskinöversättningar varit direkt involverade i mekanotransduktion vid fokala vidhäftningar och mekanosensitiv migration4. Den dynamiska instabiliteten som kännetecknar MT-plus-slutdynamiken är gjord av upprepade faser av polymerisation (tillväxt) och depolymerisation (krympning), som styrs av en uppsjö av mikrotubulibindande proteiner och intracellulära signalkaskader, såsom de som styrs av RHO-GTPaser 5,6,7. MT-nätverkets roll i cellmigration och invasion har gjort undersökningen av MT-dynamik till ett nyckelelement för att bättre förstå mekanismerna för immuncellhoming, sårläkning och cancerinvasion.

Cancercellernas förmåga att undkomma den primära tumörkärnan, sprida sig i vävnaderna och generera sekundära tumörer är ett kritiskt steg för att förhindra global framgång i kriget mot cancer som förklarades för 50 år sedan 8,9. Ett av de största hindren har varit att förstå hur cancerceller aktivt invaderar vävnaden. Viktiga invasionsmekanismer förlitar sig på samma principer som de som styr icke-tumörcellmigration10. Emellertid har cancercellsmigrationsspecificiteter uppstått11, vilket utlöser behovet av bättre karakterisering av denna typ av migration. Specifikt, eftersom tumörmikromiljön framträder som en nyckelspelare i cancerprogression12, är det viktigt att observera och analysera cancercellsinvasion i ett relevant fysiologiskt sammanhang för att avslöja mekanismerna för spridning av cancerceller.

MTs är centrala för cancerprogression, för att upprätthålla både spridning och invasion. Exakt analys av MT-dynamik på plats kan hjälpa till att identifiera MT-förändrande medel (MTA) i båda processerna. MT-dynamiken varierar drastiskt vid en förändring i miljön. In vitro förhindrar behandling med MT-destabiliserande medel såsom nocodazol cellutsprångsbildning när celler är inbäddade i geler i 3D, medan det har liten effekt på 2D-cellmigration13,14. Även om det är tekniskt utmanande, tillåter framsteg inom intravital avbildning in vivo-analys av MT-dynamik under cancercellsinvasion. Till exempel avslöjade observationen av MT i subkutant xenograferade fibrosarkomceller hos möss att tumörassocierade makrofager påverkar MT-dynamiken i tumörceller15. Dessa musmodeller involverar dock omfattande kirurgiska ingrepp och förblir otillfredsställande för mindre tillgängliga cancerformer, såsom den mycket invasiva hjärntumören GBM.

Trots en dyster 15 månaders genomsnittlig överlevnadstid16 är lite känt om GBM: s spridningssätt inom hjärnparenkymen eller de viktigaste molekylära elementen som upprätthåller GBM-cellinvasion i hjärnvävnaden. Förbättring av musens ortotopiska xenograft (PDX) -modell och etablering av kranialfönster erbjöd nya utsikter för GBM-cellinvasionsstudier17,18. På grund av suboptimal bildkvalitet har denna modell dock mestadels tillåtit longitudinell avbildning av ytliga xenografter och har hittills inte framgångsrikt använts för att studera subcellulär avbildning av cytoskelettproteiner. I kölvattnet av "3R"-föreläggandet att minska användningen av gnagare och ersätta dem med lägre ryggradsdjur har dessutom alternativa modeller etablerats.

Genom att utnyttja den primitiva immuniteten som observerats hos zebrafisklarver (Danio rerio) utvecklades ortotopisk injektion av GBM-celler i fiskhjärnan 19,20,21. Injektion i närheten av ventriklarna i den utvecklande mellanhjärnan rekapitulerar det mesta av mänsklig GBM-patofysiologi21, och samma föredragna mönster av GBM-invasion som hos människor och kärl co-option-observeras22. Tack vare fisklarvernas transparens möjliggör denna modell visualisering av GBM-celler som invaderar hjärnan från de peri-ventrikulära områdena där de flesta GBM tros uppstå23.

Eftersom MTs är avgörande för GBM-cellinvasion in vitro24,25, behövs en bättre karakterisering av MT-dynamiken och identifiering av viktiga regulatorer under cellinvasion. Hittills har dock de data som genererats med zebrafiskens ortotopiska modell inte inkluderat subcellulär analys av MT-dynamiken under invasionsprocessen. Detta dokument ger ett protokoll för att studera MT-dynamik in vivo och bestämma dess roll under hjärncancerinvasion. Efter stabil mikrotubulimärkning mikroinjiceras GBM-celler vid 3 dpf i zebrafisklarvernas hjärnor och avbildas i realtid med hög spatio-temporal upplösning under deras progression i hjärnvävnaden. Levande avbildning av fluorescerande MTs möjliggör kvalitativ och kvantitativ analys av MT plus-end-dynamik. Dessutom gör denna modell det möjligt att bedöma effekten av MTA på MT-dynamiken och på de invasiva egenskaperna hos GBM-celler i realtid. Detta relativt icke-invasiva protokoll i kombination med ett stort antal larver som hanteras åt gången och den enkla läkemedelsapplikationen (i fiskvattnet) gör modellen till en tillgång för preklinisk testning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurförsök utfördes enligt Europeiska unionens riktlinjer för hantering av försöksdjur. Alla protokoll godkändes av den etiska kommittén för djurförsök vid Institut Pasteur - CEEA 89 och det franska ministeriet för forskning och utbildning (tillstånd #01265.03). Under injektioner eller levande avbildningssessioner bedövades djur med Tricaine.At slutet av experimentprocedurerna, de avlivades genom överdosering av bedövningsmedel. Se materialförteckningen för detaljer relaterade till material, utrustning och programvara som används i detta protokoll. Protokollets allmänna arbetsflöde beskrivs i figur 1.

1. Generering av glioblastomceller som stabilt uttrycker α-tubulin-mKate2

OBS: Följande steg utförs i ett biosäkerhetsskåp BSL2+.

  1. Producera lentivirala partiklar som uttrycker mKate2-tubulin med kalciumfosfatmetoden för transfektion av 7 × 106 HEK-293T-celler.
    1. I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 10 μg 2:a generationens förpackningsplasmid psPAX2, 5 μg viral kuvertplasmid pMD2.G och 10 μg av plasmiden av intresse, pGK-mKate2-humant tubulin α1a med 50 μL CaCl2( 2,5 M lager). Justera till 500 μL med sterilt DNAse-frittH2O.
      OBS: Det är viktigt att lägga till CaCl2 sist.
    2. Blanda genom att invertera röret några gånger och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur (RT).
    3. Under inkubationen, förbered ytterligare ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med 500 μL HEPES-buffrad saltlösning (HBS), pH 7,0 (2x).
    4. Efter 20 min, tillsätt CaCl2/DNA-blandningen droppe för droppe i HBS (2x) lösningen. Blanda genom att invertera röret några gånger. Inkubera i 12 minuter vid RT.
    5. Efter 12 min, tillsätt försiktigt CaCl2/DNA blandat med HBS direkt på en 70% sammanflytande 10 cm skål med HEK-293T-celler, droppe för droppe.
    6. Lämna cellerna i den fuktade inkubatorn vid 37 °C med 5%CO2 i 36-48 timmar.
    7. Samla supernatanten och snurra ner den vid 3 000 × g i 5 minuter för att ta bort cellulärt skräp.
    8. För att koncentrera viruspartiklarna, ladda supernatanten i ett ultracentrifugrör och snurra ner den vid 47 508 × g i 90 minuter vid 4 °C.
    9. Kassera supernatanten och placera röret upp och ner på papper för att torka rörets insida.
    10. Tillsätt 30 μl PBS på viruspelleten. Återsuspendera inte pelleten. Låt stå vid 4 °C i 2 timmar.
    11. Återsuspendera försiktigt viruspartiklarna genom att pipettera upp och ner. Undvik att göra bubblor. Förvaras vid -80 °C.
      OBS: Större mängder viruspartiklar kan produceras genom att transfektera flera plattor av HEK-2-93T-celler.
  2. Infektera glioblastomceller med lentivirala partiklar.
    OBS: Detta protokoll är skrivet för kommersiella glioblastomcellinjer som U-87 MG, U-373 MG eller T98. För att använda primära patientderiverade glioblastomceller, använd specifik beläggning av plattorna och icke-serumbaserat medium26.
    1. Förbered en 70% sammanflytande 10 cm skål med U-87 MG glioblastomceller odlade i Eagles minsta essentiella medium (MEM) kompletterat med 10% fosterkalvserum, penicillin-streptomycin (100 enheter / ml slutlig koncentration för penicillin och 100 μg / ml för streptomycin) och icke-essentiella aminosyror (1x).
    2. Tillsätt viruspartiklarna vid en utspädning på 1 på 5 000 direkt på cellerna. Blanda med en mild virvel. Låt virusen infektera cellerna i högst 20 timmar.
    3. Ta bort det virusinnehållande mediet och ersätt det med färskt odlingsmedium. Tillåt uttrycket av det taggade tubulinet i 48-72 timmar.
      OBS: Följande steg ska utföras i ett biosäkerhetsskåp BSL2.
    4. FACS-sortera cellerna för att markera de ljusaste 15% av mKate2+ cellerna. Efter att ha tagit bort skräp och dubblettceller med hjälp av framåt- och sidospridningsgating (FCS vs SSC), applicera en annan grind på de ljusaste 30% mKate2 + -cellerna för att hålla de översta 15%.
    5. Förstärk de MT-märkta cellerna.
      OBS: Alternativt kan klonal selektion baserat på höga nivåer av tubulin-mKate2 utföras under ett epifluorescensmikroskop.

2. Förbered zebrafisklarver för mikroinjektion

  1. Generera zebrafiskägg.
    1. Placera tre män och fyra honor av önskad zebrafiskstam i en parningstank kompletterad med kulor 4 dagar före xenotransplantationen, sent på eftermiddagen.
      OBS: Tg (fli1a: gfp), Tg (gfap: gfp) eller Tg (Huc: gfp) linjer används för att markera endogena kärl, neurala stamceller / astrocyter respektive neuroner.
    2. Samla äggen som produceras genom marmorinducerad gytning morgonen efter.
    3. Rengör äggen genom att överföra dem till ett 50 ml centrifugrör fyllt med mineralkällvatten27 kompletterat med blekmedel (0,004% slutligt). Vänd försiktigt röret i 5 minuter. Tvätta endast två gånger med mineralvatten.
    4. Överför äggen till en petriskål som innehåller mineralvattnet kompletterat med 0,28 mg/ml metylenblått.
    5. Ta bort de obefruktade och utvecklingsarresterade äggen. Inkubera embryona vid 28 °C.
  2. Skapa transparenta larver.
    1. Introducera N-fenyltiourea (PTU) (0,003% slutlig) till mediet 8 h senare, för att förhindra melaninpigmentering och säkerställa optisk transparens. Förvara PTU i mediet under resten av protokollet.
      OBS: Eftersom PTU-behandling kan orsaka utvecklingsdefekter, välj endast de normalt utvecklade larverna för xenotransplantation. Som ett alternativ till kemisk behandling kan man använda mutant zebrafiskstam casper (nacre och roy orbison dubbelmutant), där pigmentering saknas28.
    2. Höj inkubationstemperaturen till 29 °C.
    3. Höj temperaturen varje dag med 1 °C så att larverna på 3 dpf når 32 °C på injektionsdagen.
  3. Förbered mikroinjektionsplattan.
    1. Bered 20 ml 1% agaros + 0,28 mg/ml metylenblått med mineralvatten.
    2. Häll agarosen i en 10 cm petriskål och applicera snabbt mikroinjektionsplastformen upp och ner för att skapa 2,5 mm breda V-formade diken (figur 2B).
      OBS: Plastformen är tillgänglig kommersiellt eller kan byggas internt efter den design som beskrivs i Zebrafish Book29.
    3. Ta försiktigt bort plastformen när agarosen har stelnat.
      OBS: Mikroinjektionsgjutna plattor kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 månader.
  4. Förbered larverna för xenotransplantation.
    1. På injektionsdagen, screena för utvalt fluorescerande transgenuttryck i 3 dpf larverna. Ta bort de icke-fluorescerande, onormala djuren.
    2. Dekorionera larverna manuellt med finspetsade urmakartångar. Vid 3 dpf, peta försiktigt eller riv upp korionerna med två par finspetsade tångar för att frigöra larverna från korionen.
      OBS: Alternativt kan enzymatisk behandling med pronas A användas för att dekorionera larver, vanligtvis vid 24 hpf.
    3. Behåll de dekorionerade larverna i mineralvattenmedium med metylenblått (0,28 mg / ml) och PTU (0,003% slutligt).

3. Xenotransplantation förfarande

  1. Förbered mikroinjektionsnålar.
    1. Ta en borosilikatglaskapillär utan en central glödtråd och placera den i en vertikal nåldragare.
    2. Använd följande inställningar-öka 8,5 och värmare 3-sträck kapillären för att förvandla den till en mikroinjektionsnål.
  2. Ställ in mikroinjektorn.
    1. Ladda mineralolja i en manuell mikroinjektor. Ta bort luftbubblor.
    2. Anslut en universell kapillärhållare till mikroinjektorn och fäst den ordentligt på en mekanisk mikromanipulator (figur 2A).
  3. Skörda glioblastomcellerna.
    OBS: Följande steg utförs i ett biosäkerhetsskåp BSL2.
    1. Förbered en 10 cm platta med glioblastomceller så att de når 80% sammanflöde på transplantationsdagen.
    2. (Valfritt) Märk cellkärnorna tillfälligt genom att tillsätta Hoechst 35480 (200 ng/ml) till cellerna. Inkubera i 20 min vid 37 °C i den fuktade cellinkubatorn och tvätta 2x med PBS.
    3. Ta cellplattan ur inkubatorn och tvätta en gång med PBS. Lossa cellerna genom att tillsätta 1 ml 0,05% trypsin-EDTA och inkubera i 5-10 min vid 37 °C i cellinkubatorn tills alla celler är helt lossnade.
      OBS: Detta steg är kritiskt eftersom dålig trypsinisering kommer att resultera i att cellaggregat fastnar i nålen.
    4. Återsuspendera cellerna i 5 ml fullständigt glioblastomcellmedium i ett 50 ml centrifugrör. Tillsätt 45 ml iskall PBS och centrifugera vid 134 × g i 5 minuter.
    5. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna med 1 ml iskall PBS genom att pipettera upp och ner ordentligt.
      OBS: Detta steg av mekanisk dissociation hjälper till att förhindra risken för igensättning i kapillären under mikroinjektion.
    6. Tillsätt 49 ml iskall PBS och centrifugera vid 134 × g i 5 minuter. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 μL iskall PBS. Förvara på is under transplantationsproceduren.
  4. Mikroinjicera glioblastomcellerna i zebrafisklarverna i mellanhjärnan.
    1. Fyll en mikroinjektionsgjuten platta med 6 ml E3-medium30 kompletterat med 160 mg / L trikain.
    2. Överför ett dussin dekorionerade larver till mikroinjektionsplattan. När de inte svarar på beröring, rikta in dem i skyttegravarna på deras sida, huvudet uppåt och äggula sac skjuts mot väggen i diket, med en storlek 00 pensel (figur 2B, C).
    3. Återsuspendera glioblastomcellerna. Ladda 5 μL celler i mikrokapillären med hjälp av mikrolastningsspetsar och sätt in kapillären i den universella kapillärhållaren.
    4. Placera mikroinjektionsplattan som innehåller de svarslösa larverna under stereomikroskopet. Placera mikrokapillärens spets på gränsen till mikroinjektionsplattan med hjälp av mikromanipulatorknapparna. Bryt den med en skalpell för att skapa en skarp ingångspunkt, ungefär storleken på en cells diameter.
    5. Kontrollera att cellerna strömmar ut ur kapillären genom att försiktigt köra olja i mikroinjektorn och kasta nålspetsen i mediet. Koncentrera cellerna vid kapillärspetsen för att maximera antalet celler som injiceras per utstött volym och undvik att fylla hjärnvävnaden med PBS (figur 2C).
    6. Undersök noggrant cellerna som kommer ut ur mikrokapillären när olja införs manuellt i injektorn. Definiera empiriskt hur mycket varv som behövs på den manuella ratten för att leverera 20 till 50 celler. Vanligtvis, om cellerna är tillräckligt koncentrerade, räcker det med en mild sväng för att mata ut ~ 10 celler.
      OBS: Om vätska inte rinner ordentligt ut ur mikrokapillären, försök att lossa fästet av mikrokapillären i kapillärhållaren. Genom att göra det kan olja läcka och droppa ner längs kapillären.
    7. Närma dig kapillärspetsen mot vänster optisk tectum (OT), strax ovanför den mellersta cerebrala venen (MCeV, figur 2F).
    8. Tryck försiktigt kapillären mot larverna tills hudmembranet går sönder (figur 2D,E).
      OBS: Tryck inte för hårt eftersom det kommer att resultera i att cellerna injiceras för djupt i hjärnan där den lägre optiska klarheten förhindrar att man observerar MTs i detalj. Bildtekniken är möjlig för ett djup som når 250-300 μm. Det rekommenderas dock att inte injicera djupare än 100 μm från fiskytan.
    9. När en lämplig position i OT har uppnåtts, mata ut cellerna. Observera noggrant kapillärens spets för att visualisera strömmen av celler som går in i djuret och därigenom säkerställa framgångsrik injektion.
      OBS: Var försiktig så att du inte injicerar i ventriklarna (figur 2E). En gång i ventriklarna tenderar cellerna att ackumuleras och fastna istället för att infiltrera vävnaden (figur 2I). Ventricle injektion kännetecknas av intensiv svullnad i hjärnan och observerbar spridning av injicerade celler till framhjärnan och bakhjärnan (Figur 2J).
    10. Upprepa proceduren från steg 3.4.9-3.4.11 för så många djur som krävs. Fortsätt snabbt för att förhindra klumpning av celler i kapillären.
      OBS: Beroende på hur snabb experimenteraren är på att injicera kan ett nålbyte behövas var 10: e till 20: e larver.
    11. När xenotransplantationen är klar, ta bort larverna från mikroinjektionsplattan och peka ut dem i en 24-brunnsplatta fylld med mineralkällvatten + PTU + metylenblått medium.
    12. Validera framgångsrik injektion genom att observera larverna under ett fluorescerande stereomikroskop (figur 2G). Välj endast xenografter som innehåller en enda tumörmassa bildad av 20-50 celler belägna i de översta 200 μm (i z) av OT (figur 2H vs misslyckad injektion i figur 2I-K).
      OBS: Utbytet av framgångsrikt lokaliserade xenografter varierar från 10% i början till nästan 100% med övning.
    13. Låt larverna återhämta sig i minst 4 timmar vid 32 °C innan de avbildas.
      OBS: Att tillsätta antibiotika i mediet ökar inte larvernas överlevnad. I detta skede, om mikroinjektion har utförts korrekt, överlever nästan 100% av fisken.

4. Intravital avbildning av glioblastom xenografts

  1. Montera larverna för levande avbildning.
    OBS: Larver kan avbildas från 4 h efter injektion (hpi). Levande avbildning av MT utförs vanligtvis från 20 hpi, när invasiva GBM-celler har börjat förlänga utsprång och migrera bort från tumörmassan.
    1. Förbered en 1% lågsmältande agaroslösning. Överför 500 μl kokt 1% lågsmältande agaroslösning till ett 1,5 ml centrifugrör och låt det svalna vid 37 °C på ett värmeblock. Tillsätt tricaine (112 μg/ml) till agarosen och blanda väl.
    2. Överför en till fyra xenografterade larver i en 3,5 cm petriskål fylld med mineralkällvatten + PTU + metylenmedium kompletterat med tricain (112 μg/ml). När larverna inte svarar på beröring, överför dem försiktigt till röret som innehåller agarosen och tricaine med hjälp av en finspetsöverföringspipett.
      OBS: Håll volymen medium till ett minimum för att begränsa utspädningen av agarosen.
    3. Blanda försiktigt larverna med agarosen. Använd en normal (stor glödlampa) överföringspipett och placera larverna blandade i agarosen på mitten av en glasbottnad 3,5 cm videoavbildningsskål. Under ett stereomikroskop placerar du snabbt larverna på ryggen med hjälp av en mikroladdningsspets för att manipulera fisken.
      OBS: Eftersom ett inverterat konfokalmikroskop med snurrskivor används för intravital hjärnavbildning i detta protokoll, monteras larverna dorsalt. Justera larvernas positionering i enlighet därmed om du använder ett upprätt konfokalmikroskop.
    4. Ta bort extra agaros för att bibehålla det tunnaste möjliga agarosskiktet. När agarosen har stelnat, tillsätt 2,5 ml mineralkällvatten + PTU + 0,2x tricaine (bildmedium) och fortsätt till nästa steg.
  2. In vivo levande avbildning av MT-dynamik i invaderande glioblastomceller
    OBS: Den optiska kvaliteten på bilderna beror i hög grad på prestanda för mikroskopet som används. Protokollet är skrivet för ett inverterat konfokalmikroskop med snurrande skivor utrustat med en sCMOS-kamera (pixelstorlek 6,5 μm, 2048 x 2044 pixlar), mål för långt arbetsavstånd och temperaturkontrollerad miljökammare.
    1. Placera videoavbildningsskålen som innehåller de agarosinbäddade xenografterade larverna i miljökammaren i ett inverterat konfokalmikroskop, med temperaturen inställd på 32 °C. Hitta larverna i videoavbildningsskålen med ett 10x-mål med ett motoriserat XY-steg.
    2. Tryck på ESC för att sänka måltornet, tillsätt mineralolja på ett 60x oljemål (1,4 NA, arbetsavstånd: 0,13 mm) och tryck på ESC för att gå tillbaka till det ursprungliga fokusläget.
    3. Observera de invaderande glioblastomcellerna i den röda kanalen (561 nm laserkälla, 20% lasereffekt, tidsexponering: 200 ms) och välj en cell med ett utspritt MT-nätverk och lätt urskiljbara MT-filament (figur 3B).
    4. Ställ in z-seriens inställningar. Använd ett piezosteg på 200 μm och välj MT-nätverkets övre och nedre positioner: en 10-30 μm djup z-stack räcker för att visualisera mikrotubulinätverket i utsprånget av den migrerande cellen, med ett z-skivsteg på 0,3 μm.
    5. Ställ in inställningar för tidsfördröjningsförvärv för att möjliggöra en optimal balans mellan förvärvshastighet, z-stackdjup och fluorescerande signal för att undvika snabb fotoblekning. Skaffa bilder av MTs var 5-10: e s i flera minuter. Hämta och spara hyperstacken 5D (x,y,z,t,c).
      OBS: För att undvika drift i z under förvärvet, använd ett mikroskop utrustat med ett perfekt fokussystem som hårdvarufokusstabilisering.
  3. (Valfritt) Bestäm effekterna av de mikrotubuliförändrande medlen (MTA) på MTs.
    OBS: Följande steg tillåter testning av effekterna av MTA på ett MT-nätverk vid migrering av glioblastomceller i realtid.
    1. Ta försiktigt bort bildmediet från videobildskålen. Rör inte vid botten av skålen, eftersom xyz-positionen kommer att gå vilse.
    2. Bered nytt bildmedium som innehåller MTA i olika koncentrationer. Tillsätt försiktigt det MTA-innehållande mediet i videobildskålen droppe för droppe.
    3. Skaffa långtidsfilmer (2-16 timmar, en bild var 10-20 min) för att observera effekterna av varje koncentration av MTA på MT-nätverket och cellmigrering (figur 4A).
    4. (Valfritt) Tvätta ur MTA genom att försiktigt ta bort mediet och tillsätt 2,5 ml färskt bildmedium utan MTA. Upprepa tvättproceduren 3x för att rensa eventuella spår av MTA i mediet.
    5. (Valfritt) Skaffa en liknande långtidsfilm som i 4.3.3 (figur 4B).
      OBS: Ovanstående steg bestämmer den minimala koncentrationen som förändrar MT-nätverket utan att påverka larvernas överlevnad. Tvättstegen definierar om läkemedlets effekt är reversibel.
  4. Bedöm MTA-påverkan på glioblastominvasion genom sekventiell avbildning.
    1. Följ steg 4.1 till 4.2.1 4 h efter mikroinjektion.
      OBS: Denna del av protokollet kan också uppnås med andra fluorescerande märkta glioblastomcellinjer. Helst sammärka GBM med en cytosolisk tagg och en kärntagg för att säkerställa detektering av cellens globala morfologi.
    2. Byt till ett långt arbetsavstånd 40x vattenmål (NA: 1.15, WD: 0.6 mm).
    3. Ställ in z-seriens intervall för att hämta OT-regionen. Skaffa z-stacken med en högkänslig sCMOS-kamera (pixelstorlek 11 μm,1 200 x 1 200 pixlar, kvanteffektivitet 95%).
      OBS: Z-stacken börjar vanligtvis vid den mest dorsala delen av OT (nära ytan) och slutar tillräckligt djupt i hjärnan för att inkludera hela tumörcellmassan.
    4. Ta bort videobildskålen från mikroskopet. Frigör larverna från agarosen genom att använda en mikroladdningsspets och försiktigt peta agarosen runt djuret.
      OBS: Eftersom 3 dpf larver fortfarande är mycket ömtåliga, var försiktig när du tar bort dem från agarosen.
    5. När djuret har befriats från agarosen, överför det försiktigt till en enda brunn av en 24-brunnsplatta fylld med mineralkällvatten + metylenblått + PTU-medium. Markera brunnen för att identifiera larverna för efterföljande avbildning.
    6. Lägg till det MTA som är av intresse i mediet vid den koncentration som bestämts tidigare (steg 4.3.3). Uppdatera mediet kompletterat med läkemedlet varje dag. Upprepa bildbehandlingsproceduren från steg 4.4.1 till 4.4.5 varje dag i 3-4 dagar.

5. Bildanalys

  1. Analysera MT-dynamik med fritt tillgängliga FIJI-plugins.
    OBS: Många recensioner och protokoll beskriver metoderna för MT-dynamikanalys i celler31,32,33,34 och kan tillämpas i detta skede. Detta protokoll kommer kortfattat att hänvisa till två metoder för att mäta grundläggande MT-dynamiska egenskaper.
    1. Öppna 5D-hyperstacken och generera en 4D-stack där z-segmenten har projicerats i ett enda plan för att skapa en maximal intensitetsprojektion (MIP) i z (Image | Staplar | Z-projekt | Max intensitet) (figur 3B).
    2. Öppna 4D MIP-stacken och spåra manuellt slutet på en utsprångsbaserad MT med hjälp av den manuella spårningsfunktionen i FIJI (Plugins | Spåra | Manuell spårning). (Figur 3D). Extrahera parametrarna för MT-dynamik som tillväxthastighet, krympningshastighet, räddningsfrekvens och katastroffrekvens.
    3. Du kan också rita en segmenterad linje med 10 pixlar bred längs MT för att analysera (figur 3B). Använd funktionen Multi Kymograph (Analysera | Multi Kymograph) (figur 3C) i FIJI. Observera och mät MT-odlingsfaserna (G), pausernas längd (P) och frekvensen av MT-katastrofer.
  2. Analys av långvarig glioblastominvasion
    OBS: Denna analys kräver användning av 4D-visualisering och analys med bioimaging-programvara.
    1. Konvertera den råa 4D z-stacken från steg 4.4.3 (4 hpi) till lämpligt programvaruformat med hjälp av File Converter-programvaran.
    2. Öppna programvaran och importera den konverterade z-stack-filen i Surpass-vyn (bild 5A).
    3. För att segmentera tumörcellerna och kassera irrelevant autofluorescens i den röda kanalen, klicka på Lägg till nya ytor och följ 5-stegsprocessen.
      1. Validera standardinställningarna genom att klicka på nästa pil när fönstret dyker upp. Fortsätt till steg 2/5.
        OBS: Om den fluorescerande signalen förvärvas i 561-kanalen kan autofluorescens från kvarvarande pigmentering i ögat vara stark och ändra den automatiska segmenteringsprocessen. Detta är problematiskt om xenograften ligger nära ögat. I så fall måste segmenteringen slutföras manuellt genom att klippa och ta bort icke-glioblastomcellsignaler.
      2. Navigera till Källkanal | 561-kanal. Jämna ut bilden (Gaussiskt filter) genom att lägga till 1,50 μm i Surfaces Detail och genom att lägga till 2,5 μm för diametern på sfärerna i Substract background. Klicka på nästa pil och fortsätt till steg 3/5.
      3. Beroende på signalens intensitet justerar du manuellt tröskelvärdet (bakgrundssubstraktion) för att inkludera varje cellprocess. Fortsätt till steg 4/5.
      4. Filtrera den segmenterade signalen genom att ta bort de händelser som inte representerar en del av en cell (t.ex. skräp, autofluorescens). Klicka på Filtertyp | volym och justera tröskeln manuellt för att utesluta alla händelser under den minsta volymen som representerar en del av en cell. Fortsätt till steg 5/5.
        OBS: Om autofluorescenssignalerna är större i volym än den minsta celldelen, fortsätt ändå och ta bort de oönskade signalerna manuellt genom att vänsterklicka och ta bort dem.
      5. Ignorera klassificeringssteget och avsluta segmenteringsguiden genom att klicka på den dubbla gröna pilen för att slutföra skapandet av en ytvy av tumörcellerna (bild 5B).
    4. Om de segmenterade cellerna inte rör varandra och inte bildar ett unikt objekt, slå samman dem konstgjort för att skapa ett tumörcellmassobjekt. Klicka i korthet på Statistik | detaljerad | specifika värden | volym. Välj alla händelser genom att vänsterklicka på den översta och sedan hålla ned Skift och vänsterklicka på den sista. Navigera för att redigera | markering | enhetlig.
    5. Definiera centroiden i tumörcellmassan. Klicka på Lägg till nya platser | Hoppa över automatisk skapande | Lägg till (markören skär med) | Objektets mittpunkt. Håll skift och vänsterklicka för att skapa platsen, som är centroiden för den segmenterade tumörcellmassan.
    6. Mät 3D-avståndet mellan varje GBM-cell och tumörmassans centroid. Det gör du genom att skapa ett avstånd till centroidkanalen genom att stanna kvar i vyn Plats och välja verktygsikonen | Avståndstransformation. Vänta tills ett nytt avstånd till centroidkanalen skapas, tillsammans med 488 och 561-kanalen (i blått, figur 5C).
      OBS: Intensiteten hos varje voxel i denna kanal motsvarar 3D-avståndet mellan voxeln och centroiden i tumörcellmassan.
    7. Mät 3D-avståndet till centroiden för varje segmenterad cell genom att klicka på Lägg till nya fläckar | Hoppa över automatisk skapande | Lägg till (markören skär med) | specifik kanal 561. Håll skift och vänsterklicka på cellkärnområdet. Utför den här uppgiften för varje cell (bild 5D).
      OBS: Ta bort ytvyn för att bättre uppskatta cellernas fluorescenssignal. Alternativt, om det finns, använd kärnsignalen (405 nm eller 647 nm signal) för bättre noggrannhet.
    8. Klicka på Statistik | Detaljerad | Specifika värden | intensitet betyder Ch = avstånd till centroid.
      OBS: Värdet på intensiteten är 3D-avståndet i μm mellan cellkärnområdet och centroiden.
    9. Medelvärdet av dessa intensiteter för att beräkna tumörmassans radie vid 4 hpi. Upprepa proceduren för varje tidpunkt för analysen (24 hpi, 48 hpi och 72 hpi).
      OBS: Mät endast de 10 eller 20 mest spridda cellerna för att undvika underskattning av cellinvasion. Faktum är att den tvingade komprimeringen av cellerna under injektionen kan förhindra att celler i mitten av tumörmassan migrerar.
    10. Beräkna invasionsindexet (II) som förhållandet mellan de genomsnittliga 3D-avstånden vid t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi för de mest spridda cellerna över tumörmassans medelradie vid t = 4 hpi (figur 5E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att analysera den roll som MTs spelar under in vivo GBM-invasion beskriver vi här de viktigaste stegen för att utföra stabil MT-märkning i GBM-celler genom lentiviral infektion, ortotopisk xenotransplantation av GBM-celler i 3 dpf zebrafisklarver, högupplöst intravital avbildning av MT-dynamik, MTA-behandling och dess effekter på GBM-invasion och bildanalys av MT-dynamik och in vivo-invasion (Figur 1). MT-dynamiken mäts antingen genom att bygga kymografer längs växande och krympande MTs (figur 3C) eller genom att manuellt spåra enskilda MT-kanter över tid (figur 3D). Ett exempel på läkemedelsbehandling administrerad i larvmediet och dess reversibla effekt på MT-nätverksorganisation ges i figur 4. Behandling med en låg dos nocodazol (200 nM) leder till progressiv krympning av MT-nätverket och försvinnande av glioblastomcellsutsprång 4 h senare (figur 4A). Tvättning av läkemedlet återställde glioblastomcellernas kapacitet att bilda utsprång. Cellerna återupptog migreringen längs kärlen 12 timmar efter tvättningen (figur 4B). Dessa data tyder på att behandling med 200 nM nocodazol är tillräcklig för att störa MT-nätverket och snabbt blockerar in vivo glioblastomcellsinvasion. En 3 dagar lång analys av samma behandling vid global invasion av glioblastomceller avslöjar att nocodazol 200 nM stoppar långvarig invasion av glioblastomceller in vivo, utan att påverka fiskens allmänna hälsa, jämfört med en kontroll (figur 4C).

Figure 1
Bild 1: Diagram över protokollarbetsflöde. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; HPI = timmar efter injektion; MT = mikrotubuli; MTA = mikrotubuliförändrande medel; GBM = glioblastom multiforme. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Mikroinjicering av glioblastomceller i 3 dpf zebrafisklarver hjärnor. A) Fotografi av den utrustning som används för xenotransplantation: 1, oljemikroinjektor. 2, mekanisk mikromanipulator; 3, universell kapillärhållare; 4, glaskapillär. Mikroinjektionsplattan är under ett stereomikroskop. (B) Fotografi som visar bedövade 3 dfp zebrafisklarver inriktade i ett dike och redo att mikroinjiceras. Spetsen på en mikrokapillär laddad med ett rött färgämne syns till höger om fotografiet. Detaljer om de mönstrade skyttegravarna som byggts i agarosplattan ses i insatsen i det nedre högra hörnet. Skalstång = 3 mm. (C) Schema för en representativ mikroinjektionsplatta. Färdiga injicerade larver placeras i sidled (mitten av plattan). Observera att cellerna koncentreras vid mikrokapillärens spets (svart pil) innan du fortsätter till injektionen. Injicerade larver visas till höger om plattan, placerade ventralt. D) Schema för en tvärgående skiva i mikroinjektionsplattan (längs den svarta prickade linjen i C) som visar skyttegravarna där larverna placeras under injektionen. (E) Fotografi som visar kapillärens spets redo att tränga in i optiktectum (prickad linje). Ventriklarna avgränsas av de vita linjerna. Skalstreck = 150 μm. (F) Schema för en 3 dpf fli1a: gfp larv som uttrycker gfp i endotelcellerna, vilket indikerar OT-regionen där cellerna injiceras, strax ovanför den mellersta cerebrala venen. (G) Fluorescensbild av en 3 dpf gfap:gfp-larv (gfp uttryckt i neurala stamceller) placerad i sidled efter mikroinjektion av U87-mkate2-celler (vit cirkel och vit pil). Hög autofluorescens i rött orsakas av iridoforerna i ögonen. Skalstreck = 100 μm. (H) Konfokal fluorescensbild av en framgångsrikt injicerad fli1a:gfp-larv vid 16 hpi. Skalstreck: 50 μm. (I-K) Konfokala fluorescensbilder av misslyckat injicerade fli1a:gfp-larver vid 96 hpi (I) och 4 hpi (J,K). GBM-celler har injicerats i ventriklar (I,J) eller i flera foci i hjärnan (K). Skalstänger = 50 μm. Förkortningar: dpf = dagar efter befruktning; OT = optiskt tectum; MCeV = mellersta cerebrala venen; GFP = grönt fluorescerande protein; gfap = glialfibrillärt surt protein; HPI = timmar efter injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Visualisering in vivo mikrotubulidynamik i glioblastomceller. (A) Representativ fluorescensbild av xenograferade U87-celler som uttrycker tubulin-α1-mkate2 i OT hos en fli1a:GFP zebrafisklarv vid 20 hpi. (B) Maximal intensitetsprojicerad fluorescensbild av MT-nätet i en enda xenograferad U87-cell. (C) Kymograf längs den röda prickade linjen i B, som visar tillväxt-, paus- och katastroffaserna för MT-dynamisk instabilitet. (D) Tidsfördröjningssekvens för det boxade området i B som markerar spårningen av tre MT + -ändar. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: OT = optiskt tectum; GFP = grönt fluorescerande protein; HPI = timmar efter injektion; MT = mikrotubuli; G = växande fas; P = pausfas; C = katastroffas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Visualisera effekterna av mikrotubuliförändrande medel på glioblastominvasion in vivo. (A) Time-lapse-sekvens av U87-celler som uttrycker tubulin-α1a-mkate2 hos zebrafisklarver behandlade med nokadazol (200 nM). Pilar pekar på extremiteten av utsprånget i två olika celler som invaderar hjärnan längs ett blodkärl. Observera att utsprånget dras tillbaka vid behandling med nocodazol. Skalstreck = 10 μm. (B) Time-lapse-sekvens som representerar effekten av nocodazol-tvättning på U87-cellinvasion. Vid 500 minuter efter tvättningen förlänger cellen markerad med den vita asterisken ett MT-baserat utsprång (vit pil), vilket gör det möjligt att återuppta invasionen längs ett blodkärl. Skalstreck = 20 μm. (C) 3D-representationer av en xenografterad larvhjärna behandlad med DMSO eller nocodazol (200 nM) i 72 timmar. U87-cellsignalen har segmenterats (i rött) och integrerats med fli1a-GFP-fluorescenssignalen (i vitt). Observera den minskade spridningen av U87-celler behandlade med nocodazol. Skalstreck = 30 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; HPI = timmar efter injektion; MT = mikrotubuli. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Bildanalys av in vivo glioblastominvasion. (A) Fluorescerande bilder av xenograferade U87-celler som uttrycker cytosolisk mKate2 i fli1a-GFP zebrafisklarver, 4 hpi. Vita asterisker understryker typisk autofluorescens från ögoniridoforer. Skalstreck = 40 μm. (B) Fluorescerande bild av fli1a-GFP-larver i kombination med den segmenterade ytan som motsvarar U87-cellsignalen i A. Tumörmassans centroid verkar grön. Skalstreck = 40 μm. (C) Fluorescerande bild som representerar den röda kanalsignalen i A och den nyligen definierade "avståndet till centroid" -kanalen (i blått). Skalstreck = 30 μm. (D) Röd kanalfluorescensbild överlagrad med färgade fläckar, vars färg representerar cellens avstånd till centroiden (i grönt), violett är närmast centroiden och vit är längst ifrån varandra. Skalstreck = 20 μm. (E) Ett exempel på sekventiell analys av global GBM-invasion. 3D-avstånd bestäms vid 4 hpi och 72 hpi, och invasionsindexet (II) beräknas enligt formeln i inkorgen. Skalstreck = 20 μm. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; HPI = timmar efter injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avbildning av tumörxenografter vid encellsupplösning kommer sannolikt att bli ett oumbärligt verktyg för att förbättra vår förståelse av GBM-biologi. Live imaging i mus PDX-modeller har lett till värdefulla upptäckter om hur GBM kollektivt invaderar hjärnvävnaden18. Men hittills är den spatiotemporala upplösningen inte tillräckligt hög för att avslöja dynamiken hos proteiner som kontrollerar GBM-invasion. Vi resonerade att genom att koppla den ortotopiska engraferingen av GBM-celler i transparenta zebrafisklarver med högupplöst intravital avbildning, kunde cytoskelettproteiner som MTs analyseras tillräckligt detaljerat för att analysera deras dynamik under in situ GBM-invasion.

De kritiska stegen i metoden ligger i beredningen av GBM-cellerna och mikroinjektionsförfarandet. Ohälsosamma och otillräckligt dissocierade celler kommer att hålla sig ihop eller till kapillärgränserna och blockera injektionsflödet. Dessutom måste cellerna vara tillräckligt koncentrerade i kapillären för att minimera den injicerade volymen och implantera dem i bulk. Att injicera en högre volym av mer utspädda celler kommer att resultera i flera, ibland blandade tumörfoci, vars invasiva index blir svåra att mäta. I våra händer möjliggör manuell hantering av den oljebaserade mikroinjektorn bättre kontroll av injektionsflödet än en trycksatt luftbaserad elektronisk mikroinjektor som tidigare har använts i en liknande modell19. Detta är avgörande för att förhindra överskott av flödestryck inuti hjärnan och därigenom undvika efterföljande vävnadsskada och ventrikulär aggregering av de injicerade cellerna.

Några begränsningar av denna modell inkluderar nödvändigheten av att utföra experimentet vid suboptimala temperaturer för båda arterna. Zebrafiskar föds vanligtvis upp vid 28 °C, medan mänskliga celler odlas vid 37 °C. Över 32 °C förändras zebrafiskembryons utveckling och dessa förändringar kan vara dödliga35. I likhet med vad som görs i vuxna zebrafisk xenograftmodeller 36, ökar dock sekventiellt acklimatisering av zebrafisklarverna till en temperatur på 32 °C överlevnaden hos transplanterade djur jämfört med den snabba temperaturförändringen efter transplantation från 28 °C till32 °C. Att höja temperaturen leder dock ytterligare till ökad djurdöd i enlighet med zebrafiskembryonas känslighet för temperaturer över 32 °C35.

Tolkning av in vivo MT-dynamikdata måste göras noggrant eftersom MT-dynamiken förändras när temperaturen sjunker under 37 °C37. Parallell in vitro-mätning av MT-dynamik vid 37 °C och 32 °C i samma GBM-celler med samma MTA-behandling hjälper till att validera skillnaderna mellan olika GBM-celler eller mellan in vivo-behandlingar . Det bör hjälpa till att bekräfta att skillnaderna inte orsakas av variation i temperaturkänslighet utan av olika regleringsvägar (för GBM-jämförelseanalys) eller av MTA-behandling (för MTA-effektanalys). Detta kommer att vara av intresse om MT-dynamikens heterogeniteter kopplas till olika invasionsförmågor.

En annan begränsning är det korta tidsfönstret under vilket invasion kan övervakas (72 till 96 timmar), vilket förhindrar mätning av invasionens plasticitet som drivs av potentiella förändringar i MT-dynamik38. Efter 96 h märkte vi en kraftig minskning av GBM-cellinvasionen. Vid 6 dagar efter injektionen minskade antalet GBM-celler snabbt, förmodligen på grund av ett värdimmunsvar orsakat av ackumulering av neutrofiler och makrofager i tumörmikromiljön39. Att leverera MTA till hela hjärnan kommer sannolikt att påverka närliggande neuronala värdceller, som är beroende av MT för sin aktivitet och vars förändring senare kan påverka GBM-invasion40. Detta tillvägagångssätt måste kompletteras med shRNA- eller optogenetikanalyser som begränsar MT-förändring av GBM-cellerna, men är fortfarande en bra plattform för att screena för nya antiinvasiva föreningar.

Den ortotopiska injektionen av MT-märkta GBM-celler i zebrafiskhjärnan är av särskilt intresse för att dechiffrera MTs roll under cancercellsinvasion, eftersom mycket få djurmodeller tillåter in situ subcellulär avbildning av cancercellmigration i deras ursprungsvävnad15. Hittills är studier av MT-funktioner under GBM-migration främst beroende av in vitro- och ex vivo-analyser och saknar in vivo-validering 24,41,42,43. Tillsammans med gen-of-interest-knock down eller en opartisk genbaserad screeningmetod kommer analysen som presenteras här att hjälpa till att avslöja nya MT-regulatorer som är viktiga för GBM-invasion in vivo.

GBM är mycket heterogena tumörer vars invasiva egenskaper skiljer sig mycket mellan prover44. Att förstå de molekylära mekanismerna som ligger till grund för deras olika invasionssätt kommer att hjälpa till att definiera ad hoc-terapeutiska behandlingar för att blockera GBM-spridning. Systematisk mätning av invasivt index, invasionssätt och cytoskelettegenskaper såsom MT-dynamik i olika GBM-prover kommer att avslöja nya korrelationer mellan frekventa genomiska mutationsprofiler och cellinvasionsmönster som förlitar sig på specifika cytoskelettegenskaper. Att avslöja hur dessa mutationer påverkar förändringen i MT-dynamiken skulle inte bara öka vår kunskap om MT-reglering under cellmigration45,46 utan kan också leda till efterlängtade patientspecifika, antiinvasiva terapier.

Den relativa lättheten att mikroinjicera i zebrafisk i kombination med det stora antalet tillgängliga larver och enkel injektion av läkemedel gör denna procedur lämplig för personlig medicin47,48. Dessutom, i motsats till intravital avbildning av GBM-xenografter hos möss, sker det bara i den övre 500 μm-delen av cortex49,50, med hjälp av zebrafisk möjliggör visualisering av GBM-infiltration i hela CNS. Modellen som presenteras här uppfyller kriterierna för att bli ett ovärderligt verktyg för snabb analys av glioblastoms invasiva kapacitet och dess svar på behandlingar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi är oerhört tacksamma mot Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrike) och hans laboratorium, särskilt Valérie Briolat, och Emma Colucci-Guyon för att ha försett oss med zebrafisklinjerna och plastformen för mikroinjektionsplattor och för deras värdefulla expertis om zebrafiskexperimentella procedurer. Vi erkänner tacksamt UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, med stöd av den franska nationella forskningsbyrån France BioImaging, och ANR-10-INBS-04; Investeringar för framtiden). Detta arbete stöddes av Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique och Institut Pasteur och genom generösa donationer från fru Marguerite MICHEL och herr Porquet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Biologi Utgåva 185 Ortotopisk xenograft PDX Zebrafisk Danio rerio Glioblastom Subcellulär intravital avbildning 5D-bildanalys
Levande avbildning av mikrotubulidynamik i glioblastomceller som invaderar zebrafiskhjärnan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter