Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

אנו מדווחים על טכניקה המאפשרת הדמיה חיה של דינמיקה של מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה (GBM) הפולשים לרקמת מוח של בעלי חוליות. צימוד ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המתויגים באופן פלואורסצנטי למוח שקוף של דגי זברה עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה מאפשר מדידה של דינמיקת השלד הציטוסקולרי במהלך פלישת סרטן באתרו .

Abstract

עם זמן הישרדות חציוני עגום באוכלוסיות אמיתיות - בין 6 ל -15 חודשים - גליובלסטומה (GBM) היא גידול המוח הממאיר ההרסני ביותר. כישלון הטיפול נובע בעיקר מהפולשנות של תאי GBM, מה שמדבר על הצורך בהבנה טובה יותר של תכונות תנועתיות GBM. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי התומך בפלישת GBM, נדרשים מודלים פיזיולוגיים חדשים המאפשרים אפיון מעמיק של דינמיקה של חלבונים במהלך הפלישה. תצפיות אלה יסללו את הדרך לגילוי מטרות חדשות לחסימת חדירת גידולים ולשיפור תוצאות המטופלים. מאמר זה מדווח כיצד שתל אורתוטופי של תאי GBM במוח של דגי זברה מאפשר הדמיה חיה תוך-תאית תת-תאית. תוך התמקדות במיקרוטובולים (MTs), אנו מתארים הליך לתיוג MT בתאי GBM, מיקרו-הזרקה של תאי GBM במוח השקוף של 3 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי דגי זברה, הדמיה תוך-חיונית של MTs בהפצת קסנוגרפטים, שינוי הדינמיקה של MT כדי להעריך את תפקידם במהלך פלישת GBM, וניתוח הנתונים שנרכשו.

Introduction

תנועתיות תאים היא תהליך סטריאוטיפי הדורש התבססות ציר קוטביות וסידור מחדש של ציטוסקטליים המייצרים כוח. פילמור אקטין והקשר שלו למיוזין מוכרים כתורמים העיקריים לכוחות בולטים ומתכווצים הנדרשים לתנועת תאים1. מיקרוטובולים נחשבים לשחקנים העיקריים בקיטוב התאים ובהתמדה כיוונית במהלך נדידה2. בשנים האחרונות הוכח גם כי MTs יוצרים ומייצבים בליטות כדי לתמוך בכוחות מכני-דחיסה במהלך פלישת תאים בתלת-ממד3. לאחרונה, MTs היו מעורבים ישירות במכניוטרנסדוקציה בהידבקויות מוקדיות והגירה מכאנו-סנסיטיבית4. חוסר היציבות הדינמי המאפיין את דינמיקת הקצה של MT-plus מורכב משלבים חוזרים ונשנים של פילמור (גדילה) ודה-פולימריזציה (התכווצות), הנשלטים על ידי שפע של חלבונים קושרי מיקרוטובולים ומפלי איתות תוך-תאיים, כגון אלה הנשלטים על ידי RHO-GTPases 5,6,7. תפקידה של רשת MT בנדידה ובפלישה של תאים הפך את חקר הדינמיקה של MT למרכיב מפתח להבנה טובה יותר של המנגנונים של ביות תאי מערכת החיסון, ריפוי פצעים ופלישה לסרטן.

היכולת של תאים סרטניים להימלט מליבת הגידול הראשונית, להתפשט ברקמות ולייצר גידולים משניים היא צעד קריטי במניעת הצלחה עולמית במלחמה בסרטן שהוכרזה לפני 50 שנה לפני 8,9. אחד המכשולים הגדולים ביותר היה הבנת האופן שבו תאים סרטניים פולשים באופן פעיל לרקמה. מנגנוני פלישה מרכזיים מסתמכים על אותם עקרונות כמו אלה השולטים בנדידה של תאים שאינם סרטניים10. עם זאת, מאפיינים ספציפיים של נדידת תאים סרטניים הופיעו11, מה שמעורר את הצורך באפיון טוב יותר של סוג זה של הגירה. באופן ספציפי, מכיוון שהמיקרו-סביבה של הגידול מופיעה כשחקן מפתח בהתקדמות הסרטן12, התבוננות וניתוח של פלישת תאים סרטניים בהקשר פיזיולוגי רלוונטי היא חיונית כדי לפענח את המנגנונים של הפצת תאים סרטניים.

MTs הם מרכזיים בהתקדמות הסרטן, כדי לקיים הן התפשטות והן פלישה. ניתוח מדויק של דינמיקת MT באתרו יכול לסייע בזיהוי חומרים משני MTA (MTA) בשני התהליכים. דינמיקת MT משתנה באופן דרסטי עם שינוי בסביבה. במבחנה, טיפול בחומרים מערערי יציבות MT כגון nocodazole מונע היווצרות בלט תאים כאשר תאים מוטבעים בג'לים בתלת-ממד, בעוד שיש לו השפעה מועטה על נדידת תאים דו-ממדית13,14. למרות שזה מאתגר מבחינה טכנית, ההתקדמות בהדמיה תוך-חיונית מאפשרת ניתוח in vivo של דינמיקת MT במהלך פלישה של תאים סרטניים. לדוגמה, תצפית של MTs בתאי פיברוסרקומה תת-עוריים בעכברים גילתה כי מקרופאגים הקשורים לגידול משפיעים על דינמיקת MT בתאי גידול15. עם זאת, מודלים אלה של עכברים כרוכים בהליכים כירורגיים נרחבים ונשארים לא מספקים עבור סוגי סרטן פחות נגישים, כגון גידול המוח הפולשני ביותר, GBM.

למרות זמן הישרדות עגום של15 חודשים ממוצע 16, מעט ידוע על אופן ההפצה של GBM בתוך הפרנכימה המוחית או על האלמנטים המולקולריים העיקריים המקיימים פלישה של תאי GBM לרקמת המוח. שיפור במודל xenograft אורתוטופי של עכבר (PDX) והקמת חלונות גולגולתיים הציעו סיכויים חדשים למחקרי פלישה לתאי GBM17,18. עם זאת, בשל איכות ההדמיה הלא אופטימלית, מודל זה התיר בעיקר הדמיה אורכית של קסנוגרפטים שטחיים ולא שימש בהצלחה לחקר הדמיה תת-תאית של חלבוני שלד ציטוסקטלי עד כה. יתר על כן, בעקבות צו המניעה "3Rs" להפחתת השימוש במכרסמים והחלפתם בבעלי חוליות נמוכים יותר, הוקמו מודלים חלופיים.

תוך ניצול החסינות הפרימיטיבית שנצפתה בזחלי דגי זברה (Danio rerio), פותחה הזרקה אורתוטופית של תאי GBM במוח הדג 19,20,21. הזרקה בקרבת החדרים במוח האמצעי המתפתח משחזרת את רוב הפתופיזיולוגיה האנושית של GBM21, ואותו דפוס מועדף של פלישת GBM כמו בבני אדם-כלי שיט משותף - נצפה22. הודות לשקיפות של זחלי הדגים, מודל זה מאפשר הדמיה של תאי GBM הפולשים למוח מהאזורים הפרי-חדריים שבהם רוב GBMs נחשבים להתעורר23.

מכיוון ש-MTs חיוניים לפלישה לתאי GBM במבחנה 24,25, יש צורך באפיון טוב יותר של דינמיקת MT וזיהוי של רגולטורים מרכזיים במהלך פלישה לתאים. עם זאת, עד כה, הנתונים שנוצרו עם המודל האורתוטופי של דג הזברה לא כללו ניתוח תת-תאי של דינמיקת MT במהלך תהליך הפלישה. מאמר זה מספק פרוטוקול לחקר הדינמיקה של MT in vivo ולקביעת תפקידו במהלך פלישה לסרטן המוח. בעקבות תיוג יציב של מיקרוטובולים, תאי GBM מוזרקים במיקרו-אינדסטריקט ב-3 dpf במוחם של זחלי דגי זברה ומצולמים בזמן אמת ברזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה במהלך התקדמותם ברקמת המוח. הדמיה חיה של MTs פלואורסצנטיים מאפשרת ניתוח איכותי וכמותי של דינמיקת MT plus-end. יתר על כן, מודל זה מאפשר להעריך את ההשפעה של MTAs על הדינמיקה של MT ועל התכונות הפולשניות של תאי GBM בזמן אמת. פרוטוקול לא פולשני יחסית זה בשילוב עם מספר רב של זחלים המטופלים בו זמנית וקלות היישום של התרופה (במי הדגים) הופכים את המודל לנכס לבדיקות פרה-קליניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי לטיפול בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים של מכון פסטר - CEEA 89 ומשרד המחקר והחינוך הצרפתי (היתר #01265.03). במהלך זריקות או מפגשי הדמיה חיים, בעלי חיים הורדו עם Tricaine.At סיום ההליכים הניסיוניים, הם הומתו על ידי מנת יתר של חומר הרדמה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לחומרים, לציוד ולתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה. זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול מתוארת באיור 1.

1. יצירת תאי גליובלסטומה המבטאים ביציבות α-טובולין-mKate2

הערה: השלבים הבאים מבוצעים בארון בטיחות ביולוגית BSL2+.

  1. לייצר חלקיקים לנטי-ויראליים המבטאים mKate2-tubulin באמצעות שיטת סידן פוספט להעברה של 7 × 106 תאי HEK-293T.
    1. בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסף 10 מיקרוגרם של פלסמיד psPAX2 אריזה מהדורהשני , 5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפת ויראלית pMD2.G, ו-10 מיקרוגרם של הפלסמיד המעניין, pGK-mKate2-tubulin אנושי α1a עם 50 μL של CaCl2 (מלאי 2.5 M). כוונן ל-500 μL עם H2O סטרילי ללא DNAse.
      הערה: חשוב להוסיף CaCl2 אחרון.
    2. מערבבים על ידי היפוך הצינור כמה פעמים ודוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. במהלך הדגירה, להכין עוד 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge עם 500 μL של מלח HEPES-buffered (HBS), pH 7.0 (2x).
    4. לאחר 20 דקות, הוסף את תערובת CaCl2/DNA טיפה אחר טיפה לתמיסת HBS (2x). מערבבים על ידי היפוך הצינור כמה פעמים. דגירה במשך 12 דקות ב- RT.
    5. לאחר 12 דקות, הוסיפו בעדינות את CaCl2/DNA מעורבב עם HBS ישירות על צלחת של 70% משקעים בקוטר 10 ס"מ של תאי HEK-293T, טיפה אחר טיפה.
    6. השאירו את התאים באינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 36-48 שעות.
    7. אספו את הסופר-נטנט וסובבו אותו ב-3,000 × גרם למשך 5 דקות כדי להסיר פסולת תאית.
    8. כדי לרכז את החלקיקים הנגיפיים, טען את הסופר-נטרנט לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה וסובב אותו כלפי מטה ב-47,508 × גרם למשך 90 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    9. השליכו את השפופרת והניחו את הצינור הפוך על נייר כדי לייבש את החלק הפנימי של הצינור.
    10. הוסיפו 30 μL של PBS לכדור הנגיפי. אין להשעות את הכדור. להשאיר ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    11. החזירו בעדינות את החלקיקים הנגיפיים על ידי זליגה למעלה ולמטה. הימנעו מיצירת בועות. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: ניתן לייצר כמויות גדולות יותר של חלקיקים נגיפיים על-ידי העברת לוחות מרובים של תאי HEK-2-93T.
  2. להדביק תאי גליובלסטומה בחלקיקים לנטי-ויראליים.
    הערה: פרוטוקול זה נכתב עבור קווי תאי גליובלסטומה מסחריים כגון U-87 MG, U-373 MG או T98. כדי להשתמש בתאי גליובלסטומה ראשוניים שמקורם בחולה, השתמש בציפוי ספציפי של הצלחות ובמדיום שאינו מבוסס סרום26.
    1. הכינו צלחת של 70% תאי גליובלסטומה U-87 MG שגודלו במדיום החיוני המינימלי (MEM) של Eagle בתוספת 10% סרום עגל עוברי, פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי של 100 יחידות/מ"ל לפניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל לסטרפטומיצין) וחומצות אמינו לא חיוניות (פי 1).
    2. הוסיפו את החלקיקים הנגיפיים בדילול של 1 ל-5,000 ישירות על התאים. מערבבים עם מערבולת עדינה. אפשר לווירוסים להדביק את התאים למשך לא יותר מ -20 שעות.
    3. הסר את המדיום המכיל וירוס והחלף אותו במדיום תרבית טרי. אפשר את הביטוי של טובולין מתויג במשך 48-72 שעות.
      הערה: יש לבצע את השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית BSL2.
    4. מיין את התאים באמצעות FACS כדי לבחור את 15% הבהירים ביותר של תאי mKate2+ . לאחר הסרת פסולת ותאים כפולים באמצעות פיזור קדימה וצד (FCS לעומת SSC), יש למרוח גמירה נוספת על תאי mKate2+ הבהירים ביותר של 30% כדי לשמור על 15% העליונים.
    5. הגבר את התאים המסומנים ב- MT.
      הערה: לחלופין, ניתן לבצע בחירה קלונית המבוססת על רמות גבוהות של טובולין-mKate2 תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

2. הכינו זחלי דגי זברה למיקרו הזרקה

  1. צור ביצי דג זברה.
    1. הניחו שלושה זכרים וארבע נקבות מזן דג הזברה הרצוי במיכל הזדווגות בתוספת גולות 4 ימים לפני הקסנוטרנספלנטציה, בשעות אחר הצהריים המאוחרות.
      הערה: הקווים Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) או Tg(Huc:gfp) משמשים לסימון כלי דם אנדוגניים, תאי גזע עצביים/אסטרוציטים ונוירונים, בהתאמה.
    2. אספו את הביצים המיוצרות על ידי השרצה הנגרמת על ידי שיש בבוקר שאחרי.
    3. נקו את הביצים על ידי העברתן לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל מלא במי מקור מינרליים27 בתוספת אקונומיקה (0.004% סופי). הפוך בעדינות את הצינור למשך 5 דקות. יש לשטוף פעמיים במים מינרליים בלבד.
    4. העבירו את הביצים לצלחת פטרי המכילה את המים המינרליים בתוספת 0.28 מ"ג/מ"ל מתילן כחול.
    5. הסר את הביציות הלא מופרות ועצורות הפיתוח. לדגום את העוברים ב 28 מעלות צלזיוס.
  2. צור זחלים שקופים.
    1. הציגו N-פנילתיוראה (PTU) (0.003% סופי) למדיום 8 שעות מאוחר יותר, כדי למנוע פיגמנטציה של מלנין ולהבטיח שקיפות אופטית. שמור את PTU במדיום למשך שאר הפרוטוקול.
      הערה: מכיוון שטיפול ב-PTU עלול לגרום לפגמים התפתחותיים, בחר רק את הזחלים המפותחים בדרך כלל עבור xenotransplantation. כחלופה לטיפול כימי, ניתן להשתמש בזן דג הזברה המוטנטי קספר (נקרה ורועי אורביסון מוטציה כפולה), שבו הפיגמנטציה נעדרת28.
    2. להעלות את טמפרטורת הדגירה ל 29 °C (75 °F).
    3. הגדל את הטמפרטורה בכל יום ב -1 ° C כך זחלי 3 dpf להגיע 32 ° C ביום ההזרקה.
  3. הכינו את צלחת המיקרו הזרקה.
    1. הכינו 20 מ"ל של 1% אגרוז + 0.28 מ"ג/מ"ל מתילן כחול עם מים מינרליים.
    2. יוצקים את האגרוז לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ ומורחים במהירות את תבנית הפלסטיק במיקרו-הזרקה במהופך כדי ליצור תעלות בצורת V ברוחב 2.5 מ"מ (איור 2B).
      הערה: תבנית הפלסטיק זמינה באופן מסחרי או שניתן לבנות אותה בתוך הבית בהתאם לעיצוב המתואר בספר דג הזברה29.
    3. בזהירות להסיר את תבנית פלסטיק כאשר agarose התמצק.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות יציקת מיקרו-הזרקה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
  4. הכן את הזחלים עבור xenotransplantation.
    1. ביום ההזרקה, יש לבדוק את הביטוי הטרנסגני הפלואורסצנטי הנבחר בזחלי 3 dpf. הסר את בעלי החיים שאינם פלואורסצנטיים, בעלי מראה חריג.
    2. נטרלו את הזחלים באופן ידני בעזרת מלקחיים עדינים. ב 3 dpf, בעדינות לתקוע או לקרוע לפתוח את chorions עם שני זוגות של מלקחיים עדינים כדי לשחרר את הזחלים מן chorion.
      הערה: לחלופין, טיפול אנזימטי עם פרונז A יכול לשמש כדי dechorionate זחלים, בדרך כלל ב 24 hpf.
    3. שמרו על הזחלים המנופחים בתווך מים מינרליים עם מתילן כחול (0.28 מ"ג/מ"ל) ו-PTU (0.003% סופי).

3. הליך Xenotransplantation

  1. הכינו מחטי מיקרו הזרקה.
    1. קח נימי זכוכית בורוסיליקט ללא נימה מרכזית והנח אותו במשיכת מחט אנכית.
    2. באמצעות ההגדרות הבאות - להגדיל 8.5 ומחמם 3-למתוח את הנימי כדי להפוך אותו מחט microinjection.
  2. הגדר את המיקרו-אינג'קטור.
    1. טען שמן מינרלי במיקרו-מזרק ידני. הסר בועות אוויר.
    2. חברו מחזיק נימי אוניברסלי למיקרו-אינז'קטור וחברו אותו בחוזקה למיקרומניפולטור מכני (איור 2A).
  3. לקצור את תאי הגליובלסטומה.
    הערה: השלבים הבאים מתבצעים בארון בטיחות ביולוגית BSL2.
    1. הכן צלחת 10 ס"מ של תאי גליובלסטומה, כך שהם מגיעים 80% מפגש ביום ההשתלה.
    2. (אופציונלי) תייג באופן זמני את גרעיני התא על ידי הוספת Hoechst 35480 (200 ננוגרם/מ"ל) לתאים. לדגור במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור התא הלח ולשטוף 2x עם PBS.
    3. הוציאו את צלחת התאים מהאינקובטור ושטפו פעם אחת עם PBS. נתק את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA ודגרה במשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור התא עד שכל התאים מנותקים לחלוטין.
      הערה: שלב זה הוא קריטי מכיוון שטריפסיניזציה לקויה תגרום לכך שאגרגטים של תאים יישארו תקועים במחט.
    4. יש להשעות את התאים ב-5 מ"ל של מדיום שלם של תאי גליובלסטומה בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. הוסיפו 45 מ"ל של PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-134 × גרם למשך 5 דקות.
    5. השליכו את ה-supernatant והחזירו את התאים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח על ידי צנרת מעלה ומטה ביסודיות.
      הערה: שלב זה של דיסוציאציה מכנית מסייע מאוד במניעת הסיכון של סתימה בנימים במהלך מיקרו הזרקה.
    6. הוסיפו 49 מ"ל של PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-134 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופר-נאטנט והחזירו את התאים ב-200 מיקרוגרם של PBS קר כקרח. יש לאחסן על קרח למשך הליך ההשתלה.
  4. הזריקו את תאי הגליובלסטומה לזחלי דגי הזברה במרכז המוח.
    1. מלאו צלחת יציקת מיקרו-הזרקה ב-6 מ"ל של E3-medium30 בתוספת טריקיין במינון 160 מ"ג/ליטר.
    2. להעביר תריסר זחלים dechorionated לתוך צלחת microinjection. לאחר שלא הגיבו למגע, יישרו אותם בתעלות שבצד שלהם, ראש למעלה, ושק החלמון נדחף אל קיר התעלה, עם מברשת צבע בגודל 00 (איור 2B,C).
    3. השהה את תאי הגליובלסטומה. טען 5 μL של תאים לתוך microcapillary באמצעות קצוות microloading והכנס את נימי לתוך מחזיק נימי אוניברסלי.
    4. מניחים את לוחית המיקרו-הזרקה המכילה את הזחלים שאינם מגיבים מתחת לסטריאומיקרוסקופ. מניחים את קצה המיקרו-קפילרי על גבול לוחית המיקרו-הזרקה באמצעות ידיות המיקרומניפולטור. לשבור אותו עם אזמל כדי ליצור נקודת כניסה חדה, בערך בגודל של קוטר התא.
    5. ודא שהתאים זורמים מתוך הנימים על ידי הזרמת שמן בעדינות במיקרו-אינז'קטור וצניחת קצה המחט לתוך המדיום. רכז את התאים בקצה הנימי כדי למקסם את מספר התאים המוזרקים לכל נפח שנפלט, והימנע ממילוי רקמת המוח ב-PBS (איור 2C).
    6. בחנו היטב את התאים היוצאים מהמיקרו-קפילרי כאשר שמן מוכנס ידנית לתוך המזרק. הגדר באופן אמפירי כמה סיבוב נדרש בידית הידנית כדי לספק 20 עד 50 תאים. בדרך כלל, אם התאים מרוכזים מספיק, מספיק סיבוב עדין אחד כדי לפלוט ~10 תאים.
      הערה: אם הנוזל אינו זורם כראוי מתוך המיקרו-קפילרי, נסה לשחרר את החיבור של המיקרו-קפילרי במחזיק הנימים. על ידי כך, שמן עלול לדלוף ולטפטף לאורך הנימים.
    7. התקרבו לקצה הנימי כנגד הטקטום האופטי השמאלי (OT), ממש מעל הווריד המוחי האמצעי (MCeV, איור 2F).
    8. לחצו בעדינות על הנימים כנגד הזחלים עד שקרום העור נשבר (איור 2D,E).
      הערה: אל תדחפו חזק מדי מכיוון שהדבר יגרום להזרקת התאים עמוק מדי במוח, שם הבהירות האופטית הנמוכה יותר תמנע התבוננות ב-MTs בפירוט. טכניקת ההדמיה אפשרית לעומק המגיע ל 250-300 מיקרומטר. עם זאת, מומלץ לא להזריק עמוק יותר מ -100 מיקרומטר מפני השטח של הדג.
    9. ברגע שמגיעים למיקום מתאים ב-OT, מוציאים את התאים. בזהירות לבחון את קצה הנימי כדי לדמיין את זרם התאים נכנס בתוך החיה, ובכך להבטיח הזרקה מוצלחת.
      הערה: היזהרו לא להזריק לחדרים (איור 2E). ברגע שהם מגיעים לחדרים, התאים נוטים להצטבר ולהיתקע במקום לחדור לרקמה (איור 2I). הזרקת חדרים מאופיינת בנפיחות אינטנסיבית של המוח ובהפצה נצפית של תאים מוזרקים למוח הקדמי ולמוח האחורי (איור 2J).
    10. חזור על ההליך משלבים 3.4.9-3.4.11 עבור בעלי חיים רבים ככל הנדרש. המשך במהירות כדי למנוע גושים של תאים בנימי.
      הערה: בהתאם למהירות ההזרקה של הנסיין, ייתכן שיהיה צורך בהחלפת מחט כל 10 עד 20 זחלים.
    11. לאחר השלמת ה-xenotransplantation, הסירו את הזחלים מצלחת המיקרו-הזרקה ובודדו אותם בצלחת בת 24 בארות מלאה במי מקור מינרליים + PTU + מדיום כחול מתילן.
    12. אמת הזרקה מוצלחת על-ידי התבוננות בזחלים תחת סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2G). בחרו רק קסנוגרפטים המכילים מסת גידול יחידה שנוצרת על-ידי 20-50 תאים הממוקמים ב-200 המיקרומטר העליונים (ב-z) של ה-OT (איור 2H לעומת הזרקה לא מוצלחת באיור 2I-K).
      הערה: התשואה של xenografts מקומיים בהצלחה משתנה מ 10% בהתחלה כמעט 100% עם תרגול.
    13. תנו לזחלים להתאושש לפחות 4 שעות ב-32 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה.
      הערה: הוספת אנטיביוטיקה בתווך אינה מגדילה את שיעור ההישרדות של הזחלים. בשלב זה, אם מיקרו הזרקה בוצעה כראוי, כמעט 100% מהדגים שורדים.

4. הדמיה תוך-חיונית של גליובלסטומה קסנוגרפטים

  1. הרכיבו את הזחלים להדמיה חיה.
    הערה: ניתן לדמות זחלים מ-4 שעות לאחר ההזרקה (hpi). הדמיה חיה של MT מבוצעת בדרך כלל מ 20 hpi, כאשר תאי GBM פולשניים החלו להרחיב בליטות ולנדוד הרחק ממסת הגידול.
    1. הכינו תמיסת אגרוז עם התכה נמוכה של 1%. העבירו 500 μL של תמיסת אגרוז מותחת עם 1% התכה נמוכה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ותנו לו להתקרר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס על בלוק חום. מוסיפים טריקיין (112 מיקרוגרם/מ"ל) לאגארוז ומערבבים היטב.
    2. מעבירים זחל אחד עד ארבעה זחלי קסנוגרפט בצלחת פטרי בקוטר 3.5 ס"מ מלאה במי מקור מינרליים + PTU + מדיום מתילן בתוספת טריקיין (112 מיקרוגרם/מ"ל). לאחר שהזחלים אינם מגיבים למגע, העבירו אותם בזהירות לתוך הצינור המכיל את האגרוז ואת הטריקיין באמצעות פיפטה בעלת קצה עדין.
      הערה: שמור על נפח בינוני למינימום כדי להגביל את דילול האגרוז.
    3. מערבבים בעדינות את הזחלים עם האגרוז. באמצעות פיפטה רגילה (נורה גדולה), מניחים את הזחלים המעורבבים באגרוז על מרכזה של צלחת הדמיה בגודל 3.5 ס"מ עם תחתית זכוכית. תחת סטריאומיקרוסקופ, מקם במהירות את הזחלים על גבם באמצעות קצה מיקרו-העמסה כדי לתמרן את הדג.
      הערה: מכיוון שמיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב הפוך משמש להדמיה מוחית תוך-חיונית בפרוטוקול זה, הזחלים מותקנים באופן דורסלי. התאימו את מיקום הזחלים בהתאם אם אתם משתמשים במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף.
    4. הסר אגרוז נוסף כדי לשמור על שכבת האגרוז הדקה ביותר האפשרית. לאחר שהאגרוז התמצק, הוסיפו 2.5 מ"ל של מי מקור מינרליים + PTU + 0.2x tricaine (מדיום הדמיה) והמשיכו לשלב הבא.
  2. הדמיה חיה in vivo של דינמיקת MT בתאי גליובלסטומה פולשים
    הערה: האיכות האופטית של התמונות תלויה במידה רבה בביצועי המיקרוסקופ שבו נעשה שימוש. הפרוטוקול נכתב עבור מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך-דיסק מסתובב המצויד במצלמת sCMOS (גודל פיקסל 6.5 מיקרומטר, 2048 x 2044 פיקסלים), מטרת מרחק עבודה ארוך, ותא סביבתי מבוקר טמפרטורה.
    1. הניחו את צלחת הדמיית הווידאו המכילה את הזחלים הקסנוגרפטים המשובצים באגרוז בתא הסביבתי של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, כאשר הטמפרטורה נקבעה על 32 מעלות צלזיוס. מצא את הזחלים בצלחת הדמיית הווידאו עם מטרה של פי 10, באמצעות שלב XY ממונע.
    2. לחץ על ESC כדי להנמיך את צריח המטרות, הוסף שמן מינרלי ליעד שמן 60x (1.4 NA, מרחק עבודה: 0.13 מ"מ), ולחץ על ESC כדי לחזור למצב המוקד הראשוני.
    3. שימו לב לתאי הגליובלסטומה הפולשים בתעלה האדומה (מקור לייזר של 561 ננומטר, 20% עוצמת לייזר, חשיפה בזמן: 200 מילישניות) ובחרו תא עם רשת MT מפוזרת וחוטי MT הניתנים להבחנה בקלות (איור 3B).
    4. הגדר את הגדרות z-series. באמצעות שלב piezo בטווח של 200 מיקרומטר, בחר את המיקומים העליונים והתחתונים של רשת MT: ערימת z בעומק 10-30 מיקרומטר מספיקה כדי לדמיין את רשת המיקרוטובול בבליטה של התא הנודד, עם שלב z-פרוסה של 0.3 מיקרומטר.
    5. הגדר הגדרות רכישה בהילוך מהיר כדי לאפשר איזון אופטימלי בין מהירות הרכישה, עומק z-stack ואות פלואורסצנטי כדי למנוע הלבנת תמונות מהירה. קבל תמונות של MTs כל 5-10 שניות במשך מספר דקות. רכוש ושמור את ה- hyperstack ה- 5D (x,y,z,t,c).
      הערה: כדי למנוע סחף ב-z במהלך הרכישה, השתמש במיקרוסקופ המצויד במערכת מיקוד מושלמת כייצוב מיקוד חומרה.
  3. (אופציונלי) קבע את ההשפעות של החומרים המשנים מיקרוטובולים (MTAs) על MTs.
    הערה: השלבים הבאים מאפשרים לבדוק את ההשפעות של ה-MTAs על רשת MT בהעברת תאי גליובלסטומה בזמן אמת.
    1. הסר בעדינות את מדיום ההדמיה מצלחת הדמיית הווידאו. אין לגעת בתחתית המנה, שכן מיקום xyz יאבד.
    2. הכינו מדיום הדמיה חדש המכיל את ה-MTA בריכוזים שונים. הוסיפו בעדינות את המדיום המכיל MTA לתוך צלחת הדמיית הווידאו טיפה אחר טיפה.
    3. רכשו סרטים ארוכי טווח (2-16 שעות, תמונה אחת כל 10-20 דקות) כדי לבחון את ההשפעות של כל ריכוז של MTA על רשת ה-MT ועל נדידת התאים (איור 4A).
    4. (אופציונלי) שטפו את ה-MTA על ידי הסרה עדינה של המדיום והוספת 2.5 מ"ל של מדיום הדמיה טרי ללא ה-MTA. חזור על הליך ההדחה 3x כדי לנקות כל זכר של MTA במדיום.
    5. (אופציונלי) רכשו סרט דומה לטווח ארוך כמו ב-4.3.3 (איור 4B).
      הערה: השלבים לעיל קובעים את הריכוז המינימלי המשנה את רשת MT מבלי להשפיע על הישרדות הזחלים. שלבי ההדחה מגדירים אם ההשפעה של התרופה הפיכה.
  4. הערך את השפעת MTA על פלישת גליובלסטומה על ידי הדמיה רציפה.
    1. בצע את השלבים 4.1 עד 4.2.1 4 שעות לאחר הזרקת מיקרו.
      הערה: חלק זה של הפרוטוקול יכול להיות מושג גם עם קווי תאי גליובלסטומה אחרים המתויגים באופן פלואורסצנטי. באופן אידיאלי, תייג במשותף את ה- GBM עם תג ציטוזולי ותג גרעין כדי להבטיח זיהוי של המורפולוגיה הגלובלית של התא.
    2. עבור למרחק עבודה ארוך 40x יעד מים (NA:1.15, WD: 0.6 מ"מ).
    3. הגדר את טווח z-series כדי לרכוש את אזור ה- OT. רכוש את z-stack באמצעות מצלמת sCMOS בעלת רגישות גבוהה (גודל פיקסל 11 מיקרומטר, 1,200 x 1,200 פיקסלים, יעילות קוונטית 95%).
      הערה: מחסנית z מתחילה בדרך כלל בחלק הגבי ביותר של ה-OT (קרוב לפני השטח) ומסתיימת עמוק מספיק במוח כדי לכלול את כל מסת תאי הגידול.
    4. הסר את צלחת הדמיית הווידאו מהמיקרוסקופ. שחררו את הזחלים מהאגרוז על ידי שימוש בקצה העמסה במיקרו וניקוב עדין של האגרוז סביב החיה.
      הערה: מכיוון שזחלי 3 dpf עדיין שבירים מאוד, היזהר בעת הוצאתם מהאגורוז.
    5. לאחר שהחיה משתחררת מהאגרוז, מעבירים אותה בעדינות לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות מלאה במים ממקור מינרלי + מתילן כחול + מדיום PTU. סמן את הבאר כדי לזהות את הזחלים להדמיה הבאה.
    6. הוסף את ה- MTA של עניין במדיום בריכוז שנקבע קודם לכן (שלב 4.3.3). רענן את המדיום בתוספת התרופה כל יום. חזור על הליך ההדמיה משלבים 4.4.1 עד 4.4.5 מדי יום למשך 3-4 ימים.

5. ניתוח תמונות

  1. נתח דינמיקת MT עם תוספי FIJI הזמינים בחינם.
    הערה: סקירות ופרוטוקולים רבים מתארים את השיטות של ניתוח דינמיקת MT בתאים31,32,33,34 וניתן ליישם אותם בשלב זה. פרוטוקול זה יתייחס בקצרה לשתי שיטות למדידת תכונות דינמיות בסיסיות של MT.
    1. פתח את ה- hyperstack ה- 5D וצור ערימה 4D שבה פרוסות z הוקרנו במישור יחיד כדי ליצור הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) ב- z (Image | ערימות | | פרויקט Z עוצמה מקסימלית) (איור 3B).
    2. פתח את מחסנית MIP 4D ועקוב ידנית אחר הקצה של MT מבוסס בליטה באמצעות פונקציית המעקב הידנית ב- FIJI (תוספים | מעקב אחר | מעקב ידני). (איור 3D). חלץ את הפרמטרים של דינמיקת MT כגון מהירות צמיחה, מהירות התכווצות, תדירות הצלה ותדירות קטסטרופה.
    3. לחלופין, ציירו קו מקוטע ברוחב 10 פיקסלים לאורך ה-MT כדי לנתח אותו (איור 3B). השתמש בפונקציה Multi Kymograph (ניתוח | מולטי קימוגרף) (איור 3C) בפיג'י. התבונן ומדוד את שלבי הגידול של MT (G), את אורך ההפסקות (P) ואת התדירות של אסונות MT.
  2. ניתוח פלישת גליובלסטומה ארוכת טווח
    הערה: ניתוח זה דורש שימוש בהדמיה וניתוח ב- 4D עם תוכנת הדמיה ביולוגית.
    1. המר את z-stack 4D גולמי משלב 4.4.3 (4 hpi) לתבנית התוכנה המתאימה, באמצעות תוכנת ממיר הקבצים.
    2. פתח את התוכנה וייבא את קובץ z-stack שהומר בתצוגת Surpass (איור 5A).
    3. כדי לפלח את תאי הגידול ולהשליך אוטופלואורסצנציה לא רלוונטית בערוץ האדום, לחץ על הוסף משטחים חדשים ועקוב אחר התהליך בן 5 השלבים.
      1. אמת את הגדרות ברירת המחדל על ידי לחיצה על החץ הבא ברגע שהחלון צץ. המשך לשלב 2/5.
        הערה: אם האות הפלואורסצנטי נרכש בערוץ 561, פלואורסצנציה אוטומטית מפיגמנטציה שיורית בעין יכולה להיות חזקה ולשנות את תהליך הפילוח האוטומטי. זה בעייתי אם xenograft ממוקם קרוב לעין. במקרה כזה, יש לסיים את הסגמנטציה באופן ידני על ידי חיתוך ומחיקה של אותות תאים שאינם גליובלסטומה.
      2. נווט אל ערוץ המקור | ערוץ 561. החלקת התמונה (מסנן גאוס) על-ידי הוספת 1.50 מיקרומטר ב-Surfaces Detail ועל-ידי הוספת 2.5 מיקרומטר לקוטר הכדורים ברקע Substract. לחץ על החץ הבא והמשך לשלב 3/5.
      3. בהתאם לעוצמת האות, כוונן באופן ידני את הסף (החלפת רקע) כך שיכלול כל תהליך תא. המשך לשלב 4/5.
      4. סנן את האות המקוטע על-ידי הסרת האירועים שאינם מייצגים חלק מתא (לדוגמה, פסולת, אוטופלואורסצנציה). לחץ על סוג מסנן | עוצמת הקול והתאם את הסף באופן ידני כדי לא לכלול את כל האירועים מתחת לעוצמת הקול הקטנה ביותר המייצגת חלק מתא. המשך לשלב 5/5.
        הערה: אם האותות האוטונומיים גדולים יותר בנפחם מאשר חלק התא הקטן ביותר, המשך בכל זאת והסר ידנית את האותות הלא רצויים על-ידי לחיצה שמאלית ומחיקתם .
      5. בטל את שלב הסיווג וסיים את אשף הפילוח על-ידי לחיצה על החץ הירוק הכפול כדי לסיים את יצירת תצוגת Surface של תאי הגידול (איור 5B).
    4. אם התאים המקוטעים אינם נוגעים זה בזה ואינם יוצרים אובייקט ייחודי, מזגו אותם באופן מלאכותי כדי ליצור אובייקט בעל מסה של תא גידול. בקצרה, לחץ על סטטיסטיקה | מפורט | ערכים ספציפיים | נפח. בחר את כל האירועים על ידי לחיצה ימנית על החלק העליון ולאחר מכן החזקת Shift ולחיצה שמאלית על האחרון. נווט כדי לערוך | הבחירה | לאחד.
    5. הגדר את הצנטרואיד של מסת תא הגידול. לחצו על ' הוסף נקודות חדשות' | דלג על יצירה אוטומטית | הוספה (הסמן מצטלב עם) | מרכז האובייקט. החזק את shift ולחץ שמאלה כדי ליצור את הנקודה, שהיא המרכז של מסת תא הגידול המקוטעת.
    6. מדוד את המרחק התלת-ממדי בין כל תא GBM לבין המרכז של מסת הגידול. לשם כך, צרו מרחק לערוץ centroid על-ידי הישארות בתצוגת Spot ובחירת סמל הכלי | טרנספורמציה של מרחק. המתן למרחק חדש לערוץ צנטרואידי, לצד ערוץ 488 וערוץ 561 (בכחול, איור 5C).
      הערה: העוצמה של כל ווקסל בערוץ זה תואמת את המרחק התלת-ממדי בין הווקסל למרכז מסת תא הגידול.
    7. מדוד את המרחק התלת-ממדי למרכז של כל תא מקוטע על-ידי לחיצה על הוסף נקודות חדשות | דלג על יצירה אוטומטית | הוספה (הסמן מצטלב עם) | ערוץ ספציפי 561. החזק Shift ולחץ שמאלה על אזור גרעין התא. בצע משימה זו עבור כל תא (איור 5D).
      הערה: הסר את תצוגת Surface כדי להעריך טוב יותר את אות הפלואורסצנציה של התאים. לחלופין, אם קיים, השתמש באות הגרעין (אות 405 ננומטר או 647 ננומטר) לדיוק טוב יותר.
    8. לחץ על סטטיסטיקה | | מפורטת ערכים ספציפיים | עוצמה פירושה Ch=מרחק לסנטרואיד.
      הערה: ערך העוצמה הוא המרחק התלת-ממדי ב-μm בין אזור גרעין התא לבין הצנטרואיד.
    9. ממוצע עוצמות אלה כדי לחשב את רדיוס מסת הגידול ב 4 hpi. חזור על ההליך עבור כל נקודת זמן של הניתוח (24 hpi, 48 hpi ו- 72 hpi).
      הערה: מדוד רק את 10 או 20 התאים המופצים ביותר כדי למנוע הערכת חסר של פלישת תאים. ואכן, הדחיסה הכפויה של התאים במהלך ההזרקה עשויה למנוע מהתאים במרכז מסת הגידול לנדוד.
    10. חשב את מדד הפלישה (II) כיחס בין המרחקים התלת-ממדיים הממוצעים ב- t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi של התאים המופצים ביותר מעל הרדיוס הממוצע של מסת הגידול ב- t = 4 hpi (איור 5E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לנתח את התפקיד שממלאים MTs במהלך פלישת in vivo GBM, אנו מתארים כאן את הצעדים העיקריים לביצוע תיוג MT יציב בתאי GBM על ידי זיהום לנטי-ויראלי, קסנוטרנספלנטציה אורתוטופית של תאי GBM בזחלי דגי זברה 3 dpf, הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה של דינמיקת MT, טיפול ב-MTA והשפעותיו על פלישת GBM, וניתוח תמונה של דינמיקת MT ופלישה in vivo (איור 1). דינמיקת MT נמדדת על-ידי בניית קימוגרפיות לאורך MTs גדלים ומתכווצים (איור 3C) או על-ידי מעקב ידני אחר קצוות MT בודדים לאורך זמן (איור 3D). דוגמה לטיפול תרופתי הניתן במדיום הזחלים והשפעתו ההפיכה על ארגון רשת MT ניתנת באיור 4. טיפול במינון נמוך של נוקודזול (200 ננומטר) מוביל להתכווצות הדרגתית של רשת MT ולהיעלמות בליטת תאי גליובלסטומה 4 שעות מאוחר יותר (איור 4A). שטיפת התרופה החזירה את יכולתם של תאי גליובלסטומה ליצור בליטות. התאים חזרו לנדוד לאורך כלי הדם 12 שעות לאחר השטיפה (איור 4B). נתונים אלה מצביעים על כך שטיפול בנוקודזול של 200 ננומטר מספיק כדי לשבש את רשת MT וחוסם במהירות פלישה של תאי גליובלסטומה in vivo. ניתוח בן 3 ימים של אותו טיפול על פלישת תאי גליובלסטומה גלובלית מגלה כי nocodazole 200 nM עוצר פלישה ארוכת טווח של תאי גליובלסטומה in vivo, מבלי להשפיע על הבריאות הכללית של הדגים, בהשוואה לבקרה (איור 4C).

Figure 1
איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה של פרוטוקול. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; hpi = שעות לאחר ההזרקה; MT = מיקרוטובול; MTA = סוכן משנה מיקרוטובול; GBM = גליובלסטומה מולטיפורמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מיקרו-הזרקה של תאי גליובלסטומה ל-3 מוחות של זחלי דגי זברה dpf. (A) תצלום של הציוד המשמש להעברת קסנוטרנספלנטציה: 1, מיקרו-אינז'קטור שמן; 2, מיקרומניפולטור מכני; 3, מחזיק נימי אוניברסלי; 4, נימי זכוכית. צלחת המיקרו-הזרקה נמצאת תחת סטריאומיקרוסקופ. (B) תצלום המציג 3 זחלי דגי זברה dfp מורדמים מיושרים בתעלה ומוכנים להזרקה זעירה. קצהו של מיקרונימי עמוס בצבע אדום נראה בצד ימין של התצלום. פרטים על התעלות המעוצבות שנבנו בלוח האגרוז נראים בכניסה בפינה הימנית התחתונה. סרגל קנה מידה = 3 מ"מ. (C) ערכת צלחת מיקרו-הזרקה מייצגת. זחלים מוכנים להיות מוזרקים ממוקמים לרוחב (מרכז הצלחת). שימו לב שהתאים מרוכזים בקצה המיקרו-קפילרי (חץ שחור) לפני שהם ממשיכים להזרקה. זחלים מוזרקים מוצגים בצד ימין של הצלחת, ממוקם הגחון. (D) סכימה של פרוסה רוחבית בלוח המיקרו-הזרקה (לאורך הקו המקווקו השחור ב-C) המציגה את התעלות שבהן הזחלים ממוקמים במהלך ההזרקה. (E) תצלום המציג את קצה הנימי מוכן לחדור לטקטום האופטי (קו מקווקו). החדרים מסומנים על ידי הקווים הלבנים. סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. (F) סכימה של זחל 3 dpf fli1a:gfp המבטא gfp בתאי האנדותל, המציין את אזור ה-OT שבו מוזרקים התאים, ממש מעל הווריד המוחי האמצעי. (G) תמונה פלואורסצנטית של זחל gfp של 3 dpf:gfp (gfp המתבטא בתאי גזע עצביים) הממוקמת לרוחב לאחר מיקרו-הזרקה של תאי U87-mkate2 (עיגול לבן וחץ לבן). אוטופלואורסצנציה גבוהה באדום נגרמת על ידי האירידופורים בעיניים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (H) תמונה פלואורסצנטית קונפוקלית של זחל fli1a:gfp שהוזרק בהצלחה ב-16 hpi. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (I-K) תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות של זחלי fli1a:gfp שהוזרקו ללא הצלחה ב-96 כ"ס (I) ו-4 כ"ס (J,K). תאי GBM הוזרקו בחדרים (I,J) או במספר מוקדים במוח (K). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; OT = טקטום אופטי; MCeV = וריד מוחי אמצעי; gfp = חלבון פלואורסצנטי ירוק; gfap = חלבון חומצי פיברילרי גליאלי; HPI = שעות לאחר ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה של דינמיקה של מיקרוטובולים in vivo בתאי גליובלסטומה. (A) תמונה פלואורסצנטית מייצגת של תאי U87 שעברו קסנוגרפט המבטאים טובולין-α1-mkate2 ב-OT של זחל דג זברה fli1a:GFP ב-20 hpi. (B) תמונה פלואורסצנטית מוקרנת בעוצמה מרבית של רשת MT בתא U87 יחיד. (C) קימוגרף לאורך הקו המקווקו האדום ב-B, המציג את שלבי הגידול, ההשהיה והקטסטרופה של אי-יציבות דינמית של MT. (D) רצף קיטועי זמן של האזור הממוסגר ב-B המדגיש את המעקב אחר שלושה קצוות MT +. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: OT = טקטום אופטי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; hpi = שעות לאחר ההזרקה; MT = מיקרוטובול; G = שלב הגידול; P = שלב ההשהיה; C = שלב הקטסטרופה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה של ההשפעות של החומר המשנה את המיקרוטובול על פלישת גליובלסטומה in vivo. (A) רצף של תאי U87 המבטאים טובולין-α1a-mkate2 בזחלי דגי זברה שטופלו בנוקדזול (200 ננומטר). חיצים מצביעים על קצה הבליטה בשני תאים שונים הפולשים למוח לאורך כלי דם. שים לב לנסיגה של הבליטה עם הטיפול עם nocodazole. סרגל קנה מידה = 10 μm. (B) רצף קיטועי זמן המייצג את ההשפעה של שטיפת נוקודזול על פלישת תאי U87. בשעה 500 דקות לאחר השטיפה, התא המסומן בכוכבית הלבנה מאריך בליטה מבוססת MT (חץ לבן), המאפשרת את חידוש הפלישה לאורך כלי דם. סרגל קנה מידה = 20 μm. (C) ייצוגים תלת-ממדיים של מוח זחלים קסנוגרפד שטופלו ב-DMSO או ב-nocodazole (200 ננומטר) במשך 72 שעות. אות תאי U87 פולח (באדום) ושולב לאות פלואורסצנטי fli1a-GFP (בלבן). שים לב לירידה בהפצה של תאי U87 שטופלו בנוקודזול. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; hpi = שעות לאחר ההזרקה; MT = מיקרוטובול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח תמונה של פלישת גליובלסטומה in vivo . (A) תמונות פלואורסצנטיות של תאי U87 שעברו קסנוגראפט המבטאים mKate2 ציטוזולי בזחלי דגי זברה fli1a-GFP, 4 hpi. כוכביות לבנות מדגישות את האוטופלואורסצנטיות האופיינית מאירידופורים בעין. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר. (B) תמונה פלואורסצנטית של זחלי fli1a-GFP יחד עם המשטח המקוטע המתאים לאות התאים U87 ב-A. המרכז של מסת הגידול נראה ירוק. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר. (C) תמונה פלואורסצנטית המייצגת את אות הערוץ האדום ב-A ואת ערוץ "המרחק לצנטרואיד" החדש שהוגדר (בכחול). סרגל קנה מידה = 30 μm. (D) תמונת פלואורסצנציה של ערוץ אדום על גבי כתמים צבעוניים, שצבעם מייצג את המרחק של התא לצנטרואיד (בירוק), סגול הוא הקרוב ביותר למרכז והלבן הוא הרחוק ביותר זה מזה. סרגל קנה מידה = 20 μm. (E) דוגמה לניתוח רציף של פלישת GBM גלובלית. מרחקים תלת-ממדיים נקבעים על 4 hpi ו- 72 hpi, ומדד הפלישה (II) מחושב על פי הנוסחה בתיבת הדואר הנכנס. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; HPI = שעות לאחר ההזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדמיית קסנוגרפטים של גידולים ברזולוציה של תא בודד עשויה להפוך לכלי חיוני לשיפור הבנתנו את הביולוגיה של GBM. הדמיה חיה במודלים של PDX של עכברים הובילה לתגליות חשובות על האופן שבו GBM פולש באופן קולקטיבי לרקמת המוח18. עם זאת, עד כה, הרזולוציה המרחבית-טמפורלית אינה גבוהה מספיק כדי לחשוף את הדינמיקה של חלבונים השולטים בפלישה GBM. הסברנו כי על ידי צימוד החריטה האורתוטופית של תאי GBM בזחלי דגי זברה שקופים עם הדמיה תוך-חיונית ברזולוציה גבוהה, ניתן לנתח חלבונים ציטוסקטליים כגון MTs בפירוט מספיק כדי לנתח את הדינמיקה שלהם במהלך פלישת GBM באתרה .

השלבים הקריטיים של המתודולוגיה טמונים בהכנת תאי ה- GBM והליך המיקרו-הזרקה. תאים לא בריאים ולא מנותקים מספיק יידבקו זה לזה או לגבולות הנימים ויחסמו את זרימת ההזרקה. בנוסף, תאים צריכים להיות מרוכזים מספיק בנימים כדי למזער את נפח מוזרק ולהשתיל אותם בתפזורת. הזרקת נפח גבוה יותר של תאים מדוללים יותר תגרום למוקדי גידול מרובים, לעתים מעורבים, שהאינדקסים הפולשניים שלהם הופכים קשים למדידה. בידינו, טיפול ידני במיקרו-אינז'קטור מבוסס שמן מאפשר שליטה טובה יותר בזרימת ההזרקה מאשר מיקרו-מזרק אלקטרוני מבוסס אוויר בלחץ ששימש בעבר בדגםדומה 19. זה קריטי כדי למנוע לחץ זרימה עודף בתוך המוח, ובכך למנוע נזק לרקמות הבאות וצבירה חדרית של התאים המוזרקים.

חלק מהמגבלות של מודל זה כוללות את הצורך לבצע את הניסוי בטמפרטורות לא אופטימליות עבור שני המינים. דגי זברה גדלים בדרך כלל ב 28 מעלות צלזיוס, בעוד תאים אנושיים הם תרבית ב 37 מעלות צלזיוס. מעל 32 מעלות צלזיוס, התפתחות העובר של דגי זברה משתנה ושינויים אלה יכולים להיות קטלניים35. עם זאת, בדומה למה שנעשה בדגמי xenograft של דגי זברה בוגרים 36, התאקלמות רציפה של זחלי דגי הזברה לטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס מגדילה את הישרדותם של בעלי חיים מושתלים בהשוואה לשינוי המהיר בטמפרטורה לאחר ההשתלה מ -28 מעלות צלזיוס ל -32 מעלות צלזיוס. עם זאת, העלאת הטמפרטורה מובילה לעלייה במקרי מוות של בעלי חיים בהתאם לרגישות של עוברי דגי זברה לטמפרטורות מעל 32 מעלות צלזיוס35.

פירוש נתוני הדינמיקה של in vivo MT צריך להיעשות בזהירות כאשר דינמיקת MT משתנה כאשר הטמפרטורה יורדת מתחת ל -37 מעלות צלזיוס37. מדידה מקבילה במבחנה של דינמיקת MT ב-37 °C ו-32 °C באותם תאי GBM עם אותו טיפול MTA תסייע לאמת את ההבדלים הנראים בין תאי GBM שונים או בין טיפולי in vivo . זה אמור לעזור לאשר שההבדלים אינם נגרמים על ידי שונות ברגישות לטמפרטורה אלא על ידי מסלולי ויסות שונים (לניתוח השוואת GBM) או על ידי טיפול ב- MTA (לניתוח אפקט MTA). זה יהיה מעניין אם ההטרוגניות של הדינמיקה של MT תהיה קשורה ליכולות פלישה שונות.

מגבלה נוספת היא חלון הזמן הקצר שבמהלכו ניתן לעקוב אחר הפלישה (72 עד 96 שעות), מה שמונע את מדידת פלסטיות הפלישה המונעת על ידי שינויים פוטנציאליים בדינמיקה של MT38. לאחר 96 שעות, שמנו לב לירידה חדה בפלישה לתאי GBM. לאחר 6 ימים לאחר ההזרקה, מספר תאי ה-GBM ירד במהירות, ככל הנראה בשל תגובה חיסונית מארחת הנגרמת על ידי הצטברות של נויטרופילים ומקרופאגים במיקרו-סביבה של הגידול39. אספקת MTAs לכל המוח עשויה להשפיע על תאים מארחים עצביים סמוכים, התלויים ב-MTs לצורך פעילותם, ושהשינוי שלהם עשוי להשפיע לאחר מכן על פלישת GBM40. יש להשלים גישה זו עם מבחני shRNA או אופטוגנטיקה המגבילים את שינוי ה-MT לתאי ה-GBM, אך נותרה פלטפורמה טובה לסינון תרכובות אנטי-פולשניות חדשות.

ההזרקה האורתוטופית של תאי GBM המסומנים ב-MT במוח דג הזברה מעניינת במיוחד לפענוח תפקידם של תאי MTs במהלך פלישה של תאים סרטניים, שכן מעט מאוד מודלים של בעלי חיים מאפשרים הדמיה תת-תאית באתרה של נדידת תאים סרטניים ברקמה שלהם ממקור15. נכון להיום, מחקרים על פונקציות MT במהלך העברת GBM מסתמכים בעיקר על מבחני in vitro ו- ex vivo וחסרים אימות in vivo 24,41,42,43. יחד עם נפילת גנים מעניינים או גישת סינון מבוססת גנים בלתי משוחדת, הבדיקה המוצגת כאן תסייע לחשוף רגולטורים חדשים של MT החשובים לפלישה ל- GBM in vivo.

GBMs הם גידולים הטרוגניים מאוד שתכונותיהם הפולשניות שונות מאוד בין דגימות44. הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס אופן הפלישה השונה שלהם תסייע להגדיר טיפולים אד-הוק לחסימת הפצת GBM. מדידה שיטתית של האינדקס הפולשני, אופן הפלישה ותכונות ציטוסקטליות כגון דינמיקת MT בדגימות GBM שונות תחשוף מתאמים חדשים בין פרופילים גנומיים תכופים של מוטציות לבין דפוסי פלישת תאים המסתמכים על תכונות ציטוסקטליות ספציפיות. חשיפת האופן שבו מוטציות אלה משפיעות על השינוי בדינמיקה של MT לא רק תוסיף לידע שלנו על ויסות MT במהלך נדידת תאים45,46, אלא גם עשויה להוביל לטיפולים אנטי-פולשניים ספציפיים למטופל.

הקלות היחסית של מיקרו-הזרקה בדגי זברה בשילוב עם מספר הזחלים הגבוה הזמין וקלות הזרקת התרופות הופכים הליך זה למתאים לרפואה מותאמת אישית47,48. יתר על כן, בניגוד להדמיה תוך-חיונית של קסנוגרפטים GBM בעכברים, המתרחשת רק בחלק העליון של 500 מיקרומטר של קליפת המוח49,50, באמצעות דגי זברה מאפשרת הדמיה של חדירת GBM בכל מערכת העצבים המרכזית. המודל המוצג כאן עומד בקריטריונים להפוך לכלי רב ערך לניתוח מהיר של היכולות הפולשניות של גליובלסטומה ותגובתה לטיפולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים מאוד לד"ר פ. הרבומל (מכון פסטר, צרפת) ולמעבדתו, במיוחד ולרי בריולט, ואמה קולוצ'י-גויון על שסיפקו לנו את קווי דגי הזברה ואת תבנית הפלסטיק לצלחות מיקרו-הזרקה, ועל מומחיותם רבת הערך בהליכי ניסוי בדגי זברה. אנו מודים על ההדמיה הביולוגית הפוטונית של UtechS (C2RT, מכון פסטר, הנתמך על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית France BioImaging, ו- ANR-10-INBS-04; השקעות לעתיד). עבודה זו נתמכה על ידי הליגה נגד סרטן (EL2017). LNCC), המרכז הלאומי דה לה רשרש סיינטיפיק, ומכון פסטר ועל ידי תרומות נדיבות של גברת מרגריט מישל ומר פורקט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

ביולוגיה גיליון 185 קסנוגראפט אורתוטופי PDX דג זברה דניו ריו גליובלסטומה הדמיה תוך-תאית תת-תאית ניתוח תמונה 5D
הדמיה חיה של דינמיקת מיקרוטובולים בתאי גליובלסטומה הפולשים למוח דג הזברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter