Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Живая визуализация динамики микротрубочек в клетках глиобластомы, вторгающихся в мозг рыбок данио

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

Мы сообщаем о методе, позволяющем в реальном времени визуализировать динамику микротрубочек в клетках глиобластомы (GBM), вторгающихся в ткань мозга позвоночных. Соединение ортотопической инъекции флуоресцентно помеченных клеток GBM в прозрачный мозг рыбок данио с прижизненной визуализацией высокого разрешения позволяет измерять динамику цитоскелета во время инвазии рака in situ .

Abstract

С мрачным средним временем выживания в реальных популяциях - от 6 до 15 месяцев - глиобластома (GBM) является наиболее разрушительной злокачественной опухолью головного мозга. Неудача лечения в основном обусловлена инвазивностью клеток GBM, что говорит о необходимости лучшего понимания подвижных свойств GBM. Для исследования молекулярного механизма, поддерживающего инвазию GBM, требуются новые физиологические модели, позволяющие углубленно характеризовать динамику белка во время инвазии. Эти наблюдения проложат путь к открытию новых целей для блокирования инфильтрации опухоли и улучшения результатов лечения пациентов. В этой статье сообщается, как ортотопический ксенотрансплантат клеток GBM в мозге рыбок данио позволяет субклеточную прижизненную живую визуализацию. Сосредоточив внимание на микротрубочках (МТ), мы описываем процедуру маркировки МТ в клетках GBM, микроинъекции клеток GBM в прозрачный мозг через 3 дня после оплодотворения (dpf) личинок рыбок данио, прижизненной визуализации МТ в диссеминирующих ксенотрансплантатах, изменения динамики МТ для оценки их роли во время инвазии GBM и анализа полученных данных.

Introduction

Подвижность клеток является стереотипным процессом, требующим установления оси полярности и силообразующих цитоскелетных перестроек. Полимеризация актина и его связь с миозином признаны основными факторами, способствующими протрузивным и сократительным силам, необходимым для движения клеток1. Микротрубочки считаются основными действующими лицами в поляризации клеток и направленной персистенции во время миграции2. В последние годы было также показано, что МТ создают и стабилизируют протрузии для поддержки механокомпрессивных сил во время инвазии клеток в 3D3. В последнее время МТ принимают непосредственное участие в механотрансдукции при фокальных спайках и механочувствительной миграции4. Динамическая нестабильность, характеризующая конечную динамику МТ-плюс, состоит из повторяющихся фаз полимеризации (роста) и деполимеризации (усадки), которые контролируются множеством микротрубочек-связывающих белков и внутриклеточных сигнальных каскадов, таких как управляемые RHO-GTPases 5,6,7. Роль сети МТ в миграции и инвазии клеток сделала исследование динамики МТ ключевым элементом для лучшего понимания механизмов самонаведения иммунных клеток, заживления ран и инвазии рака.

Способность раковых клеток покидать первичное ядро опухоли, распространяться в тканях и генерировать вторичные опухоли является критическим шагом в предотвращении глобального успеха в войне против рака, объявленной 50 лет назад 8,9. Одним из самых больших препятствий было понимание того, как раковые клетки активно вторгаются в ткани. Ключевые механизмы инвазии основаны на тех же принципах, что и те, которые управляют миграцией неопухолевых клеток10. Тем не менее, особенности миграции раковых клеток выявили11, что вызвало необходимость лучшей характеристики этого типа миграции. В частности, поскольку микроокружение опухоли выступает в качестве ключевого игрока в прогрессировании рака12, наблюдение и анализ инвазии раковых клеток в соответствующем физиологическом контексте имеет важное значение для разгадки механизмов распространения раковых клеток.

МТ играют центральную роль в прогрессировании рака, чтобы поддерживать как пролиферацию, так и инвазию. Точный анализ динамики МТ in situ может помочь идентифицировать МТ-изменяющие агенты (МТА) в обоих процессах. Динамика MT резко меняется в зависимости от изменения окружающей среды. In vitro лечение МТ-дестабилизирующими агентами, такими как нокодазол, предотвращает образование протрузии клеток, когда клетки встроены в гели в 3D, тогда как оно мало влияет на миграцию 2D клеток13,14. Несмотря на технические сложности, достижения в области прижизненной визуализации позволяют in vivo анализировать динамику МТ во время инвазии раковых клеток. Например, наблюдение МТ в подкожно ксенотрансплантированных клетках фибросаркомы у мышей показало, что опухолеассоциированные макрофаги влияют на динамику МТ в опухолевых клетках15. Тем не менее, эти мышиные модели включают обширные хирургические процедуры и остаются неудовлетворительными для менее доступных видов рака, таких как высокоинвазивная опухоль головного мозга, GBM.

Несмотря на мрачное 15-месячное среднее время выживания16, мало что известно о способе распространения GBM в паренхиме мозга или ключевых молекулярных элементах, поддерживающих инвазию клеток GBM в ткани мозга. Улучшение модели ортотопического ксенотрансплантата мышей (PDX) и создание черепных окон открыли новые перспективы для исследований инвазии клеток GBM17,18. Однако из-за неоптимального качества визуализации эта модель в основном позволяла продольную визуализацию поверхностных ксенотрансплантатов и до сих пор не была успешно использована для изучения субклеточной визуализации белков цитоскелетов. Кроме того, после введения запрета "3R" на сокращение использования грызунов и замену их низшими позвоночными были созданы альтернативные модели.

Используя преимущества примитивного иммунитета, наблюдаемого у личинок рыбок данио (Danio rerio), ортотопическая инъекция клеток GBM в мозг рыбы была разработана 19,20,21. Инъекция в непосредственной близости от желудочков в развивающемся среднем мозге рекапитулирует большую часть патофизиологии GBM человека21, и наблюдается та же предпочтительная картина инвазии GBM, что и у человека - ко-вариант сосудов -22. Благодаря прозрачности личинок рыб эта модель позволяет визуализировать клетки GBM, вторгающиеся в мозг из перижелудочковых областей, где, как полагают, возникает большинство GBM23.

Поскольку МТ необходимы для инвазии клеток GBM in vitro 24,25, необходима лучшая характеристика динамики МТ и идентификация ключевых регуляторов во время клеточной инвазии. Однако на сегодняшний день данные, полученные с помощью ортотопической модели рыбок данио, не включали субклеточный анализ динамики МТ в процессе инвазии. В данной работе представлен протокол для изучения динамики МТ in vivo и определения ее роли при инвазии рака мозга. После стабильной маркировки микротрубочек клетки GBM микроинъецируются с 3 dpf в мозг личинок рыбок данио и визуализируются в режиме реального времени с высоким пространственно-временным разрешением во время их прогрессирования в ткани мозга. Живая визуализация флуоресцентных МТ позволяет проводить качественный и количественный анализ динамики МТ плюс-энд. Кроме того, эта модель позволяет оценить влияние MTA на динамику MT и на инвазивные свойства клеток GBM в режиме реального времени. Этот относительно неинвазивный протокол в сочетании с большим количеством личинок, обрабатываемых одновременно, и простотой применения препарата (в рыбьей воде) делает модель активом для доклинических испытаний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Европейского Союза по обращению с лабораторными животными. Все протоколы были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных Института Пастера - CEEA 89 и Министерством исследований и образования Франции (разрешение No 01265.03). Во время инъекций или сеансов визуализации животных анестезировали Tricaine.At окончания экспериментальных процедур их усыпляли передозировкой анестетика. Подробную информацию о материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов. Общий рабочий процесс протокола описан на рисунке 1.

1. Генерация клеток глиобластомы стабильно экспрессирующих α-тубулин-mKate2

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги выполняются в шкафу биобезопасности BSL2+.

  1. Продуцируют лентивирусные частицы, экспрессирующие mKate2-тубулин, используя метод фосфата кальция для трансфекции 7 × 106 HEK-293T клеток.
    1. В микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл добавьте 10 мкг упаковочной плазмиды psPAX22-го поколения, 5 мкг плазмиды вирусной оболочки pMD2.G и 10 мкг интересующей плазмиды pGK-mKate2-человеческого тубулина α1a с 50 мкл CaCl2 (запас 2,5 М). Отрегулируйте до 500 мкл со стерильным H2Oбез DNAse.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавить CaCl2 последним.
    2. Перемешайте, перевернув трубку несколько раз, и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре (RT).
    3. Во время инкубации готовят еще 1,5 мл микроцентрифужной трубки с 500 мкл HEPES-буферного физиологического раствора (HBS), рН 7,0 (2x).
    4. Через 20 мин добавьте смесь CaCl2/ДНК по каплям в раствор HBS (2x). Перемешайте, перевернув трубку несколько раз. Инкубировать в течение 12 мин на РТ.
    5. Через 12 мин осторожно добавьте CaCl2/ДНК, смешанную с HBS, непосредственно на 70% сливающуюся 10 см чашку из клеток HEK-293T, капля за каплей.
    6. Оставьте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2 в течение 36-48 ч.
    7. Соберите супернатант и раскрутите его на 3000 × г в течение 5 мин, чтобы удалить клеточный мусор.
    8. Чтобы сконцентрировать вирусные частицы, загрузите супернатант в ультрацентрифужную трубку и раскрутите его при 47 508 × г в течение 90 мин при 4 °C.
    9. Выбросьте супернатант и поместите трубку вверх ногами на бумагу, чтобы высушить внутреннюю часть трубки.
    10. Добавьте 30 мкл PBS на вирусную гранулу. Не восстанавливайте гранулы повторно. Оставить при температуре 4 °C в течение 2 ч.
    11. Осторожно повторно суспендируйте вирусные частицы, пипетируя вверх и вниз. Избегайте образования пузырьков. Хранить при температуре -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большее количество вирусных частиц может быть получено путем трансфекции нескольких пластин клеток HEK-2-93T.
  2. Инфицировать клетки глиобластомы лентивирусными частицами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол написан для коммерческих клеточных линий глиобластомы, таких как U-87 MG, U-373 MG или T98. Для использования первичных клеток глиобластомы, полученных от пациента, используют специфическое покрытие пластин и несывороточную среду26.
    1. Приготовьте 70% сливающуюся 10-сантиметровую чашку из клеток U-87 MG глиобластомы, выращенных в минимальной незаменимой среде Eagle (MEM), дополненную 10% сывороткой для телят плода, пенициллином-стрептомицином (конечная концентрация 100 единиц / мл для пенициллина и 100 мкг / мл для стрептомицина) и заменимыми аминокислотами (1x).
    2. Добавьте вирусные частицы в разведении 1 из 5000 непосредственно на клетки. Перемешать нежным вихрем. Позвольте вирусам заразить клетки не более чем на 20 ч.
    3. Удалите вирусосодержащую среду и замените ее свежей питательной средой. Допускается экспрессия меченого тубулина в течение 48-72 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в шкафу биобезопасности BSL2.
    4. FACS -отсортировать ячейки, чтобы выбрать самые яркие 15% ячеек mKate2+ . После удаления мусора и дублетных ячеек с помощью переднего и бокового рассеяния (FCS vs SSC) нанесите еще один затвор на самые яркие 30% ячейки mKate2+ , чтобы сохранить верхние 15%.
    5. Усиливайте МТ-меченые клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, клональный отбор на основе высоких уровней тубулина-mKate2 может быть выполнен под эпифлуоресцентным микроскопом.

2. Подготовьте личинок рыбок данио к микроинъекции

  1. Генерируйте яйца рыбок данио.
    1. Поместите трех самцов и четырех самок нужного штамма рыбок данио в брачный аквариум, дополненный шариками, за 4 дня до ксенотрансплантации, поздно вечером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Линии Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) или Tg(Huc:gfp) используются для маркировки эндогенных сосудов, нервных стволовых клеток/астроцитов и нейронов соответственно.
    2. Соберите икру, полученную в результате нереста, вызванного мрамором, на следующее утро.
    3. Очистите яйца, перенеся их в центрифужную трубку объемом 50 мл, заполненную минеральной исходной водой27 , дополненной отбеливателем (0,004% финала). Осторожно переверните трубку на 5 мин. Дважды смойте только минеральной водой.
    4. Переложите яйца в чашку Петри, содержащую минеральную воду, дополненную 0,28 мг/мл метиленового синего.
    5. Удалите неоплодотворенные и остановленные развитием яйца. Инкубируют эмбрионы при 28 °C.
  2. Создавайте прозрачные личинки.
    1. Вводят N-фенилтиомочевину (ПТУ) (0,003% финала) в среду через 8 ч, чтобы предотвратить пигментацию меланина и обеспечить оптическую прозрачность. Держите PTU в среде для остальной части протокола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку обработка ПТУ может вызвать дефекты развития, выбирайте только нормально развитые личинки для ксенотрансплантации. В качестве альтернативы химической обработке можно использовать мутантный штамм рыбок данио каспер (перламутровый и рой-орбизон двойной мутант), у которого отсутствует пигментация28.
    2. Поднимите температуру инкубации до 29 °C.
    3. Увеличивайте температуру каждый день на 1 °C, чтобы личинки 3 dpf достигали 32 °C в день инъекции.
  3. Подготовьте микроинъекционную пластину.
    1. Приготовьте 20 мл 1% агарозы + 0,28 мг/мл метиленового синего с минеральной водой.
    2. Вылейте агарозу в чашку Петри размером 10 см и быстро нанесите микроинъекционную пластиковую форму вверх ногами, чтобы создать V-образные траншеи шириной 2,5 мм (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковая форма доступна в продаже или может быть изготовлена собственными силами в соответствии с конструкцией, описанной в Книге29 рыбок данио.
    3. Осторожно удалите пластиковую форму, когда агароза затвердеет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Литые пластины микроинъекции могут храниться при температуре 4 °C до 2 месяцев.
  4. Подготовьте личинок к ксенотрансплантации.
    1. В день инъекции проводится скрининг на выделенную флуоресцентную экспрессию трансгенов в личинках 3 dpf. Удалите нефлуоресцентных, аномально выглядящих животных.
    2. Дехорионируйте личинок вручную с помощью щипцов часовщика с мелким наконечником. При 3 dpf осторожно ткните или разорвите хорионы двумя парами щипцов с мелкими наконечниками, чтобы освободить личинок от хориона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, ферментативная обработка проназой А может быть использована для дехорионата личинок, обычно при 24 л.с.ф.
    3. Поддерживать дехорионированные личинки в среде минеральной воды с метиленовым синим (0,28 мг/мл) и ПТУ (0,003% конечным).

3. Процедура ксенотрансплантации

  1. Подготовьте микроинъекционные иглы.
    1. Возьмите капилляр боросиликатного стекла без центральной нити и поместите его в вертикальный съемник иглы.
    2. С помощью следующих настроек – увеличение на 8,5 и нагреватель на 3 – растяжения капилляра, чтобы превратить его в микроинъекционную иглу.
  2. Настройте микроинжектор.
    1. Загрузите минеральное масло в ручной микроинжектор. Удалите пузырьки воздуха.
    2. Подключите универсальный капиллярный держатель к микроинжектору и прочно прикрепите его к механическому микроманипулятору (рисунок 2А).
  3. Соберите клетки глиобластомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги проводятся в шкафу биобезопасности BSL2.
    1. Подготовьте 10-сантиметровую пластинку клеток глиобластомы так, чтобы они достигали 80% слияния в день трансплантации.
    2. (Необязательно) Временно маркируют ядра клеток, добавляя в клетки Hoechst 35480 (200 нг/мл). Инкубировать в течение 20 мин при 37 °C в увлажненном клеточном инкубаторе и промыть 2 раза PBS.
    3. Выньте пластинку клеток из инкубатора и вымойте один раз PBS. Отделяют клетки путем добавления 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубации в течение 5-10 мин при 37 °C в клеточном инкубаторе до полного отделения всех клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, так как плохая трипсинизация приведет к тому, что клеточные агрегаты останутся застрявшими в игле.
    4. Повторное суспендирование клеток в 5 мл полной клеточной среды глиобластомы в центрифужной трубке объемом 50 мл. Добавьте 45 мл ледяного PBS и центрифугу по 134 × г в течение 5 мин.
    5. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки с 1 мл ледяного PBS путем тщательной пипетки вверх и вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап механической диссоциации в значительной степени помогает предотвратить риск засорения капилляра во время микроинъекции.
    6. Добавьте 49 мл ледяного PBS и центрифугу по 134 × г в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в 200 мкл ледяного PBS. Хранить на льду на время процедуры трансплантации.
  4. Микроинъекция клеток глиобластомы в личинки рыбок данио в среднем мозге.
    1. Заполните микроинъекционную литую пластину 6 мл E3-среды30 с добавлением 160 мг/л трикаина.
    2. Перенесите дюжину дехорионированных личинок в микроинъекционную пластину. Как только вы перестанете реагировать на прикосновение, выровняйте их в траншеях на боку, головой вверх, а желточный мешок прижмитесь к стене траншеи, с помощью кисти размера 00 (рисунок 2B, C).
    3. Повторное суспендирование клеток глиобластомы. Загрузите 5 мкл клеток в микрокапилляр с помощью микрозагружающих наконечников и вставьте капилляр в универсальный капиллярный держатель.
    4. Поместите микроинъекционную пластину, содержащую невосприимчивых личинок, под стереомикроскоп. Поместите наконечник микрокапилляра на границу микроинъекционной пластины с помощью ручек микроманипулятора. Разбейте его скальпелем, чтобы создать резкую точку входа, размером примерно с диаметр ячейки.
    5. Убедитесь, что клетки вытекают из капилляра, осторожно запуская масло в микроинжектор и погружая кончик иглы в среду. Сконцентрируйте клетки на кончике капилляра, чтобы максимизировать количество клеток, вводимых на выбрасываемый объем, и избежать заполнения ткани мозга PBS (рисунок 2C).
    6. Внимательно изучите клетки, выходящие из микрокапилляра, так как масло вручную вводится в инжектор. Определите эмпирически, сколько оборотов необходимо на ручной ручке для доставки от 20 до 50 ячеек. Как правило, если клетки достаточно сконцентрированы, достаточно одного плавного поворота, чтобы извлечь ~ 10 клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость не вытекает должным образом из микрокапилляра, попробуйте ослабить прикрепление микрокапилляра в капиллярном держателе. При этом масло может просачиваться и капать вниз вдоль капилляра.
    7. Подойдите к кончику капилляра против левого оптического тектума (OT), чуть выше средней мозговой вены (MCeV, рисунок 2F).
    8. Осторожно прижмите капилляр к личинкам до тех пор, пока оболочка кожи не сломается (рисунок 2D,E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не давите слишком сильно, так как это приведет к инъекции клеток слишком глубоко в мозг, где более низкая оптическая четкость помешает наблюдать МТ в деталях. Метод визуализации возможен для глубины, достигающей 250-300 мкм. Однако рекомендуется не впрыскивать глубже 100 мкм от поверхности рыбы.
    9. Как только будет достигнуто подходящее положение в ОТ, выбросьте клетки. Внимательно наблюдайте за кончиком капилляра, чтобы визуализировать поток клеток, идущий внутрь животного, тем самым обеспечивая успешную инъекцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не вводить в желудочки (рисунок 2E). Попав в желудочки, клетки, как правило, накапливаются и застревают вместо того, чтобы проникать в ткань (рисунок 2I). Инъекция желудочков характеризуется интенсивным отеком мозга и наблюдаемой диссеминацией введенных клеток в передний мозг и задний мозг (рисунок 2J).
    10. Повторите процедуру, описанную в шагах 3.4.9-3.4.11, для необходимого количества животных. Действуйте быстро, чтобы предотвратить слипание клеток в капилляре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от того, насколько быстро экспериментатор делает инъекцию, может потребоваться смена иглы каждые 10-20 личинок.
    11. Как только ксенотрансплантация будет завершена, удалите личинок из микроинъекционной пластины и выделите их в 24-луночной пластине, заполненной минеральной исходной водой + ПТУ + метиленовой синей средой.
    12. Подтвердите успешную инъекцию, наблюдая за личинками под флуоресцентным стереомикроскопом (рисунок 2G). Отбирают только ксенотрансплантаты, содержащие единую опухолевую массу, образованную 20-50 клетками, расположенными в верхних 200 мкм (в z) ОТ (Рисунок 2Н против неудачной инъекции на Рисунке 2I-К).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выход успешно локализованных ксенотрансплантатов варьируется от 10% в начале до почти 100% с практикой.
    13. Дайте личинкам восстановиться в течение не менее 4 ч при 32 °C перед визуализацией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков в среду не увеличивает выживаемость личинок. На этом этапе, если микроинъекция была выполнена правильно, выживает почти 100% рыб.

4. Прижизненная визуализация ксенотрансплантатов глиобластомы

  1. Монтируйте личинок для визуализации в реальном времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки могут быть сфотографированы через 4 часа после инъекции (hpi). Живая визуализация МТ обычно выполняется от 20 hpi, когда инвазивные клетки GBM начали расширять протрузии и мигрировать от опухолевой массы.
    1. Готовят 1% низкоплавкий раствор агарозы. Переложите 500 мкл кипяченого 1% низкоплавкого раствора агарозы в трубку центрифуги объемом 1,5 мл и дайте ему остыть при 37 °C на тепловом блоке. Добавьте трикаин (112 мкг/мл) к агарозе и хорошо перемешайте.
    2. Переложите от одной до четырех ксенотрансплантированных личинок в 3,5 см чашку Петри, наполненную минеральной исходной водой + ПТУ + метиленовой средой, дополненной трицином (112 мкг/мл). Как только личинки не будут реагировать на прикосновения, осторожно перенесите их в трубку, содержащую агарозу и трикаин, используя тонкую передаточную пипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите объем среды до минимума, чтобы ограничить разбавление агарозы.
    3. Аккуратно смешайте личинки с агарозой. Используя обычную (большую колбу) передаточную пипетку, поместите личинки, смешанные в агарозе, в центр стеклянной 3,5-сантиметровой видео-картинки. Под стереомикроскопом быстро расположите личинок на спине, используя микрозарядной наконечник для манипулирования рыбой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в этом протоколе для прижизненной визуализации мозга используется инвертированный конфокальный микроскоп с вращающимся диском, личинки устанавливаются дорсально. Отрегулируйте положение личинок соответствующим образом, если используете вертикальный конфокальный микроскоп.
    4. Удалите лишнюю агарозу, чтобы сохранить как можно более тонкий слой агарозы. Как только агароза затвердеет, добавьте 2,5 мл минеральной исходной воды + PTU + 0,2x трикаин (среда визуализации) и перейдите к следующему этапу.
  2. In vivo живая визуализация динамики МТ в вторгшихся клетках глиобластомы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптическое качество изображений во многом зависит от производительности используемого микроскопа. Протокол написан для инвертированного конфокального микроскопа с вращающимся диском, оснащенного камерой sCMOS (размер пикселя 6,5 мкм, 2048 x 2044 пикселей), объективом большого рабочего расстояния и камерой окружающей среды с контролируемой температурой.
    1. Поместите видеовизуальную тарелку, содержащую встроенные в агарозу ксенотрансплантированные личинки, в камеру окружающей среды перевернутого конфокального микроскопа с температурой, установленной на уровне 32 °C. Найдите личинок в видео-картинке с 10-кратным объективом, используя моторизованную ступень XY.
    2. Нажмите клавишу ESC , чтобы опустить башню объектива, добавьте минеральное масло на 60-кратный масляный объектив (1,4 NA, рабочее расстояние: 0,13 мм) и нажмите КЛАВИШУ ESC , чтобы вернуться в исходное фокальное положение.
    3. Понаблюдайте за вторгающимися клетками глиобластомы в красном канале (лазерный источник 561 нм, мощность лазера 20%, время экспозиции: 200 мс) и выберите ячейку с разветвленной сетью МТ и легко различимыми НИТЯМИ МТ (рисунок 3В).
    4. Установите параметры z-серии. Используя пьезоступенчату диапазона 200 мкм, выберите верхнюю и нижнюю позиции сети MT: z-стека глубиной 10-30 мкм достаточно для визуализации сети микротрубочек в протрузии мигрирующей ячейки, с шагом z-среза 0,3 мкм.
    5. Установите параметры покадровой съемки, чтобы обеспечить оптимальный баланс между скоростью захвата, глубиной z-стека и флуоресцентным сигналом, чтобы избежать быстрого фотоотбеливания. Получайте изображения МТ каждые 5-10 с в течение нескольких минут. Приобретите и сохраните гиперстек 5D (x,y,z,t,c).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать дрейфа в z во время захвата, используйте микроскоп, оснащенный идеальной системой фокусировки в качестве аппаратной стабилизации фокусировки.
  3. (Необязательно) Определить влияние микротрубочек-изменяющих агентов (MTA) на МТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги позволяют проверить влияние MTA на сеть MT в миграции клеток глиобластомы в режиме реального времени.
    1. Аккуратно извлеките носитель изображений из видеокамеры. Не прикасайтесь к дну тарелки, так как положение xyz будет потеряно.
    2. Подготовьте новую среду визуализации, содержащую MTA в различных концентрациях. Аккуратно добавьте MTA-содержащую среду в тарелку для видеосъемки капля за каплей.
    3. Приобретайте долгосрочные фильмы (2-16 ч, одно изображение каждые 10-20 мин), чтобы наблюдать влияние каждой концентрации MTA на сеть MT и миграцию клеток (рисунок 4A).
    4. (Необязательно) Вымойте MTA, осторожно удалив среду и добавив 2,5 мл свежей среды для визуализации без MTA. Повторите процедуру вымывания 3 раза, чтобы очистить любые следы MTA в среде.
    5. (Необязательно) Приобретите такой же долгосрочный фильм, как в 4.3.3 (рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные этапы определяют минимальную концентрацию, изменяющую сеть МТ, не влияя на выживание личинок. Этапы вымывания определяют, является ли действие препарата обратимым.
  4. Оценить влияние MTA на инвазию глиобластомы с помощью последовательной визуализации.
    1. Выполните шаги с 4.1 по 4.2.1 через 4 ч после микроинъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола также может быть достигнута с помощью других флуоресцентно помеченных клеточных линий глиобластомы. В идеале, совместно маркируйте GBM с цитозольной меткой и меткой ядра, чтобы обеспечить обнаружение глобальной морфологии клетки.
    2. Переключение на большое рабочее расстояние 40x водяной объектив (NA:1.15, WD: 0.6 мм).
    3. Задайте диапазон z-серии для получения области OT. Приобретайте z-стек с помощью высокочувствительной sCMOS-камеры (размер пикселя 11 мкм, 1 200 x 1 200 пикселей, квантовая эффективность 95%).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Z-стек обычно начинается в самой дорсальной части ОТ (близко к поверхности) и заканчивается достаточно глубоко в мозге, чтобы включить всю массу опухолевых клеток.
    4. Извлеките видеокамеру из микроскопа. Освободите личинок от агарозы, используя микрозарядной наконечник и осторожно ткнув агарозу вокруг животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку личинки 3 dpf все еще очень хрупкие, будьте осторожны при удалении их из агарозы.
    5. Как только животное освободится от агарозы, аккуратно переложите ее в одну лунку из 24-луночной пластины, заполненной минеральной исходной водой + метиленовый синий + среда ПТУ. Отметьте колодец, чтобы идентифицировать личинок для последующей визуализации.
    6. Добавить МТА, представляющую интерес в среде, при концентрации, определенной ранее (этап 4.3.3). Обновляйте среду, дополненную препаратом каждый день. Повторяйте процедуру визуализации с шагов 4.4.1 до 4.4.5 каждый день в течение 3-4 дней.

5. Анализ изображений

  1. Анализируйте динамику MT с помощью свободно доступных плагинов FIJI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многие обзоры и протоколы описывают методы анализа динамики МТ в ячейках 31,32,33,34 и могут быть применены на данном этапе. Этот протокол кратко будет ссылаться на два метода измерения основных динамических свойств MT.
    1. Откройте гиперстек 5D и сгенерируйте 4D-стек, где z-срезы были спроецированы в одной плоскости для создания проекции максимальной интенсивности (MIP) в z (Image | Стеки | | проекта Z Максимальная интенсивность) (рисунок 3B).
    2. Откройте стек 4D MIP и вручную отследите конец MT на основе выступов, используя функцию ручного отслеживания в FIJI (Плагины | Отслеживание | Ручное отслеживание). (Рисунок 3D). Извлеките параметры динамики MT, такие как скорость роста, скорость усадки, частота спасения и частота катастроф.
    3. Кроме того, можно нарисовать сегментированную линию шириной 10 пикселей вдоль MT для анализа (рисунок 3B). Использование функции Multi Kymograph (Анализ | Мультикимограф) (рисунок 3С) на ФИДЖИ. Наблюдайте и измеряйте фазы роста МТ (G), продолжительность пауз (Р) и частоту катастроф МТ.
  2. Анализ длительной инвазии глиобластомы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ требует использования 4D-визуализации и анализа с программным обеспечением для биовизуализации.
    1. Преобразуйте необработанный 4D z-стек из шага 4.4.3 (4 hpi) в соответствующий формат программного обеспечения с помощью программного обеспечения File Converter.
    2. Откройте программное обеспечение и импортируйте преобразованный файл z-stack в представлении Surpass (рисунок 5A).
    3. Чтобы сегментировать опухолевые клетки и отбросить нерелевантную автофлуоресценцию в красном канале, нажмите «Добавить новые поверхности» и следуйте 5-этапному процессу.
      1. Проверьте настройки по умолчанию, щелкнув стрелку «Далее », как только появится окно. Перейдите к шагу 2/5.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если флуоресцентный сигнал получен в канале 561, автофлуоресценция от остаточной пигментации в глазу может быть сильной и изменить автоматический процесс сегментации. Это проблематично, если ксенотрансплантат расположен близко к глазу. В этом случае сегментация должна быть завершена вручную путем вырезания и удаления сигналов клеток, не относящихся к глиобластоме.
      2. Перейдите в раздел Исходный канал | канал 561. Сгладьте изображение (фильтр Гаусса), добавив 1,50 мкм в surfaces Detail и добавив 2,5 мкм для диаметра сфер на субстрактном фоне. Нажмите на следующую стрелку и перейдите к шагу 3/5.
      3. В зависимости от интенсивности сигнала вручную настройте Threshold (фоновая субстратия), чтобы включить каждый клеточный процесс. Перейдите к шагу 4/5.
      4. Отфильтруйте сегментированный сигнал, удалив события, которые не представляют часть ячейки (например, мусор, автофлуоресценция). Щелкните Тип фильтра | громкости и отрегулируйте пороговое значение вручную, чтобы исключить все события ниже наименьшего объема, представляющего часть ячейки. Перейдите к шагу 5/5.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если автофлуоресцентные сигналы больше по объему, чем самая маленькая часть ячейки, продолжайте в любом случае и вручную удалите нежелательные сигналы , щелкнув левой кнопкой мыши и удалив их.
      5. Отбросьте шаг классификации и завершите работу мастера сегментации, щелкнув двойную зеленую стрелку, чтобы завершить создание поверхностного представления опухолевых клеток (рисунок 5B).
    4. Если сегментированные клетки не касаются друг друга и не образуют уникальный объект, объедините их искусственно, чтобы создать объект массы опухолевой клетки. Вкратце, нажмите на Статистику | подробно | конкретных значений | объема. Выберите все события, щелкнув левой кнопкой мыши на верхнем, а затем удерживая Shift и щелкнув левой кнопкой мыши по последнему. Перейдите к редактированию | выделению | унификации.
    5. Определите центроид массы опухолевой клетки. Нажмите на Добавить новые места | Пропустить | автоматического создания Добавить (курсор пересекается с) | Центр объекта. Удерживайте shift и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы создать пятно, которое является центроидом сегментированной массы опухолевой клетки.
    6. Измерьте 3D-расстояние между каждой клеткой GBM и центроидом опухолевой массы. Для этого создайте расстояние до канала центроида , оставаясь в представлении Spot и выбирая значок инструмента | Преобразование расстояний. Дождитесь создания нового канала расстояния до центроида, наряду с каналами 488 и 561 (синим цветом, рисунок 5C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность каждого вокселя в этом канале соответствует 3D-расстоянию между вокселем и центроидом массы опухолевой клетки.
    7. Измерьте 3D-расстояние до центроида каждой сегментированной ячейки, нажав « Добавить новые пятна», | Пропустить | автоматического создания Добавить (курсор пересекается с) | специфический канал 561. Удерживайте shift и щелкните левой кнопкой мыши на области ядра клетки. Выполните эту задачу для каждой ячейки (рисунок 5D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите вид Surface , чтобы лучше оценить флуоресцентный сигнал ячеек. В качестве альтернативы, если она присутствует, используйте сигнал ядра (сигнал 405 нм или 647 нм) для большей точности.
    8. Нажмите на статистику | Подробный | Конкретные значения | среднее значение интенсивности Ch=расстояние до центроида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение интенсивности представляет собой 3D-расстояние в мкм между областью ядра клетки и центроидом.
    9. Усредните эти интенсивности, чтобы рассчитать радиус опухолевой массы при 4 hpi. Повторите процедуру для каждой временной точки анализа (24 hpi, 48 hpi и 72 hpi).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте только 10 или 20 наиболее диссеминированных клеток, чтобы избежать недооценки клеточной инвазии. Действительно, принудительное уплотнение клеток во время инъекции может помешать клеткам в центре опухолевой массы мигрировать.
    10. Рассчитайте индекс инвазии (II) как отношение между средними 3D-расстояниями при t = 24 hpi/48 hpi/72 hpi наиболее диссеминированных клеток по среднему радиусу массы опухоли при t = 4 hpi (рисунок 5E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы проанализировать роль, которую играют MTs во время инвазии IN VIVO GBM, мы опишем здесь основные шаги по выполнению стабильной маркировки MT в клетках GBM лентивирусной инфекцией, ортотопической ксенотрансплантации клеток GBM в личинках рыбок данио 3 dpf, прижизненной визуализации динамики MT с высоким разрешением, лечение MTA и его влияние на инвазию GBM, а также анализ изображений динамики MT и инвазии in vivo (рисунок 1). Динамика МТ измеряется либо путем построения кимографов вдоль растущих и уменьшающихся МТ (рисунок 3С), либо путем ручного отслеживания отдельных краев МТ с течением времени (рисунок 3D). Пример лекарственного лечения, проводимого в личиночной среде, и его обратимого влияния на организацию сети МТ приведен на рисунке 4. Лечение низкой дозой нокодазола (200 нМ) приводит к прогрессирующему усадке сети МТ и исчезновению протрузии клеток глиобластомы через 4 ч (рисунок 4А). Вымывание препарата восстановило способность клеток глиобластомы образовывать протрузии. Клетки возобновили миграцию вдоль сосудистой системы через 12 ч после вымывания (рисунок 4В). Эти данные свидетельствуют о том, что лечение нокодазолом 200 нМ достаточно для нарушения сети МТ и быстрого блокирования инвазии клеток глиобластомы in vivo . 3-дневный анализ того же лечения глобальной инвазии клеток глиобластомы показывает, что нокодазол 200 нМ останавливает долгосрочную инвазию клеток глиобластомы in vivo, не влияя на общее состояние здоровья рыб по сравнению с контролем (рисунок 4C).

Figure 1
Рисунок 1: Схема рабочего процесса протокола. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; hpi = часы после инъекции; МТ = микротрубочки; MTA = изменяющий микротрубочки агент; GBM = мультиформная глиобластома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Микроинъекция клеток глиобластомы в мозг 3 dpf личинок рыбок данио. (А) Фотография оборудования, используемого для ксенотрансплантации: 1, масляный микроинжектор; 2, механический микроманипулятор; 3, универсальный капиллярный держатель; 4, стеклянный капилляр. Микроинъекционная пластина находится под стереомикроскопом. (B) Фотография, на которой показаны анестезированные личинки рыбок данио 3 dfp, выровненные в траншее и готовые к микроинъекции. Кончик микрокапилляра, нагруженного красным красителем, виден справа от фотографии. Детали узорчатых траншей, встроенных в агарозную пластину, видны во вставке в правом нижнем углу. Шкала стержня = 3 мм. (C) Схема репрезентативной микроинъекционной пластины. Готовые к инъекции личинки размещаются сбоку (центр пластины). Обратите внимание, что клетки концентрируются на кончике микрокапилляра (черная стрелка), прежде чем приступить к инъекции. Введенные личинки показаны справа от пластины, размещенной вентрально. (D) Схема поперечного среза в микроинъекционной пластине (вдоль черной пунктирной линии в С), показывающая траншеи, куда помещаются личинки во время инъекции. (E) Фотография, показывающая кончик капилляра, готового проникнуть в оптический тектум (пунктирная линия). Желудочки очерчены белыми линиями. Шкала bar = 150 мкм. (F) Схема личинки 3 dpf fli1a:gfp, экспрессирующей gfp в эндотелиальных клетках, указывающая область OT, куда вводятся клетки, чуть выше средней мозговой вены. (G) Флуоресцентное изображение личинки 3 dpf gfap:gfp (gfp, экспрессируемой в нервных стволовых клетках), помещенной латерально после микроинъекции клеток U87-mkate2 (белый круг и белая стрелка). Высокая автофлуоресценция в красном цвете вызвана иридофорами в глазах. Шкала бара = 100 мкм. (H) Конфокальное флуоресцентное изображение успешно введенной личинки fli1a:gfp при 16 hpi. Шкала: 50 мкм. (I-K) Конфокальные флуоресцентные изображения неудачно введенных личинок fli1a:gfp при 96 hpi (I) и 4 hpi (J,K). Клетки GBM были введены в желудочки (I,J) или в несколько очагов в головном мозге (K). Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: dpf = дни после оплодотворения; OT = оптический тектум; MCeV = средняя мозговая вена; gfp = зеленый флуоресцентный белок; gfap = глиальный фибриллярный кислый белок; hpi = часы после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Визуализация динамики микротрубочек in vivo в клетках глиобластомы. (A) Репрезентативное флуоресцентное изображение ксенотрансплантированных клеток U87, экспрессирующих тубулин-α1-mkate2 в ОТ личинки рыбки данио fli1a:GFP при 20 hpi. (B) Проекционное флуоресцентное изображение максимальной интенсивности сети MT в одной ксенотрансплантированной ячейке U87. (C) Кимограф вдоль красной пунктирной линии в B, показывающий растущую, паузу и катастрофические фазы динамической нестабильности MT. (D) Последовательность замедления квадратной области в B с выделением отслеживания трех концов MT +. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: OT = оптический тектум; GFP = зеленый флуоресцентный белок; hpi = часы после инъекции; МТ = микротрубочки; G = фаза роста; P = фаза паузы; C = фаза катастрофы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Визуализация влияния агента, изменяющего микротрубочки, на инвазию глиобластомы in vivo. (A) Покадровая последовательность клеток U87, экспрессирующих тубулин-α1a-mkate2 у личинок рыбок данио, обработанных нокадазолом (200 нМ). Стрелки указывают на конечность выпячивания в двух разных клетках, вторгающихся в мозг вдоль кровеносного сосуда. Обратите внимание на втягивание выпячивания при лечении нокодазолом. Шкала бара = 10 мкм. (B) Покадровая последовательность, представляющая влияние вымывания нокодазола на инвазию клеток U87. Через 500 мин после вымывания клетка, отмеченная белой звездочкой, удлиняет выступ на основе МТ (белая стрелка), что позволяет возобновить инвазию вдоль кровеносного сосуда. Шкала бара = 20 мкм. (C) 3D-представления мозга ксенотрансплантированных личинок, обработанных DMSO или нокодазолом (200 нМ) в течение 72 ч. Сигнал ячеек U87 был сегментирован (красным цветом) и интегрирован в флуоресцентный сигнал fli1a-GFP (белым цветом). Обратите внимание на снижение диссеминации клеток U87, обработанных нокодазолом. Шкала бара = 30 мкм. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; hpi = часы после инъекции; МТ = микротрубочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ изображений инвазии in vivo глиобластомы. (A) Флуоресцентные изображения ксенотрансплантированных клеток U87, экспрессирующих цитозольный mKate2 в личинках рыбок данио fli1a-GFP, 4 hpi. Белые звездочки подчеркивают типичную автофлуоресценцию от глазных иридофоров. Шкала бара = 40 мкм. (B) Флуоресцентное изображение личинок fli1a-GFP в сочетании с сегментированной поверхностью, соответствующей сигналу клеток U87 в A. Центроид опухолевой массы выглядит зеленым. Шкала = 40 мкм. (C) Флуоресцентное изображение, представляющее сигнал красного канала в A и вновь определенный канал «расстояние до центроида» (синим). Шкала = 30 мкм. (D) Изображение флуоресценции красного канала, наложенное цветными пятнами, цвет которых представляет расстояние ячейки до центроида (зеленым цветом), фиолетовый является ближайшим к центроиду, а белый - самым дальним друг от друга. Шкала бара = 20 мкм. (E) Пример последовательного анализа глобального вторжения GBM. 3D-расстояния определяются при 4 hpi и 72 hpi, а индекс вторжения (II) рассчитывается по формуле в почтовом ящике. Шкала бар = 20 мкм. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; hpi = часы после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Визуализация опухолевых ксенотрансплантатов с одноклеточным разрешением, вероятно, станет незаменимым инструментом для улучшения нашего понимания биологии GBM. Живая визуализация в мышиных моделях PDX привела к ценным открытиям о том, как GBM коллективно вторгается в ткань мозга18. Однако на сегодняшний день пространственно-временное разрешение недостаточно велико, чтобы выявить динамику белков, контролирующих инвазию GBM. Мы пришли к выводу, что, связав ортотопическое приживление клеток GBM в прозрачных личинках рыбок данио с прижизненной визуализацией высокого разрешения, цитоскелетные белки, такие как MT, могут быть проанализированы достаточно подробно, чтобы проанализировать их динамику во время инвазии IN SITU GBM.

Важнейшие этапы методики заключаются в подготовке клеток GBM и процедуре микроинъекции. Нездоровые и неадекватно диссоциированные клетки будут слипаться или к капиллярным границам и блокировать поток инъекций. Кроме того, клетки должны быть достаточно сконцентрированы в капилляре, чтобы минимизировать вводимый объем и имплантировать их оптом. Инъекция большего объема более разбавленных клеток приведет к множественным, иногда смешанным опухолевым очагам, инвазивные показатели которых становится трудно измерить. В наших руках ручное управление микроинжектором на масляной основе позволяет лучше контролировать поток впрыска, чем электронный микроинжектор на воздушной основе под давлением, который ранее использовался в аналогичной модели19. Это имеет решающее значение для предотвращения избыточного давления потока внутри мозга, тем самым избегая последующего повреждения тканей и желудочковой агрегации введенных клеток.

Некоторые ограничения этой модели включают необходимость проведения эксперимента при неоптимальных температурах для обоих видов. Рыбок данио обычно выращивают при 28 ° C, тогда как человеческие клетки культивируют при 37 ° C. Выше 32 °C развитие эмбриона рыбки данио изменяется, и эти изменения могут быть смертельными35. Однако, подобно тому, что делается у взрослых рыбок данио ксенотрансплантатов моделей36, последовательная акклиматизация личинок рыбок данио до температуры 32 °C увеличивает выживаемость пересаженных животных по сравнению с быстрым изменением температуры после трансплантации с 28 °C до 32 °C. Однако повышение температуры в дальнейшем приводит к увеличению смертности животных в соответствии с чувствительностью эмбрионов рыбок данио к температурам выше 32 °C35.

Интерпретация динамических данных in vivo MT должна быть выполнена осторожно, поскольку динамика MT изменяется при падении температуры ниже 37 ° C37. Параллельное измерение in vitro динамики МТ при 37 °C и 32 °C в одних и тех же клетках GBM с одинаковым лечением MTA поможет подтвердить различия, наблюдаемые между различными клетками GBM или между процедурами in vivo . Это должно помочь подтвердить, что различия вызваны не изменением температурной чувствительности, а различными путями регуляции (для сравнительного анализа GBM) или лечением MTA (для анализа эффекта MTA). Это будет интересно, если неоднородности динамики МТ будут связаны с различными способностями к вторжению.

Другим ограничением является короткое временное окно, в течение которого можно контролировать инвазию (от 72 до 96 ч), предотвращая измерение пластичности инвазии, обусловленной потенциальными изменениями в динамикеMT 38. Через 96 ч мы заметили резкое снижение инвазии клеток GBM. Через 6 дней после инъекции количество клеток GBM быстро снижалось, предположительно из-за иммунного ответа хозяина, вызванного накоплением нейтрофилов и макрофагов в микроокружении опухоли39. Доставка MTA во весь мозг, вероятно, повлияет на близлежащие нейронные клетки-хозяева, которые зависят от МТ для их активности и изменение которых может впоследствии повлиять на инвазию GBM40. Этот подход должен быть дополнен шрРНК или оптогенетическими анализами, ограничивающими изменение МТ клетками GBM, но остается хорошей платформой для скрининга новых антиинвазивных соединений.

Ортотопическая инъекция меченых МТ gbM клеток в мозг рыбок данио представляет особый интерес для расшифровки роли МТ во время инвазии раковых клеток, поскольку очень немногие модели животных допускают субклеточную визуализацию in situ миграции раковых клеток в их ткани происхождения15. На сегодняшний день исследования функций МТ во время миграции GBM основаны в основном на анализах in vitro и ex vivo и не имеют валидации in vivo 24,41,42,43. В сочетании с нокдауном гена или непредвзятым подходом к скринингу на основе генов, анализ, представленный здесь, поможет выявить новые регуляторы MT, которые важны для инвазии GBM in vivo.

GBM представляют собой высоко гетерогенные опухоли, инвазивные свойства которых сильно различаются между образцами44. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе их различного способа инвазии, поможет определить специальные терапевтические методы лечения для блокирования распространения GBM. Систематическое измерение инвазивного индекса, способа инвазии и свойств цитоскелета, таких как динамика МТ в различных образцах GBM, выявит новые корреляции между частыми геномными мутационными профилями и паттернами инвазии клеток, основанными на специфических свойствах цитоскелета. Раскрытие того, как эти мутации влияют на изменение динамики МТ, не только добавит к нашим знаниям о регуляции МТ во время миграции клеток 45,46, но также может привести к долгожданным антиинвазивным терапевтическим средствам, специфичным для пациента.

Относительная легкость микроинъекции рыбок данио в сочетании с большим количеством доступных личинок и легкостью инъекций лекарств делают эту процедуру подходящей для персонализированной медицины47,48. Более того, в отличие от прижизненной визуализации ксенотрансплантатов GBM у мышей, которая происходит только в верхней 500 мкм части коры49,50, использование рыбок данио позволяет визуализировать инфильтрацию GBM во всей ЦНС. Модель, представленная здесь, соответствует критериям, чтобы стать бесценным инструментом для быстрого анализа инвазивных возможностей глиобластомы и ее реакции на лечение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы чрезвычайно благодарны доктору. Хербомелю (Институт Пастера, Франция) и его лаборатории, особенно Валери Бриола и Эмме Колуччи-Гийон за предоставление нам линий для рыбок данио и пластиковой формы для микроинъекционных пластин, а также за их ценный опыт в экспериментальных процедурах рыбок данио. Мы с благодарностью выражаем признательность UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, при поддержке Французского национального исследовательского агентства France BioImaging, и ANR-10-INBS-04; Инвестиции в будущее). Эта работа была поддержана Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), Национальный центр научных исследований и Институт Пастера, а также благодаря щедрым пожертвованиям г-жи Маргариты МИШЕЛЬ и г-на Порке.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

Tags

Биология Выпуск 185 Ортотопический ксенотрансплантат PDX Рыбка данио Данио рерио Глиобластома Субклеткая прижизненная визуализация 5D анализ изображений
Живая визуализация динамики микротрубочек в клетках глиобластомы, вторгающихся в мозг рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peglion, F., Coumailleau, F.,… More

Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter