Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ज़ेबराफिश मस्तिष्क पर हमला करने वाले ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबुल्स डायनामिक्स की लाइव इमेजिंग

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

हम एक ऐसी तकनीक की रिपोर्ट करते हैं जो एक कशेरुक मस्तिष्क ऊतक पर हमला करने वाले ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) कोशिकाओं में सूक्ष्मनलिका गतिशीलता की लाइव इमेजिंग की अनुमति देती है। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए जीबीएम कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंट्रावाइटल इमेजिंग के साथ एक पारदर्शी ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में जोड़ना सीटू कैंसर आक्रमण के दौरान साइटोस्केलेटन गतिशीलता के माप की अनुमति देता है।

Abstract

वास्तविक आबादी में एक निराशाजनक औसत जीवित रहने के समय के साथ- 6 से 15 महीने के बीच-ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) सबसे विनाशकारी घातक मस्तिष्क ट्यूमर है। उपचार की विफलता मुख्य रूप से जीबीएम कोशिकाओं की आक्रामकता के कारण होती है, जो जीबीएम मोटाइल गुणों की बेहतर समझ की आवश्यकता के लिए बोलती है। जीबीएम आक्रमण का समर्थन करने वाले आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, आक्रमण के दौरान प्रोटीन गतिशीलता के गहन लक्षण वर्णन को सक्षम करने वाले नए शारीरिक मॉडल की आवश्यकता होती है। ये अवलोकन ट्यूमर घुसपैठ को रोकने और रोगी के परिणामों में सुधार करने के लिए नए लक्ष्यों की खोज का मार्ग प्रशस्त करेंगे। यह पेपर रिपोर्ट करता है कि कैसे ज़ेब्राफिश मस्तिष्क में जीबीएम कोशिकाओं का एक ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट उपकोशिकीय इंट्रावाइटल लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है। सूक्ष्मनलिकाएं (एमटी) पर ध्यान केंद्रित करते हुए, हम जीबीएम कोशिकाओं में एमटी लेबलिंग के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, निषेचन (डीपीएफ) जेब्राफिश लार्वा के पारदर्शी मस्तिष्क में जीबीएम कोशिकाओं को माइक्रोइंजेक्शन करना, जेनोग्राफ्ट्स के प्रसार में एमटी की इंट्रावाइटल इमेजिंग, जीबीएम आक्रमण के दौरान उनकी भूमिका का आकलन करने के लिए एमटी गतिशीलता को बदलना और अधिग्रहित डेटा का विश्लेषण करना।

Introduction

सेल गतिशीलता एक रूढ़िबद्ध प्रक्रिया है जिसमें ध्रुवीयता अक्ष स्थापना और बल-उत्पन्न साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था की आवश्यकता होती है। एक्टिन पोलीमराइजेशन और मायोसिन के साथ इसके सहयोग कोसेल आंदोलन के लिए आवश्यक प्रोट्रूसिव और सिकुड़ा हुआ बलों के मुख्य योगदानकर्ताओं के रूप में मान्यता प्राप्त है। माइग्रेशन 2 के दौरान कोशिका ध्रुवीकरण और दिशात्मक दृढ़ता में सूक्ष्मनलिकाएं मुख्य अभिनेता माना जाताहै। हाल के वर्षों में, एमटी को 3 डी3 में सेल आक्रमण के दौरान मेकेनोकंप्रेसिव बलों का समर्थन करने के लिए प्रोट्रूशियंस बनाने और स्थिर करने के लिए भी दिखाया गया है। हाल ही में, एमटी सीधे फोकल आसंजन और मेकेनोसेंसिटिव माइग्रेशन4 पर मेकेनोट्रांसडक्शन में शामिल रहे हैं। एमटी-प्लस एंड डायनामिक्स की विशेषता वाली गतिशील अस्थिरता पोलीमराइजेशन (विकास) और डिपोलीमराइजेशन (संकोचन) के दोहराए गए चरणों से बनी होती है, जो सूक्ष्मनलिका-बाध्यकारी प्रोटीन और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग कैस्केड के ढेरों द्वारा नियंत्रित होते हैं, जैसे कि आरएचओ-जीटीपेस 5,6,7 द्वारा शासित। सेल माइग्रेशन और आक्रमण में एमटी नेटवर्क की भूमिका ने एमटी गतिशीलता की जांच को प्रतिरक्षा कोशिका होमिंग, घाव भरने और कैंसर आक्रमण के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व बना दिया है।

प्राथमिक ट्यूमर कोर से बचने, ऊतकों में फैलने और माध्यमिक ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए कैंसर कोशिकाओं की क्षमता 50साल पहले घोषित कैंसर के खिलाफ युद्ध में वैश्विक सफलता को रोकने में एक महत्वपूर्ण कदम है। सबसे बड़ी बाधाओं में से एक यह समझना है कि कैंसर कोशिकाएं ऊतक पर सक्रिय रूप से कैसे आक्रमण करती हैं। प्रमुख आक्रमण तंत्र गैर-ट्यूमर सेल माइग्रेशन10 को नियंत्रित करने वाले सिद्धांतों के समान सिद्धांतों पर भरोसा करते हैं। हालांकि, कैंसर सेल माइग्रेशन विशिष्टताएंउभरी हैं, जिससे इस प्रकार के प्रवास के बेहतर लक्षण वर्णन की आवश्यकता है। विशेष रूप से, क्योंकि ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट कैंसर की प्रगति12 में एक प्रमुख खिलाड़ी के रूप में दिखाई देता है, कैंसर सेल प्रसार के तंत्र को उजागर करने के लिए एक प्रासंगिक शारीरिक संदर्भ में कैंसर सेल आक्रमण का अवलोकन और विश्लेषण करना आवश्यक है।

एमटी कैंसर की प्रगति के लिए केंद्रीय हैं, प्रसार और आक्रमण दोनों को बनाए रखने के लिए। सीटू में एमटी गतिशीलता का सटीक विश्लेषण दोनों प्रक्रियाओं में एमटी-चेंजिंग एजेंटों (एमटीए) की पहचान करने में मदद कर सकता है। पर्यावरण में बदलाव पर एमटी गतिशीलता काफी भिन्न होती है। इन विट्रो में, नोकोडाज़ोल जैसे एमटी-अस्थिर एजेंटों के साथ उपचार सेल प्रोट्रूशन गठन को रोकता है जब कोशिकाएं 3 डी में जैल में एम्बेडेड होती हैं, जबकि 2 डी सेल माइग्रेशन13,14 पर इसका बहुत कम प्रभाव पड़ता है। हालांकि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, इंट्रावाइटल इमेजिंग में प्रगति कैंसर सेल आक्रमण के दौरान एमटी गतिशीलता के विवो विश्लेषण में अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, चूहों में चमड़े के नीचे जेनोग्राफ्ड फाइब्रोसारकोमा कोशिकाओं में एमटी के अवलोकन से पता चला कि ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेजट्यूमर कोशिकाओं में एमटी गतिशीलता को प्रभावित करते हैं। हालांकि, इन माउस मॉडल में व्यापक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाएं शामिल हैं और कम सुलभ कैंसर के लिए असंतोषजनक रहते हैं, जैसे कि अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क ट्यूमर, जीबीएम।

निराशाजनक 15 महीने के औसत जीवित रहने के समय16 के बावजूद, मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर जीबीएम के प्रसार के तरीके या मस्तिष्क के ऊतकों में जीबीएम सेल आक्रमण को बनाए रखने वाले प्रमुख आणविक तत्वों के बारे में बहुत कम जानकारी है। माउस ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल में सुधार और कपाल खिड़कियों की स्थापना ने जीबीएम सेल आक्रमण अध्ययन17,18 के लिए नई संभावनाओं की पेशकश की। हालांकि, सबऑप्टिमल इमेजिंग गुणवत्ता के कारण, इस मॉडल ने ज्यादातर सतही जेनोग्राफ्ट्स की अनुदैर्ध्य इमेजिंग की अनुमति दी है और अब तक साइटोस्केलेटन प्रोटीन के उपकोशिकीय इमेजिंग का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया गया है। इसके अलावा, कृन्तकों के उपयोग को कम करने और उन्हें निचले कशेरुकियों के साथ बदलने के लिए "3आर" निषेधाज्ञा के मद्देनजर, वैकल्पिक मॉडल स्थापित किए गए हैं।

ज़ेबराफिश (डेनियो रेरियो) लार्वा में देखी गई आदिम प्रतिरक्षा का लाभ उठाते हुए, मछली के मस्तिष्क में जीबीएम कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन 19,20,21 विकसित किया गया था। विकासशील मिडब्रेन में वेंट्रिकल्स के आसपास के क्षेत्र में इंजेक्शन मानव जीबीएम पैथोफिज़ियोलॉजी21 के अधिकांश हिस्से को पुन: उत्पन्न करता है, और जीबीएम आक्रमण का वही पसंदीदा पैटर्न देखा जाता है जैसा कि मनुष्यों-पोत सह-विकल्प में देखाजाता है। मछली के लार्वा की पारदर्शिता के लिए धन्यवाद, यह मॉडल पेरी-वेंट्रिकुलर क्षेत्रों से मस्तिष्क पर हमला करने वाली जीबीएम कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है जहां अधिकांश जीबीएम को उत्पन्न माना जाताहै।

चूंकि एमटी विट्रो24,25 में जीबीएम सेल आक्रमण के लिए आवश्यक हैं, एमटी गतिशीलता का बेहतर लक्षण वर्णन और सेल आक्रमण के दौरान प्रमुख नियामकों की पहचान की आवश्यकता है। हालांकि, आज तक, ज़ेबराफिश ऑर्थोटोपिक मॉडल के साथ उत्पन्न डेटा में आक्रमण प्रक्रिया के दौरान एमटी गतिशीलता का उपकोशिकीय विश्लेषण शामिल नहीं है। यह पेपर विवो में एमटी गतिशीलता का अध्ययन करने और मस्तिष्क कैंसर आक्रमण के दौरान इसकी भूमिका निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। स्थिर सूक्ष्मनलिका लेबलिंग के बाद, जीबीएम कोशिकाओं को ज़ेब्राफिश लार्वा के दिमाग में 3 डीपीएफ पर सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जाता है और मस्तिष्क के ऊतकों में उनकी प्रगति के दौरान वास्तविक समय में उच्च स्थानिक-अस्थायी संकल्प पर चित्रित किया जाता है। फ्लोरोसेंट एमटी की लाइव इमेजिंग एमटी प्लस-एंड गतिशीलता के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है। इसके अलावा, यह मॉडल एमटी गतिशीलता पर और वास्तविक समय में जीबीएम कोशिकाओं के आक्रामक गुणों पर एमटीए के प्रभाव का आकलन करना संभव बनाता है। यह अपेक्षाकृत गैर-इनवेसिव प्रोटोकॉल एक समय में बड़ी संख्या में लार्वा को संभालने और दवा के आवेदन में आसानी (मछली के पानी में) के साथ संयुक्त है, जो मॉडल को प्रीक्लिनिकल परीक्षण के लिए एक संपत्ति बनाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रयोगशाला जानवरों की हैंडलिंग के लिए यूरोपीय संघ के दिशानिर्देशों के अनुसार पशु प्रयोग आयोजित किए गए थे। सभी प्रोटोकॉल को इंस्टीट्यूट पाश्चर के पशु प्रयोग के लिए नैतिक समिति - सीईईए 89 और फ्रांसीसी अनुसंधान और शिक्षा मंत्रालय (परमिट # 01265.03) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इंजेक्शन या लाइव इमेजिंग सत्रों के दौरान, जानवरों को प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के अंत Tricaine.At के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया गया था, उन्हें एनेस्थेटिक ओवरडोज द्वारा इच्छामृत्यु दी गई थी। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री, उपकरण और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। प्रोटोकॉल का सामान्य वर्कफ़्लो चित्रा 1 में वर्णित है।

1. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं की पीढ़ी स्थिर रूप से व्यक्त करती है α-ट्यूबुलिन-एमकेएटी 2

नोट: निम्नलिखित चरणएक जैव सुरक्षा कैबिनेट बीएसएल 2 + में किए जाते हैं।

  1. 7 × 106 एचईके -293 टी कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए कैल्शियम फॉस्फेट विधि का उपयोग करके एमकेएटी 2-ट्यूबुलिन को व्यक्त करने वाले लेंटिवायरल कणों का उत्पादन करें।
    1. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 10 μg 2पीढ़ी की पैकेजिंग प्लास्मिड psPAX2, 5 μg वायरल लिफाफा प्लास्मिड pMD2.G, और 10 μg प्लास्मिड ऑफ इंटरेस्ट, pGK-mKate2-मानव ट्यूबुलिन a1a के साथ CaCl2 (2.5 M स्टॉक) के 50 μL जोड़ें। बाँझ DNASe-मुक्त H2O के साथ 500 μL पर समायोजित करें।
      नोट: CaCl2 को अंतिम रूप से जोड़ना महत्वपूर्ण है।
    2. ट्यूब को कुछ बार मोड़कर मिलाएं और कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेशन के दौरान, 500 μL HEPES-बफर्ड सलाइन (HBS), pH 7.0 (2x) के साथ एक और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
    4. 20 मिनट के बाद, एचबीएस (2x) समाधान में ड्रॉप द्वारा CaCl 2/DNA मिश्रण ड्रॉप जोड़ें। ट्यूब को कुछ बार मोड़कर मिलाएं। आरटी में 12 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 12 मिनट के बाद, धीरे से एचबीएस के साथ मिश्रित सीएसीएल2 / डीएनए को सीधे एचईके -293 टी कोशिकाओं के 70% कंफ्लुएंट 10 सेमी डिश पर जोड़ें, बूंद-बूंद।
    6. 36-48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को छोड़ दें।
    7. सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए इसे 5 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर घुमाएं।
    8. वायरल कणों को केंद्रित करने के लिए, सुपरनैटेंट को एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लोड करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 47,508 × ग्राम पर घुमाएं।
    9. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और ट्यूब के अंदर सूखने के लिए ट्यूब को कागज पर उल्टा रखें।
    10. वायरल गोली पर पीबीएस के 30 μL जोड़ें। गोली को फिर से निलंबित न करें। 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    11. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके वायरल कणों को पुन: निलंबित करें। बुलबुले बनाने से बचें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एचईके -2-93 टी कोशिकाओं की कई प्लेटों को स्थानांतरित करके बड़ी मात्रा में वायरल कणों का उत्पादन किया जा सकता है।
  2. लेंटिवायरल कणों के साथ ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को संक्रमित करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल वाणिज्यिक ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों जैसे यू -87 एमजी, यू -373 एमजी, या टी 98 के लिए लिखा गया है। प्राथमिक रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए, प्लेटों और गैर-सीरम-आधारित माध्यम26 की विशिष्ट कोटिंग का उपयोग करें।
    1. ईगल के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) में उगाए गए यू -87 एमजी ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का 70% कंफ्लुएंट 10 सेमी डिश तैयार करें, जिसमें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनिसिलिन के लिए 100 यूनिट / एमएल अंतिम एकाग्रता और स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए 100 μg / mL), और गैर-आवश्यक अमीनो-एसिड (1x) शामिल हैं।
    2. वायरल कणों को 5,000 कमजोर पड़ने में 1 पर सीधे कोशिकाओं पर जोड़ें। एक कोमल घुमाव के साथ मिलाएं। वायरस को 20 घंटे से अधिक समय तक कोशिकाओं को संक्रमित करने की अनुमति न दें।
    3. वायरस युक्त माध्यम को हटा दें और इसे ताजा संस्कृति माध्यम से बदलें। टैग किए गए ट्यूबुलिन की अभिव्यक्ति को 48-72 घंटे के लिए अनुमति दें।
      नोट: निम्नलिखित चरणों को जैव सुरक्षा कैबिनेट बीएसएल 2 में किया जाना है।
    4. FACS-mKate2+ कोशिकाओं के सबसे चमकीले 15% का चयन करने के लिए कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। फॉरवर्ड और साइड स्कैटर (एफसीएस बनाम एसएससी) गेटिंग का उपयोग करके मलबे और डबल कोशिकाओं को हटाने के बाद, शीर्ष 15% रखने के लिए सबसे चमकीले 30% एमकेएटी 2 + कोशिकाओं पर एक और गेटिंग लागू करें।
    5. एमटी-लेबल कोशिकाओं को बढ़ाएं।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्यूबुलिन-एमकेएटी 2 के उच्च स्तर के आधार पर क्लोनल चयन एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है।

2. माइक्रोइंजेक्शन के लिए जेब्राफिश लार्वा तैयार करें

  1. जेब्राफिश अंडे उत्पन्न करें।
    1. वांछित ज़ेबराफिश स्ट्रेन के तीन नर और चार मादाओं को एक संभोग टैंक में ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन से 4 दिन पहले, देर दोपहर में मार्बल के साथ पूरक करें।
      नोट: टीजी (fli1a:gfp), Tg (gfap:gfp), या Tg (Huc:gfp) लाइनों का उपयोग क्रमशः अंतर्जात वाहिकाओं, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं / एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स को चिह्नित करने के लिए किया जाता है।
    2. सुबह के बाद संगमरमर से प्रेरित स्पॉनिंग द्वारा उत्पादित अंडे एकत्र करें।
    3. अंडे को खनिज स्रोत पानी से भरे 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करके साफ करें27 ब्लीच (0.004% अंतिम) के साथ पूरक है। धीरे से ट्यूब को 5 मिनट के लिए पलट दें। केवल मिनरल वाटर से दो बार धोएं।
    4. अंडे को एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें खनिज पानी 0.28 मिलीग्राम / एमएल मेथिलीन नीले रंग के साथ पूरक होता है।
    5. अनफर्टिलाइज्ड और विकास-गिरफ्तार अंडे को हटा दें। भ्रूण को 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. पारदर्शी लार्वा बनाएं।
    1. मेलेनिन पिग्मेंटेशन को रोकने और ऑप्टिकल पारदर्शिता सुनिश्चित करने के लिए, 8 घंटे बाद मध्यम में एन-फेनिलथियोरिया (पीटीयू) (0.003% अंतिम) पेश करें। बाकी प्रोटोकॉल के लिए पीटीयू को माध्यम में रखें।
      नोट: क्योंकि पीटीयू उपचार विकास संबंधी दोषों का कारण बन सकता है, इसलिए क्सीनोट्रांसप्लांटेशन के लिए केवल सामान्य रूप से विकसित लार्वा का चयन करें। रासायनिक उपचार के विकल्प के रूप में, कोई उत्परिवर्ती ज़ेब्राफिश स्ट्रेन कैस्पर (नेकर और रॉय ऑर्बिसन डबल म्यूटेंट) का उपयोग कर सकता है, जिसमें रंजकताअनुपस्थित है।
    2. इनक्यूबेटिंग तापमान को 29 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं।
    3. हर दिन तापमान को 1 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं ताकि इंजेक्शन के दिन 3 डीपीएफ लार्वा 32 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाए।
  3. माइक्रोइंजेक्शन प्लेट तैयार करें।
    1. खनिज पानी के साथ 1% अगारोस + 0.28 मिलीग्राम / एमएल मेथिलीन ब्लू के 20 एमएल तैयार करें।
    2. अगारोस को 10 सेमी पेट्री डिश में डालें और 2.5 मिमी चौड़ी वी-आकार की खाइयों को बनाने के लिए माइक्रोइंजेक्शन प्लास्टिक मोल्ड को जल्दी से उल्टा लागू करें (चित्रा 2 बी)।
      नोट: प्लास्टिक मोल्ड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या ज़ेबराफिश बुक29 में वर्णित डिजाइन के बाद इन-हाउस बनाया जा सकता है।
    3. जब अगारोस जम गया हो तो प्लास्टिक के सांचे को सावधानी से हटा दें।
      नोट: माइक्रोइंजेक्शन कास्ट प्लेटों को 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. क्सीनोट्रांसप्लांटेशन के लिए लार्वा तैयार करें।
    1. इंजेक्शन के दिन, 3 डीपीएफ लार्वा में चयनित फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के लिए स्क्रीन। गैर-फ्लोरोसेंट, असामान्य दिखने वाले जानवरों को हटा दें।
    2. लार्वा को मैन्युअल रूप से बारीक-बारीक घड़ी निर्माता बल के साथ डीकोरियोनेट करें। 3 डीपीएफ पर, लार्वा को कोरियन से मुक्त करने के लिए दो जोड़ी महीन-टिम्प फोर्स के साथ कोरोन को धीरे-धीरे खोलें या फाड़ें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, प्रोनेस ए के साथ एंजाइमेटिक उपचार का उपयोग लार्वा को डिकोरियोनेट करने के लिए किया जा सकता है, आमतौर पर 24 एचपीएफ पर।
    3. मेथिलीन ब्लू (0.28 मिलीग्राम / एमएल) और पीटीयू (0.003% अंतिम) के साथ खनिज जल माध्यम में डिकोरियोनेटेड लार्वा को बनाए रखें।

3. ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन प्रक्रिया

  1. माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करें।
    1. केंद्रीय फिलामेंट के बिना एक बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका लें और इसे ऊर्ध्वाधर सुई खींचने वाले में रखें।
    2. निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके- 8.5 और हीटर 3-केशिका को माइक्रोइंजेक्शन सुई में बदलने के लिए स्ट्रेच करें।
  2. माइक्रोइंजेक्टर सेट करें।
    1. एक मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर में खनिज तेल लोड करें। हवा के बुलबुले हटा दें।
    2. माइक्रोइंजेक्टर के लिए एक सार्वभौमिक केशिका धारक प्लग करें और इसे एक यांत्रिक माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 2 ए) से मजबूती से संलग्न करें।
  3. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं की कटाई करें।
    नोट: निम्नलिखित चरण एक जैव सुरक्षा कैबिनेट बीएसएल 2 में आयोजित किए जाते हैं।
    1. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं की 10 सेमी प्लेट तैयार करें ताकि वे प्रत्यारोपण के दिन 80% संगम तक पहुंच सकें।
    2. (वैकल्पिक) कोशिकाओं में Hoechst 35480 (200 ng / mL) जोड़कर कोशिका नाभिक को क्षणिक रूप से लेबल करें। ह्यूमिडिफायर सेल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और पीबीएस के साथ 2 एक्स धोएं।
    3. कोशिकाओं की प्लेट को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और पीबीएस के साथ एक बार धो लें। 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 1 एमएल को जोड़कर कोशिकाओं को अलग करें और सेल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि सभी कोशिकाएं पूरी तरह से अलग न हो जाएं।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि खराब ट्रिप्सिनाइजेशन के परिणामस्वरूप सेल समुच्चय सुई में फंस जाएंगे।
    4. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पूर्ण ग्लियोब्लास्टोमा सेल माध्यम के 5 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया गया। 5 मिनट के लिए 134 × ग्राम पर 45 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
    5. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 1 एमएल बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से ऊपर और नीचे करके पुन: निलंबित करें।
      नोट: यांत्रिक पृथक्करण का यह कदम माइक्रोइंजेक्शन के दौरान केशिका में क्लॉगिंग के जोखिम को रोकने में बहुत मदद करता है।
    6. 5 मिनट के लिए 134 × ग्राम पर 49 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे पीबीएस के 200 μL में पुन: निलंबित करें। प्रत्यारोपण प्रक्रिया की अवधि के लिए बर्फ पर स्टोर करें।
  4. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को जेब्राफिश लार्वा मिडब्रेन में इंजेक्ट करें।
    1. 160 मिलीग्राम / एल ट्राइकेन के साथ पूरक ई 3-मध्यम30 के 6 एमएल के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन कास्ट प्लेट भरें।
    2. माइक्रोइंजेक्शन प्लेट में एक दर्जन डिकोरियोनेटेड लार्वा स्थानांतरित करें। एक बार छूने के लिए अनुत्तरदायी होने के बाद, उन्हें अपनी तरफ की खाइयों में संरेखित करें, सिर ऊपर उठाएं, और जर्दी थैली को खाई की दीवार के खिलाफ धकेल दिया जाए, जिसमें आकार 00 पेंट ब्रश (चित्रा 2 बी, सी) हो।
    3. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। माइक्रोलोडिंग युक्तियों का उपयोग करके माइक्रोकेशिका में कोशिकाओं के 5 μL लोड करें और केशिका को सार्वभौमिक केशिका धारक में डालें।
    4. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे अनुत्तरदायी लार्वा युक्त माइक्रोइंजेक्शन प्लेट रखें। माइक्रोमैनिपुलेटर नॉब्स का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन प्लेट की सीमा पर माइक्रोकेशिका की नोक रखें। एक तेज प्रवेश बिंदु बनाने के लिए इसे स्केलपेल के साथ तोड़ें, मोटे तौर पर एक सेल के व्यास का आकार।
    5. सत्यापित करें कि माइक्रोइंजेक्टर में धीरे-धीरे तेल चलाकर और सुई की नोक को माध्यम में गिराकर कोशिकाएं केशिका से बाहर बह रही हैं। केशिका के सिरे पर कोशिकाओं को केंद्रित करें ताकि प्रति मात्रा में इंजेक्ट की गई कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम किया जा सके और पीबीएस (चित्रा 2 सी) के साथ मस्तिष्क के ऊतकों को भरने से बचा जा सके।
    6. माइक्रोकेशिका से निकलने वाली कोशिकाओं की सावधानीपूर्वक जांच करें क्योंकि इंजेक्शन में तेल मैन्युअल रूप से पेश किया जाता है। अनुभवजन्य रूप से परिभाषित करें कि 20 से 50 कोशिकाओं को वितरित करने के लिए मैनुअल नॉब पर कितना मोड़ आवश्यक है। आमतौर पर, यदि कोशिकाएं पर्याप्त रूप से केंद्रित होती हैं, तो ~ 10 कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए एक कोमल मोड़ पर्याप्त होता है।
      नोट: यदि तरल माइक्रोकेशिका से ठीक से बाहर नहीं निकलता है, तो केशिका धारक में माइक्रोकेशिका के लगाव को ढीला करने का प्रयास करें। ऐसा करने से, तेल लीक हो सकता है और केशिका के साथ नीचे टपक सकता है।
    7. मध्य सेरेब्रल नस (एमसीईवी, चित्रा 2 एफ) के ठीक ऊपर, बाएं ऑप्टिक टेक्टम (ओटी) के खिलाफ केशिका की नोक से संपर्क करें।
    8. लार्वा के खिलाफ केशिका को धीरे से दबाएं जब तक कि त्वचा झिल्ली टूट न जाए (चित्रा 2डी, ई)।
      नोट: बहुत जोर से धक्का न दें क्योंकि इसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को मस्तिष्क में बहुत गहरा इंजेक्ट किया जाएगा जहां कम ऑप्टिकल स्पष्टता एमटी को विस्तार से देखने से रोक ेगी। इमेजिंग तकनीक 250-300 μm तक पहुंचने वाली गहराई के लिए संभव है। हालांकि, मछली की सतह से 100 μm से अधिक गहरा इंजेक्शन नहीं लगाने की सिफारिश की जाती है।
    9. एक बार ओटी में एक उपयुक्त स्थिति तक पहुंचने के बाद, कोशिकाओं को बाहर निकाल दें। जानवर के अंदर जाने वाली कोशिकाओं की धारा की कल्पना करने के लिए केशिका की नोक का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें, जिससे सफल इंजेक्शन सुनिश्चित हो सके।
      नोट: सावधान रहें कि वेंट्रिकल्स में इंजेक्शन न लगाएं (चित्रा 2 ई)। एक बार वेंट्रिकल्स में, कोशिकाएं ऊतक में घुसपैठ करने के बजाय जमा हो जाती हैं और अटक जाती हैं (चित्रा 2 आई)। वेंट्रिकल इंजेक्शन मस्तिष्क की तीव्र सूजन और अग्रमस्तिष्क और हिंडब्रेन में इंजेक्शन कोशिकाओं के अवलोकन योग्य प्रसार की विशेषता है (चित्रा 2 जे)।
    10. चरण 3.4.9-3.4.11 से प्रक्रिया को उतने जानवरों के लिए दोहराएं जितना आवश्यक हो। केशिका में कोशिकाओं के झुरमुट को रोकने के लिए जल्दी से आगे बढ़ें।
      नोट: प्रयोगकर्ता इंजेक्शन में कितनी तेजी से है, इसके आधार पर, हर 10 से 20 लार्वा में सुई के परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है।
    11. एक बार जब ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन पूरा हो जाता है, तो लार्वा को माइक्रोइंजेक्शन प्लेट से हटा दें और उन्हें खनिज स्रोत पानी + पीटीयू + मेथिलीन ब्लू माध्यम से भरी 24-वेल प्लेट में एकल करें।
    12. फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 2 जी) के तहत लार्वा का अवलोकन करके सफल इंजेक्शन को मान्य करें। ओटी के शीर्ष 200 μm (z में) में स्थित 20-50 कोशिकाओं द्वारा गठित एकल ट्यूमर द्रव्यमान वाले केवल जेनोग्राफ्ट्स का चयन करें (चित्रा 2H बनाम चित्रा 2I-K में असफल इंजेक्शन)।
      नोट: सफलतापूर्वक स्थानीयकृत जेनोग्राफ्ट्स की उपज शुरुआत में 10% से अभ्यास के साथ लगभग 100% तक भिन्न होती है।
    13. इमेजिंग से पहले लार्वा को 32 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए ठीक होने दें।
      नोट: माध्यम में एंटीबायोटिक्स जोड़ने से लार्वा की जीवित रहने की दर में वृद्धि नहीं होती है। इस स्तर पर, यदि माइक्रोइंजेक्शन सही ढंग से किया गया है, तो लगभग 100% मछली जीवित रहती है।

4. ग्लियोब्लास्टोमा जेनोग्राफ्ट्स की इंट्रावाइटल इमेजिंग

  1. लाइव इमेजिंग के लिए लार्वा को माउंट करें।
    नोट: लार्वा को 4 घंटे के बाद इंजेक्शन (एचपीआई) से चित्रित किया जा सकता है। एमटी की लाइव इमेजिंग आमतौर पर 20 एचपीआई से की जाती है, जब आक्रामक जीबीएम कोशिकाओं ने प्रोट्रूशियंस का विस्तार करना शुरू कर दिया है और ट्यूमर द्रव्यमान से दूर पलायन कर रहे हैं।
    1. 1% कम पिघलने वाला अगारोस समाधान तैयार करें। उबले हुए 1% कम पिघलने वाले अगारोस घोल के 500 μL को 1.5 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे हीट ब्लॉक पर 37 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा होने दें। अगारोस में ट्राइकेन (112 μg/mL) डालें और अच्छी तरह मिलाएँ।
    2. खनिज स्रोत पानी + पीटीयू + मेथिलीन माध्यम से भरे 3.5 सेमी पेट्री डिश में एक से चार जेनोग्राफ्ड लार्वा को स्थानांतरित करें जो ट्राइकेन (112 μg / mL) के साथ पूरक है। एक बार जब लार्वा छूने के लिए अनुत्तरदायी हो जाते हैं, तो उन्हें एक फाइन-टिप ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके अगारोस और ट्राइकेन युक्त ट्यूब में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
      नोट: अगारोस को पतला करने को सीमित करने के लिए मध्यम की मात्रा को न्यूनतम रखें।
    3. धीरे से लार्वा को अगारोस के साथ मिलाएं। एक सामान्य (बड़े बल्ब) ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, अगारोस में मिश्रित लार्वा को ग्लास-बॉटम 3.5 सेमी वीडियो-इमेजिंग डिश के केंद्र पर रखें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, मछली में हेरफेर करने के लिए माइक्रोलोडिंग टिप का उपयोग करके लार्वा को जल्दी से अपनी पीठ पर रखें।
      नोट: क्योंकि इस प्रोटोकॉल में इंट्रावाइटल मस्तिष्क इमेजिंग के लिए एक उल्टे स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, लार्वा को पृष्ठीय रूप से लगाया जाता है। एक सीधा कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय लार्वा की स्थिति को तदनुसार समायोजित करें।
    4. सबसे पतली संभव अगारोस परत को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त अगारोस को हटा दें। एक बार जब अगारोस जम जाता है, तो खनिज स्रोत पानी + पीटीयू + 0.2 एक्स ट्राइकेन (इमेजिंग माध्यम) के 2.5 एमएल जोड़ें और अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  2. ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं पर हमला करने में एमटी गतिशीलता की विवो लाइव इमेजिंग में
    नोट: छवियों की ऑप्टिकल गुणवत्ता माइक्रोस्कोप के प्रदर्शन पर निर्भर करती है। प्रोटोकॉल एक उल्टे स्पिनिंग-डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए लिखा गया है जो एक एससीएमओएस कैमरा (पिक्सेल आकार 6.5 μm, 2048 x 2044 पिक्सेल), लंबी कामकाजी दूरी के उद्देश्य और तापमान-नियंत्रित पर्यावरण कक्ष से लैस है।
    1. वीडियो-इमेजिंग डिश जिसमें अगारोस-एम्बेडेड जेनोग्राफ्ड लार्वा होता है, को एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के पर्यावरण कक्ष में रखें, जिसमें तापमान 32 डिग्री सेल्सियस पर सेट होता है। मोटरचालित एक्सवाई चरण का उपयोग करके 10x उद्देश्य के साथ वीडियो-इमेजिंग डिश में लार्वा का पता लगाएं।
    2. उद्देश्यों को कम करने के लिए ईएससी दबाएं, 60x तेल उद्देश्य (1.4 एनए, कामकाजी दूरी: 0.13 मिमी) पर खनिज तेल जोड़ें, और प्रारंभिक फोकल स्थिति में वापस जाने के लिए ईएससी दबाएं।
    3. लाल चैनल (561 एनएम लेजर स्रोत, 20% लेजर पावर, टाइम एक्सपोजर: 200 एमएस) में हमलावर ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का निरीक्षण करें और एक स्प्रेड-आउट एमटी नेटवर्क और आसानी से पहचाने जाने वाले एमटी फिलामेंट्स के साथ एक सेल का चयन करें (चित्रा 3 बी)।
    4. z-श्रृंखला सेटिंग्स सेट करें। 200 μm रेंज पीज़ो चरण का उपयोग करके, MT नेटवर्क के शीर्ष और निचले स्थानों का चयन करें: एक 10-30 μm गहरा z-स्टैक माइग्रेटिंग सेल के प्रोट्रूशियंस में सूक्ष्मनलिका नेटवर्क की कल्पना करने के लिए पर्याप्त है, जिसमें 0.3 μm का z-स्लाइस चरण है।
    5. तेजी से फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए अधिग्रहण की गति, जेड-स्टैक गहराई और फ्लोरोसेंट सिग्नल के बीच इष्टतम संतुलन की अनुमति देने के लिए टाइम-लैप्स अधिग्रहण सेटिंग्स सेट करें। कई मिनटों के लिए हर 5-10 सेकंड में एमटी की छवियां प्राप्त करें। 5 डी (x, y, z, t, c) हाइपरस्टैक प्राप्त करें और सहेजें।
      नोट: अधिग्रहण के दौरान जेड में बहाव से बचने के लिए, हार्डवेयर फोकस स्थिरीकरण के रूप में एक आदर्श फोकस सिस्टम से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  3. (वैकल्पिक) एमटी पर सूक्ष्मनलिका-परिवर्तन एजेंटों (एमटीए) के प्रभावों को निर्धारित करें।
    नोट: निम्नलिखित चरण वास्तविक समय में ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को माइग्रेट करने में एमटी नेटवर्क पर एमटीए के प्रभावों का परीक्षण करने की अनुमति देते हैं।
    1. धीरे से वीडियो-इमेजिंग डिश से इमेजिंग माध्यम को हटा दें। पकवान के निचले हिस्से को न छुएं, क्योंकि xyz स्थिति खो जाएगी।
    2. विभिन्न सांद्रता पर एमटीए युक्त नया इमेजिंग माध्यम तैयार करें। धीरे से एमटीए युक्त माध्यम को वीडियो-इमेजिंग डिश ड्रॉप में ड्रॉप द्वारा जोड़ें।
    3. एमटी नेटवर्क और सेल माइग्रेशन पर एमटीए की प्रत्येक एकाग्रता के प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए दीर्घकालिक फिल्में (2-16 घंटे, हर 10-20 मिनट में एक छवि) प्राप्त करें (चित्रा 4 ए)।
    4. (वैकल्पिक) एमटीए को धीरे से हटाकर और एमटीए के बिना 2.5 एमएल ताजा इमेजिंग माध्यम जोड़कर एमटीए को धो लें। माध्यम में एमटीए के किसी भी निशान को साफ करने के लिए वॉशआउट प्रक्रिया को 3x दोहराएं।
    5. (वैकल्पिक) 4.3.3 (चित्रा 4 बी) के समान दीर्घकालिक फिल्म प्राप्त करें।
      नोट: उपरोक्त चरण लार्वा के अस्तित्व को प्रभावित किए बिना एमटी नेटवर्क को बदलने वाली न्यूनतम एकाग्रता निर्धारित करते हैं। वॉशआउट चरण परिभाषित करते हैं कि दवा का प्रभाव प्रतिवर्ती है या नहीं।
  4. अनुक्रमिक इमेजिंग द्वारा ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण पर एमटीए प्रभाव का आकलन करें।
    1. माइक्रोइंजेक्शन के बाद चरण 4.1 से 4.2.1 4 घंटे का पालन करें।
      नोट: प्रोटोकॉल का यह हिस्सा अन्य फ्लोरोसेंटली टैग किए गए ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों के साथ भी प्राप्त किया जा सकता है। आदर्श रूप से, कोशिका की वैश्विक आकृति विज्ञान का पता लगाने के लिए जीबीएम को साइटोसोलिक टैग और एक न्यूक्लियस टैग के साथ सह-लेबल करें।
    2. एक लंबी कामकाजी दूरी 40x पानी के उद्देश्य पर स्विच करें (NA: 1.15, WD: 0.6 मिमी)।
    3. ओटी क्षेत्र प्राप्त करने के लिए जेड-श्रृंखला रेंज सेट करें। उच्च संवेदनशीलता एससीएमओएस कैमरा (पिक्सेल आकार 11 μm,1,200 x 1,200 पिक्सेल, क्वांटम दक्षता 95%) का उपयोग करके z-स्टैक प्राप्त करें।
      नोट: जेड-स्टैक आमतौर पर ओटी के सबसे पृष्ठीय भाग (सतह के करीब) से शुरू होता है और पूरे ट्यूमर सेल द्रव्यमान को शामिल करने के लिए मस्तिष्क में पर्याप्त गहरा समाप्त होता है।
    4. माइक्रोस्कोप से वीडियो-इमेजिंग डिश को हटा दें। माइक्रोलोडिंग टिप का उपयोग करके और धीरे से जानवर के चारों ओर अगारोस को घुमाकर लार्वा को अगारोस से मुक्त करें।
      नोट: चूंकि 3 डीपीएफ लार्वा अभी भी बहुत नाजुक हैं, इसलिए उन्हें अगारोस से हटाते समय सावधान रहें।
    5. एक बार जब जानवर अगारोस से मुक्त हो जाता है, तो धीरे से इसे खनिज स्रोत पानी + मेथिलीन ब्लू + पीटीयू माध्यम से भरे 24-वेल प्लेट के एकल कुएं में स्थानांतरित करें। बाद की इमेजिंग के लिए लार्वा की पहचान करने के लिए कुएं को चिह्नित करें।
    6. पहले निर्धारित एकाग्रता पर माध्यम में रुचि का एमटीए जोड़ें (चरण 4.3.3)। हर दिन दवा के साथ पूरक माध्यम को ताज़ा करें। 3-4 दिनों के लिए हर दिन चरण 4.4.1 से 4.4.5 तक इमेजिंग प्रक्रिया दोहराएं।

5. छवि विश्लेषण

  1. स्वतंत्र रूप से उपलब्ध फिजी प्लगइन्स के साथ एमटी गतिशीलता का विश्लेषण करें।
    नोट: कई समीक्षाएं और प्रोटोकॉल कोशिकाओं 31,32,33,34 में एमटी गतिशीलता विश्लेषण के तरीकों का वर्णन करते हैं और इस स्तर पर लागू किए जा सकते हैं। यह प्रोटोकॉल मूल एमटी गतिशील गुणों को मापने के लिए संक्षेप में दो तरीकों का उल्लेख करेगा।
    1. 5 डी हाइपरस्टैक खोलें और एक 4 डी स्टैक उत्पन्न करें जहां जेड में अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) बनाने के लिए जेड-स्लाइस को एक विमान में प्रक्षेपित किया गया है (छवि | ढेर | जेड परियोजना | अधिकतम तीव्रता) (चित्रा 3 बी)।
    2. 4 डी एमआईपी स्टैक खोलें और फिजी (प्लगइन्स | में मैन्युअल ट्रैकिंग फ़ंक्शन का उपयोग करके प्रोट्रूशन-आधारित एमटी के अंत को मैन्युअल रूप से ट्रैक करें। ट्रैकिंग | मैनुअल ट्रैकिंग)। (चित्र 3 डी)। एमटी गतिशीलता के मापदंडों जैसे विकास की गति, संकोचन गति, बचाव आवृत्ति और तबाही आवृत्ति निकालें।
    3. वैकल्पिक रूप से, विश्लेषण करने के लिए एमटी के साथ 10 पिक्सेल चौड़ी एक खंडित रेखा खींचें (चित्रा 3 बी)। मल्टी काइमोग्राफ फ़ंक्शन का उपयोग करें (विश्लेषण | फिजी में मल्टी काइमोग्राफ) (चित्रा 3 सी)। एमटी बढ़ते चरणों (जी), विराम (पी) की लंबाई, और एमटी तबाही की आवृत्ति का निरीक्षण और माप करें।
  2. दीर्घकालिक ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण का विश्लेषण
    नोट: इस विश्लेषण के लिए बायोइमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ 4 डी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण के उपयोग की आवश्यकता होती है।
    1. फ़ाइल कनवर्टर सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, चरण 4.4.3 (4 hpi) से कच्चे 4D z-स्टैक को उपयुक्त सॉफ़्टवेयर प्रारूप में कनवर्ट करें।
    2. सॉफ़्टवेयर खोलें और परिवर्तित z-स्टैक फ़ाइल को अपरव्यू (चित्रा 5A) में आयात करें।
    3. ट्यूमर कोशिकाओं को विभाजित करने और लाल चैनल में अप्रासंगिक ऑटोफ्लोरेसेंस को छोड़ने के लिए, नई सतह जोड़ें पर क्लिक करें और 5-चरण प्रक्रिया का पालन करें।
      1. विंडो पॉप अप होने के बाद अगले तीर पर क्लिक करके डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को मान्य करें। चरण 2/5 पर आगे बढ़ें।
        नोट: यदि फ्लोरोसेंट सिग्नल 561 चैनल में प्राप्त किया जाता है, तो आंख में अवशिष्ट रंजकता से ऑटोफ्लोरेसेंस मजबूत हो सकता है और स्वचालित विभाजन प्रक्रिया को बदल सकता है। यह समस्याग्रस्त है यदि जेनोग्राफ्ट आंख के करीब स्थित है। उस स्थिति में, गैर-ग्लियोब्लास्टोमा सेल संकेतों को काटकर और हटाकर विभाजन को मैन्युअल रूप से समाप्त करना होगा।
      2. स्रोत चैनल | 561 चैनल पर नेविगेट करें। सतहों के विस्तार में 1.50 μm जोड़कर और उप-पृष्ठभूमि में गोले के व्यास के लिए 2.5 μm जोड़कर छवि (गॉसियन फ़िल्टर) को चिकना करें। अगले तीर पर क्लिक करें और चरण 3/5 पर आगे बढ़ें।
      3. सिग्नल की तीव्रता के आधार पर, प्रत्येक सेल प्रक्रिया को शामिल करने के लिए थ्रेशोल्ड (पृष्ठभूमि सबस्ट्रक्शन) को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। चरण 4/5 पर आगे बढ़ें।
      4. खंडित संकेत को उन घटनाओं को हटाकर फ़िल्टर करें जो सेल के हिस्से का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं (जैसे, मलबे, ऑटोफ्लोरेसेंस)। फ़िल्टर प्रकार | वॉल्यूम पर क्लिक करें और सेल के हिस्से का प्रतिनिधित्व करने वाले सबसे छोटे वॉल्यूम के नीचे की सभी घटनाओं को बाहर करने के लिए थ्रेशोल्ड को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। चरण 5/5 पर आगे बढ़ें।
        नोट: यदि ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल सबसे छोटे सेल भाग की तुलना में मात्रा में बड़े हैं, तो वैसे भी आगे बढ़ें और बाएं-क्लिक करके और उन्हें हटाकर अवांछित संकेतों को मैन्युअल रूप से हटा दें।
      5. वर्गीकरण चरण को त्याग दें और ट्यूमर कोशिकाओं का सतह दृश्य बनाने के लिए डबल हरे तीर पर क्लिक करके विभाजन विज़ार्ड समाप्त करें (चित्रा 5 बी)।
    4. यदि खंडित कोशिकाएं एक-दूसरे को नहीं छूती हैं और एक अद्वितीय वस्तु नहीं बनाती हैं, तो उन्हें ट्यूमर सेल मास ऑब्जेक्ट बनाने के लिए कृत्रिम रूप से विलय करें। संक्षेप में, वॉल्यूम | विशिष्ट मानों | विस्तृत सांख्यिकी | पर क्लिक करें। शीर्ष पर बाएं क्लिक करके और फिर शिफ्ट पकड़कर और अंतिम पर क्लिक करके सभी घटनाओं का चयन करें। चयन को संपादित करने | एकीकृत करने | लिए नेविगेट करें।
    5. ट्यूमर सेल द्रव्यमान के केन्द्रक को परिभाषित करें। नए स्पॉट जोड़ें | पर क्लिक करें स्वचालित निर्माण | छोड़ दें जोड़ें (कर्सर के साथ प्रतिच्छेद करता है) | वस्तु का केंद्र। स्पॉट बनाने के लिए शिफ्ट और बाएं क्लिक को पकड़ें, जो खंडित ट्यूमर सेल द्रव्यमान का केन्द्रक है।
    6. प्रत्येक जीबीएम सेल और ट्यूमर द्रव्यमान के केन्द्रक के बीच 3 डी दूरी को मापें। ऐसा करने के लिए, स्पॉट दृश्य पर रहकर और टूल आइकन का चयन करके केन्द्रक चैनल की दूरी बनाएं | दूरी परिवर्तन। 488 और 561 चैनल (नीले रंग में, चित्रा 5 सी) के साथ केन्द्रक चैनल के लिए एक नई दूरी बनाए जाने की प्रतीक्षा करें।
      नोट: इस चैनल में प्रत्येक वोक्सेल की तीव्रता वोक्सेल से ट्यूमर सेल द्रव्यमान के केन्द्रक के बीच 3 डी दूरी से मेल खाती है।
    7. नए स्पॉट जोड़ें पर क्लिक करके प्रत्येक खंडित सेल के केन्द्रक तक 3 डी दूरी को मापें | स्वचालित निर्माण | छोड़ दें जोड़ें (कर्सर के साथ प्रतिच्छेद करता है) | विशिष्ट चैनल 561. शिफ्ट पकड़ें और सेल न्यूक्लियस क्षेत्र पर बाएं क्लिक करें। प्रत्येक कक्ष के लिए यह कार्य करें (चित्र 5D)।
      नोट: कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति संकेत की बेहतर सराहना करने के लिए सतह दृश्य को हटा दें। वैकल्पिक रूप से, यदि मौजूद है, तो बेहतर सटीकता के लिए न्यूक्लियस सिग्नल (405 एनएम या 647 एनएम सिग्नल) का उपयोग करें।
    8. सांख्यिकी | पर क्लिक करें विस्तृत | विशिष्ट मान | तीव्रता का अर्थ Ch = केन्द्रक से दूरी है।
      नोट: तीव्रता का मान सेल न्यूक्लियस क्षेत्र और केन्द्रक के बीच 3 डी दूरी है।
    9. 4 एचपीआई पर ट्यूमर द्रव्यमान की त्रिज्या की गणना करने के लिए इन तीव्रताओं को औसत करें। विश्लेषण के हर समय बिंदु (24 एचपीआई, 48 एचपीआई, और 72 एचपीआई) के लिए प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: सेल आक्रमण को कम आंकने से बचने के लिए केवल 10 या 20 सबसे अधिक प्रसारित कोशिकाओं को मापें। दरअसल, इंजेक्शन के दौरान कोशिकाओं का जबरन संघनन ट्यूमर द्रव्यमान के केंद्र में कोशिकाओं को पलायन करने से रोक सकता है।
    10. आक्रमण सूचकांक (II) की गणना t = 4 hpi पर ट्यूमर द्रव्यमान की औसत त्रिज्या पर सबसे अधिक प्रसारित कोशिकाओं की औसत 3D दूरी = 24 hpi/48 hpi/72 hpi के बीच के अनुपात के रूप में करें (चित्र 5E)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विवो जीबीएम आक्रमण के दौरान एमटी द्वारा निभाई गई भूमिका का विश्लेषण करने के लिए, हम यहां लेंटिवायरल संक्रमण द्वारा जीबीएम कोशिकाओं में स्थिर एमटी लेबलिंग करने के प्रमुख चरणों का वर्णन करते हैं, 3 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा में जीबीएम कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक जेनोट्रांसप्लांटेशन, एमटी गतिशीलता की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंट्रावाइटल इमेजिंग, एमटीए उपचार और जीबीएम आक्रमण पर इसके प्रभाव, और एमटी गतिशीलता और विवो आक्रमण की छवि विश्लेषण (चित्रा 1)। एमटी गतिशीलता को या तो बढ़ते और सिकुड़ते एमटी (चित्रा 3 सी) के साथ किमोग्राफ के निर्माण द्वारा या समय के साथ व्यक्तिगत एमटी किनारों को मैन्युअल रूप से ट्रैक करके मापा जाता है (चित्रा 3 डी)। लार्वा माध्यम में प्रशासित दवा उपचार और एमटी नेटवर्क संगठन पर इसके प्रतिवर्ती प्रभाव का एक उदाहरण चित्र 4 में दिया गया है। नोकोडाज़ोल (200 एनएम) की कम खुराक के साथ उपचार एमटी नेटवर्क के प्रगतिशील संकोचन और ग्लियोब्लास्टोमा सेल प्रोट्रूशन के गायब होने की ओर जाता है 4 घंटे बाद (चित्रा 4 ए)। दवा को धोने से ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं की प्रोट्रूशियंस बनाने की क्षमता बहाल हो गई। वॉशआउट के 12 घंटे बाद वाहिका के साथ कोशिकाओं ने पलायन करना शुरू कर दिया (चित्रा 4 बी)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि 200 एनएम नोकोडाज़ोल के साथ उपचार एमटी नेटवर्क को बाधित करने और विवो ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण में तेजी से ब्लॉक करने के लिए पर्याप्त है। वैश्विक ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण पर एक ही उपचार के 3 दिन के विश्लेषण से पता चलता है कि नोकोडाज़ोल 200 एनएम एक नियंत्रण की तुलना में मछली के सामान्य स्वास्थ्य को प्रभावित किए बिना विवो में दीर्घकालिक ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण को रोकता है (चित्रा 4 सी)।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल वर्कफ़्लो आरेख। संक्षेप: डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; एचपीआई = इंजेक्शन के बाद घंटे; एमटी = सूक्ष्मनलिकाएं; एमटीए = सूक्ष्मनलिका-परिवर्तन एजेंट; जीबीएम = ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को 3 डीपीएफ जेब्राफिश लार्वा दिमाग में माइक्रोइंजेक्ट करना। (ए) ज़ेनोट्रांसप्लांटेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरणों की तस्वीर: 1, तेल माइक्रोइंजेक्टर; 2, मैकेनिकल माइक्रोमैनिपुलेटर; 3, सार्वभौमिक केशिका धारक; 4, ग्लास केशिका। माइक्रोइंजेक्शन प्लेट एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे है। (बी) एनेस्थेटाइज्ड 3 डीएफपी जेब्राफिश लार्वा को एक खाई में संरेखित और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए तैयार दिखाने वाली तस्वीर। लाल डाई से भरी एक माइक्रोकेशिका की नोक तस्वीर के दाईं ओर दिखाई देती है। अगारोस प्लेट में निर्मित पैटर्न वाली खाइयों का विवरण निचले दाएं कोने पर इनसेट में देखा जाता है। स्केल बार = 3 मिमी (सी) एक प्रतिनिधि माइक्रोइंजेक्शन प्लेट की योजना। रेडी-टू-इंजेक्टेड लार्वा को पार्श्व (प्लेट का केंद्र) रखा जाता है। ध्यान दें कि इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं को माइक्रोकेशिका (काला तीर) के सिरे पर केंद्रित किया जाता है। इंजेक्शन वाले लार्वा को प्लेट के दाईं ओर दिखाया जाता है, जिसे उदर रूप से रखा जाता है। (डी) माइक्रोइंजेक्शन प्लेट (सी में काली बिंदीदार रेखा के साथ) में एक ट्रांसवर्सल स्लाइस की योजना, जिसमें उन खाइयों को दिखाया गया है जहां इंजेक्शन के दौरान लार्वा रखे जाते हैं। (ई) ऑप्टिक टेक्टम (डॉटेड लाइन) में प्रवेश करने के लिए तैयार केशिका की नोक को दिखाने वाली तस्वीर। वेंट्रिकल्स को सफेद रेखाओं द्वारा चित्रित किया गया है। स्केल बार = 150 μm. (F) एंडोथेलियल कोशिकाओं में gfp को व्यक्त करने वाले 3 dpf fli1a: gfp लार्वा की योजना, ओटी क्षेत्र को इंगित करती है जहां कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, मध्य सेरेब्रल नस के ठीक ऊपर। (जी) यू 87-एमकेएटी 2 कोशिकाओं (सफेद सर्कल और सफेद तीर) के माइक्रोइंजेक्शन के बाद पार्श्व रूप से रखे गए 3 डीपीएफ जीपएपी: जीएफपी लार्वा (तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में व्यक्त जीएफपी) की प्रतिदीप्ति छवि। लाल रंग में उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस आंखों में इरिडोफोर के कारण होता है। स्केल बार = 100 μm. (H) 16 hpi पर सफलतापूर्वक इंजेक्ट किए गए fli1a: gfp लार्वा की कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस छवि। स्केल बार: 96 एचपीआई (आई) और 4 एचपीआई (जे, के) पर असफल इंजेक्शन वाले एफएलआई 1 ए: जीएफपी लार्वा की 50 μm (I-K) कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस छवियां। जीबीएम कोशिकाओं को वेंट्रिकल्स (आई, जे) या मस्तिष्क (के) में कई फॉसी में इंजेक्ट किया गया है। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षेप: डीपीएफ = निषेचन के बाद के दिन; ओटी = ऑप्टिक टेक्टम; एमसीईवी = मध्य सेरेब्रल नस; जीएफपी = हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन; जीएफएपी = ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन; एचपीआई = इंजेक्शन के बाद घंटे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में विवो माइक्रोट्यूबुल्स गतिशीलता में कल्पना करना। (ए) 20 एचपीआई पर एक एफएलआई 1 ए: जीएफपी जेब्राफिश लार्वा के ओटी में ट्यूबुलिन-ए 1-एमकेएटी 2 को व्यक्त करने वाली जेनोग्राफ्ड यू 87 कोशिकाओं की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवि। (बी) एकल जेनोग्राफ्ड यू 87 सेल में एमटी नेटवर्क की अधिकतम तीव्रता अनुमानित प्रतिदीप्ति छवि। (सी) बी में लाल बिंदीदार रेखा के साथ किमोग्राफ, एमटी गतिशील अस्थिरता के बढ़ते, ठहराव और तबाही चरणों को दर्शाता है। (डी) बी में बॉक्स किए गए क्षेत्र का टाइम-लैप्स अनुक्रम तीन एमटी + सिरों की ट्रैकिंग को उजागर करता है। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षेप: ओटी = ऑप्टिक टेक्टम; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एचपीआई = इंजेक्शन के बाद घंटे; एमटी = सूक्ष्मनलिकाएं; जी = बढ़ता चरण; पी = विराम चरण; सी = तबाही चरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विवो में ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण पर सूक्ष्मनलिका बदलने वाले एजेंट के प्रभावों की कल्पना करना। (ए) नोकैडाज़ोल (200 एनएम) के साथ इलाज किए गए ज़ेबराफिश लार्वा में ट्यूबुलिन-ए 1 ए-एमकेएटी 2 को व्यक्त करने वाली यू 87 कोशिकाओं का टाइम-लैप्स अनुक्रम। तीर एक रक्त वाहिका के साथ मस्तिष्क पर आक्रमण करने वाली दो अलग-अलग कोशिकाओं में प्रोट्रूशियंस के चरम को इंगित करते हैं। नोकोडाज़ोल के साथ उपचार पर प्रोट्रूशियंस की वापसी पर ध्यान दें। स्केल बार = 10 μm. (B) यू 87 सेल आक्रमण पर नोकोडाज़ोल वॉशआउट के प्रभाव का प्रतिनिधित्व करने वाला टाइम-लैप्स अनुक्रम। वॉशआउट के 500 मिनट बाद, सफेद तारांकन चिह्न के साथ चिह्नित कोशिका एक एमटी-आधारित प्रोट्रूशियंस (सफेद तीर) को बढ़ाती है, जो रक्त वाहिका के साथ आक्रमण को फिर से शुरू करने की अनुमति देती है। स्केल बार = 20 μm. (C) 72 घंटे के लिए DMSO या nocodazole (200 nM) के साथ इलाज किए गए एक जेनोग्राफ्टेड लार्वा मस्तिष्क का 3D प्रतिनिधित्व। यू 87 कोशिकाओं के संकेत को खंडित (लाल रंग में) किया गया है और एफएलआई 1 ए-जीएफपी फ्लोरेसेंस सिग्नल (सफेद में) में एकीकृत किया गया है। नोकोडाज़ोल के साथ इलाज किए गए यू 87 कोशिकाओं के कम प्रसार पर ध्यान दें। स्केल बार = 30 μm. संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एचपीआई = इंजेक्शन के बाद घंटे; एमटी = सूक्ष्मनलिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विवो ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण में छवि विश्लेषण। (ए) एफएलआई 1 ए-जीएफपी जेब्राफिश लार्वा, 4 एचपीआई में साइटोसोलिक एमकेएटी 2 को व्यक्त करने वाली जेनोग्राफ्ड यू 87 कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट छवियां। सफेद तारांकन आंख इरिडोफोर से विशिष्ट ऑटोफ्लोरेसेंस को रेखांकित करते हैं। स्केल बार = 40 μm. (B) FLI1a-GFP लार्वा की फ्लोरोसेंट छवि A में U87 कोशिकाओं के संकेत के अनुरूप खंडित सतह के साथ युग्मित है। ट्यूमर द्रव्यमान का केन्द्रक हरा दिखाई देता है। स्केल बार = 40 μm. (C) फ्लोरोसेंट छवि A में लाल चैनल सिग्नल और नए परिभाषित "केन्द्रक से दूरी" चैनल (नीले रंग में) का प्रतिनिधित्व करती है। (D) लाल चैनल फ्लोरेसेंस छवि रंगीन धब्बों के साथ सुपरइम्पोज की जाती है, जिसका रंग कोशिका की केन्द्रक (हरे रंग में) की दूरी का प्रतिनिधित्व करता है, बैंगनी केन्द्रक के सबसे करीब होता है और सफेद सबसे दूर होता है। स्केल बार = 20 μm. (E) वैश्विक GBM आक्रमण के अनुक्रमिक विश्लेषण का एक उदाहरण। 3 डी दूरी 4 एचपीआई और 72 एचपीआई पर निर्धारित की जाती है, और आक्रमण सूचकांक (II) की गणना इनबॉक्स में सूत्र के अनुसार की जाती है। स्केल बार = 20 μm। संक्षेप: जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एचपीआई = इंजेक्शन के बाद घंटे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एकल-कोशिका संकल्प पर इमेजिंग ट्यूमर जेनोग्राफ्ट्स जीबीएम जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनने की संभावना है। माउस पीडीएक्स मॉडल में लाइव इमेजिंग ने मूल्यवान खोजों को जन्म दिया है कि जीबीएम सामूहिक रूप से मस्तिष्क के ऊतकों पर कैसे आक्रमण करताहै। हालांकि, आज तक, जीबीएम आक्रमण को नियंत्रित करने वाले प्रोटीन की गतिशीलता को प्रकट करने के लिए स्थानिक संकल्प पर्याप्त नहीं है। हमने तर्क दिया कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंट्रावाइटल इमेजिंग के साथ पारदर्शी ज़ेब्राफिश लार्वा में जीबीएम कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक एनग्राफ्टिंग को युग्मित करके, एमटी जैसे साइटोस्केलेटल प्रोटीन का सीटू जीबीएम आक्रमण के दौरान उनकी गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त विस्तार से विश्लेषण किया जा सकता है।

कार्यप्रणाली के महत्वपूर्ण चरण जीबीएम कोशिकाओं और माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया की तैयारी में निहित हैं। अस्वास्थ्यकर और अपर्याप्त रूप से अलग कोशिकाएं एक साथ या केशिका सीमाओं पर चिपक जाएंगी और इंजेक्शन के प्रवाह को अवरुद्ध करेंगी। इसके अलावा, इंजेक्शन की मात्रा को कम करने और उन्हें थोक में प्रत्यारोपित करने के लिए कोशिकाओं को केशिका में पर्याप्त रूप से केंद्रित करने की आवश्यकता होती है। अधिक पतला कोशिकाओं की उच्च मात्रा को इंजेक्ट करने से कई, कभी-कभी इंटरमिक्स ट्यूमर फॉसी होंगे, जिनके आक्रामक इंडेक्स को मापना मुश्किल हो जाता है। हमारे हाथों में, तेल-आधारित माइक्रोइंजेक्टर की मैनुअल हैंडलिंग एक दबाव वाले वायु-आधारित इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोइंजेक्टर की तुलना में इंजेक्शन प्रवाह के बेहतर नियंत्रण की अनुमति देती है जिसका उपयोग पहले इसी तरह के मॉडल19 में किया गया है। यह मस्तिष्क के अंदर अतिरिक्त प्रवाह दबाव को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे बाद में ऊतक क्षति और इंजेक्शन कोशिकाओं के वेंट्रिकुलर एकत्रीकरण से बचा जा सकता है।

इस मॉडल की कुछ सीमाओं में दोनों प्रजातियों के लिए उप-मानक तापमान पर प्रयोग करने की आवश्यकता शामिल है। ज़ेबराफिश को आमतौर पर 28 डिग्री सेल्सियस पर उठाया जाता है, जबकि मानव कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत किया जाता है। 32 डिग्री सेल्सियस से ऊपर, ज़ेबराफिश भ्रूण के विकास को बदल दिया जाता है और ये परिवर्तन घातक हो सकतेहैं। हालांकि, वयस्क ज़ेब्राफिश जेनोग्राफ्ट मॉडल36 में जो किया जाता है, उसी तरह, क्रमिक रूप से ज़ेब्राफिश लार्वा को 32 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर अनुकूलित करने से प्रत्यारोपण के बाद के तापमान में तेजी से बदलाव की तुलना में प्रत्यारोपित जानवरों का अस्तित्व बढ़ जाता है। हालांकि, तापमान बढ़ने से 32 डिग्री सेल्सियस35 से ऊपर के तापमान के लिए ज़ेब्राफिश भ्रूण की संवेदनशीलता के अनुसार जानवरों की मृत्यु में वृद्धि होती है।

विवो एमटी डायनामिक्स डेटा की व्याख्या सावधानी से की जानी चाहिए क्योंकि तापमान 37 डिग्री सेल्सियस से नीचे गिरने पर एमटी गतिशीलता बदल जातीहै। एक ही एमटीए उपचार के साथ एक ही जीबीएम कोशिकाओं में 37 डिग्री सेल्सियस और 32 डिग्री सेल्सियस पर एमटी गतिशीलता के समानांतर इन विट्रो माप विभिन्न जीबीएम कोशिकाओं के बीच या विवो उपचारों के बीच देखे गए अंतरों को मान्य करने में मदद करेगा। यह पुष्टि करने में मदद करनी चाहिए कि अंतर तापमान संवेदनशीलता में भिन्नता के कारण नहीं बल्कि विभिन्न विनियमन मार्गों (जीबीएम तुलना विश्लेषण के लिए) या एमटीए उपचार (एमटीए प्रभाव विश्लेषण के लिए) के कारण होते हैं। यह दिलचस्प होगा यदि एमटी गतिशीलता विषमताओं को विभिन्न आक्रमण क्षमताओं से जोड़ा जाना चाहिए।

एक और सीमा कम समय की खिड़की है जिसके दौरान आक्रमण की निगरानी की जा सकती है (72 से 96 घंटे), एमटी गतिशीलता38 में संभावित परिवर्तनों द्वारा संचालित आक्रमण प्लास्टिसिटी के माप को रोकता है। 96 घंटे के बाद, हमने जीबीएम सेल आक्रमण में तेज कमी देखी। इंजेक्शन के 6 दिनों के बाद, जीबीएम कोशिकाओं की संख्या में तेजी से गिरावट आई, संभवतः ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट39 में न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज के संचय के कारण मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण। पूरे मस्तिष्क में एमटीए वितरित करने से आस-पास की न्यूरोनल होस्ट कोशिकाओं को प्रभावित करने की संभावना है, जो अपनी गतिविधि के लिए एमटी पर निर्भर करते हैं और जिनका परिवर्तन बाद में जीबीएम आक्रमण40 को प्रभावित कर सकता है। इस दृष्टिकोण को जीबीएम कोशिकाओं में एमटी परिवर्तन को प्रतिबंधित करने वाले एसएचआरएनए या ऑप्टोजेनेटिक्स परख के साथ पूरक करने की आवश्यकता है, लेकिन नए एंटी-इनवेसिव यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक अच्छा मंच बना हुआ है।

जेब्राफिश मस्तिष्क में एमटी-लेबल जीबीएम कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन कैंसर सेल आक्रमण के दौरान एमटी की भूमिका को समझने के लिए विशेष रुचि रखता है, क्योंकि बहुत कम पशु मॉडल अपने मूल15 के ऊतक में कैंसर सेल माइग्रेशन के सीटू उपकोशिकीय इमेजिंग की अनुमति देते हैं। आज तक, जीबीएम माइग्रेशन के दौरान एमटी कार्यों के अध्ययन ज्यादातर इन विट्रो और एक्स विवो परखों पर निर्भर करते हैं और विवो सत्यापन 24,41,42,43 में कमी है। जीन-ऑफ-इंटरेस्ट नॉक डाउन या निष्पक्ष जीन-आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के साथ युग्मित, यहां प्रस्तुत परख नए एमटी नियामकों को प्रकट करने में मदद करेगी जो विवो में जीबीएम आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण हैं।

जीबीएम अत्यधिक विषम ट्यूमर हैं जिनके आक्रामक गुण नमूनों44 के बीच बहुत भिन्न होते हैं। आक्रमण के अपने विभिन्न तरीकों को अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना जीबीएम प्रसार को अवरुद्ध करने के लिए तदर्थ चिकित्सीय उपचार को परिभाषित करने में मदद करेगा। विभिन्न जीबीएम नमूनों में आक्रामक सूचकांक, आक्रमण के तरीके और एमटी गतिशीलता जैसे साइटोस्केलेटल गुणों का व्यवस्थित माप विशिष्ट साइटोस्केलेटल गुणों पर निर्भर लगातार जीनोमिक म्यूटेशनल प्रोफाइल और सेल आक्रमण पैटर्न के बीच नए सहसंबंध प्रकट करेगा। यह खुलासा करना कि ये उत्परिवर्तन एमटी गतिशीलता में परिवर्तन को कैसे प्रभावित करते हैं, न केवल सेल माइग्रेशन45,46 के दौरान एमटी विनियमन पर हमारे ज्ञान को जोड़ देगा, बल्कि लंबे समय से प्रतीक्षित रोगी-विशिष्ट, एंटी-इनवेसिव चिकित्सीय भी हो सकता है।

उपलब्ध लार्वा की उच्च संख्या और दवाओं के इंजेक्शन की आसानी के साथ संयुक्त जेब्राफिश में माइक्रोइंजेक्टिंग की सापेक्ष आसानी इस प्रक्रिया को व्यक्तिगत दवा47,48 के लिए उपयुक्त बनाती है। इसके अलावा, चूहों में जीबीएम जेनोग्राफ्ट्स की इंट्रावाइटल इमेजिंग के विपरीत, यह केवल कॉर्टेक्स49,50 के ऊपरी 500 μm भाग में होता है, ज़ेब्राफिश का उपयोग पूरे सीएनएस में जीबीएम घुसपैठ के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। यहां प्रस्तुत मॉडल ग्लियोब्लास्टोमा की आक्रामक क्षमताओं और उपचार के प्रति इसकी प्रतिक्रिया के तेजी से विश्लेषण के लिए एक अमूल्य उपकरण बनने के मानदंडों को पूरा करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हर्बोमेल (इंस्टीट्यूट पाश्चर, फ्रांस) और उनकी प्रयोगशाला, विशेष रूप से वैलेरी ब्रिओलैट और एम्मा कोलुची-गुयोन के लिए बेहद आभारी हैं कि उन्होंने हमें जेब्राफिश लाइनें और माइक्रोइंजेक्शन प्लेटों के लिए प्लास्टिक मोल्ड प्रदान किया, और ज़ेब्राफिश प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पर उनकी मूल्यवान विशेषज्ञता के लिए। हम फ्रेंच नेशनल रिसर्च एजेंसी फ्रांस बायोइमेजिंग और एएनआर -10-आईएनबीएस -04 द्वारा समर्थित यूटीसीएस फोटोनिक बायोइमेजिंग (सी 2आरटी, इंस्टीट्यूट पाश्चर) को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं; भविष्य के लिए निवेश)। इस काम को लिग्यू कॉन्ट्रे ले कैंसर (ईएल 2017) द्वारा समर्थित किया गया था। एलएनसीसी, सेंटर नेशनल डे ला रेचरचे साइंटिफिक, और इंस्टीट्यूट पाश्चर और श्रीमती मार्गुराइट मिशेल और श्री पोरक्वेट के उदार दान द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

जीव विज्ञान अंक 185 ऑर्थोटोपिक जेनोग्राफ्ट पीडीएक्स ज़ेबराफिश डेनियो रेरियो ग्लियोब्लास्टोमा उपकोशिकीय इंट्रावाइटल इमेजिंग 5 डी छवि विश्लेषण
ज़ेबराफिश मस्तिष्क पर हमला करने वाले ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबुल्स डायनामिक्स की लाइव इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter