Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Levende billeddannelse af mikrotubulusdynamik i glioblastomceller, der invaderer zebrafiskhjernen

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

Vi rapporterer en teknik, der tillader levende billeddannelse af mikrotubulusdynamik i glioblastom (GBM) celler, der invaderer et hvirveldyrs hjernevæv. Kobling af den ortopiske injektion af fluorescerende mærkede GBM-celler til en gennemsigtig zebrafiskhjerne med intravital billeddannelse med høj opløsning muliggør måling af cytoskeletdynamik under in situ kræftinvasion.

Abstract

Med en dyster median overlevelsestid i reelle populationer - mellem 6 og 15 måneder - er glioblastom (GBM) den mest ødelæggende maligne hjernetumor. Behandlingssvigt skyldes hovedsageligt invasiviteten af GBM-celler, hvilket taler for behovet for en bedre forståelse af GBM-bevægelige egenskaber. For at undersøge den molekylære mekanisme, der understøtter GBM-invasion, kræves nye fysiologiske modeller, der muliggør dybdegående karakterisering af proteindynamikken under invasion. Disse observationer ville bane vejen for opdagelsen af nye mål for at blokere tumorinfiltration og forbedre patientresultaterne. Dette papir rapporterer, hvordan en ortotopisk xenograft af GBM-celler i zebrafiskhjernen tillader subcellulær intravital levende billeddannelse. Med fokus på mikrotubuli (MT'er) beskriver vi en procedure for MT-mærkning i GBM-celler, mikroinjektion af GBM-celler i den gennemsigtige hjerne 3 dage efter befrugtning (dpf) zebrafisklarver, intravital billeddannelse af MT'er i de formidlende xenografts, ændring af MT-dynamik for at vurdere deres rolle under GBM-invasion og analyse af de erhvervede data.

Introduction

Cellemotilitet er en stereotyp proces, der kræver polaritetsakse etablering og kraftgenererende cytoskeletale omlejringer. Actinpolymerisation og dets tilknytning til myosin anerkendes som de vigtigste bidragydere til påtrængende og kontraktile kræfter, der kræves til cellebevægelse1. Mikrotubuli anses for at være hovedaktørerne i cellepolarisering og retningsbestemt vedholdenhed under migration2. I de senere år har MT'er også vist sig at skabe og stabilisere fremspring for at understøtte mekanokompressive kræfter under celleinvasion i 3D3. For nylig har MT'er været direkte involveret i mekanotransduktion ved fokale adhæsioner og mekanosensitiv migration4. Den dynamiske ustabilitet, der karakteriserer MT-plus-slutdynamikken, er lavet af gentagne faser af polymerisation (vækst) og depolymerisering (krympning), som styres af en overflod af mikrotubulibindende proteiner og intracellulære signalkaskader, såsom dem, der styres af RHO-GTPases 5,6,7. MT-netværkets rolle i cellemigration og invasion har gjort undersøgelsen af MT-dynamik til et nøgleelement for bedre at forstå mekanismerne for immuncellehoming, sårheling og kræftinvasion.

Kræftcellernes evne til at undslippe den primære tumorkerne, sprede sig i vævene og generere sekundære tumorer er et kritisk skridt i at forhindre global succes i krigen mod kræft erklæret for 50 år siden 8,9. En af de største forhindringer har været at forstå, hvordan kræftceller aktivt invaderer vævet. Nøgleinvasionsmekanismer er afhængige af de samme principper som dem, der styrer ikke-tumorcellemigration10. Imidlertid er der opstået specificiteter ved kræftcellemigration11, hvilket udløser behovet for bedre karakterisering af denne type migration. Specifikt, fordi tumormikromiljøet fremstår som en nøglespiller i kræftprogression12, er observation og analyse af kræftcelleinvasion i en relevant fysiologisk sammenhæng afgørende for at optrævle mekanismerne for kræftcelleformidling.

MT'er er centrale for kræftprogression for at opretholde både spredning og invasion. Præcis analyse af MT-dynamikken in situ kan hjælpe med at identificere MTA-ændrende midler (MTA) i begge processer. MT-dynamikken varierer drastisk ved en ændring i miljøet. In vitro forhindrer behandling med MT-destabiliserende midler såsom nocodazol cellefremspringsdannelse, når celler er indlejret i geler i 3D, mens det har ringe effekt på 2D-cellemigration13,14. Selvom det er teknisk udfordrende, tillader fremskridt inden for intravital billeddannelse in vivo-analyse af MT-dynamik under kræftcelleinvasion. For eksempel afslørede observationen af MT'er i subkutant xenograferede fibrosarkomceller hos mus, at tumorassocierede makrofager påvirker MT-dynamikken i tumorceller15. Disse musemodeller involverer imidlertid omfattende kirurgiske procedurer og forbliver utilfredsstillende for mindre tilgængelige kræftformer, såsom den meget invasive hjernetumor, GBM.

På trods af en dyster 15 måneders gennemsnitlig overlevelsestid16, er der lidt kendt om GBM's formidlingsmåde inden for hjernens parenchyma eller de vigtigste molekylære elementer, der opretholder GBM-celleinvasion i hjernevævet. Forbedring af musens ortopiske xenograft (PDX) -model og etablering af kranialvinduer gav nye udsigter til GBM-celleinvasionsundersøgelser17,18. På grund af suboptimal billeddannelseskvalitet har denne model imidlertid for det meste tilladt langsgående billeddannelse af overfladiske xenotransplantater og er ikke blevet brugt med succes til at studere subcellulær billeddannelse af cytoskeletproteiner hidtil. I kølvandet på "3R"-påbuddet om at reducere brugen af gnavere og erstatte dem med lavere hvirveldyr er der desuden etableret alternative modeller.

Ved at udnytte den primitive immunitet, der blev observeret i zebrafisk (Danio rerio) larver, blev ortopisk injektion af GBM-celler i fiskehjernen udviklet 19,20,21. Injektion i nærheden af ventriklerne i den udviklende mellemhjerne rekapitulerer det meste af human GBM-patofysiologi21, og det samme foretrukne mønster af GBM-invasion som hos mennesker-kar-co-option-observeres22. Takket være gennemsigtigheden af fiskelarverne tillader denne model visualisering af GBM-celler, der invaderer hjernen fra de peri-ventrikulære områder, hvor de fleste GBM'er menes at opstå23.

Fordi MT'er er afgørende for GBM-celleinvasion in vitro24,25, er der behov for en bedre karakterisering af MT-dynamik og identifikation af nøgleregulatorer under celleinvasion. Til dato har de data, der genereres med zebrafiskens ortopiske model, imidlertid ikke inkluderet subcellulær analyse af MT-dynamik under invasionsprocessen. Dette papir giver en protokol til at studere MT-dynamik in vivo og bestemme dens rolle under hjernekræft invasion. Efter stabil mikrotubulimærkning mikroinjiceres GBM-celler ved 3 dpf i zebrafisklarvers hjerner og afbildes i realtid ved høj spatio-temporal opløsning under deres progression i hjernevævet. Live billeddannelse af fluorescerende MT'er muliggør kvalitativ og kvantitativ analyse af MT plus-end dynamik. Desuden gør denne model det muligt at vurdere effekten af MTA'er på MT-dynamik og på GBM-cellernes invasive egenskaber i realtid. Denne relativt ikke-invasive protokol kombineret med et stort antal larver, der håndteres ad gangen, og den lette anvendelse af lægemidler (i fiskevandet) gør modellen til et aktiv til præklinisk test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøg blev udført i henhold til EU's retningslinjer for håndtering af forsøgsdyr. Alle protokoller blev godkendt af den etiske komité for dyreforsøg ved Institut Pasteur - CEEA 89 og det franske ministerium for forskning og uddannelse (tilladelse #01265.03). Under injektioner eller levende billeddannelsessessioner blev dyr bedøvet med Tricaine.At slutningen af de eksperimentelle procedurer, de blev aflivet ved bedøvelsesoverdosis. Se materialeoversigten for detaljer relateret til materialer, udstyr og software, der bruges i denne protokol. Protokollens generelle arbejdsgang er beskrevet i figur 1.

1. Generering af glioblastomceller, der stabilt udtrykker α-tubulin-mKate2

BEMÆRK: Følgende trin udføres i et biosikkerhedsskab BSL2+.

  1. Fremstil lentivirale partikler, der udtrykker mKate2-tubulin ved anvendelse af calciumphosphatmetoden til transfektion af 7 × 106 HEK-293T-celler.
    1. I et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 10 μg 2. generations emballageplasmid psPAX2, 5 μg viral kuvertplasmid pMD2.G og 10 μg af plasmidet af interesse, pGK-mKate2-humant tubulin α1a med 50 μL CaCl 2 (2,5 M lager). Der justeres til 500 μL med steril DNAse-friH2O.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at tilføje CaCl2 sidst.
    2. Bland ved at vende røret et par gange og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur (RT).
    3. Under inkubationen fremstilles et andet 1,5 ml mikrocentrifugerør med 500 μL HEPES-bufret saltvand (HBS), pH 7,0 (2x).
    4. Efter 20 minutter tilsættes CaCl2/DNA-blandingen dråbe for dråbe i HBS (2x)-opløsningen. Bland ved at vende røret et par gange. Inkuberes i 12 minutter ved RT.
    5. Efter 12 minutter tilsættes forsigtigt CaCl2/DNA blandet med HBS direkte på en 70% sammenflydende 10 cm skål med HEK-293T-celler, dråbe for dråbe.
    6. Cellerne efterlades i den befugtede inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 36-48 timer.
    7. Saml supernatanten og drej den ned ved 3.000 × g i 5 minutter for at fjerne celleaffald.
    8. For at koncentrere de virale partikler indlæses supernatanten i et ultracentrifugerør og drejes ned ved 47.508 × g i 90 minutter ved 4 °C.
    9. Kassér supernatanten, og læg røret på hovedet på papir for at tørre indersiden af røret.
    10. Tilsæt 30 μL PBS på den virale pellet. Pelleten må ikke suspenderes. Lad stå ved 4 °C i 2 timer.
    11. Resuspender forsigtigt viruspartiklerne ved at pipettere op og ned. Undgå at lave bobler. Opbevares ved -80 °C.
      BEMÆRK: Større mængder virale partikler kan produceres ved at transficere flere plader af HEK-2-93T-celler.
  2. Inficere glioblastomceller med lentivirale partikler.
    BEMÆRK: Denne protokol er skrevet til kommercielle glioblastomcellelinjer som U-87 MG, U-373 MG eller T98. For at anvende primære patientafledte glioblastomceller skal du bruge specifik belægning af pladerne og det ikke-serumbaserede medium26.
    1. Forbered en 70% sammenflydende 10 cm skål med U-87 MG glioblastomceller dyrket i Eagles mindste essentielle medium (MEM) suppleret med 10% føtalt kalveserum, penicillin-streptomycin (100 enheder / ml slutkoncentration for penicillin og 100 μg / ml for streptomycin) og ikke-essentielle aminosyrer (1x).
    2. Tilsæt de virale partikler ved en 1 ud af 5.000 fortynding direkte på cellerne. Bland med en blid hvirvel. Lad viraerne inficere cellerne i højst 20 timer.
    3. Fjern det virusholdige medium og udskift det med frisk kulturmedium. Tillad udtrykket af den mærkede tubulin i 48-72 timer.
      BEMÆRK: Følgende trin skal udføres i et biosikkerhedsskab BSL2.
    4. FACS-sorter cellerne for at vælge de lyseste 15% af mKate2+ celler. Når du har fjernet snavs og dubletceller ved hjælp af fremad- og sidespredningen (FCS vs SSC), skal du anvende en anden gating på de lyseste 30% mKate2+ celler for at holde de øverste 15%.
    5. Forstærk de MT-mærkede celler.
      BEMÆRK: Alternativt kan klonal udvælgelse baseret på høje niveauer af tubulin-mKate2 udføres under et epifluorescensmikroskop.

2. Forbered zebrafisklarver til mikroinjektion

  1. Generer zebrafiskæg.
    1. Placer tre hanner og fire hunner af den ønskede zebrafiskestamme i et parringstank suppleret med kugler 4 dage før xenotransplantationen, sidst på eftermiddagen.
      BEMÆRK: Tg (fli1a: gfp), Tg (gfap: gfp) eller Tg (Huc: gfp) linjer bruges til at markere henholdsvis endogene kar, neurale stamceller / astrocytter og neuroner.
    2. Saml de æg, der produceres ved marmorinduceret gydning morgenen efter.
    3. Rengør æggene ved at overføre dem til et 50 ml centrifugerør fyldt med mineralkildevand27 suppleret med blegemiddel (0,004% endelig). Vend forsigtigt røret i 5 min. Vask kun to gange med mineralvand.
    4. Æggene overføres til en petriskål indeholdende mineralvandet suppleret med 0,28 mg/ml methylenblåt.
    5. Fjern de ubefrugtede og udviklingshæmmede æg. Embryonerne inkuberes ved 28 °C.
  2. Opret gennemsigtige larver.
    1. Indfør N-phenylthiourea (PTU) (0,003% endelig) til mediet 8 timer senere for at forhindre melaninpigmentering og sikre optisk gennemsigtighed. Hold PTU i mediet i resten af protokollen.
      BEMÆRK: Da PTU-behandling kan forårsage udviklingsfejl, skal du kun vælge de normalt udviklede larver til xenotransplantation. Som alternativ til kemisk behandling kan man bruge den mutante zebrafiskstamme casper (nacre og roy orbison dobbelt mutant), hvor pigmentering er fraværende28.
    2. Inkubationstemperaturen hæves til 29 °C.
    3. Temperaturen øges hver dag med 1 °C, så larverne på 3 dpf når op på 32 °C på injektionsdagen.
  3. Forbered mikroinjektionspladen.
    1. Der fremstilles 20 ml 1% agarose + 0,28 mg/ml methylenblåt med mineralvand.
    2. Hæld agarosen i en 10 cm petriskål og påfør hurtigt mikroinjektionsplastformen på hovedet for at skabe 2,5 mm brede V-formede grøfter (figur 2B).
      BEMÆRK: Plastformen er tilgængelig kommercielt eller kan bygges internt efter det design, der er beskrevet i Zebrafish Book29.
    3. Fjern forsigtigt plastformen, når agarosen er størknet.
      BEMÆRK: Mikroinjektionsstøbte plader kan opbevares ved 4 °C i op til 2 måneder.
  4. Forbered larverne til xenotransplantation.
    1. På injektionsdagen screenes for udvalgte fluorescerende transgenekspression i 3 dpf larverne. Fjern de ikke-fluorescerende, unormalt udseende dyr.
    2. Dechorioner larverne manuelt med fintippede urmagertang. Ved 3 dpf skal du forsigtigt stikke eller rive korionerne op med to par finspidsede tang for at frigøre larverne fra chorionen.
      BEMÆRK: Alternativt kan enzymatisk behandling med pronase A bruges til at dechorionere larver, normalt ved 24 hpf.
    3. Vedligehold de dekorionerede larver i mineralvandsmedium med methylenblåt (0,28 mg / ml) og PTU (0,003% endelig).

3. Xenotransplantation procedure

  1. Forbered mikroinjektionsnåle.
    1. Tag en borosilikatglaskapillær uden en central glødetråd og læg den i en lodret nåletrækker.
    2. Brug følgende indstillinger-øg 8,5 og varmelegeme 3-stræk kapillæren for at gøre den til en mikroinjektionsnål.
  2. Indstil mikroinjektoren.
    1. Læg mineralolie i en manuel mikroinjektor. Fjern luftbobler.
    2. Sæt en universel kapillærholder i mikroinjektoren, og fastgør den fast til en mekanisk mikromanipulator (figur 2A).
  3. Høst glioblastomcellerne.
    BEMÆRK: Følgende trin udføres i et biosikkerhedsskab BSL2.
    1. Forbered en 10 cm plade af glioblastomceller, så de når 80% sammenløb på transplantationsdagen.
    2. (Valgfrit) Etiket forbigående cellekernerne ved at tilføje Hoechst 35480 (200 ng / ml) til cellerne. Der inkuberes i 20 minutter ved 37 °C i den befugtede celleinkubator, og der vaskes 2x med PBS.
    3. Tag pladen af celler ud af inkubatoren og vask en gang med PBS. Afmonter cellerne ved at tilsætte 1 ml 0,05% trypsin-EDTA og inkubere i 5-10 minutter ved 37 °C i celleinkubatoren, indtil alle cellerne er helt løsnet.
      BEMÆRK: Dette trin er kritisk, da dårlig trypsinisering vil resultere i, at celleaggregater forbliver fast i nålen.
    4. Resuspender cellerne i 5 ml komplet glioblastomcellemedium i et 50 ml centrifugerør. Tilsæt 45 ml iskold PBS og centrifuge ved 134 × g i 5 min.
    5. Kassér supernatanten og suspender cellerne med 1 ml iskold PBS ved at pipettere grundigt op og ned.
      BEMÆRK: Dette trin med mekanisk dissociation hjælper i høj grad med at forhindre risikoen for tilstopning i kapillæren under mikroinjektion.
    6. Tilsæt 49 ml iskold PBS og centrifuge ved 134 × g i 5 min. Supernatanten kasseres, og cellerne gensuspenderes i 200 μL iskold PBS. Opbevares på is i løbet af transplantationsproceduren.
  4. Mikroinsprøjter glioblastomcellerne ind i zebrafisklarverne i mellemhjernen.
    1. Fyld en mikroinjektionsstøbt plade med 6 ml E3-medium30 suppleret med 160 mg / L tricain.
    2. Overfør et dusin dechorionerede larver til mikroinjektionspladen. Når de ikke reagerer på berøring, skal du justere dem i skyttegravene på deres side, hovedet opad, og æggeblommesækken skubbet mod grøftens væg med en pensel i størrelse 00 (figur 2B, C).
    3. Resuspend glioblastomcellerne. Læg 5 μL celler i mikrokapillæren ved hjælp af mikrobelastningsspidser, og indsæt kapillæren i den universelle kapillærholder.
    4. Placer mikroinjektionspladen, der indeholder larverne, der ikke reagerer, under stereomikroskopet. Placer spidsen af mikrokapillæren på kanten af mikroinjektionspladen ved hjælp af mikromanipulatorknapperne. Bryd det med en skalpel for at skabe et skarpt indgangspunkt, omtrent på størrelse med diameteren af en celle.
    5. Kontroller, at celler strømmer ud af kapillæren ved forsigtigt at køre olie i mikroinjektoren og kaste spidsen af nålen ind i mediet. Koncentrer cellerne ved spidsen af kapillæren for at maksimere antallet af celler, der injiceres pr. Volumen, der udstødes, og undgå at fylde hjernevævet med PBS (figur 2C).
    6. Undersøg omhyggeligt cellerne, der kommer ud af mikrokapillæren, da olie manuelt indføres i injektoren. Definer empirisk, hvor meget drejning der er behov for på manuel knap for at levere 20 til 50 celler. Typisk, hvis celler er koncentreret nok, er en blid drejning nok til at skubbe ~ 10 celler ud.
      BEMÆRK: Hvis væske ikke strømmer korrekt ud af mikrokapillæren, skal du prøve at løsne fastgørelsen af mikrokapillæren i kapillærholderen. Ved at gøre det kan olie lække og dryppe ned langs kapillæren.
    7. Gå til spidsen af kapillæren mod venstre Optic Tectum (OT), lige over den midterste cerebrale vene (MCeV, figur 2F).
    8. Tryk forsigtigt kapillæren mod larverne, indtil hudmembranen går i stykker (figur 2D,E).
      BEMÆRK: Skub ikke for hårdt, da dette vil resultere i at injicere cellerne for dybt i hjernen, hvor den lavere optiske klarhed forhindrer observation af MT'er i detaljer. Billeddannelsesteknikken er mulig for en dybde, der når 250-300 μm. Det anbefales dog ikke at injicere dybere end 100 μm fra fiskeoverfladen.
    9. Når en passende position i OT er nået, skal du skubbe cellerne ud. Overhold omhyggeligt spidsen af kapillæren for at visualisere strømmen af celler, der går ind i dyret, og derved sikre en vellykket injektion.
      BEMÆRK: Pas på ikke at injicere i ventriklerne (figur 2E). En gang i ventriklerne har cellerne tendens til at akkumulere og sidde fast i stedet for at infiltrere vævet (figur 2I). Ventrikelinjektion er kendetegnet ved intens hævelse af hjernen og observerbar spredning af injicerede celler til forhjernen og baghjernen (figur 2J).
    10. Gentag proceduren fra trin 3.4.9-3.4.11 for så mange dyr som nødvendigt. Fortsæt hurtigt for at forhindre sammenklumpning af celler i kapillæren.
      BEMÆRK: Afhængigt af hvor hurtig eksperimentatoren er til at injicere, kan der være behov for et nåleskift hver 10. til 20. larve.
    11. Når xenotransplantationen er afsluttet, skal du fjerne larverne fra mikroinjektionspladen og udpege dem i en 24-brøndsplade fyldt med mineralkildevand + PTU + methylenblåt medium.
    12. Valider vellykket injektion ved at observere larverne under et fluorescerende stereomikroskop (figur 2G). Vælg kun xenotransplantater indeholdende en enkelt tumormasse dannet af 20-50 celler placeret i de øverste 200 μm (i z) af OT (figur 2H vs mislykket injektion i figur 2I-K).
      BEMÆRK: Udbyttet af vellykket lokaliserede xenografter varierer fra 10% i begyndelsen til næsten 100% med praksis.
    13. Lad larverne komme sig i mindst 4 timer ved 32 °C før billeddannelse.
      BEMÆRK: Tilsætning af antibiotika i mediet øger ikke larvernes overlevelsesrate. På dette stadium, hvis mikroinjektion er korrekt udført, overlever næsten 100% af fisken.

4. Intravital billeddannelse af glioblastom xenografts

  1. Monter larverne til levende billeddannelse.
    BEMÆRK: Larver kan afbildes fra 4 timer efter injektion (hpi). Levende billeddannelse af MT udføres normalt fra 20 hpi, når invasive GBM-celler er begyndt at forlænge fremspring og migrere væk fra tumormassen.
    1. Forbered en 1% lavsmeltende agaroseopløsning. Der overføres 500 μL kogt 1% lavsmeltende agaroseopløsning til et 1,5 ml centrifugerør, og det afkøles ved 37 °C på en varmeblok. Tilsæt tricain (112 μg/ml) til agarosen og bland godt.
    2. Overfør en til fire xenotransplanterede larver i en 3,5 cm petriskål fyldt med mineralsk kildevand + PTU + methylenmedium suppleret med tricain (112 μg / ml). Når larverne ikke reagerer på berøring, overføres de forsigtigt til røret, der indeholder agarosen og tricainen, ved hjælp af en finspidset overførselspipette.
      BEMÆRK: Hold volumenet af medium til et minimum for at begrænse fortynding af agarose.
    3. Bland forsigtigt larverne med agarose. Ved hjælp af en normal (stor pære) overførselspipette placeres larverne blandet i agarosen på midten af en glasbundet 3,5 cm videobilleddannelsesskål. Under et stereomikroskop skal du hurtigt placere larverne på ryggen ved hjælp af en mikrobelastningsspids for at manipulere fisken.
      BEMÆRK: Fordi et omvendt konfokalmikroskop med spindeskive bruges til intravital hjernebilleddannelse i denne protokol, monteres larverne dorsalt. Juster larvernes placering i overensstemmelse hermed, hvis du bruger et opretstående konfokalmikroskop.
    4. Fjern ekstra agarose for at opretholde det tyndest mulige agaroselag. Når agarosen er størknet, tilsættes 2,5 ml mineralkildevand + PTU + 0,2x tricain (billeddannende medium) og fortsæt til næste trin.
  2. In vivo levende billeddannelse af MT-dynamik i invaderende glioblastomceller
    BEMÆRK: Den optiske kvalitet af billederne afhænger i høj grad af udførelsen af det mikroskop, der bruges. Protokollen er skrevet til et omvendt konfokalt mikroskop med drejeskive udstyret med et sCMOS-kamera (pixelstørrelse 6,5 μm, 2048 x 2044 pixels), langdistancemål og temperaturstyret miljøkammer.
    1. Anbring videobilleddannelsesskålen indeholdende de agaroseindlejrede xenograferede larver i miljøkammeret i et omvendt konfokalmikroskop med temperaturen indstillet til 32 °C. Find larverne i videobilleddannelsen med et 10x mål ved hjælp af et motoriseret XY-trin.
    2. Tryk på ESC for at sænke måltårnet, tilsæt mineralolie på et 60x oliemål (1,4 NA, arbejdsafstand: 0,13 mm), og tryk på ESC for at gå tilbage til den oprindelige brændpunktsposition.
    3. Overhold de invaderende glioblastomceller i den røde kanal (561 nm laserkilde, 20% lasereffekt, tidseksponering: 200 ms), og vælg en celle med et spredt MT-netværk og let skelnelige MT-filamenter (figur 3B).
    4. Indstil z-seriens indstillinger. Ved hjælp af et 200 μm piezo-trin skal du vælge MT-netværkets øverste og nederste position: en 10-30 μm dyb z-stak er nok til at visualisere mikrotubulusnetværket i fremspringet af den migrerende celle med et z-skivetrin på 0,3 μm.
    5. Indstil time-lapse-optagelsesindstillinger for at tillade en optimal balance mellem anskaffelseshastighed, z-stack-dybde og fluorescerende signal for at undgå hurtig fotoblegning. Få billeder af MT'er hver 5-10 s i flere minutter. Anskaf og gem 5D (x, y, z, t, c) hyperstack.
      BEMÆRK: For at undgå drift i z under erhvervelsen skal du bruge et mikroskop udstyret med et perfekt fokussystem som hardwarefokusstabilisering.
  3. (Valgfrit) Bestem virkningerne af mikrotubuli-ændrende midler (MTA'er) på MT'er.
    BEMÆRK: Følgende trin gør det muligt at teste virkningerne af MTA'erne på et MT-netværk ved migrering af glioblastomceller i realtid.
    1. Fjern forsigtigt billedmediet fra videobilleddannelsesskålen. Rør ikke ved bunden af skålen, da xyz-positionen går tabt.
    2. Forbered nyt billeddannende medium indeholdende MTA i forskellige koncentrationer. Tilsæt forsigtigt det MTA-holdige medium i videobilleddannelsen dråbe for dråbe.
    3. Anskaf langtidsfilm (2-16 timer, et billede hvert 10.-20. minut) for at observere virkningerne af hver koncentration af MTA på MT-netværket og cellemigration (figur 4A).
    4. (Valgfrit) Vask MTA'en ud ved forsigtigt at fjerne mediet og tilføje 2,5 ml frisk billeddannelsesmedium uden MTA. Gentag udvaskningsproceduren 3x for at fjerne ethvert spor af MTA i mediet.
    5. (Valgfrit) Få en lignende langsigtet film som i 4.3.3 (figur 4B).
      BEMÆRK: Ovenstående trin bestemmer den minimale koncentration, der ændrer MT-netværket uden at påvirke larvernes overlevelse. Udvaskningstrinnene definerer, om lægemidlets virkning er reversibel.
  4. Vurder MTA-indvirkning på glioblastominvasion ved sekventiel billeddannelse.
    1. Følg trin 4.1 til 4.2.1 4 timer efter mikroinjektion.
      BEMÆRK: Denne del af protokollen kan også opnås med andre fluorescerende mærkede glioblastomcellelinjer. Ideelt set co-label GBM med et cytosolisk mærke og et kernemærke for at sikre påvisning af cellens globale morfologi.
    2. Skift til en lang arbejdsdistance 40x vandmål (NA:1.15, WD: 0,6 mm).
    3. Indstil z-seriens rækkevidde for at erhverve OT-regionen. Anskaf z-stakken ved hjælp af et sCMOS-kamera med høj følsomhed (pixelstørrelse 11 μm, 1.200 x 1.200 pixels, kvanteeffektivitet 95%).
      BEMÆRK: Z-stakken starter normalt ved den mest dorsale del af OT (tæt på overfladen) og slutter dybt nok i hjernen til at omfatte hele tumorcellemassen.
    4. Fjern videobilleddannelsen fra mikroskopet. Frigør larverne fra agarosen ved at bruge en mikrobelastningsspids og forsigtigt stikke agarosen rundt om dyret.
      BEMÆRK: Da 3 dpf larver stadig er meget skrøbelige, skal du være forsigtig, når du fjerner dem fra agarose.
    5. Når dyret er befriet fra agarose, overføres det forsigtigt til en enkelt brønd i en 24-brøndplade fyldt med mineralkildevand + methylenblåt + PTU-medium. Marker brønden for at identificere larverne til efterfølgende billeddannelse.
    6. Den MTA, der er af interesse for mediet, tilsættes ved den tidligere fastsatte koncentration (trin 4.3.3). Opdater mediet suppleret med stoffet hver dag. Gentag billedbehandlingsproceduren fra trin 4.4.1 til 4.4.5 hver dag i 3-4 dage.

5. Billedanalyse

  1. Analyser MT-dynamik med frit tilgængelige FIJI-plugins.
    BEMÆRK: Mange anmeldelser og protokoller beskriver metoderne til MT-dynamikanalyse i celle31,32,33,34 og kan anvendes på dette stadium. Denne protokol vil kort henvise til to metoder til måling af grundlæggende MT dynamiske egenskaber.
    1. Åbn 5D-hyperstakken, og generer en 4D-stak, hvor z-skiverne er projiceret i et enkelt plan for at skabe en maksimal intensitetsprojektion (MIP) i z (billede | Stakke | Z-projekt | Maks. intensitet) (figur 3B).
    2. Åbn 4D MIP-stakken, og spor manuelt slutningen af en fremspringsbaseret MT ved hjælp af den manuelle sporingsfunktion i FIJI (Plugins | Sporing | Manuel sporing). (Figur 3D). Udtræk parametrene for MT-dynamik såsom væksthastighed, krympningshastighed, redningsfrekvens og katastrofefrekvens.
    3. Alternativt kan du tegne en segmenteret linje på 10 pixels bred langs MT for at analysere (figur 3B). Brug funktionen Multi Kymograph (Analysér | Multi Kymograph) (figur 3C) i FIJI. Overhold og mål MT-vækstfaserne (G), længden af pauserne (P) og hyppigheden af MT-katastrofer.
  2. Analyse af langvarig glioblastom invasion
    BEMÆRK: Denne analyse kræver brug af 4D-visualisering og analyse med bioimaging-software.
    1. Konverter den rå 4D z-stack fra trin 4.4.3 (4 hpi) til det relevante softwareformat ved hjælp af File Converter-softwaren.
    2. Åbn softwaren, og importer den konverterede z-stack-fil i Surpass-visningen (figur 5A).
    3. For at segmentere tumorcellerne og kassere irrelevant autofluorescens i den røde kanal skal du klikke på Tilføj nye overflader og følge 5-trinsprocessen.
      1. Valider standardindstillingerne ved at klikke på den næste pil, når vinduet dukker op. Fortsæt til trin 2/5.
        BEMÆRK: Hvis det fluorescerende signal erhverves i 561-kanalen, kan autofluorescens fra resterende pigmentering i øjet være stærk og ændre den automatiske segmenteringsproces. Dette er problematisk, hvis xenograften er placeret tæt på øjet. I så fald skal segmentering udføres manuelt ved at skære og slette ikke-glioblastomcellesignaler.
      2. Naviger til Kildekanal | 561-kanal. Udjævn billedet (Gaussian Filter) ved at tilføje 1,50 μm i Surfaces Detail og ved at tilføje 2,5 μm for diameteren af kuglerne i Substract baggrund. Klik på den næste pil og fortsæt til trin 3/5.
      3. Afhængigt af signalets intensitet skal du manuelt justere tærsklen (baggrundssubstraktion) for at inkludere hver celleproces. Fortsæt til trin 4/5.
      4. Filtrer det segmenterede signal ved at fjerne de hændelser, der ikke repræsenterer en del af en celle (f.eks. snavs, autofluorescens). Klik på Filtertype | lydstyrke, og juster tærsklen manuelt for at udelukke alle hændelser under den mindste lydstyrke, der repræsenterer en del af en celle. Fortsæt til trin 5/5.
        BEMÆRK: Hvis autofluorescenssignalerne er større i volumen end den mindste celledel, skal du fortsætte alligevel og manuelt fjerne de uønskede signaler ved at venstreklikke og slette dem.
      5. Kassér klassifikationstrinnet, og afslut segmenteringsguiden ved at klikke på den dobbelte grønne pil for at afslutte oprettelsen af en overfladevisning af tumorcellerne (figur 5B).
    4. Hvis de segmenterede celler ikke rører hinanden og ikke danner et unikt objekt, skal du flette dem kunstigt for at skabe et tumorcellemasseobjekt. Kort sagt skal du klikke på Statistik | detaljerede | specifikke værdier | volumen. Vælg alle begivenheder ved at venstreklikke på den øverste og derefter holde Shift nede og venstreklikke på den sidste. Naviger for at redigere | markering | forenes.
    5. Definer centroiden af tumorcellemassen. Klik på Tilføj nye pletter | Spring over automatisk oprettelse | Tilføj (markøren skærer med) | Centrum af objektet. Hold skift og venstreklik for at oprette stedet, som er centroiden af den segmenterede tumorcellemasse.
    6. Mål 3D-afstanden mellem hver GBM-celle og centroiden af tumormassen. For at gøre det skal du oprette en afstand til centroidkanalen ved at forblive i visningen Spot og vælge værktøjsikonet | Afstand transformation. Vent på, at der oprettes en ny afstand til centroidkanalen sammen med 488- og 561-kanalen (i blåt, figur 5C).
      BEMÆRK: Intensiteten af hver voxel i denne kanal svarer til 3D-afstanden mellem voxel og centroiden af tumorcellemassen.
    7. Mål 3D-afstanden til centroiden for hver segmenteret celle ved at klikke på Tilføj nye pletter | Spring over automatisk oprettelse | Tilføj (markøren skærer med) | specifik kanal 561. Hold skift og venstreklik på cellekerneområdet. Udfør denne opgave for hver celle (figur 5D).
      BEMÆRK: Fjern Surface-visningen for bedre at forstå cellernes fluorescenssignal. Alternativt, hvis det er til stede, skal du bruge kernesignalet (405 nm eller 647 nm signal) for bedre nøjagtighed.
    8. Klik på Statistik | Detaljeret | Specifikke værdier | intensitet betyder Ch = afstand til centroid.
      BEMÆRK: Værdien af intensiteten er 3D-afstanden i μm mellem cellekerneområdet og centroiden.
    9. Gennemsnit disse intensiteter for at beregne radius af tumormassen ved 4 hpi. Gentag proceduren for hvert analysepunkt (24 hpi, 48 hpi og 72 hpi).
      BEMÆRK: Mål kun de 10 eller 20 mest spredte celler for at undgå at undervurdere celleinvasion. Faktisk kan den tvungne komprimering af cellerne under injektionen forhindre celler i midten af tumormassen i at migrere.
    10. Invasionsindekset (II) beregnes som forholdet mellem de gennemsnitlige 3D-afstande ved t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi for de mest spredte celler over tumormassens gennemsnitlige radius ved t = 4 hpi (figur 5E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at analysere den rolle, som MT'er spiller under in vivo GBM-invasion, beskriver vi her de vigtigste trin til at udføre stabil MT-mærkning i GBM-celler ved lentiviral infektion, ortopisk xenotransplantation af GBM-celler i 3 dpf zebrafisklarver, højopløsnings intravital billeddannelse af MT-dynamik, MTA-behandling og dens virkninger på GBM-invasion og billedanalyse af MT-dynamik og in vivo-invasion (figur 1). MT-dynamikken måles enten ved at bygge kymografer langs voksende og krympende MT'er (figur 3C) eller ved manuelt at spore individuelle MT-kanter over tid (figur 3D). Et eksempel på lægemiddelbehandling administreret i larvemediet og dets reversible virkning på MT-netværksorganisation er angivet i figur 4. Behandling med en lav dosis nocodazol (200 nM) fører til progressiv krympning af MT-netværket og forsvinden af glioblastomcellefremspring 4 timer senere (figur 4A). Udvaskning af lægemidlet genoprettede glioblastomcellernes kapacitet til at danne fremspring. Cellerne genoptog migrering langs vaskulaturen 12 timer efter udvaskningen (figur 4B). Disse data tyder på, at behandling med 200 nM nocodazol er tilstrækkelig til at forstyrre MT-netværket og hurtigt blokerer in vivo glioblastomcelleinvasion. En 3 dage lang analyse af den samme behandling af global glioblastomcelleinvasion afslører, at nocodazol 200 nM stopper langvarig glioblastomcelleinvasion in vivo uden at påvirke fiskens generelle sundhed sammenlignet med en kontrol (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Protokolarbejdsgangsdiagram. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; hpi = timer efter injektion; MT = mikrotubuli; MTA = mikrotubuli-ændrende middel; GBM = glioblastom multiforme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Mikroinjektion af glioblastomceller i 3 dpf zebrafisklarverhjerner. A) Fotografi af det udstyr, der anvendes til xenotransplantation: 1, oliemikroinjektor 2, mekanisk mikromanipulator; 3, universel kapillærholder; 4, glas kapillær. Mikroinjektionspladen er under et stereomikroskop. (B) Fotografi, der viser bedøvede 3 dfp zebrafisklarver justeret i en grøft og klar til at blive mikroinjiceret. Spidsen af en mikrokapillær fyldt med et rødt farvestof er synlig til højre på fotografiet. Detaljer om de mønstrede skyttegrave bygget i agarosepladen ses i indlægget i nederste højre hjørne. Skalastang = 3 mm. (C) Skema af en repræsentativ mikroinjektionsplade. Larver, der er klar til at blive injiceret, placeres sideværts (midten af pladen). Bemærk, at celler er koncentreret ved spidsen af mikrokapillæren (sort pil), inden de fortsætter til injektionen. Injicerede larver vises til højre for pladen, placeret ventralt. (D) Skema med en tværsnit i mikroinjektionspladen (langs den sorte stiplede linje i C), der viser skyttegravene, hvor larverne placeres under injektionen. (E) Fotografi, der viser spidsen af kapillæren klar til at trænge ind i det optiske tectum (stiplet linje). Ventriklerne er afgrænset af de hvide linjer. Skalabar = 150 μm. (F) Skema af en 3 dpf fli1a: gfp larve, der udtrykker gfp i endotelcellerne, hvilket angiver OT-regionen, hvor cellerne injiceres, lige over den midterste cerebrale vene. (G) Fluorescensbillede af en 3 dpf gfap: gfp larve (gfp udtrykt i neurale stamceller) placeret sideværts efter mikroinjektion af U87-mkate2 celler (hvid cirkel og hvid pil). Høj autofluorescens i rødt er forårsaget af iridoforerne i øjnene. Skalabar = 100 μm. (H) Konfokal fluorescensbillede af en vellykket injiceret fli1a: gfp larve ved 16 hpi. Skalastang: 50 μm. (I-K) Konfokale fluorescensbilleder af mislykket injiceret fli1a: gfp-larver ved 96 hpi (I) og 4 hpi (J, K). GBM-celler er blevet injiceret i ventrikler (I, J) eller i flere foci i hjernen (K). Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; OT = optisk tectum; MCeV = midterste hjernevene; gfp = grønt fluorescerende protein; GFAP = glialfibrillært surt protein; HPI = timer efter injektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Visualisering in vivo mikrotubuli dynamik i glioblastomceller. (A) Repræsentativt fluorescensbillede af xenograferede U87-celler, der udtrykker tubulin-α1-mkate2 i OT af en fli1a:GFP zebrafisklarve ved 20 hpi. (B) Maksimal intensitet projiceret fluorescensbillede af MT-netværket i en enkelt xenograferet U87-celle. (C) Kymograf langs den røde stiplede linje i B, der viser væksten, pausen og katastrofefaserne af MT dynamisk ustabilitet. (D) Time-lapse-sekvens af det boksede område i B , der fremhæver sporingen af tre MT + ender. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: OT = optisk tectum; GFP = grønt fluorescerende protein; hpi = timer efter injektion; MT = mikrotubuli; G = vækstfase; P = pause fase; C = katastrofefasen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Visualisering af virkningerne af mikrotubulusændringsmidlet på glioblastominvasion in vivo. (A) Time-lapse-sekvens af U87-celler, der udtrykker tubulin-α1a-mkate2 i zebrafisklarver behandlet med nocadazol (200 nM). Pile peger på ekstremiteten af fremspringet i to forskellige celler, der invaderer hjernen langs et blodkar. Bemærk tilbagetrækningen af fremspringet ved behandling med nocodazol. Skalabar = 10 μm. (B) Time-lapse-sekvens, der repræsenterer effekten af nocodazoludvaskning på U87-celleinvasion. 500 minutter efter udvaskningen forlænger cellen markeret med den hvide stjerne et MT-baseret fremspring (hvid pil), som tillader genoptagelse af invasionen langs et blodkar. Skalabar = 20 μm. (C) 3D-repræsentationer af en xenografted larvehjerne behandlet med DMSO eller nocodazol (200 nM) i 72 timer. U87-cellesignalet er blevet segmenteret (i rødt) og integreret i fli1a-GFP-fluorescenssignalet (i hvidt). Bemærk den nedsatte spredning af U87-celler behandlet med nocodazol. Skala bar = 30 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; hpi = timer efter injektion; MT = mikrotubuli. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Billedanalyse af in vivo glioblastom invasion. (A) Fluorescerende billeder af xenograferede U87-celler, der udtrykker cytosolisk mKate2 i fli1a-GFP zebrafisklarver, 4 hpi. Hvide stjerner understreger typisk autofluorescens fra øjeniridoforer. Skalabar = 40 μm. (B) Fluorescerende billede af fli1a-GFP-larver kombineret med den segmenterede overflade svarende til U87-cellesignalet i A. Centroiden af tumormassen fremstår grøn. Skalabjælke = 40 μm. (C) Fluorescerende billede, der repræsenterer det røde kanalsignal i A og den nyligt definerede "afstand til centroid" kanal (i blåt). Skalabjælke = 30 μm. (D) Rød kanalfluorescensbillede overlejret med farvede pletter, hvis farve repræsenterer cellens afstand til centroiden (i grønt), violet er tættest på centroiden og hvid er længst fra hinanden. Skala bar = 20 μm. (E) Et eksempel på sekventiel analyse af global GBM-invasion. 3D-afstande bestemmes ved 4 hpi og 72 hpi, og invasionsindekset (II) beregnes i henhold til formlen i indbakken. Skala bar = 20 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; HPI = timer efter injektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Imaging tumor xenografts ved enkeltcelleopløsning vil sandsynligvis blive et uundværligt værktøj til at forbedre vores forståelse af GBM-biologi. Live imaging i PDX-modeller til mus har ført til værdifulde opdagelser om, hvordan GBM kollektivt invaderer hjernevævet18. Til dato er den spatiotemporale opløsning imidlertid ikke høj nok til at afsløre dynamikken i proteiner, der styrer GBM-invasion. Vi ræsonnerede, at ved at koble den ortopiske indpodning af GBM-celler i gennemsigtige zebrafisklarver med intravital billeddannelse med høj opløsning, kunne cytoskeletale proteiner såsom MT'er analyseres tilstrækkeligt detaljeret til at analysere deres dynamik under in situ GBM-invasion.

De kritiske trin i metoden ligger i forberedelsen af GBM-cellerne og mikroinjektionsproceduren. Usunde og utilstrækkeligt dissocierede celler vil holde sammen eller til kapillærgrænserne og blokere injektionsstrømmen. Derudover skal cellerne være tilstrækkeligt koncentreret i kapillæren for at minimere det injicerede volumen og implantere dem i bulk. Injektion af et højere volumen af mere fortyndede celler vil resultere i flere, undertiden blandede tumorfoci, hvis invasive indekser bliver vanskelige at måle. I vores hænder giver manuel håndtering af den oliebaserede mikroinjektor bedre kontrol over injektionsflowet end en trykluftbaseret elektronisk mikroinjektor, der tidligere er blevet brugt i en lignende model19. Dette er afgørende for at forhindre overskydende flowtryk inde i hjernen og derved undgå efterfølgende vævsskade og ventrikulær aggregering af de injicerede celler.

Nogle begrænsninger ved denne model inkluderer nødvendigheden af at udføre eksperimentet ved suboptimale temperaturer for begge arter. Zebrafisk opdrættes normalt ved 28 °C, mens humane celler dyrkes ved 37 °C. Over 32 °C ændres udviklingen af zebrafiskembryoner, og disse ændringer kan være dødelige35. I lighed med hvad der gøres i voksne zebrafisk xenograft modeller 36, øger sekventielt akklimatisering af zebrafisklarverne til en temperatur på 32 °C overlevelsen af transplanterede dyr sammenlignet med den hurtige temperaturændring efter transplantation fra 28 °C til32 °C. En forøgelse af temperaturen fører imidlertid yderligere til øget dyredød i overensstemmelse med zebrafiskembryoners følsomhed over for temperaturer over 32 °C35.

Fortolkning af in vivo MT-dynamikdata skal udføres omhyggeligt, da MT-dynamikken ændres, når temperaturen falder til under 37 ° C37. Parallel in vitro-måling af MT-dynamik ved 37 °C og 32 °C i de samme GBM-celler med samme MTA-behandling vil hjælpe med at validere de forskelle, der ses mellem forskellige GBM-celler eller mellem in vivo-behandlinger . Det skal hjælpe med at bekræfte, at forskellene ikke skyldes variation i temperaturfølsomhed, men forskellige reguleringsveje (til GBM-sammenligningsanalyse) eller MTA-behandling (til MTA-effektanalyse). Dette vil være af interesse, hvis MT-dynamikkens heterogeniteter knyttes til forskellige invasionsevner.

En anden begrænsning er det korte tidsvindue, hvor invasion kan overvåges (72 til 96 timer), hvilket forhindrer måling af invasionsplasticitet drevet af potentielle ændringer i MT-dynamikken38. Efter 96 timer bemærkede vi et kraftigt fald i GBM-celleinvasion. 6 dage efter injektionen faldt antallet af GBM-celler hurtigt, formodentlig på grund af et værtsimmunrespons forårsaget af ophobning af neutrofiler og makrofager i tumormikromiljøet39. Levering af MTA'er til hele hjernen vil sandsynligvis påvirke nærliggende neuronale værtsceller, som er afhængige af MT'er for deres aktivitet, og hvis ændring efterfølgende kan påvirke GBM-invasion40. Denne tilgang skal suppleres med shRNA- eller optogenetikassays, der begrænser MT-ændring til GBM-cellerne, men forbliver en god platform til at screene for nye antiinvasive forbindelser.

Den ortopiske injektion af MT-mærkede GBM-celler i zebrafiskhjernen er af særlig interesse for at dechiffrere MT'ernes rolle under kræftcelleinvasion, da meget få dyremodeller tillader in situ subcellulær billeddannelse af kræftcellemigration i deres oprindelsesvæv15. Til dato er undersøgelser af MT-funktioner under GBM-migrering hovedsagelig afhængige af in vitro- og ex vivo-assays og manglende in vivo-validering 24,41,42,43. Sammen med gen-af-interesse-knock down eller en upartisk genbaseret screeningsmetode vil analysen, der præsenteres her, hjælpe med at afsløre nye MT-regulatorer, der er vigtige for GBM-invasion in vivo.

GBM'er er meget heterogene tumorer, hvis invasive egenskaber varierer meget mellem prøver44. At forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for deres forskellige form for invasion, vil hjælpe med at definere ad hoc terapeutiske behandlinger for at blokere GBM-formidling. Systematisk måling af det invasive indeks, invasionsmåde og cytoskeletale egenskaber såsom MT-dynamik i forskellige GBM-prøver vil afsløre nye sammenhænge mellem hyppige genomiske mutationsprofiler og celleinvasionsmønstre, der er afhængige af specifikke cytoskeletale egenskaber. At afsløre, hvordan disse mutationer påvirker ændringen i MT-dynamikken, ville ikke kun øge vores viden om MT-regulering under cellemigration45,46, men kan også føre til længe ventede patientspecifikke, anti-invasive terapier.

Den relative lethed ved mikroinjektion i zebrafisk kombineret med det store antal larver, der er til rådighed, og den lette injektion af lægemidler gør denne procedure velegnet til personlig medicin47,48. I modsætning til intravital billeddannelse af GBM xenografts hos mus, der kun forekommer i den øvre 500 μm del af cortex49,50, ved hjælp af zebrafisk giver mulighed for visualisering af GBM-infiltration i hele CNS. Modellen, der præsenteres her, opfylder kriterierne for at blive et uvurderligt værktøj til hurtig analyse af glioblastoms invasive kapacitet og dets respons på behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Vi er meget taknemmelige for Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankrig) og hans laboratorium, især Valérie Briolat og Emma Colucci-Guyon for at give os zebrafisklinjerne og plastformen til mikroinjektionsplader og for deres værdifulde ekspertise om zebrafiskeksperimentelle procedurer. Vi anerkender taknemmeligt UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, støttet af det franske nationale forskningsagentur France BioImaging og ANR-10-INBS-04; Investeringer for fremtiden). Dette arbejde blev støttet af Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Pasteur og ved generøse donationer fra fru Marguerite MICHEL og hr. Porquet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Biologi udgave 185 Ortopisk xenograft PDX Zebrafisk Danio rerio Glioblastom Subcellulær intravital billeddannelse 5D billedanalyse
Levende billeddannelse af mikrotubulusdynamik i glioblastomceller, der invaderer zebrafiskhjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter