Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Abstract

Gerçek popülasyonlarda kasvetli bir medyan sağkalım süresi ile - 6 ila 15 ay arasında - glioblastom (GBM) en yıkıcı malign beyin tümörüdür. Tedavi başarısızlığı esas olarak GBM hücrelerinin invazivliğinden kaynaklanmaktadır, bu da GBM hareketli özelliklerinin daha iyi anlaşılması ihtiyacını ifade etmektedir. GBM invazyonunu destekleyen moleküler mekanizmayı araştırmak için, invazyon sırasında protein dinamiklerinin derinlemesine karakterizasyonunu sağlayan yeni fizyolojik modellere ihtiyaç vardır. Bu gözlemler, tümör infiltrasyonunu bloke etmek ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için yeni hedeflerin keşfine yol açacaktır. Bu makale, zebra balığı beynindeki GBM hücrelerinin ortotopik ksenograftının hücre altı intravital canlı görüntülemeye nasıl izin verdiğini bildirmektedir. Mikrotübüllere (MT'ler) odaklanarak, GBM hücrelerinde MT etiketleme, döllenme sonrası 3 gün (dpf) zebra balığı larvalarının şeffaf beyninde GBM hücrelerinin mikroenjekte edilmesi, yayılan ksenogreftlerde MT'lerin intravital görüntülenmesi, GBM invazyonu sırasında rollerini değerlendirmek için MT dinamiklerini değiştirme ve elde edilen verileri analiz etme prosedürünü açıklıyoruz.

Introduction

Hücre hareketliliği, polarite ekseni oluşturulmasını ve kuvvet üreten sitoiskelet yeniden düzenlemelerini gerektiren kalıplaşmış bir süreçtir. Aktin polimerizasyonu ve miyozin ile ilişkisi, hücre hareketi için gerekli olan çıkıntılı ve kontraktil kuvvetlere ana katkıda bulunanlar olarak kabul edilmektedir1. Mikrotübüller, hücre polarizasyonunda ve göç sırasında yönlü kalıcılıkta ana aktörler olarak kabul edilir2. Son yıllarda, MT'lerin 3D3'te hücre invazyonu sırasında mekanokompresif kuvvetleri desteklemek için çıkıntılar oluşturduğu ve stabilize ettiği gösterilmiştir. Daha yakın zamanlarda, MT'ler fokal adezyonlar ve mekanosensitif migrasyonda mekanotransdüksiyona doğrudan dahil olmuştur4. MT-plus uç dinamiklerini karakterize eden dinamik kararsızlık, RHO-GTPazlar 5,6,7 tarafından yönetilenler gibi çok sayıda mikrotübül bağlayıcı protein ve hücre içi sinyal kaskadları tarafından kontrol edilen tekrarlanan polimerizasyon (büyüme) ve depolimerizasyon (büzülme) aşamalarından oluşur. MT ağının hücre göçü ve invazyonundaki rolü, MT dinamiklerinin araştırılmasını, bağışıklık hücresi homing, yara iyileşmesi ve kanser invazyonu mekanizmalarını daha iyi anlamak için kilit bir unsur haline getirmiştir.

Kanser hücrelerinin birincil tümör çekirdeğinden kaçma, dokulara yayılma ve ikincil tümörler üretme yeteneği, 50 yıl önceilan edilen kansere karşı savaşta küresel başarıyı önlemede kritik bir adımdır 8,9. En büyük engellerden biri, kanser hücrelerinin dokuyu aktif olarak nasıl istila ettiğini anlamaktır. Anahtar invazyon mekanizmaları, tümörlü olmayan hücre göçünü yönetenlerle aynı prensiplere dayanır10. Bununla birlikte, kanser hücresi göçü özgüllükleriortaya çıkmıştır 11, bu da bu göç türünün daha iyi karakterize edilmesine duyulan ihtiyacı tetiklemektedir. Spesifik olarak, tümör mikroçevresi kanser progresyonunda kilit bir oyuncu olarak göründüğü için12, kanser hücresi invazyonunu ilgili fizyolojik bağlamda gözlemlemek ve analiz etmek, kanser hücresi yayılma mekanizmalarını çözmek için gereklidir.

MT'ler, hem proliferasyon hem de istilayı sürdürmek için kanser progresyonunun merkezindedir. MT dinamiklerinin yerinde hassas analizi, her iki proseste de MT değiştirici ajanların (MTA) tanımlanmasına yardımcı olabilir. MT dinamikleri, ortamdaki bir değişikliğe bağlı olarak büyük ölçüde değişir. In vitro, nokodazol gibi MT-istikrarsızlaştırıcı ajanlarla tedavi, hücreler 3D jellere gömüldüğünde hücre çıkıntısı oluşumunu önlerken, 2D hücre göçü13,14 üzerinde çok az etkisi vardır. Teknik olarak zor olmasına rağmen, intravital görüntülemedeki ilerlemeler, kanser hücresi invazyonu sırasında MT dinamiklerinin in vivo analizine izin vermektedir. Örneğin, farelerde deri altından ksenograflanmış fibrosarkom hücrelerinde MTs'lerin gözlemlenmesi, tümörle ilişkili makrofajların tümör hücrelerinde MT dinamiklerini etkilediğini ortaya koymuştur15. Bununla birlikte, bu fare modelleri kapsamlı cerrahi prosedürler içerir ve yüksek derecede invaziv beyin tümörü GBM gibi daha az erişilebilir kanserler için tatmin edici değildir.

Kasvetli bir 15 aylık ortalama hayatta kalma süresi16'ya rağmen, GBM'nin beyin parankimi içindeki yayılma şekli veya beyin dokusunda GBM hücre invazyonunu sürdüren temel moleküler elementler hakkında çok az şey bilinmektedir. Fare ortotopik ksenogreft (PDX) modelindeki gelişmeler ve kraniyal pencerelerin kurulması GBM hücre invazyonu çalışmaları için yeni umutlar sunmuştur17,18. Bununla birlikte, yetersiz görüntüleme kalitesi nedeniyle, bu model çoğunlukla yüzeysel ksenogreftlerin uzunlamasına görüntülenmesine izin vermiş ve şimdiye kadar sitoiskelet proteinlerinin hücre altı görüntülemesini incelemek için başarılı bir şekilde kullanılmamıştır. Ayrıca, kemirgenlerin kullanımını azaltmak ve onları alt omurgalılarla değiştirmek için "3R" emrinin ardından, alternatif modeller oluşturulmuştur.

Zebra balığı (Danio rerio) larvalarında gözlenen ilkel bağışıklıktan yararlanarak, balık beynine GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu 19,20,21 geliştirilmiştir. Gelişmekte olan orta beyindeki ventriküllerin yakınına enjeksiyon, insan GBM patofizyolojisinin çoğunu özetler21 ve insan-damar ko-seçeneğinde olduğu gibi aynı tercih edilen GBM invazyonu paternigözlenir 22. Balık larvalarının şeffaflığı sayesinde, bu model, çoğu GBM'nin ortaya çıktığı düşünülen peri-ventriküler bölgelerden beyni istila eden GBM hücrelerinin görselleştirilmesine izin verir23.

MT'ler in vitro24,25 GBM hücre invazyonu için gerekli olduğundan, MT dinamiklerinin daha iyi bir karakterizasyonu ve hücre invazyonu sırasında anahtar düzenleyicilerin tanımlanması gereklidir. Bununla birlikte, bugüne kadar, zebra balığı ortotopik modeli ile üretilen veriler, istila işlemi sırasında MT dinamiklerinin hücre altı analizini içermemiştir. Bu makale, MT dinamiklerini in vivo olarak incelemek ve beyin kanseri invazyonu sırasındaki rolünü belirlemek için bir protokol sunmaktadır. Kararlı mikrotübül etiketlemesini takiben, GBM hücrelerine zebra balığı larvalarının beyinlerinde 3 dpf'de mikroenjekte edilir ve beyin dokusundaki ilerlemeleri sırasında yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte gerçek zamanlı olarak görüntülenir. Floresan MT'lerin canlı görüntülenmesi, MT artı uç dinamiklerinin kalitatif ve kantitatif analizini sağlar. Ayrıca, bu model MTA'ların MT dinamikleri ve GBM hücrelerinin invaziv özellikleri üzerindeki etkisini gerçek zamanlı olarak değerlendirmeyi mümkün kılar. Bu nispeten invaziv olmayan protokol, bir seferde ele alınan çok sayıda larva ve ilaç uygulama kolaylığı (balık suyunda) ile birleştiğinde, modeli klinik öncesi testler için bir varlık haline getirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan deneyleri, laboratuvar hayvanlarının kullanımı için Avrupa Birliği kılavuzlarına göre yapılmıştır. Tüm protokoller Institut Pasteur - CEEA 89 Hayvan Deneyleri Etik Komitesi ve Fransız Araştırma ve Eğitim Bakanlığı (izin #01265.03) tarafından onaylanmıştır. Enjeksiyonlar veya canlı görüntüleme seansları sırasında, hayvanlar deneysel prosedürlerin sonunda Tricaine.At ile uyuşturuldu, anestezik doz aşımı ile ötenazi yapıldı. Bu protokolde kullanılan malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. Protokolün genel iş akışı Şekil 1'de açıklanmıştır.

1. α-tübülin-mKate2'yi kararlı bir şekilde eksprese eden glioblastoma hücrelerinin oluşumu

NOT: Aşağıdaki adımlar BSL2+ biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.

  1. 7 × 106 HEK-293T hücrelerinin transfeksiyonu için kalsiyum fosfat yöntemini kullanarak mKate2-tübülini eksprese eden lentiviral parçacıklar üretin.
    1. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne, 10 μg 2. nesil ambalaj plazmidi psPAX2, 5 μg viral zarf plazmidi pMD2.G ve 10 μg ilgili plazmid, 50 μL CaCl 2 (2,5 M stok) ile pGK-mKate2-insan tübülin α1a ekleyin. Steril DNAse içermeyen H2O ile 500 μL'ye ayarlayın.
      NOT: En son CaCl2'yi eklemek önemlidir.
    2. Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin.
    3. Kuluçka sırasında, 500 μL HEPES tamponlu salin (HBS), pH 7.0 (2x) içeren başka bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
    4. 20 dakika sonra, CaCl2/DNA karışımını HBS (2x) çözeltisine damla damla ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. RT'de 12 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
    5. 12 dakika sonra, HBS ile karıştırılmış CaCl2 / DNA'yı doğrudan HEK-293T hücrelerinin %70'lik akıcı, 10 cm'lik bir kabına damla damla ekleyin.
    6. Hücreleri nemlendirilmiş inkübatörde 36-48 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de bırakın.
    7. Süpernatantı toplayın ve hücresel kalıntıları gidermek için 5 dakika boyunca 3.000 × g'de döndürün.
    8. Viral parçacıkları konsantre etmek için, süpernatantı bir ultrasantrifüj tüpüne yükleyin ve 4 ° C'de 90 dakika boyunca 47.508 × g'de döndürün.
    9. Süpernatantı atın ve tüpün içini kurutmak için tüpü baş aşağı kağıda yerleştirin.
    10. Viral pelet üzerine 30 μL PBS ekleyin. Peleti tekrar askıya almayın. 2 saat boyunca 4 °C'de bırakın.
    11. Viral parçacıkları yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe yeniden askıya alın. Kabarcık yapmaktan kaçının. -80 °C'de saklayın.
      NOT: HEK-2-93T hücrelerinin birden fazla plakasının transfekte edilmesiyle daha büyük miktarlarda viral partikül üretilebilir.
  2. Glioblastoma hücrelerini lentiviral parçacıklarla enfekte edin.
    NOT: Bu protokol, U-87 MG, U-373 MG veya T98 gibi ticari glioblastoma hücre hatları için yazılmıştır. Birincil hasta kaynaklı glioblastoma hücrelerini kullanmak için, plakaların spesifik kaplamasını ve serum bazlı olmayan ortam26'yı kullanın.
    1. % 10 fetal buzağı serumu, penisilin-streptomisin (penisilin için 100 ünite / mL nihai konsantrasyon ve streptomisin için 100 μg / mL) ve esansiyel olmayan amino asitler (1x) ile desteklenmiş, Eagle'ın minimum esansiyel ortamında (MEM) yetiştirilen% 70 akıcı 10 cm'lik bir U-87 MG glioblastoma hücresi kabı hazırlayın.
    2. Viral parçacıkları 5.000'de 1'lik bir seyreltmede doğrudan hücrelere ekleyin. Nazik bir girdap ile karıştırın. Virüslerin hücreleri 20 saatten fazla etkilememesine izin verin.
    3. Virüs içeren ortamı çıkarın ve taze kültür ortamıyla değiştirin. Etiketli tübülinin ifadesine 48-72 saat izin verin.
      NOT: Aşağıdaki adımlar BSL2 biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
    4. FACS, mKate2+ hücrelerinin en parlak %15'ini seçmek için hücreleri sıralayın. İleri ve yan saçılma (FCS vs SSC) geçidini kullanarak kalıntıları ve çift hücreleri çıkardıktan sonra, üstteki %15'i korumak için en parlak% 30 mKate2+ hücrelerine başka bir geçit uygulayın.
    5. MT etiketli hücreleri yükseltin.
      NOT: Alternatif olarak, yüksek seviyelerde tübülin-mKate2'ye dayalı klonal seçim bir epifloresan mikroskobu altında gerçekleştirilebilir.

2. Zebra balığı larvalarını mikroenjeksiyon için hazırlayın

  1. Zebra balığı yumurtaları üretin.
    1. İstenilen zebra balığı suşunun üç erkeğini ve dört dişisini ksenotransplantasyondan 4 gün önce, öğleden sonra geç saatlerde mermerlerle desteklenmiş bir çiftleşme tankına yerleştirin.
      NOT: Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) veya Tg(Huc:gfp) çizgileri sırasıyla endojen damarları, nöral kök hücreleri/astrositleri ve nöronları işaretlemek için kullanılır.
    2. Ertesi sabah mermer kaynaklı yumurtlama ile üretilen yumurtaları toplayın.
    3. Yumurtaları, çamaşır suyu ile desteklenmiş maden kaynağı suyu27 ile doldurulmuş 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktararak temizleyin (% 0.004 nihai). Tüpü 5 dakika boyunca yavaşça ters çevirin. Sadece maden suyu ile iki kez yıkayın.
    4. Yumurtaları, 0.28 mg / mL metilen mavisi ile desteklenmiş maden suyunu içeren bir Petri kabına aktarın.
    5. Döllenmemiş ve gelişimi durdurulmuş yumurtaları çıkarın. Embriyoları 28 °C'de inkübe edin.
  2. Şeffaf larvalar oluşturun.
    1. Melanin pigmentasyonunu önlemek ve optik şeffaflığı sağlamak için N-feniltiourea (PTU) (% 0.003 nihai) ortama 8 saat sonra sürün. PTU'yu protokolün geri kalanı için ortamda tutun.
      NOT: PTU tedavisi gelişimsel kusurlara neden olabileceğinden, ksenotransplantasyon için sadece normal olarak geliştirilmiş larvaları seçin. Kimyasal tedaviye alternatif olarak, pigmentasyonun olmadığı mutant zebra balığı suş casper (sedef ve roy orbizon çift mutant) kullanılabilir28.
    2. Kuluçka sıcaklığını 29 °C'ye yükseltin.
    3. Sıcaklığı her gün 1 ° C arttırın, böylece 3 dpf larvaları enjeksiyon gününde 32 ° C'ye ulaşır.
  3. Mikroenjeksiyon plakasını hazırlayın.
    1. Maden suyu ile 20 mL% 1 agaroz + 0.28 mg / mL metilen mavisi hazırlayın.
    2. Agarozu 10 cm'lik bir Petri kabına dökün ve 2,5 mm genişliğinde V şeklinde hendekler oluşturmak için mikroenjeksiyon plastik kalıbını hızla baş aşağı uygulayın (Şekil 2B).
      NOT: Plastik kalıp ticari olarak temin edilebilir veya Zebra Balığı Kitabı29'da açıklanan tasarıma uygun olarak şirket içinde üretilebilir.
    3. Agaroz katılaştığında plastik kalıbı dikkatlice çıkarın.
      NOT: Mikroenjeksiyon döküm plakalar 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.
  4. Larvaları ksenotransplantasyon için hazırlayın.
    1. Enjeksiyon gününde, 3 dpf larvalarında seçilen floresan transgen ekspresyonu taranır. Floresan olmayan, anormal görünümlü hayvanları çıkarın.
    2. Larvaları ince uçlu saat ustası forsepsleriyle manuel olarak dekoryonlayın. 3 dpf'de, larvaları koryondan kurtarmak için koryonları iki çift ince uçlu forseps ile hafifçe dürtün veya yırtın.
      NOT: Alternatif olarak, larvaları dekoryonize etmek için genellikle 24 hpf'de pronaz A ile enzimatik tedavi kullanılabilir.
    3. Dekoriyonlanmış larvaları metilen mavisi (0.28 mg / mL) ve PTU (% 0.003 nihai) ile maden suyu ortamında tutun.

3. Ksenotransplantasyon prosedürü

  1. Mikroenjeksiyon iğneleri hazırlayın.
    1. Merkezi bir filament olmadan borosilikat cam kılcal damar alın ve dikey bir iğne çektirme makinesine yerleştirin.
    2. Aşağıdaki ayarları kullanarak 8.5'i artırın ve ısıtıcı 3-kılcal damarı mikroenjeksiyon iğnesine dönüştürmek için gerin.
  2. Mikroenjektörü kurun.
    1. Mineral yağı manuel bir mikroenjektöre yükleyin. Hava kabarcıklarını çıkarın.
    2. Evrensel bir kılcal tutucuyu mikroenjektöre takın ve mekanik bir mikromanipülatöre sıkıca takın (Şekil 2A).
  3. Glioblastoma hücrelerini hasat edin.
    NOT: Aşağıdaki adımlar BSL2 biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
    1. 10 cm'lik bir glioblastoma hücresi plakası hazırlayın, böylece nakil gününde% 80 birleşime ulaşırlar.
    2. (İsteğe bağlı) Hücrelere Hoechst 35480 (200 ng / mL) ekleyerek hücre çekirdeklerini geçici olarak etiketleyin. Nemlendirilmiş hücre inkübatöründe 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve PBS ile 2 kat yıkayın.
    3. Hücre plakasını inkübatörden çıkarın ve PBS ile bir kez yıkayın. 1 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyerek ve tüm hücreler tamamen ayrılana kadar hücre inkübatöründe 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe ederek hücreleri ayırın.
      NOT: Bu adım, zayıf tripsinizasyon, hücre agregalarının iğnede sıkışıp kalmasına neden olacağından kritik öneme sahiptir.
    4. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 5 mL'lik tam glioblastoma hücre ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın. 45 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 134 × g'da santrifüj yapın.
    5. Süpernatantı atın ve hücreleri 1 mL buz gibi soğuk PBS ile yukarı ve aşağı iyice pipetleyerek yeniden askıya alın.
      NOT: Bu mekanik ayrışma adımı, mikroenjeksiyon sırasında kılcal damarda tıkanma riskini önlemeye büyük ölçüde yardımcı olur.
    6. 49 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 134 × g'da santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücreleri 200 μL buz gibi soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Transplantasyon prosedürü boyunca buz üzerinde saklayın.
  4. Glioblastoma hücrelerini zebra balığı larvalarının orta beynine mikroenjekte edin.
    1. Bir mikroenjeksiyon döküm plakasını, 160 mg / L trikain ile desteklenmiş 6 mLE3-orta 30 ile doldurun.
    2. Bir düzine dekoriyonlu larvayı mikroenjeksiyon plakasına aktarın. Dokunmaya tepki vermedikten sonra, onları yanlarındaki siperlere hizalayın, başını yukarı kaldırın ve yumurta sarısı kesesi 00 büyüklüğünde bir boya fırçası ile açmanın duvarına doğru itildi (Şekil 2B, C).
    3. Glioblastoma hücrelerini yeniden askıya alın. Mikro yükleme uçlarını kullanarak 5 μL hücreyi mikrokılcal damara yükleyin ve kılcal damarı üniversal kılcal tutucuya yerleştirin.
    4. Tepkisiz larvaları içeren mikroenjeksiyon plakasını stereomikroskop altına yerleştirin. Mikrokapilerin ucunu, mikromanipülatör düğmelerini kullanarak mikroenjeksiyon plakasının sınırına yerleştirin. Kabaca bir hücrenin çapının büyüklüğünde keskin bir giriş noktası oluşturmak için bir neşterle kırın.
    5. Mikroenjektörde hafifçe yağ akarak ve iğnenin ucunu ortama daldırarak hücrelerin kılcal damardan aktığını doğrulayın. Çıkarılan hacim başına enjekte edilen hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak ve beyin dokusunu PBS ile doldurmaktan kaçınmak için hücreleri kılcal damarın ucunda yoğunlaştırın (Şekil 2C).
    6. Mikrokapiler içinden çıkan hücreleri dikkatlice inceleyin, çünkü yağ enjektöre manuel olarak verilir. 20 ila 50 hücre iletmek için manuel düğmede ne kadar dönüşe ihtiyaç duyulduğunu ampirik olarak tanımlayın. Tipik olarak, hücreler yeterince konsantre olursa, ~ 10 hücreyi çıkarmak için yumuşak bir dönüş yeterlidir.
      NOT: Sıvı mikrokılcal damardan düzgün bir şekilde akmazsa, kılcal damar tutucusundaki mikrokapilerin bağlantısını gevşetmeye çalışın. Bunu yaparak, yağ kılcal damar boyunca sızabilir ve damlayabilir.
    7. Kılcal damarın ucuna, Orta Serebral Ven'in hemen üstünde, sol Optik Tektuma (OT) doğru yaklaşın (MCeV, Şekil 2F).
    8. Cilt zarı kırılana kadar kılcal damarı larvalara karşı nazikçe bastırın (Şekil 2D,E).
      NOT: Çok fazla zorlamayın, çünkü bu, düşük optik netliğin MTs'leri ayrıntılı olarak gözlemlemeyi önleyeceği beyinde hücrelerin çok derinlerine enjekte edilmesine neden olacaktır. Görüntüleme tekniği 250-300 μm'ye ulaşan bir derinlik için mümkündür. Bununla birlikte, balık yüzeyinden 100 μm'den daha derine enjekte edilmemesi önerilir.
    9. OT'de uygun bir konuma ulaşıldığında, hücreleri dışarı atın. Hayvanın içine giren hücre akışını görselleştirmek için kılcal damarın ucunu dikkatlice gözlemleyin, böylece başarılı bir enjeksiyon sağlayın.
      NOT: Ventriküllere enjekte etmemeye dikkat edin (Şekil 2E). Ventriküllere girdikten sonra, hücreler dokuya sızmak yerine birikme ve sıkışma eğilimindedir (Şekil 2I). Ventrikül enjeksiyonu, beynin yoğun şişmesi ve enjekte edilen hücrelerin ön beyne ve arka beyne gözlemlenebilir yayılması ile karakterizedir (Şekil 2J).
    10. Gerektiği kadar hayvan için 3.4.9-3.4.11 arasındaki adımları tekrarlayın. Kılcal damardaki hücrelerin kümelenmesini önlemek için hızlı bir şekilde ilerleyin.
      NOT: Deneycinin enjekte etmede ne kadar hızlı olduğuna bağlı olarak, her 10 ila 20 larvada bir iğne değişikliği gerekebilir.
    11. Ksenotransplantasyon tamamlandıktan sonra, larvaları mikroenjeksiyon plakasından çıkarın ve mineral kaynak suyu + PTU + metilen mavisi ortam ile doldurulmuş 24 delikli bir plakada ayırın.
    12. Larvaları floresan stereomikroskop altında gözlemleyerek başarılı enjeksiyonu doğrulayın (Şekil 2G). OT'nin üst 200 μm'sinde (z cinsinden) bulunan 20-50 hücre tarafından oluşturulan tek bir tümör kütlesi içeren sadece ksenogreftleri seçin (Şekil 2H'ye karşı Şekil 2I-K'daki başarısız enjeksiyon).
      NOT: Başarılı lokalize ksenogreftlerin verimi başlangıçta %10'dan pratikte neredeyse %100'e kadar değişmektedir.
    13. Larvaların görüntülemeden önce 32 ° C'de en az 4 saat iyileşmesine izin verin.
      NOT: Ortama antibiyotik eklenmesi larvaların hayatta kalma oranını arttırmaz. Bu aşamada, mikroenjeksiyon doğru bir şekilde yapılmışsa, balıkların neredeyse% 100'ü hayatta kalır.

4. Glioblastoma ksenogreftlerinin intravital görüntülenmesi

  1. Canlı görüntüleme için larvaları monte edin.
    NOT: Larvalar enjeksiyon sonrası 4 saatten (hpi) görüntülenebilir. MT'nin canlı görüntülemesi genellikle invaziv GBM hücrelerinin çıkıntıları genişletmeye ve tümör kütlesinden uzaklaşmaya başladığı 20 hpi'den itibaren gerçekleştirilir.
    1. % 1 düşük erime noktalı bir agaroz çözeltisi hazırlayın. 500 μL kaynamış% 1 düşük erime noktalı agaroz çözeltisini 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir ısı bloğu üzerinde 37 ° C'de soğumaya bırakın. Agaroza trikain (112 μg / mL) ekleyin ve iyice karıştırın.
    2. Trikain (112 μg / mL) ile tamamlanan mineral kaynak suyu + PTU + metilen ortamı ile doldurulmuş 3,5 cm'lik bir Petri kabında bir ila dört ksenograflanmış larva aktarın. Larvalar dokunmaya tepki vermediğinde, ince uçlu bir transfer pipeti kullanarak agaroz ve trikain içeren tüpe dikkatlice aktarın.
      NOT: Agarozun seyreltilmesini sınırlamak için ortamın hacmini minimumda tutun.
    3. Larvaları agaroz ile yavaşça karıştırın. Normal (büyük ampul) bir transfer pipeti kullanarak, agarozda karıştırılmış larvaları cam tabanlı 3,5 cm'lik bir video görüntüleme kabının ortasına yerleştirin. Bir stereomikroskop altında, balıkları manipüle etmek için bir mikro yükleme ucu kullanarak larvaları sırtına hızlı bir şekilde yerleştirin.
      NOT: Bu protokolde intravital beyin görüntüleme için ters eğirme diskli konfokal mikroskop kullanıldığından, larvalar dorsal olarak monte edilir. Dik bir konfokal mikroskop kullanıyorsanız larvaların konumlandırılmasını buna göre ayarlayın.
    4. Mümkün olan en ince agaroz tabakasını korumak için ekstra agarozu çıkarın. Agaroz katılaştıktan sonra, 2,5 mL maden kaynak suyu + PTU + 0,2x trikain (görüntüleme ortamı) ekleyin ve bir sonraki adıma geçin.
  2. İnvaziv glioblastoma hücrelerinde MT dinamiklerinin in vivo canlı görüntülenmesi
    NOT: Görüntülerin optik kalitesi büyük ölçüde kullanılan mikroskobun performansına bağlıdır. Protokol, bir sCMOS kamera (piksel boyutu 6,5 μm, 2048 x 2044 piksel), uzun çalışma mesafesi hedefi ve sıcaklık kontrollü çevre odası ile donatılmış ters çevrilmiş bir eğirme diski konfokal mikroskop için yazılmıştır.
    1. Agaroza gömülü ksenograflanmış larvaları içeren video görüntüleme kabını, sıcaklık 32 ° C'ye ayarlanmış şekilde ters çevrilmiş bir konfokal mikroskobun çevre odasına yerleştirin. Video görüntüleme kabındaki larvaları, motorlu bir XY aşaması kullanarak 10x objektif ile bulun.
    2. Hedef taretini alçaltmak için ESC tuşuna basın, 60x yağ hedefine mineral yağ ekleyin (1,4 NA, çalışma mesafesi: 0,13 mm) ve ilk odak konumuna geri dönmek için ESC tuşuna basın.
    3. Kırmızı kanaldaki istilacı glioblastoma hücrelerini gözlemleyin (561 nm lazer kaynağı,% 20 lazer gücü, zamana maruz kalma: 200 ms) ve yayılmış MT ağına ve kolayca ayırt edilebilir MT filamentlerine sahip bir hücre seçin (Şekil 3B).
    4. Z serisi ayarlarını yapın. 200 μm aralıklı piezo aşamasını kullanarak, MT ağının üst ve alt konumlarını seçin: 10-30 μm derinliğinde bir z-yığını, göç eden hücrenin çıkıntısındaki mikrotübül ağını 0,3 μm'lik bir z-dilim adımıyla görselleştirmek için yeterlidir.
    5. Hızlı fotobeyazlatmayı önlemek için alım hızı, z-yığını derinliği ve floresan sinyali arasında optimum denge sağlamak için hızlandırılmış alma ayarlarını yapın. Birkaç dakika boyunca her 5-10 saniyede bir MTs görüntüleri alın. 5B (x,y,z,t,c) hiperyığınını edinin ve kaydedin.
      NOT: Edinme sırasında z'de kaymaları önlemek için, donanım odak stabilizasyonu olarak mükemmel bir odak sistemi ile donatılmış bir mikroskop kullanın.
  3. (İsteğe bağlı) Mikrotübül değiştirici ajanların (MTA'lar) MT'ler üzerindeki etkilerini belirleyin.
    NOT: Aşağıdaki adımlar, MTA'ların glioblastoma hücrelerinin gerçek zamanlı olarak göç etmesinde MT ağı üzerindeki etkilerinin test edilmesine izin vermektedir.
    1. Görüntüleme ortamını video görüntüleme kabından yavaşça çıkarın. Xyz pozisyonu kaybolacağından yemeğin dibine dokunmayın.
    2. MTA'yı farklı konsantrasyonlarda içeren yeni görüntüleme ortamı hazırlayın. MTA içeren ortamı video görüntüleme kabına damla damla yavaşça ekleyin.
    3. MTA'nın her konsantrasyonunun MT ağı ve hücre göçü üzerindeki etkilerini gözlemlemek için uzun vadeli filmler (2-16 saat, her 10-20 dakikada bir görüntü) edinin (Şekil 4A).
    4. (İsteğe bağlı) Ortamı nazikçe çıkararak ve MTA olmadan 2,5 mL taze görüntüleme ortamı ekleyerek MTA'yı yıkayın. Ortamdaki MTA izlerini temizlemek için yıkama prosedürünü 3 kat tekrarlayın.
    5. (İsteğe bağlı) 4.3.3'te olduğu gibi benzer bir uzun vadeli film edinin (Şekil 4B).
      NOT: Yukarıdaki adımlar, larvaların sağkalımını etkilemeden MT ağını değiştiren minimum konsantrasyonu belirler. Yıkama adımları, ilacın etkisinin geri dönüşümlü olup olmadığını tanımlar.
  4. MTA'nın glioblastoma invazyonu üzerindeki etkisini sıralı görüntüleme ile değerlendirin.
    1. Mikroenjeksiyondan 4 saat sonra 4.1 ila 4.2.1 arasındaki adımları izleyin.
      NOT: Protokolün bu kısmı, floresan olarak etiketlenmiş diğer glioblastoma hücre hatları ile de elde edilebilir. İdeal olarak, hücrenin küresel morfolojisinin tespit edilmesini sağlamak için GBM'yi bir sitozolik etiket ve bir çekirdek etiketi ile birlikte etiketleyin.
    2. Uzun çalışma mesafesi 40x su hedefine geçin (NA:1,15, WD:0,6 mm).
    3. OT bölgesini almak için z serisi aralığını ayarlayın. Yüksek hassasiyetli bir sCMOS kamera (piksel boyutu 11 μm, 1.200 x 1.200 piksel, kuantum verimliliği% 95) kullanarak z-stack'i edinin.
      NOT: Z-yığını genellikle OT'nin en dorsal kısmında (yüzeye yakın) başlar ve beyinde tüm tümör hücresi kütlesini içerecek kadar derin bir şekilde sona erer.
    4. Video görüntüleme kabını mikroskoptan çıkarın. Bir mikro yükleme ucu kullanarak ve agarozu hayvanın etrafına hafifçe dürterek larvaları agarozdan kurtarın.
      NOT: 3 dpf larvaları hala çok kırılgan olduğundan, onları agarozdan çıkarırken dikkatli olun.
    5. Hayvan agarozdan kurtulduktan sonra, mineral kaynak suyu + metilen mavisi + PTU ortamı ile doldurulmuş 24 kuyucuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna yavaşça aktarın. Sonraki görüntüleme için larvaları tanımlamak için kuyuyu işaretleyin.
    6. Daha önce belirlenen konsantrasyonda ortama ilgi duyan MTA'yı ekleyin (adım 4.3.3). Her gün ilaçla desteklenen ortamı yenileyin. Görüntüleme prosedürünü 3-4 gün boyunca her gün 4.4.1'den 4.4.5'e kadar olan adımları tekrarlayın.

5. Görüntü analizi

  1. Ücretsiz olarak kullanılabilen FIJI eklentileriyle MT dinamiklerini analiz edin.
    NOT: Birçok derleme ve protokol,31,32,33,34 hücrelerinde MT dinamiği analizi yöntemlerini açıklar ve bu aşamada uygulanabilir. Bu protokol, temel MT dinamik özelliklerini ölçmek için kısaca iki yönteme atıfta bulunacaktır.
    1. 5B hiper yığını açın ve z'de maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) oluşturmak için z dilimlerinin tek bir düzlemde yansıtıldığı bir 4B yığın oluşturun (Görüntü | Yığınlar | Z proje | Maksimum Yoğunluk) (Şekil 3B).
    2. 4D MIP yığınını açın ve FIJI'deki manuel izleme işlevini kullanarak çıkıntı tabanlı bir MT'nin ucunu manuel olarak izleyin (Eklentiler | Takip | Manuel İzleme). (Şekil 3D). MT dinamiklerinin büyüme hızı, büzülme hızı, kurtarma frekansı ve felaket frekansı gibi parametrelerini ayıklayın.
    3. Alternatif olarak, analiz etmek için MT boyunca 10 piksel genişliğinde parçalı bir çizgi çizin (Şekil 3B). Çoklu Kymograph işlevini kullanın (Analiz | Çoklu Kymograph) (Şekil 3C) FIJI'de. MT büyüme fazlarını (G), duraklamaların uzunluğunu (P) ve MT felaketlerinin sıklığını gözlemleyin ve ölçün.
  2. Uzun süreli glioblastoma invazyonu analizi
    NOT: Bu analiz, 4D görselleştirme ve biyogörüntüleme yazılımı ile analiz kullanılmasını gerektirir.
    1. Dosya Dönüştürücü yazılımını kullanarak ham 4D z-yığınını adım 4.4.3'ten (4 hpi) uygun yazılım formatına dönüştürün.
    2. Yazılımı açın ve dönüştürülen z-stack dosyasını Surpass görünümünde içe aktarın (Şekil 5A).
    3. Tümör hücrelerini segmentlere ayırmak ve kırmızı kanaldaki alakasız otofloresansı atmak için, Yeni Yüzeyler Ekle'ye tıklayın ve 5 adımlı işlemi izleyin.
      1. Pencere açıldığında bir sonraki oka tıklayarak varsayılan ayarları doğrulayın. Adım 2/5'e geçin.
        NOT: Floresan sinyal 561 kanalında alınırsa, gözdeki artık pigmentasyondan kaynaklanan otofloresan güçlü olabilir ve otomatik segmentasyon işlemini değiştirebilir. Ksenogreft göze yakın yerleştirilmişse bu sorunludur. Bu durumda, glioblastoma dışı hücre sinyallerini keserek ve silerek segmentasyonun manuel olarak tamamlanması gerekir.
      2. Kaynak kanal | 561 Kanal seçeneğine gidin. Yüzey Ayrıntısı'na 1,50 μm ekleyerek ve Çıkarma arka planındaki kürelerin çapı için 2,5 μm ekleyerek görüntüyü (Gauss Filtresi) düzgünleştirin. Bir sonraki oka tıklayın ve 3/5 adımına geçin.
      3. Sinyalin yoğunluğuna bağlı olarak, Eşiği (arka plan çıkarma) her hücre işlemini içerecek şekilde manuel olarak ayarlayın. Adım 4/5'e geçin.
      4. Bir hücrenin bir parçasını temsil etmeyen olayları (örneğin, enkaz, otofloresan) kaldırarak parçalanmış sinyali filtreleyin. Ses düzeyini | filtre türü'ne tıklayın ve bir hücrenin bölümünü temsil eden en küçük birimin altındaki tüm olayları hariç tutmak için eşiği manuel olarak ayarlayın. Adım 5/5'e geçin.
        NOT: Otofloresan sinyalleri hacim olarak en küçük hücre parçasından daha büyükse, yine de devam edin ve istenmeyen sinyalleri sol tıklayıp silerek manuel olarak kaldırın.
      5. Sınıflandırma adımını atın ve tümör hücrelerinin Yüzey görünümünü oluşturmayı tamamlamak için çift yeşil oka tıklayarak segmentasyon sihirbazını tamamlayın (Şekil 5B).
    4. Parçalanmış hücreler birbirine dokunmuyorsa ve benzersiz bir nesne oluşturmuyorsa, bir tümör hücresi kütle nesnesi oluşturmak için bunları yapay olarak birleştirin. Kısacası, belirli değerlerin | hacminin ayrıntılı | İstatistik|e tıklayın. Üstteki etkinliğe sol tıklayıp ardından Shift tuşunu basılı tutarak ve sonuncusuna sol tıklayarak tüm etkinlikleri seçin. Seçimi düzenlemek | birleştirmek | gidin.
    5. Tümör hücre kütlesinin sentroidini tanımlayın. Yeni Noktalar Ekle | tıklayın Otomatik oluşturma | atla Ekle (imleç şununla kesişir) | Nesnenin Merkezi. Segmente edilmiş tümör hücresi kütlesinin merkezi olan noktayı oluşturmak için shift tuşunu basılı tutun ve sol tıklayın.
    6. Her GBM hücresi ile tümör kütlesinin merkezi arasındaki 3D mesafeyi ölçün. Bunu yapmak için, Spot görünümünde kalıp araç simgesini seçerek merkezcil kanala bir mesafe oluşturun | Mesafe Dönüşümü. 488 ve 561 kanalının yanında merkezcil kanala yeni bir mesafe oluşturulmasını bekleyin (mavi renkte, Şekil 5C).
      NOT: Bu kanaldaki her vokselin yoğunluğu, voksel ile tümör hücresi kütlesinin merkezi arasındaki 3D mesafeye karşılık gelir.
    7. Yeni Noktalar Ekle'ye tıklayarak her bölümlenmiş hücrenin merkezine olan 3B mesafeyi ölçün | Otomatik oluşturma | atla Ekle (imleç şununla kesişir) | belirli kanal 561. Shift tuşunu basılı tutun ve hücre çekirdeği alanına sol tıklayın. Bu görevi her hücre için gerçekleştirin (Şekil 5D).
      NOT: Hücrelerin floresan sinyalini daha iyi anlamak için Yüzey görünümünü kaldırın. Alternatif olarak, varsa, daha iyi doğruluk için çekirdek sinyalini (405 nm veya 647 nm sinyal) kullanın.
    8. İstatistik | tıklayın Detaylı | Belirli değerler | yoğunluk ortalaması Ch=merkeze olan mesafe.
      NOT: Yoğunluğun değeri, hücre çekirdeği alanı ile merkezcil arasındaki μm cinsinden 3D mesafedir.
    9. Tümör kütlesinin yarıçapını 4 hpi'de hesaplamak için bu yoğunlukların ortalaması. Analizin her zaman noktası için prosedürü tekrarlayın (24 hpi, 48 hpi ve 72 hpi).
      NOT: Hücre invazyonunu hafife almamak için sadece en çok yayılan 10 veya 20 hücreyi ölçün. Gerçekten de, enjeksiyon sırasında hücrelerin zorla sıkıştırılması, tümör kütlesinin merkezindeki hücrelerin göç etmesini önleyebilir.
    10. İnvazyon indeksini (II), t = 4 hpi tümör kütlesinin ortalama yarıçapı üzerinde en çok yayılmış hücrelerin t = 24 hpi / 48 hpi / 72 hpi'deki ortalama 3D mesafeleri arasındaki oran olarak hesaplayın (Şekil 5E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MT'lerin in vivo GBM invazyonu sırasında oynadığı rolü analiz etmek için, burada lentiviral enfeksiyon ile GBM hücrelerinde stabil MT etiketlemesi, 3 dpf zebra balığı larvalarında GBM hücrelerinin ortotopik ksenotransplantasyonu, MT dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemesi, MTA tedavisi ve GBM invazyonu üzerindeki etkileri ve MT dinamiklerinin ve in vivo invazyonun görüntü analizi için başlıca adımları açıklıyoruz (Şekil 1). MT dinamikleri, büyüyen ve küçülen MT'ler boyunca kimograflar inşa ederek (Şekil 3C) veya zaman içinde bireysel MT kenarlarını manuel olarak izleyerek (Şekil 3D) ölçülür. Larva ortamında uygulanan ilaç tedavisine ve MT ağ organizasyonu üzerindeki geri dönüşümlü etkisine bir örnek Şekil 4'te verilmiştir. Düşük dozda nokodazol (200 nM) ile tedavi, MT ağının ilerleyici büzülmesine ve 4 saat sonra glioblastoma hücre çıkıntısının kaybolmasına yol açar (Şekil 4A). İlacın yıkanması, glioblastoma hücrelerinin çıkıntı oluşturma kapasitesini geri kazandırdı. Hücreler yıkanmadan 12 saat sonra vaskülatür boyunca göç etmeye devam ettiler (Şekil 4B). Bu veriler, 200 nM nokodazol ile tedavinin MT ağını bozmak ve in vivo glioblastoma hücre invazyonunu hızla bloke etmek için yeterli olduğunu göstermektedir. Global glioblastoma hücre invazyonu üzerine aynı tedavinin 3 gün süren bir analizi, nokodazol 200 nM'nin, bir kontrole kıyasla, balığın genel sağlığını etkilemeden, uzun süreli glioblastoma hücre invazyonunu in vivo olarak durdurduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 4C).

Figure 1
Şekil 1: Protokol iş akışı diyagramı. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; hpi = enjeksiyondan sonraki saatler; MT = mikrotübül; MTA = mikrotübül değiştirici ajan; GBM = glioblastoma multiforme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Glioblastoma hücrelerinin 3 dpf zebra balığı larva beyinlerine mikroenjekte edilmesi. (A) Ksenotransplantasyon için kullanılan ekipmanın fotoğrafı: 1, yağ mikroenjektörü; 2, mekanik mikromanipülatör; 3, evrensel kılcal tutucu; 4, cam kılcal damar. Mikroenjeksiyon plakası bir stereomikroskop altındadır. (B) Bir açmada hizalanmış ve mikroenjekte edilmeye hazır anestezi uygulanmış 3 dfp zebra balığı larvalarını gösteren fotoğraf. Kırmızı boya yüklü bir mikrokapiler ucu, fotoğrafın sağında görülebilir. Agaroz levhada inşa edilen desenli siperlerin detayları sağ alt köşedeki iç kısımda görülmektedir. Ölçek çubuğu = 3 mm. (C) Temsili bir mikroenjeksiyon plakasının şeması. Enjekte edilmeye hazır larvalar yanal olarak yerleştirilir (plakanın merkezi). Hücrelerin, enjeksiyona devam etmeden önce mikrokılcal damarın (siyah ok) ucunda yoğunlaştığını unutmayın. Enjekte edilen larvalar, ventralal olarak yerleştirilen plakanın sağında gösterilir. (D) Mikroenjeksiyon plakasındaki enine bir dilimin şeması (C'deki siyah noktalı çizgi boyunca), larvaların enjeksiyon sırasında yerleştirildiği açmaları gösterir. (E) Kılcal damarın ucunu optik tektuma nüfuz etmeye hazır gösteren fotoğraf (noktalı çizgi). Ventriküller beyaz çizgilerle tanımlanır. Ölçek çubuğu = 150 μm. (F) Endotel hücrelerinde gfp'yi eksprese eden 3 dpf fli1a: gfp larvasının şeması, hücrelerin enjekte edildiği OT bölgesini gösterir, orta serebral venin hemen üstünde. (G) U87-mkate2 hücrelerinin (beyaz daire ve beyaz ok) mikroenjeksiyonundan sonra lateral olarak yerleştirilen 3 dpf gfap: gfp larvasının (nöral kök hücrelerde eksprese edilen gfp) floresan görüntüsü. Kırmızı renkteki yüksek otofloresan, gözlerdeki iridoforlardan kaynaklanır. Ölçek çubuğu = 100 μm. (H) 16 hpi'de başarıyla enjekte edilen bir fli1a: gfp larvasının konfokal floresan görüntüsü. Ölçek çubuğu: 50 μm. (I-K) 96 hpi (I) ve 4 hpi (J, K) 'de başarısız enjekte edilen fli1a: gfp larvalarının konfokal floresan görüntüleri. GBM hücreleri ventriküllere (I,J) veya beyindeki çoklu odaklara (K) enjekte edilmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: dpf = döllenmeden sonraki günler; OT = optik tektum; MCeV = orta serebral ven; gfp = yeşil floresan protein; gfap = glial fibriler asidik protein; hpi = enjeksiyondan sonraki saatler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Glioblastoma hücrelerinde in vivo mikrotübül dinamiklerinin görselleştirilmesi. (A) 20 hpi'de bir fli1a:GFP zebra balığı larvasının OT'sinde tübülin-α1-mkate2 eksprese eden ksenograflanmış U87 hücrelerinin temsili floresan görüntüsü. (B) Tek bir ksenograflanmış U87 hücresinde MT ağının maksimum yoğunlukta yansıtılan floresan görüntüsü. (C) MT dinamik kararsızlığının büyüme, duraklama ve felaket aşamalarını gösteren, B'deki kırmızı noktalı çizgi boyunca kimograf. (D) Üç MT + ucunun izlenmesini vurgulayan B kutusundaki bölgenin hızlandırılmış dizisi. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: OT = optik tektum; GFP = yeşil floresan protein; hpi = enjeksiyondan sonraki saatler; MT = mikrotübül; G = büyüme evresi; P = duraklatma aşaması; C = felaket evresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Mikrotübül değiştirici ajanın glioblastoma invazyonu üzerindeki etkilerinin in vivo olarak görselleştirilmesi. (A) Nokadazol (200 nM) ile tedavi edilen zebra balığı larvalarında tübülin-α1a-mkate2 eksprese eden U87 hücrelerinin hızlandırılmış dizisi. Oklar, bir kan damarı boyunca beyni istila eden iki farklı hücredeki çıkıntının ekstremitesine işaret eder. Nokodazol ile tedavi üzerine çıkıntının geri çekilmesine dikkat edin. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Nokodazol yıkamasının U87 hücre invazyonu üzerindeki etkisini temsil eden hızlandırılmış dizi. Yıkamadan 500 dakika sonra, beyaz yıldız işareti ile işaretlenmiş hücre, bir kan damarı boyunca istilanın yeniden başlamasına izin veren MT bazlı bir çıkıntıyı (beyaz ok) uzatır. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) 72 saat boyunca DMSO veya nokodazol (200 nM) ile tedavi edilen ksenograflanmış larva beyninin 3D gösterimleri. U87 hücrelerinin sinyali bölümlere ayrılmıştır (kırmızı renkte) ve fli1a-GFP floresan sinyaline (beyaz) entegre edilmiştir. Nokodazol ile tedavi edilen U87 hücrelerinin azalmış yayılımına dikkat edin. Ölçek çubuğu = 30 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; hpi = enjeksiyondan sonraki saatler; MT = mikrotübül. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: İn vivo glioblastoma invazyonunun görüntü analizi. (A) Fli1a-GFP zebra balığı larvalarında sitozolik mKate2 eksprese eden ksenograflanmış U87 hücrelerinin floresan görüntüleri, 4 hpi. Beyaz yıldız işaretleri, göz iridoforlarından tipik otofloresanın altını çizer. Ölçek çubuğu = 40 μm. (B) Fli1a-GFP larvalarının floresan görüntüsü, A'daki U87 hücre sinyaline karşılık gelen parçalanmış yüzeyle birleştiğinde. Tümör kütlesinin sentroidi yeşil görünür. Ölçek çubuğu = 40 μm. (C) A'daki kırmızı kanal sinyalini ve yeni tanımlanan "merkeze olan mesafe" kanalını (mavi renkte) temsil eden floresan görüntü. Ölçek çubuğu = 30 μm. (D) Kırmızı kanal floresan görüntüsü, rengi hücrenin merkeze olan mesafesini (yeşil renkte), menekşe merkeze en yakın ve beyaz birbirinden en uzak olanı temsil eden renkli lekelerle üst üste bindirilmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (E) Küresel GBM istilasının sıralı analizine bir örnek. 3D mesafeler 4 hpi ve 72 hpi'de belirlenir ve istila indeksi (II) gelen kutusundaki formüle göre hesaplanır. Ölçek çubuğu = 20 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; hpi = enjeksiyondan sonraki saatler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tümör ksenogreftlerinin tek hücre çözünürlüğünde görüntülenmesi, GBM biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için vazgeçilmez bir araç haline gelecektir. Fare PDX modellerinde canlı görüntüleme, GBM'nin toplu olarak beyin dokusunu nasıl istila ettiğine dair değerli keşiflere yol açmıştır18. Bununla birlikte, bugüne kadar, uzaysal zamansal çözünürlük, GBM istilasını kontrol eden proteinlerin dinamiklerini ortaya çıkaracak kadar yüksek değildir. Şeffaf zebra balığı larvalarındaki GBM hücrelerinin ortotopik engraftingini yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile birleştirerek, MTs gibi sitoiskelet proteinlerinin in situ GBM invazyonu sırasında dinamiklerini analiz etmek için yeterli ayrıntıda analiz edilebileceğini düşündük .

Metodolojinin kritik adımları, GBM hücrelerinin hazırlanmasında ve mikroenjeksiyon prosedüründe yatmaktadır. Sağlıksız ve yetersiz ayrışmış hücreler birbirine veya kılcal sınırlara yapışacak ve enjeksiyon akışını engelleyecektir. Ek olarak, hücrelerin enjekte edilen hacmi en aza indirmek ve toplu olarak implante etmek için kılcal damarda yeterince konsantre olmaları gerekir. Daha yüksek hacimli daha seyreltilmiş hücrelerin enjekte edilmesi, invaziv indekslerinin ölçülmesi zorlaşan çoklu, bazen birbirine karışmış tümör odaklarına neden olacaktır. Ellerimizde, yağ bazlı mikroenjektörün manuel olarak kullanılması, enjeksiyon akışının daha önce benzer bir model19'da kullanılmış olan basınçlı hava bazlı elektronik bir mikroenjektörden daha iyi kontrol edilmesini sağlar. Bu, beynin içindeki aşırı akış basıncını önlemek, böylece enjekte edilen hücrelerin sonraki doku hasarını ve ventriküler agregasyonunu önlemek için kritik öneme sahiptir.

Bu modelin bazı sınırlamaları, deneyin her iki tür için de optimal olmayan sıcaklıklarda yapılması gerekliliğini içerir. Zebra balığı genellikle 28 ° C'de yetiştirilirken, insan hücreleri 37 ° C'de kültürlenir. 32 ° C'nin üzerinde, zebra balığı embriyo gelişimi değişir ve bu değişiklikler ölümcül olabilir35. Bununla birlikte, yetişkin zebra balığı ksenogreft modelleri36'da yapılanlara benzer şekilde, zebra balığı larvalarını sırayla 32 ° C'lik bir sıcaklığa alıştırmak, nakli sonrası sıcaklıktaki hızlı değişime kıyasla nakledilen hayvanların hayatta kalmasını arttırır 28 ° C'den 32 ° C'ye. Bununla birlikte, sıcaklığın daha da arttırılması, zebra balığı embriyolarının 32 ° C35'in üzerindeki sıcaklıklara duyarlılığına uygun olarak hayvan ölümlerinin artmasına neden olur.

In vivo MT dinamiği verilerinin yorumlanması, sıcaklık 37 ° C'nin altına düştüğünde MT dinamikleri değiştiğinde dikkatli bir şekildeyapılmalıdır. Aynı MTA tedavisi ile aynı GBM hücrelerinde 37 ° C ve 32 ° C'de MT dinamiklerinin paralel in vitro ölçümü, çeşitli GBM hücreleri arasında veya in vivo tedaviler arasında görülen farklılıkların doğrulanmasına yardımcı olacaktır. Farklılıkların sıcaklık duyarlılığındaki değişimden değil, farklı regülasyon yollarından (GBM karşılaştırma analizi için) veya MTA tedavisinden (MTA etki analizi için) kaynaklandığını doğrulamaya yardımcı olmalıdır. MT dinamiği heterojenliklerinin farklı istila yetenekleriyle bağlantılı olması durumunda bu ilgi çekici olacaktır.

Diğer bir sınırlama ise, MT dinamiği38'deki potansiyel değişikliklerin neden olduğu istila plastisitesinin ölçülmesini önleyen istilanın izlenebileceği kısa zaman penceresidir (72 ila 96 saat). 96 saat sonra, GBM hücre invazyonunda keskin bir düşüş olduğunu fark ettik. Enjeksiyondan 6 gün sonra, GBM hücrelerinin sayısı, muhtemelen tümör mikroortamında nötrofillerin ve makrofajların birikmesinden kaynaklanan bir konakçı bağışıklık tepkisi nedeniyle hızla azalmıştır39. MTA'ların tüm beyne verilmesinin, aktiviteleri için MT'lere bağlı olan ve değişiklikleri daha sonra GBM invazyonu40'ı etkileyebilecek yakındaki nöronal konakçı hücreleri etkilemesi muhtemeldir. Bu yaklaşımın, GBM hücrelerine MT değişikliğini kısıtlayan shRNA veya optogenetik tahlillerle tamamlanması gerekir, ancak yeni anti-invaziv bileşikleri taramak için iyi bir platform olmaya devam etmektedir.

Zebra balığı beynindeki MT etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu, kanser hücresi istilası sırasında MT'lerin rolünü deşifre etmek için özellikle ilgi çekicidir, çünkü çok az sayıda hayvan modeli, menşe dokularında kanser hücresi göçünün in situ hücre altı görüntülenmesine izin verir15. Bugüne kadar, GBM göçü sırasında MT fonksiyonlarının çalışmaları çoğunlukla in vitro ve ex vivo testlere dayanmaktadır ve in vivo doğrulama eksikliği24,41,42,43'tür. İlgilenilen genin yıkılması veya tarafsız bir gen tabanlı tarama yaklaşımı ile birleştiğinde, burada sunulan tahlil, GBM invazyonu için in vivo olarak önemli olan yeni MT düzenleyicilerinin ortaya çıkarılmasına yardımcı olacaktır.

GBM'ler, invaziv özellikleri44 örnekleri arasında büyük farklılıklar gösteren oldukça heterojen tümörlerdir. Farklı istila modlarının altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak, GBM'nin yayılmasını engellemek için geçici terapötik tedavilerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Çeşitli GBM örneklerinde invaziv indeksin, invazyon modunun ve MT dinamiği gibi sitoiskelet özelliklerinin sistematik ölçümü, sık görülen genomik mutasyon profilleri ile spesifik sitoiskelet özelliklerine dayanan hücre invazyon paternleri arasındaki yeni korelasyonları ortaya çıkaracaktır. Bu mutasyonların MT dinamiklerindeki değişimi nasıl etkilediğini ortaya çıkarmak, sadece hücre göçü45,46 sırasında MT regülasyonu hakkındaki bilgilerimize katkıda bulunmakla kalmayacak, aynı zamanda uzun zamandır beklenen hastaya özgü, anti-invaziv terapötiklere de yol açacaktır.

Zebra balıklarında mikroenjeksiyonun göreceli kolaylığı, mevcut larva sayısının yüksek olması ve ilaç enjeksiyonunun kolaylığı ile birleştiğinde, bu prosedürü kişiselleştirilmiş tıp için uygun hale getirmektedir47,48. Dahası, farelerde GBM ksenogreftlerinin intravital görüntülemesinin aksine, sadece korteks49,50'nin üst 500 μm kısmında meydana gelir, zebra balığı kullanılarak tüm CNS'de GBM infiltrasyonunun görselleştirilmesine izin verilir. Burada sunulan model, glioblastomun invaziv kapasitelerinin ve tedavilere yanıtının hızlı analizi için paha biçilmez bir araç olma kriterlerini karşılamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Dr. P. Herbomel'e (Institut Pasteur, Fransa) ve laboratuvarına, özellikle Valérie Briolat ve Emma Colucci-Guyon'a, zebra balığı hatlarını ve mikroenjeksiyon plakaları için plastik kalıbı bize sağladıkları ve zebra balığı deney prosedürleri konusundaki değerli uzmanlıkları için son derece minnettarız. UtechS Fotonik BiyoGörüntüleme'ye (C2RT, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı France BioImaging tarafından desteklenen Pasteur Enstitüsü ve ANR-10-INBS-04; Geleceğe Yönelik Yatırımlar). Bu çalışma Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Centre National de la Recherche Scientifique ve Institut Pasteur ve Bayan Marguerite MICHEL ve Bay Porquet'in cömert bağışlarıyla.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Biyoloji Sayı 185 Ortotopik ksenogreft PDX Zebra balığı Danio rerio Glioblastoma Subcellular intravital görüntüleme 5D görüntü analizi
Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter