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Biology

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

Published: July 29, 2022 doi: 10.3791/64093
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cell Polarity, Migration and Cancer Unit, Université Paris-Cité, Institut Pasteur, Équipe Labellisée Ligue Contre le Cancer

Summary

우리는 척추 동물의 뇌 조직을 침범하는 교 모세포종 (GBM) 세포에서 미세 소관 역학의 실시간 이미징을 허용하는 기술을보고합니다. 형광 태그가 부착된 GBM 세포를 투명한 제브라피쉬 뇌에 동종 주입하는 것을 고해상도 생체 내 이미징과 결합하면 현장 암 침범 중에 세포 골격 역학을 측정할 수 있습니다.

Abstract

실제 인구에서 6개월에서 15개월 사이의 암울한 생존 기간을 가진 교모세포종(GBM)은 가장 치명적인 악성 뇌종양입니다. 치료 실패는 주로 GBM 세포의 침습성으로 인한 것이며, 이는 GBM 운동성 특성에 대한 더 나은 이해의 필요성을 말해줍니다. GBM 침입을 지원하는 분자 메커니즘을 조사하려면 침입 중 단백질 역학의 심층적 인 특성화를 가능하게하는 새로운 생리 학적 모델이 필요합니다. 이러한 관찰은 종양 침윤을 차단하고 환자 결과를 개선하기 위한 새로운 표적의 발견으로 가는 길을 열어줄 것입니다. 이 논문은 제브라 피쉬 뇌에서 GBM 세포의 동종 이종 이식이 어떻게 세포 내 생체 내 생체 내 이미징을 허용하는지보고합니다. 미세소관(MTs)에 초점을 맞추어 GBM 세포에서 MT 표지, 수정 후 3일(dpf) 제브라피쉬 유충의 투명한 뇌에 GBM 세포를 미세 주입하는 절차, 전파하는 이종 이식편에서 MT의 생체 내 이미징, GBM 침입 동안 역할을 평가하기 위한 MT 역학 변경 및 획득한 데이터 분석 절차를 설명합니다.

Introduction

세포 운동성은 극성 축 설정 및 힘 생성 세포 골격 재 배열을 요구하는 고정 관념의 과정입니다. 액틴 중합 및 미오신과의 연관성은 세포 이동에 필요한 돌출 및 수축력의 주요 원인으로 인식됩니다1. 미세소관은 이동 중 세포 분극 및 방향 지속성의 주요 행위자로 간주됩니다2. 최근 몇 년 동안 MT는 3D3에서 세포 침습 중에 기계 압축력을 지원하기 위해 돌출부를 생성하고 안정화하는 것으로 나타났습니다. 보다 최근에, MT는 초점 유착 및 기계 민감성 이동에서 기계 변환에 직접 관여했습니다4. MT-plus 말단 역학을 특징짓는 동적 불안정성은 중합(성장) 및 해중합(수축)의 반복적인 단계로 이루어지며, 이는 과다한 미세소관 결합 단백질 및 RHO-GTPases 5,6,7에 의해 제어되는 것과 같은 세포 내 신호 전달 캐스케이드에 의해 제어됩니다. 세포 이동 및 침습에서 MT 네트워크의 역할로 인해 MT 역학 조사는 면역 세포 유도, 상처 치유 및 암 침습의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 핵심 요소가 되었습니다.

암세포가 원발성 종양 코어를 탈출하여 조직에 퍼지고 이차 종양을 생성하는 능력은 50년 전에 선언된 암과의 전쟁에서 세계적인 성공을 막는 데 중요한 단계입니다 8,9. 가장 큰 장애물 중 하나는 암세포가 어떻게 적극적으로 조직을 침범하는지 이해하는 것입니다. 주요 침습 메커니즘은 비종양성 세포 이동을 지배하는 것과 동일한 원리에 의존합니다10. 그러나 암세포 이동 특이성이나타났고11, 이러한 유형의 이동에 대한 더 나은 특성화의 필요성을 촉발했습니다. 특히, 종양 미세 환경이 암 진행의 핵심 플레이어로 나타나기 때문에12, 관련 생리학적 맥락에서 암세포 침습을 관찰하고 분석하는 것은 암세포 전파 메커니즘을 밝히는 데 필수적입니다.

MT는 증식과 침습을 모두 유지하기 위해 암 진행의 핵심입니다. 현장 MT 역학의 정확한 분석은 두 공정 모두에서 MT 변경 에이전트(MTA)를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. MT 역학은 환경 변화에 따라 크게 달라집니다. 시험관 내에서 노코다졸과 같은 MT 불안정화제로 처리하면 세포가 3D 겔에 매립될 때 세포 돌출 형성을 방지하는 반면 2D 세포 이동에는 거의 영향을 미치지 않습니다13,14. 기술적으로 어렵지만 생체 내 이미징의 발전으로 암세포 침범 중 MT 역학의 생체 내 분석이 가능합니다. 예를 들어, 마우스의 피하 이종 이식 섬유육종 세포에서 MT를 관찰한 결과, 종양-관련 대식세포가 종양 세포(15)에서 MT 역학에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이러한 마우스 모델은 광범위한 수술 절차를 포함하며 고도로 침습성 뇌종양 인 GBM과 같이 접근하기 어려운 암에 대해서는 만족스럽지 않습니다.

15개월의 평균 생존 기간16이라는 암울한 기간에도 불구하고, GBM이 뇌 실질 내에서 전파되는 방식이나 뇌 조직에서 GBM 세포 침습을 유지하는 핵심 분자 요소에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 마우스 동종 이종 이식 (PDX) 모델의 개선과 두개골 창의 확립은 GBM 세포 침습 연구17,18에 대한 새로운 전망을 제공했습니다. 그러나 최적이 아닌 이미징 품질로 인해이 모델은 대부분 표면 이종 이식편의 종 방향 이미징을 허용했으며 지금까지 세포 골격 단백질의 세포 내 이미징을 연구하는 데 성공적으로 사용되지 않았습니다. 또한 설치류의 사용을 줄이고 더 낮은 척추 동물로 대체하라는 "3R"명령에 따라 대체 모델이 확립되었습니다.

제브라피쉬(Danio rerio) 유충에서 관찰된 원시면역을 이용하여, 어류 뇌에 GBM 세포의 동교토픽 주사가 19,20,21 개발되었다. 발달 중뇌에서 심실 부근으로의 주입은 대부분의 인간 GBM 병리생리학(21)을 요약하고, 인간에서와 동일한 바람직한 GBM 침습 패턴-혈관 공동-옵션이 관찰된다(22). 물고기 유충의 투명성 덕분에이 모델은 대부분의 GBM이 발생하는 것으로 생각되는 뇌실 주위 영역에서 뇌를 침범하는 GBM 세포의 시각화를 허용합니다23.

MT는 시험관 내 GBM 세포 침습24,25에 필수적이기 때문에 MT 역학의 더 나은 특성 분석과 세포 침윤 중 주요 조절자의 식별이 필요합니다. 그러나 현재까지 제브라 피쉬 동종 모델로 생성 된 데이터에는 침입 과정 동안 MT 역학의 세포 내 분석이 포함되지 않았습니다. 이 논문은 생체 내에서 MT 역학을 연구하고 뇌암 침범 동안 그 역할을 결정하는 프로토콜을 제공합니다. 안정적인 미세소관 표지에 따라 GBM 세포는 제브라피쉬 유충의 뇌에 3dpf로 미세 주입되고 뇌 조직에서 진행되는 동안 높은 시공간 해상도로 실시간으로 이미징됩니다. 형광 MT의 라이브 이미징을 통해 MT 플러스 엔드 역학의 정성 및 정량 분석이 가능합니다. 또한 이 모델을 통해 MTA가 MT 역학 및 GBM 세포의 침습적 특성에 미치는 영향을 실시간으로 평가할 수 있습니다. 한 번에 처리되는 많은 수의 유충과 결합 된이 비교적 비 침습적 인 프로토콜과 약물 적용의 용이성 (어류에서)은이 모델을 전임상 테스트의 자산으로 만듭니다.

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Protocol

동물 실험은 실험실 동물의 취급에 대한 유럽 연합 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 프로토콜은 파스퇴르 연구소 동물 실험 윤리위원회 - CEEA 89와 프랑스 연구 교육부 (허가 # 01265.03)의 승인을 받았습니다. 주사 또는 라이브 이미징 세션 동안, 동물은 실험 절차가 끝날 Tricaine.At 마취되었고, 마취 과다 복용에 의해 안락사되었다. 이 프로토콜에 사용되는 재료, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 프로토콜의 일반적인 워크플로는 그림 1에 설명되어 있습니다.

1. α-튜불린-mKate2를 안정적으로 발현하는 교모세포종 세포의 생성

알림: 다음 단계는 생물안전 캐비닛 BSL2+에서 수행됩니다.

  1. 7 × 106 HEK-293T 세포의 형질감염을 위해 인산칼슘법을 사용하여 mKate2-튜불린을 발현하는 렌티바이러스 입자를 생성합니다.
    1. 1.5mL 미세원심분리 튜브에 10μg의 2세대 패키징 플라스미드 psPAX2, 5μg의 바이러스 외피 플라스미드 pMD2.G 및 50μL의 CaCl2(2.5M 스톡)가 포함된 관심 플라스미드 pGK-mKate2-인간 튜불린 α1a를 추가합니다. 멸균 DNA가 없는 H2O로 500 μL로 조정합니다.
      참고: CaCl2 를 마지막에 추가하는 것이 중요합니다.
    2. 튜브를 몇 번 뒤집어 혼합하고 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다.
    3. 배양하는 동안 500μL의 HEPES 완충 식염수(HBS), pH 7.0(2x)이 있는 또 다른 1.5mL 미세 원심분리 튜브를 준비합니다.
    4. 20분 후,CaCl2/DNA 믹스를 HBS(2x) 용액에 한 방울씩 떨어뜨립니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 섞습니다. RT에서 12 분 동안 배양하십시오.
    5. 12분 후, HBS와 혼합된CaCl2/DNA를 HEK-293T 세포의 70% 합류 10cm 접시에 직접 한 방울씩 부드럽게 추가합니다.
    6. 세포를 37-5 %CO2 로 36-48 시간 동안 37 ° C의 가습 인큐베이터에 두십시오.
    7. 상청액을 수집하고 3,000 ×g에서 5 분 동안 스핀 다운하여 세포 파편을 제거합니다.
    8. 바이러스 입자를 농축하려면 상청액을 초원심분리 튜브에 넣고 47,508× g 에서 4°C에서 90분 동안 회전시킵니다.
    9. 상청액을 버리고 튜브를 종이에 거꾸로 놓아 튜브 내부를 건조시킵니다.
    10. 30μL의 PBS를 바이러스 펠릿에 추가합니다. 펠릿을 다시 매달 지 마십시오. 4 ° C에서 2 시간 동안 그대로 두십시오.
    11. 위아래로 피펫팅하여 바이러스 입자를 부드럽게 재현탁시킵니다. 거품을 만들지 마십시오. -80 °C에서 보관하십시오.
      참고: HEK-2-93T 세포의 여러 플레이트를 형질감염시켜 더 많은 양의 바이러스 입자를 생성할 수 있습니다.
  2. 교모세포종 세포를 렌티바이러스 입자로 감염시킵니다.
    참고: 이 프로토콜은 U-87 MG, U-373 MG 또는 T98과 같은 상업용 교모세포종 세포주용으로 작성되었습니다. 1차 환자 유래 교모세포종 세포를 사용하려면 플레이트 및 비혈청 기반 배지26의 특정 코팅을 사용하십시오.
    1. 10% 태아 송아지 혈청, 페니실린-스트렙토마이신(페니실린의 경우 100단위/mL 최종 농도, 스트렙토마이신의 경우 100μg/mL) 및 비필수 아미노산(1x)이 보충된 Eagle's 최소 필수 배지(MEM)에서 성장한 U-87 MG 교모세포종 세포의 70% 합류 10cm 접시를 준비합니다.
    2. 5,000분의 1 희석액의 바이러스 입자를 세포에 직접 추가합니다. 부드러운 소용돌이와 섞는다. 바이러스가 20 시간 이상 세포를 감염시키지 않도록하십시오.
    3. 바이러스가 함유된 배지를 제거하고 새로운 배양 배지로 교체합니다. 태그가 붙은 튜 불린의 발현을 48-72 시간 동안 허용하십시오.
      알림: 다음 단계는 생물안전 캐비닛 BSL2에서 수행해야 합니다.
    4. FACS - 셀을 정렬하여 mKate2 + 셀의 가장 밝은 15 %를 선택합니다. 순방향 및 측면 산란(FCS 대 SSC) 게이팅을 사용하여 파편과 이중선 셀을 제거한 후 가장 밝은 30% mKate2+ 셀에 다른 게이팅을 적용하여 상위 15%를 유지합니다.
    5. MT 표지된 세포를 증폭합니다.
      참고: 또는 높은 수준의 튜불린-mKate2를 기반으로 한 클론 선택을 에피형광 현미경으로 수행할 수 있습니다.

2. 미세 주입을 위해 제브라 피쉬 유충 준비

  1. 제브라 피쉬 알을 생성하십시오.
    1. 원하는 제브라 피쉬 균주의 수컷 3 마리와 암컷 4 마리를 이종 이식 4 일 전, 오후 늦게 구슬이 보충 된 짝짓기 탱크에 넣으십시오.
      참고: Tg(fli1a:gfp), Tg(gfap:gfp) 또는 Tg(Huc:gfp) 라인은 각각 내인성 혈관, 신경 줄기 세포/성상 세포 및 뉴런을 표시하는 데 사용됩니다.
    2. 다음날 아침에 대리석으로 인한 산란으로 생산 된 알을 수집하십시오.
    3. 표백제(최종 0.004%)가 보충된 미네랄 공급원수27 로 채워진 50mL 원심분리기 튜브로 계란을 옮겨 세척합니다. 튜브를 5분 동안 부드럽게 뒤집습니다. 미네랄 워터로만 두 번 씻으십시오.
    4. 계란을 0.28mg/mL 메틸렌 블루가 보충된 미네랄 워터가 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다.
    5. 수정되지 않은 발달 정지 된 알을 제거하십시오. 배아를 28°C에서 배양한다.
  2. 투명한 애벌레를 만듭니다.
    1. N- 페닐 티오 우레아 (PTU) (0.003 % 최종)를 8 시간 후에 배지에 도입하여 멜라닌 색소 침착을 방지하고 광학 투명성을 보장합니다. 프로토콜의 나머지 부분에 대해 PTU를 매체에 유지합니다.
      알림: PTU 치료는 발달 장애를 일으킬 수 있으므로 이종 이식을 위해 정상적으로 발달 된 유충 만 선택하십시오. 화학 처리의 대안으로, 색소 침착이없는 돌연변이 제브라 피쉬 균주 캐스퍼 (진주 및 로이 orbison 이중 돌연변이)를 사용할 수 있습니다28.
    2. 배양 온도를 29°C로 올립니다.
    3. 주사 당일 3 dpf 유충이 32 °C에 도달하도록 매일 온도를 1 °C 씩 높입니다.
  3. 미세 주입 플레이트를 준비하십시오.
    1. 미네랄 워터로 1 % 아가 로스 + 0.28mg / mL 메틸렌 블루 20mL를 준비하십시오.
    2. 아가로스를 10cm 페트리 접시에 붓고 미세 사출 플라스틱 몰드를 거꾸로 빠르게 적용하여 2.5mm 너비의 V자형 트렌치를 만듭니다(그림 2B).
      참고: 플라스틱 몰드는 상업적으로 이용 가능하거나 Zebrafish Book29에 설명된 설계에 따라 사내에서 제작할 수 있습니다.
    3. 아가 로스가 고형화되면 플라스틱 몰드를 조심스럽게 제거하십시오.
      알림: 미세 주입 캐스트 플레이트는 4 ° C에서 최대 2 개월 동안 보관할 수 있습니다.
  4. 이종 이식을 위해 유충을 준비하십시오.
    1. 주사 당일에, 3 dpf 유충에서 선택된 형광 전이유전자 발현을 스크리닝하였다. 형광이 없고 비정상적으로 보이는 동물을 제거합니다.
    2. 끝이 가는 시계 제작자 집게로 유충을 수동으로 디코리온화합니다. 3dpf에서 두 쌍의 가는 끝 집게로 코리온을 부드럽게 찌르거나 찢어 융모막에서 유충을 제거합니다.
      참고: 또는 프로나제 A를 사용한 효소 처리를 사용하여 일반적으로 24hpf에서 유충을 데코리온화할 수 있습니다.
    3. 디코리온화된 유충을 메틸렌 블루(0.28mg/mL)와 PTU(최종 0.003%)가 있는 미네랄 워터 배지에 보관하십시오.

3. 이종 이식 절차

  1. 미세 주사 바늘을 준비하십시오.
    1. 중앙 필라멘트가없는 붕규산 유리 모세관을 가져 와서 수직 바늘 풀러에 넣으십시오.
    2. 다음 설정을 사용하여 모세관을 8.5 증가시키고 히터를 3-늘려 미세 주사 바늘로 바꿉니다.
  2. 마이크로 인젝터를 설정합니다.
    1. 수동 마이크로 인젝터에 미네랄 오일을 넣으십시오. 기포를 제거하십시오.
    2. 범용 모세관 홀더를 마이크로 인젝터에 연결하고 기계식 마이크로 매니퓰레이터에 단단히 부착합니다(그림 2A).
  3. 교 모세포종 세포를 수확하십시오.
    알림: 다음 단계는 생물안전 캐비닛 BSL2에서 수행됩니다.
    1. 이식 당일에 80 % 합류에 도달 할 수 있도록 교 모세포종 세포의 10cm 플레이트를 준비하십시오.
    2. (선택 사항) Hoechst 35480 (200 ng / mL)을 세포에 추가하여 세포핵에 일시적으로 라벨을 붙입니다. 가습 셀 인큐베이터에서 37°C에서 20분 동안 배양하고 PBS로 2x 세척합니다.
    3. 인큐베이터에서 세포 플레이트를 꺼내 PBS로 한 번 씻으십시오. 0.05% 트립신-EDTA 1mL를 첨가하여 세포를 분리하고 모든 세포가 완전히 분리될 때까지 세포 배양기에서 37°C에서 5-10분 동안 배양합니다.
      알림: 트립신 화가 불량하면 세포 응집체가 바늘에 달라붙게 되므로 이 단계는 매우 중요합니다.
    4. 50mL 원심분리 튜브에 5mL의 완전한 교모세포종 세포 배지에 세포를 재현탁합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 45mL를 넣고 134× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    5. 상청액을 버리고 완전히 위아래로 피펫팅하여 1mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 재현탁합니다.
      알림: 이 기계적 해리 단계는 미세 주입 중 모세관이 막힐 위험을 방지하는 데 크게 도움이 됩니다.
    6. 얼음처럼 차가운 PBS 49mL를 넣고 134× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세포를 200 μL의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁시킨다. 이식 절차 기간 동안 얼음 위에 보관하십시오.
  4. 교모세포종 세포를 제브라피쉬 유충 중뇌에 미세 주입합니다.
    1. 미세 주입 캐스트 플레이트에 160mg/L 트리카인이 보충된 6mL의 E3-배지30 을 채웁니다.
    2. 12 개의 디코 리온 화 된 유충을 미세 주입 판으로 옮깁니다. 터치에 반응하지 않으면 옆구리의 트렌치에 정렬하고 머리를 위로 향하게 하고 난황낭을 크기 00 페인트 브러시로 트렌치 벽에 밀어 넣습니다(그림 2B, C).
    3. 교 모세포종 세포를 다시 부유시킵니다. 마이크로로딩 팁을 사용하여 5μL의 세포를 마이크로모세관에 로드하고 모세관을 범용 모세관 홀더에 삽입합니다.
    4. 반응이없는 유충이 들어있는 미세 주입 플레이트를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 마이크로 매니퓰레이터 손잡이를 사용하여 미세 주입 플레이트의 경계에 미세 모세관의 끝을 놓습니다. 메스로 부수어 대략 세포 직경 크기의 날카로운 진입 점을 만듭니다.
    5. 마이크로 인젝터에서 오일을 부드럽게 흐르게 하고 바늘 끝을 배지에 밀어 넣어 세포가 모세관 밖으로 흘러나오는지 확인합니다. 모세관 끝에 세포를 집중시켜 배출된 부피당 주입된 세포 수를 최대화하고 뇌 조직을 PBS로 채우지 않도록 합니다(그림 2C).
    6. 오일이 주입기에 수동으로 주입될 때 미세 모세관에서 나오는 세포를 주의 깊게 검사하십시오. 20-50개의 셀을 전달하기 위해 수동 노브에서 얼마나 많은 회전이 필요한지 경험적으로 정의합니다. 일반적으로 세포가 충분히 농축되면 한 번의 부드러운 회전으로 ~ 10 개의 세포를 배출 할 수 있습니다.
      알림: 액체가 미세 모세관 밖으로 제대로 흐르지 않으면 모세관 홀더의 미세 모세관 부착을 느슨하게 하십시오. 그렇게 하면 오일이 누출되어 모세관을 따라 떨어질 수 있습니다.
    7. 모세관 끝을 중간 대뇌 정맥 바로 위의 왼쪽 시신경(OT)에 접근합니다(MCeV, 그림 2F).
    8. 피부막이 부러 질 때까지 모세관을 유충에 부드럽게 누릅니다 (그림 2D, E).
      알림: 너무 세게 밀면 세포가 뇌에 너무 깊숙이 주입되어 광학 선명도가 낮아 MT를 자세히 관찰할 수 없으므로 너무 세게 누르지 마십시오. 이미징 기술은 250-300 μm에 이르는 깊이에서 가능합니다. 그러나 어류 표면에서 100μm 이상 주입하지 않는 것이 좋습니다.
    9. OT의 적절한 위치에 도달하면 셀을 꺼냅니다. 모세관의 끝을주의 깊게 관찰하여 동물 내부로가는 세포의 흐름을 시각화하여 성공적인 주사를 보장합니다.
      알림: 심실에 주사하지 않도록주의하십시오 (그림 2E). 일단 심실에 들어가면 세포가 축적되어 조직에 침투하는 대신 붙어있는 경향이 있습니다 (그림 2I). 심실 주사는 뇌의 강렬한 팽창과 주입 된 세포가 전뇌와 뒷뇌에 관찰 가능한 전파되는 것을 특징으로합니다 (그림 2J).
    10. 필요한 만큼의 동물에 대해 3.4.9-3.4.11단계의 절차를 반복합니다. 모세관에서 세포가 뭉치는 것을 방지하기 위해 신속하게 진행하십시오.
      참고 : 실험자가 주사하는 속도에 따라 10-20 마리의 유충마다 바늘을 교체해야 할 수 있습니다.
    11. 이종 이식이 완료되면 미세 주입 플레이트에서 유충을 제거하고 미네랄 소스 워터 + PTU + 메틸렌 블루 배지로 채워진 24 웰 플레이트에서 선별합니다.
    12. 형광 실체 현미경으로 유충을 관찰하여 성공적인 주입을 검증합니다(그림 2G). OT의 상단 200μm(z)에 위치한 20-50개의 세포에 의해 형성된 단일 종양 덩어리를 포함하는 이종이식편만 선택합니다(그림 2H 대 그림 2I-K에서 실패한 주입).
      참고 : 성공적으로 지역화 된 이종 이식편의 수율은 처음에는 10 %에서 연습을 통해 거의 100 %까지 다양합니다.
    13. 이미징하기 전에 유충이 32 ° C에서 최소 4 시간 동안 회복되도록하십시오.
      알림: 배지에 항생제를 추가해도 유충의 생존율은 증가하지 않습니다. 이 단계에서 미세 주입이 올바르게 수행되면 거의 100 %의 물고기가 생존합니다.

4. 교모세포종 이종이식편의 생체내 영상

  1. 라이브 이미징을 위해 유충을 장착하십시오.
    알림: 유충은 주입 후 4시간(hpi)에서 이미지화할 수 있습니다. MT의 라이브 이미징은 일반적으로 침습성 GBM 세포가 돌출부를 확장하고 종양 덩어리에서 멀어지기 시작한 20hpi에서 수행됩니다.
    1. 1 % 저 융점 아가 로스 용액을 준비하십시오. 끓인 1% 저융점 아가로스 용액 500μL를 1.5mL 원심분리 튜브에 옮기고 열 블록에서 37°C에서 식힙니다. 트리카인(112μg/mL)을 아가로스에 넣고 잘 섞는다.
    2. 미네랄 원수 + PTU + 트리카인(112μg/mL)이 보충된 메틸렌 배지로 채워진 3.5cm 페트리 접시에 1-4마리의 이종 이식된 유충을 옮깁니다. 유충이 접촉에 반응하지 않으면 미세 팁 전달 피펫을 사용하여 아가 로스와 트리카인이 들어있는 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
      알림: 아가로스 희석을 제한하기 위해 배지의 부피를 최소로 유지하십시오.
    3. 부드럽게 애벌레를 아가 로스와 섞는다. 일반(큰 전구) 전사 피펫을 사용하여 아가로스에 혼합된 유충을 유리 바닥의 3.5cm 비디오 이미징 접시 중앙에 놓습니다. 실체 현미경으로 물고기를 조작하기 위해 마이크로 로딩 팁을 사용하여 유충을 등 뒤로 빠르게 배치하십시오.
      참고: 이 프로토콜에서 생체 내 뇌 영상에 역 회전 디스크 컨포칼 현미경이 사용되기 때문에 유충은 등쪽으로 장착됩니다. 직립 컨포칼 현미경을 사용하는 경우 그에 따라 유충의 위치를 조정하십시오.
    4. 가능한 가장 얇은 아가로스 층을 유지하기 위해 여분의 아가로스를 제거합니다. 아가로스가 고형화되면 2.5mL의 미네랄 원수 + PTU + 0.2x 트리카인(이미징 배지)을 추가하고 다음 단계로 진행합니다.
  2. 침입하는 교모세포종 세포에서 MT 역학의 생체 내 라이브 이미징
    참고: 이미지의 광학 품질은 사용 중인 현미경의 성능에 따라 크게 달라집니다. 이 프로토콜은 sCMOS 카메라(픽셀 크기 6.5μm, 2048 x 2044픽셀), 긴 작동 거리 대물렌즈 및 온도 제어 환경 챔버가 장착된 도립 회전 디스크 컨포칼 현미경용으로 작성되었습니다.
    1. 아가로스에 포매된 이종 이식된 유충이 포함된 비디오 이미징 접시를 온도가 32°C로 설정된 도립 컨포칼 현미경의 환경 챔버에 놓습니다. 전동 XY 스테이지를 사용하여 10x 대물렌즈로 비디오 이미징 접시에서 유충을 찾으십시오.
    2. ESC를 눌러 대물렌즈 포탑을 내리고 60x 오일 대물렌즈(1.4 NA, 작동 거리: 0.13mm)에 광유를 넣은 다음 ESC를 눌러 초기 초점 위치로 돌아갑니다.
    3. 적색 채널(561nm 레이저 소스, 20% 레이저 출력, 노출 시간: 200ms)에서 침범하는 교모세포종 세포를 관찰하고 분산된 MT 네트워크와 쉽게 구별할 수 있는 MT 필라멘트가 있는 세포를 선택합니다(그림 3B).
    4. z 시리즈 설정을 지정합니다. 200 μm 범위의 피에조 스테이지를 사용하여 MT 네트워크의 상단 및 하단 위치를 선택하십시오 : 10-30 μm 깊이의 z 스택은 0.3 μm의 z 슬라이스 단계로 이동하는 셀의 돌출부에서 미세 소관 네트워크를 시각화하기에 충분합니다.
    5. 빠른 광퇴색을 방지하기 위해 수집 속도, z-스택 깊이 및 형광 신호 간에 최적의 균형을 허용하도록 타임랩스 획득 설정을 지정합니다. 몇 분 동안 5-10초마다 MT의 이미지를 획득합니다. 5D(x,y,z,t,c) 하이퍼스택을 획득하고 저장합니다.
      참고: 획득 중 z의 드리프트를 방지하려면 하드웨어 초점 안정화로 완벽한 초점 시스템이 장착된 현미경을 사용하십시오.
  3. (선택 사항) MT에 대한 미세소관 변경제(MTA)의 영향을 확인합니다.
    참고: 다음 단계를 통해 MT 네트워크에서 MTA가 교모세포종 세포를 실시간으로 마이그레이션하는 데 미치는 영향을 테스트할 수 있습니다.
    1. 비디오 이미징 접시에서 이미징 미디어를 조심스럽게 제거합니다. xyz 위치가 손실되므로 접시 바닥을 만지지 마십시오.
    2. MTA를 포함하는 새로운 이미징 매체를 다양한 농도로 준비합니다. MTA 함유 배지를 비디오 이미징 접시에 한 방울씩 부드럽게 추가합니다.
    3. MTA의 각 농도가 MT 네트워크 및 세포 이동에 미치는 영향을 관찰하기 위해 장기 동영상(2-16시간, 10-20분마다 하나의 이미지)을 수집합니다(그림 4A).
    4. (선택 사항) 배지를 부드럽게 제거하고 MTA 없이 2.5mL의 새 이미징 배지를 추가하여 MTA를 씻어냅니다. 세척 절차를 3x 반복하여 유체에서 MTA의 흔적을 제거합니다.
    5. (선택 사항) 4.3.3에서와 유사한 장기 동영상을 얻습니다(그림 4B).
      알림: 위의 단계는 유충 생존에 영향을 미치지 않고 MT 네트워크를 변경하는 최소 농도를 결정합니다. 세척 단계는 약물의 효과가 가역적인지 여부를 정의합니다.
  4. 순차 영상으로 교모세포종 침습에 대한 MTA 영향을 평가합니다.
    1. 미세 주사 후 4.1-4.2.1 단계를 따르십시오.
      참고: 프로토콜의 이 부분은 형광 태그가 부착된 다른 교모세포종 세포주로도 달성할 수 있습니다. 이상적으로는 세포질 태그와 핵 태그로 GBM에 공동 라벨을 부착하여 세포의 전체 형태를 감지할 수 있도록 합니다.
    2. 긴 작동 거리 40x 물 대물렌즈(NA:1.15, WD: 0.6mm)로 전환하십시오.
    3. z 시리즈 범위를 설정하여 OT 영역을 획득합니다. 고감도 sCMOS 카메라(픽셀 크기 11μm, 1,200 x 1,200픽셀, 양자 효율 95%)를 사용하여 z-스택을 획득합니다.
      참고: z-스택은 일반적으로 OT의 가장 등쪽 부분(표면에 가까움)에서 시작하여 전체 종양 세포 덩어리를 포함할 만큼 뇌에서 충분히 깊게 끝납니다.
    4. 현미경에서 비디오 이미징 접시를 제거합니다. 마이크로 로딩 팁을 사용하여 아가 로스에서 유충을 제거하고 동물 주위에 아가 로스를 부드럽게 찔러줍니다.
      알림: 3 개의 dpf 유충은 여전히 매우 약하기 때문에 아가 로스에서 제거 할 때주의하십시오.
    5. 동물이 아가 로스에서 해방되면 미네랄 소스 워터 + 메틸렌 블루 + PTU 배지로 채워진 24 웰 플레이트의 단일 웰로 부드럽게 옮깁니다. 후속 이미징을 위해 유충을 식별하기 위해 우물을 표시하십시오.
    6. 이전에 결정된 농도에서 매체에 관심 있는 MTA를 추가합니다(단계 4.3.3). 매일 약물이 보충 된 배지를 새로 고칩니다. 3-4일 동안 매일 4.4.1단계에서 4.4.5단계까지의 이미징 절차를 반복합니다.

5. 이미지 분석

  1. 무료로 사용할 수 있는 FIJI 플러그인으로 MT 역학을 분석합니다.
    참고: 많은 리뷰와 프로토콜은 셀31,32,33,34에서 MT 역학 분석 방법을 설명하며 이 단계에서 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 기본 MT 동적 속성을 측정하는 두 가지 방법을 간략하게 설명합니다.
    1. 5D 하이퍼스택을 열고 z-슬라이스가 단일 평면에 투영된 4D 스택을 생성하여 z에서 최대 강도 투영(MIP)을 생성합니다(이미지 | 스택 | Z 프로젝트 | 최대 강도) (그림 3B).
    2. 4D MIP 스택을 열고 FIJI의 수동 추적 기능을 사용하여 돌출 기반 MT의 끝을 수동으로 추적합니다(플러그인 | 추적 | 수동 추적). (그림 3D). 성장 속도, 수축 속도, 구조 빈도 및 재해 빈도와 같은 MT 역학의 매개 변수를 추출합니다.
    3. 또는 MT를 따라 10픽셀 너비의 분할된 선을 그려 분석합니다(그림 3B). 멀티 키모그래프 기능 사용(분석 | 멀티 키모 그래프) (그림 3C) 피지에서. MT 성장 단계(G), 일시 중지 길이(P) 및 MT 재해 빈도를 관찰하고 측정합니다.
  2. 장기 교모세포종 침범 분석
    참고: 이 분석을 수행하려면 바이오이미징 소프트웨어를 사용한 4D 시각화 및 분석을 사용해야 합니다.
    1. 파일 변환기 소프트웨어를 사용하여 4.4.3단계(4hpi)의 원시 4D z 스택을 적절한 소프트웨어 형식으로 변환합니다.
    2. 소프트웨어를 열고 변환된 z-stack 파일을 Surpass 보기에서 가져옵니다(그림 5A).
    3. 종양 세포를 분할하고 빨간색 채널에서 관련 없는 자가형광을 폐기하려면 새 표면 추가를 클릭하고 5단계 프로세스를 따릅니다.
      1. 창이 나타나면 다음 화살표를 클릭하여 기본 설정의 유효성을 검사합니다. 2/5단계로 진행합니다.
        참고: 형광 신호가 561 채널에서 획득되면 눈의 잔류 색소 침착으로 인한 자가 형광이 강해질 수 있으며 자동 분할 프로세스를 변경할 수 있습니다. 이종 이식편이 눈 가까이에있는 경우 문제가됩니다. 이 경우 비교모세포종 세포 신호를 절단하고 삭제하여 분할을 수동으로 완료해야 합니다.
      2. 소스 채널 | 561 채널로 이동합니다. 표면 디테일에 1.50μm를 추가하고 빼기 배경에서 구의 지름에 2.5μm를 추가하여 이미지(가우스 필터)를 매끄럽게 합니다. 다음 화살표를 클릭하고 3/5단계로 진행합니다.
      3. 신호의 강도에 따라 모든 셀 프로세스를 포함하도록 임계값 (배경 빼기)을 수동으로 조정합니다. 4/5단계로 이동합니다.
      4. 세포의 일부를 나타내지 않는 이벤트(예: 파편, 자가형광)를 제거하여 분할된 신호를 필터링합니다. 필터 유형 | 볼륨을 클릭하고 임계값을 수동으로 조정하여 셀의 일부를 나타내는 가장 작은 볼륨 아래의 모든 이벤트를 제외합니다. 5/5단계로 이동합니다.
        참고: 자가 형광 신호가 가장 작은 셀 부분보다 부피가 큰 경우 계속 진행하고 원하지 않는 신호를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 삭제 하여 수동으로 제거하십시오.
      5. 분류 단계를 삭제하고 이중 녹색 화살표를 클릭하여 분할 마법사를 완료하여 종양 세포의 표면 뷰 만들기를 완료합니다(그림 5B).
    4. 분할 된 세포가 서로 접촉하지 않고 고유 한 물체를 형성하지 않으면 인위적으로 병합하여 종양 세포 덩어리 물체를 만듭니다. 간단히 말해서 통계를 클릭하여 볼륨| 특정 값을 자세히 | |. 상단 이벤트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭한 다음 Shift 키를 누른 상태에서 마지막 이벤트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 모든 이벤트를 선택합니다. | 선택 영역 편집| 통합으로 이동합니다.
    5. 종양 세포 질량의 중심을 정의하십시오. 새 스팟 추가를 클릭합니다| 자동 생성 | 건너 뛰기 추가(커서가 교차) | 개체의 중심. Shift 키를 누른 상태에서 왼쪽 클릭하여 분할 된 종양 세포 덩어리의 중심 인 지점을 만듭니다.
    6. 각 GBM 세포와 종양 덩어리의 중심 사이의 3D 거리를 측정합니다. 이렇게 하려면 스팟 뷰에 남아 공구 아이콘 | 거리 변환. 488 및 561 채널과 함께 중심 채널까지의 새 거리가 생성될 때까지 기다립니다(파란색, 그림 5C).
      참고: 이 채널에 있는 모든 복셀의 강도는 복셀과 종양 세포 덩어리의 중심 사이의 3D 거리에 해당합니다.
    7. 새 스폿 추가를 클릭하여 분할된 모든 셀의 중심까지의 3D 거리를 측정 | 자동 생성 | 건너 뛰기 추가(커서가 교차) | 특정 채널 561. Shift 키를 누른 상태에서 세포핵 영역을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 모든 셀에 대해 이 작업을 수행합니다(그림 5D).
      참고: 세포의 형광 신호를 더 잘 이해하기 위해 표면 보기를 제거합니다. 또는 존재하는 경우 정확도를 높이기 위해 핵 신호(405nm 또는 647nm 신호)를 사용하십시오.
    8. 통계 | 클릭하십시오. 자세한 | 특정 값 | 강도 평균 Ch=중심까지의 거리.
      알림: 강도 값은 세포핵 영역과 중심 사이의 3D 거리(μm)입니다.
    9. 이 강도를 평균화하여 4hpi에서 종양 질량의 반경을 계산합니다. 분석의 모든 시점(24hpi, 48hpi 및 72hpi)에 대해 이 절차를 반복합니다.
      참고: 세포 침입을 과소평가하지 않도록 가장 많이 전파된 세포 10개 또는 20개만 측정하십시오. 실제로, 주사 중 세포의 강제 압축은 종양 덩어리의 중심에있는 세포가 이동하는 것을 방지 할 수 있습니다.
    10. 침습 지수(II)를 t = 24hpi/48hpi/72hpi에서 종양 질량의 평균 반경에 대한 t = 4hpi/72hpi의 평균 3D 거리 간의 비율로 계산합니다(그림 5E).

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Representative Results

생체 내 GBM 침습 동안 MT가 수행하는 역할을 분석하기 위해 렌티바이러스 감염에 의한 GBM 세포에서 안정적인 MT 표지를 수행하는 주요 단계, 3개의 dpf 제브라피쉬 유충에서 GBM 세포의 동종 이종 이식, MT 역학의 고해상도 생체 내 이미징, MTA 치료 및 GBM 침습에 미치는 영향, MT 역학 및 생체 내 침습의 이미지 분석(그림 1)을 설명합니다. MT 역학은 성장 및 축소되는 MT를 따라 키모그래프를 구축하거나(그림 3C) 시간이 지남에 따라 개별 MT 에지를 수동으로 추적하여(그림 3D) 측정됩니다. 유충 배지에 투여된 약물 처리 및 MT 네트워크 조직에 대한 이의 가역적 효과의 예가 도 4에 주어진다. 저용량의 노코다졸(200nM)로 치료하면 MT 네트워크가 점진적으로 수축되고 4시간 후에 교모세포종 세포 돌출이 사라집니다(그림 4A). 약물을 씻어 내면 교 모세포종 세포가 돌출부를 형성 할 수있는 능력이 회복되었습니다. 세포는 세척 후 12 시간 후에 혈관계를 따라 이동을 재개했습니다 (그림 4B). 이러한 데이터는 200nM 노코다졸로 치료하면 MT 네트워크를 방해하고 생체 내 교모세포종 세포 침습을 빠르게 차단하기에 충분함을 시사합니다. 전 세계 교모세포종 세포 침습에 대한 동일한 치료법을 3일 동안 분석한 결과, 노코다졸 200nM은 대조군에 비해 어류의 전반적인 건강에 영향을 미치지 않으면서 생체 내에서 장기 교모세포종 세포 침습을 중단하는 것으로 나타났습니다(그림 4C).

Figure 1
그림 1: 프로토콜 워크플로 다이어그램. 약어 : dpf = 수정 후 일수; HPI = 주사 후 시간; MT = 미세소관; MTA = 미세 소관 변경제; GBM = 다형성 교모세포종. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 교모세포종 세포를 3개의 dpf 제브라피쉬 유충 뇌에 미세 주입. (A) 이종 이식에 사용되는 장비의 사진 : 1, 오일 마이크로 인젝터; 2, 기계식 마이크로 매니퓰레이터; 3, 범용 모세관 홀더; 4, 유리 모세관. 미세 주입 플레이트는 실체 현미경 아래에 있습니다. (B) 마취된 3마리의 dfp 제브라피쉬 유충이 트렌치에 정렬되어 미세 주입될 준비가 된 사진. 빨간색 염료가 함유 된 미세 모세관의 끝 부분이 사진 오른쪽에 보입니다. 아가 로스 판에 내장 된 패턴 트렌치의 세부 사항은 오른쪽 하단 모서리의 삽입물에서 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 3 mm. (C) 대표적인 미세 주입 플레이트의 구성식. 주입 준비가 된 유충은 옆으로 (판 중앙) 배치됩니다. 세포는 주사를 진행하기 전에 미세 모세관 (검은 색 화살표)의 끝 부분에 집중됩니다. 주입 된 유충은 복부에 놓인 판의 오른쪽에 표시됩니다. (D) 주사 동안 유충이 놓이는 트렌치를 보여주는 미세 주사 플레이트 (C의 검은 색 점선을 따라)에서 횡단 슬라이스의 계획. (E) 시신경을 관통할 준비가 된 모세관의 끝을 보여주는 사진(점선). 심실은 흰색 선으로 표시됩니다. 스케일 바 = 150 μm. (F) 내피 세포에서 gfp를 발현하는 3 dpf fli1a : gfp 유충의 계획으로, 세포가 주입되는 OT 영역을 나타내며 중간 대뇌 정맥 바로 위. (G) U87-mkate2 세포의 미세 주입 후 측면으로 배치된 3 dpf gfap:gfp 유충(신경 줄기 세포에서 발현된 gfp)의 형광 이미지(흰색 원 및 흰색 화살표). 빨간색의 높은자가 형광은 눈의 홍채 포어에 의해 발생합니다. 스케일 바 = 100 μm. (H) 16 hpi에서 성공적으로 주입 된 fli1a : gfp 유충의 공 초점 형광 이미지. 스케일 바: 50 μm. (I-K) 96 hpi (I) 및 4 hpi (J, K)에서 성공적으로 주입되지 않은 fli1a:gfp 유충의 컨포칼 형광 이미지. GBM 세포는 심실 (I, J) 또는 뇌의 여러 초점 (K)에 주입되었습니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어 : dpf = 수정 후 일수; OT = 시신경; MCeV = 중대뇌 정맥; GFP = 녹색 형광 단백질; GFAP = 신경교 섬유소 산성 단백질; HPI = 주입 후 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 교모세포종 세포의 생체 내 미세소관 역학 시각화. (A) 20hpi에서 fli1a:GFP 제브라피쉬 유충의 OT에서 튜불린-α1-mkate2를 발현하는 이종 이식된 U87 세포의 대표적인 형광 이미지. (B) 단일 이종 이식 된 U87 세포에서 MT 네트워크의 최대 강도 투영 형광 이미지. (C) B의 빨간색 점선을 따라 MT 동적 불안정성의 성장, 일시 중지 및 재앙 단계를 보여주는 키모 그래프. (D) 3개의 MT+ 말단의 추적을 강조하는 B 의 박스형 영역의 타임랩스 시퀀스. 스케일 바 = 10 μm. 약어 : OT = 시신경; GFP = 녹색 형광 단백질; HPI = 주사 후 시간; MT = 미세소관; G = 성장기; P = 일시 정지 단계; C = 재앙 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 생체 내 교모세포종 침범에 대한 미세소관 변경제의 효과 시각화. (A) 노카다졸(200nM)로 처리된 제브라피쉬 유충에서 튜불린-α1a-mkate2를 발현하는 U87 세포의 타임랩스 서열. 화살표는 혈관을 따라 뇌를 침범하는 두 개의 다른 세포에서 돌출부의 말단을 가리 킵니다. nocodazole로 치료할 때 돌출부의 수축에 유의하십시오. 스케일 바 = 10 μm. (B) U87 세포 침습에 대한 노코다졸 세척의 효과를 나타내는 타임랩스 시퀀스. 세척 후 500 분에 흰색 별표로 표시된 세포는 MT 기반 돌출부 (흰색 화살표)를 늘려 혈관을 따라 침입을 재개 할 수 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. (C) 72 시간 동안 DMSO 또는 노코다졸 (200 nM)로 처리 된 이종 이식 된 유충 뇌의 3D 표현. U87 세포 신호는 분절되고(빨간색) fli1a-GFP 형광 신호(흰색)에 통합되었습니다. 노코다졸로 처리된 U87 세포의 보급 감소에 주목하십시오. 스케일 바 = 30 μm. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; HPI = 주사 후 시간; MT = 미세 소관. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 생체 내 교모세포종 침습의 이미지 분석. (A) fli1a-GFP 제브라피쉬 유충에서 세포질 mKate2를 발현하는 이종 이식된 U87 세포의 형광 이미지, 4hpi. 흰색 별표는 눈 홍채의 전형적인 자가형광에 밑줄을 긋습니다. 스케일 바 = 40 μm. (B) A에서 U87 세포 신호에 대응하는 분절된 표면과 결합된 fli1a-GFP 유충의 형광 이미지. 종양 덩어리의 중심은 녹색으로 보입니다. 스케일 바 = 40 μm. (C) A 의 적색 채널 신호와 새로 정의된 "중심까지의 거리" 채널(청색)을 나타내는 형광 이미지. 스케일 바 = 30 μm. (D) 컬러 스팟과 겹쳐진 빨간색 채널 형광 이미지로, 색상은 세포에서 중심까지의 거리 (녹색)를 나타내며 보라색은 중심에 가장 가깝고 흰색은 가장 멀리 떨어져 있습니다. 스케일 바 = 20 μm. (E) 글로벌 GBM 침입의 순차적 분석의 예. 3D 거리는 4hpi와 72hpi에서 결정되며 침입 지수 (II)는받은 편지함의 공식에 따라 계산됩니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; HPI = 주입 후 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

단일 세포 분해능에서 종양 이종 이식편을 이미징하는 것은 GBM 생물학에 대한 이해를 향상시키는 데 없어서는 안될 도구가 될 것입니다. 마우스 PDX 모델에서의 라이브 이미징은 GBM이 어떻게 집합적으로 뇌 조직을 침범하는지에 대한 귀중한 발견으로 이어졌습니다(18). 그러나 현재까지 시공간 해상도는 GBM 침입을 제어하는 단백질의 역학을 밝힐만큼 충분히 높지 않습니다. 우리는 투명한 제브라 피쉬 유충에서 GBM 세포의 동종 생착을 고해상도 생체 내 영상과 결합함으로써 MT와 같은 세포 골격 단백질을 현장 GBM 침입 중 역학을 분석하기에 충분히 상세하게 분석 할 수 있다고 추론했습니다.

방법론의 중요한 단계는 GBM 세포의 준비와 미세 주입 절차에 있습니다. 건강에 해롭고 부적절하게 해리 된 세포는 서로 달라 붙거나 모세 혈관 경계에 달라 붙어 주사의 흐름을 차단합니다. 또한 세포는 주입 된 부피를 최소화하고 대량으로 이식하기 위해 모세관에 충분히 집중되어야합니다. 더 많은 양의 희석 된 세포를 주입하면 침습성 지수를 측정하기 어려워지는 여러 개, 때로는 혼합 된 종양 병소가 발생합니다. 우리 손에는 유성 마이크로 인젝터를 수동으로 처리하면 이전에 유사한 모델19에서 사용 된 가압 공기 기반 전자 마이크로 인젝터보다 주입 흐름을 더 잘 제어 할 수 있습니다. 이것은 뇌 내부의 과도한 유동 압력을 방지하여 주입 된 세포의 후속 조직 손상 및 심실 응집을 방지하는 데 중요합니다.

이 모델의 몇 가지 제한 사항에는 두 종 모두에 대해 최적이 아닌 온도에서 실험을 수행해야 할 필요성이 포함됩니다. 제브라피시는 보통 28°C에서 키우는 반면, 인간 세포는 37°C에서 배양됩니다. 32°C 이상에서는 제브라피쉬 배아 발달이 변경되고 이러한 변화는 치명적일 수 있습니다(35). 그러나, 성체 제브라피쉬 이종이식 모델 36에서 행해지는 것과 유사하게, 제브라피쉬 유충을 32°C의 온도로 순차적으로 순응시키는 것은 이식 후 온도의 급격한 변화에 비해 28°C에서32°C로 이식된 동물의 생존율을 증가시킨다. 그러나, 온도를 증가시키는 것은 32°C 이상의 온도에 대한 제브라피쉬 배아의 민감도에 따라 동물 사멸을 더욱 증가시킨다(35).

생체 내 MT 역학 데이터를 해석하는 것은 온도가 37°C 아래로 떨어질 때 MT 역학이 변하므로 신중하게 수행해야 합니다37. 동일한 MTA 처리를 사용하는 동일한 GBM 세포에서 37°C 및 32°C에서 MT 역학의 병렬 시험관 내 측정은 다양한 GBM 세포 간에 또는 생체 내 치료 간에 나타나는 차이를 검증하는 데 도움이 됩니다. 차이가 온도 민감도의 변화가 아니라 다른 조절 경로(GBM 비교 분석의 경우) 또는 MTA 처리(MTA 효과 분석의 경우)에 의해 발생하는지 확인하는 데 도움이 됩니다. 이것은 MT 역학 이질성이 다른 침략 능력과 연결될 경우 흥미로울 것입니다.

또 다른 한계는 침입을 모니터링할 수 있는 짧은 시간 창(72 내지 96시간)으로, MT 역학(38)의 잠재적 변화에 의해 구동되는 침입 가소성의 측정을 방지한다. 96 시간 후, 우리는 GBM 세포 침습의 급격한 감소를 발견했습니다. 주사 후 6 일째에, GBM 세포의 수는 급속히 감소했는데, 이는 아마도 종양 미세 환경39 (39)에서 호중구 및 대 식세포의 축적에 의해 야기 된 숙주 면역 반응에 기인한다. MTA를 전체 뇌에 전달하는 것은 근처의 신경 숙주 세포에 영향을 미칠 가능성이 있으며, 이는 활동을 위해 MT에 의존하고 그 변경은 GBM 침입에 영향을 미칠 수 있습니다40. 이 접근법은 GBM 세포에 대한 MT 변경을 제한하는 shRNA 또는 광유전학 분석으로 보완되어야 하지만 새로운 항침습성 화합물을 스크리닝하기 위한 좋은 플랫폼으로 남아 있습니다.

제브라 피쉬 뇌에서 MT 표지 GBM 세포의 동형 주입은 기원 조직15에서 암세포 이동의 현장 세포 내 이미징을 허용하는 동물 모델이 거의 없기 때문에 암세포 침범 동안 MT의 역할을 해독하는 데 특히 중요합니다. 현재까지 GBM 이동 중 MT 기능에 대한 연구는 주로 시험관 내 및 생체 외 분석에 의존하며 생체 내 검증 24,41,42,43이 부족합니다. 관심 유전자 녹다운 또는 편향되지 않은 유전자 기반 스크리닝 접근법과 함께 여기에 제시된 분석은 생체 내 GBM 침입에 중요한 새로운 MT 조절자를 밝히는 데 도움이 될 것입니다.

GBM은 침습적 특성이 표본(44)간에 크게 다른 매우 이질적인 종양이다. 다양한 침입 방식의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하면 GBM 전파를 차단하기위한 임시 치료 치료법을 정의하는 데 도움이됩니다. 다양한 GBM 샘플에서 침습성 지수, 침윤 방식 및 MT 역학과 같은 세포 골격 특성을 체계적으로 측정하면 빈번한 게놈 돌연변이 프로파일과 특정 세포 골격 특성에 의존하는 세포 침습 패턴 사이의 새로운 상관 관계가 드러날 것입니다. 이러한 돌연변이가 MT 역학의 변화에 어떻게 영향을 미치는지 밝히는 것은 세포 이동45,46 동안 MT 조절에 대한 지식을 추가할 뿐만 아니라 오랫동안 기다려온 환자 맞춤형 항침습적 치료제로 이어질 수 있습니다.

제브라 피쉬에서 미세 주입의 상대적 용이성과 사용 가능한 많은 수의 유충 및 약물 주입의 용이성으로 인해이 절차는 개인화 된 의약품47,48에 적합합니다. 더욱이, 피질49,50의 상부 500 μm 부분에서만 발생하는 마우스에서 GBM 이종 이식편의 생체 내 영상화와는 달리, 제브라 피쉬를 사용하면 전체 CNS에서 GBM 침윤의 시각화가 가능합니다. 여기에 제시된 모델은 교모세포종의 침습성 능력과 치료에 대한 반응의 신속한 분석을 위한 귀중한 도구가 되기 위한 기준을 충족합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

우리는 P. Herbomel 박사 (프랑스 파스퇴르 연구소)와 그의 실험실, 특히 Valérie Briolat과 Emma Colucci-Guion에게 제브라 피쉬 라인과 미세 주입 플레이트 용 플라스틱 몰드를 제공하고 제브라 피쉬 실험 절차에 대한 귀중한 전문 지식을 제공해 주셔서 대단히 감사합니다. 우리는 UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, 프랑스 국립 연구 기관 France BioImaging의 지원을 받음) 및 ANR-10-INBS-04; 미래를위한 투자). 이 작업은 리그 콘트레 르 암(EL2017. LNCC), 국립 과학 센터, 파스퇴르 연구소, 그리고 Marguerite MICHEL 부인과 Porquet 씨의 관대 한 기부금으로.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glioblastoma cell culture
Foetal calf serum Eurobio CVFSVF00-01 Reagent
MEM NEAA Gibco 11140-050 Reagent
Modified Eagle's medium Eurobio CM1MEM18-01 Reagent
Penicillin–streptomycin Gibco 15140-122 Reagent
U-87 MG ECACC 89081402-1VL Cells
Lenitivirus production
BD FACSAria III BD bioscience Instrument
BD FACSDiva software v8.0 BD bioscience Software
HEK-293T Merck 12022001 Cells
pMD2.G Addgene Plasmid #12259 Reagent
psPAX2 Addgene Plasmid #12260 Reagent
Ultracentrifuge Optima XPN-80 Beckman Coulter Instrument
Cell passaging and staining
dPBS Gibco 14190-094 Chemical
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Chemical
Trypsin-EDTA (0,05%) Gibco 25300-054 Reagent
Zebrafish husbandry
Fluorescence stereomicroscope LEICA M165FC LEICA https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ Instrument
Methylene Blue hydrate Sigma-Aldrich M4159 Chemical
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-25G Chemical
Transfer Pipettes fine tips Samco Scientific 232 Equipment
Transfer Pipettes Large Bulb3mL Samco Scientific 225 Equipment
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma-Aldrich Cat#: A5040 Chemical
Volvic Source Water DUTSCHER DOMINIQUE SAS 999556 Reagent
Xenotransplantation
24-well plate TPP 92024 Equipment
Borosilicate glass capillaries (1.0 ODx0.58IDx150L mm) Harvard Apparatus (#30-0017 GC100-15 Equipment
CellTram oil vario microinjector Eppendorf 5176000.025 Instrument
Microloading pipet tips (Microloader) 20µL Eppendorf  5242956003 Equipment
Micromanipulator NARISHIGE https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html Equipment
Mineral Oil Sigma M8410-100ml Equipment
Stereomicroscope Olympus KL 2500 LCD Instrument
Universal capillary holder Eppendorf 5176190002 Equipment
Vertical Pipette puller KOPF (Roucaire) Model 720 Instrument
Intravital Imaging
3.5cm glass-bottom videoimaging dish MatTek Life Sciences, MA, USA P35G-1,5-14-C Equipment
Acquisition software: NIS-Elements-AR version 5.21 Nikon Software
Heat-Block Techne DRI-BLOCK DB-2D Equipment
Microscope head Nikon Ti2E Nikon Instrument
sCMOS camera Prime 95B Photometrics Instrument
sCMOS camera Orca Flash 4 Hammatsu Instrument
Ultrapure Low melting point agarose Invitrogen 16520-050 Chemical
Yokagawa CSU-W1 spinning disk unit Hammatsu Instrument
Drug Treatment
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML Chemical
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404-2MG Chemical
Image Analysis
Imaris 9.5.1 software Oxford Instruments Software
ImarisFileConverter 9.5.1 Oxford Instruments Software

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References

  1. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  2. Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
  3. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  4. Seetharaman, S., et al. Microtubules tune mechanosensitive cell responses. Nature Materials. 21 (3), 366-377 (2022).
  5. Etienne-Manneville, S. From signaling pathways to microtubule dynamics: the key players. Current Opinion in Cell Biology. 22 (1), 104-111 (2010).
  6. Garcin, C., Straube, A. Microtubules in cell migration. Essays in Biochemistry. 63 (5), 509-520 (2019).
  7. Dogterom, M., Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 38-54 (2019).
  8. Nature editorial. The 'war on cancer' isn't yet won. Nature. 601 (297), (2022).
  9. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  10. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  11. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
  12. Clark, A. G., Vignjevic, D. M. Modes of cancer cell invasion and the role of the microenvironment. Current Opinion in Cell Biology. 36, 13-22 (2015).
  13. Meyer, A. S., et al. 2D protrusion but not motility predicts growth factor-induced cancer cell migration in 3D collagen. Journal of Cell Biology. 197 (6), 721-729 (2012).
  14. Bouchet, B. P., et al. Mesenchymal cell invasion requires cooperative regulation of persistent microtubule growth by SLAIN2 and CLASP1. Developmental Cell. 39 (6), 708-723 (2016).
  15. Luthria, G., et al. In vivo microscopy reveals macrophage polarization locally promotes coherent microtubule dynamics in migrating cancer cells. Nature Commun. 11 (1), 3521 (2020).
  16. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
  17. Ricard, C., Stanchi, F., Rougon, G., Debarbieux, F. An orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (86), e55108 (2014).
  18. Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
  19. Astell, K. R., Sieger, D. Investigating microglia-brain tumor cell interactions in vivo in the larval zebrafish brain. Methods in Cell Biology. , 593-626 (2017).
  20. Zeng, A., et al. Identify a blood-brain barrier penetrating drug-TNB using zebrafish orthotopic glioblastoma xenograft model. Scientific Reports. 7 (1), 14372 (2017).
  21. Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Disease Models & Mechanisms. 9 (9), 1063-1065 (2016).
  22. Umans, R. A., Ten Kate, M., Pollock, C., Sontheimer, H. Fishing for contact: modeling perivascular glioma invasion in the zebrafish brain. ACS Pharmacology & Translational Science. 4 (4), 1295-1305 (2021).
  23. Lee, J. H., et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature. 560 (7717), 243-247 (2018).
  24. Pagano, A., et al. Epothilone B inhibits migration of glioblastoma cells by inducing microtubule catastrophes and affecting EB1 accumulation at microtubule plus ends. Biochemical Pharmacology. 84 (4), 432-443 (2012).
  25. Berges, R., et al. The novel tubulin-binding checkpoint activator BAL101553 inhibits EB1-dependent migration and invasion and promotes differentiation of glioblastoma stem-like cells. Molecular Cancer Therapeutics. 15 (11), 2740-2749 (2016).
  26. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  27. Volvic source water mineral composition. Volvic. , Available from: https://www.volvic.co.uk/volcanic-water/composition (2022).
  28. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  29. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene. , Chapter 5 (2000).
  30. E3, M. Recipe E3 medium (for zebrafish embryos. , Cold Spring Harbor Protocols. (2011).
  31. Straube, A. How to measure microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 777, 1-14 (2011).
  32. Honore, S., Braguer, D. Investigating microtubule dynamic instability using microtubule-targeting agents. Methods in Molecular Biology. 777, 245-260 (2011).
  33. Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of microtubule dynamics by spinning disk microscopy in monopolar mitotic spindles. Journal of Visualized Experiments. (153), e60478 (2019).
  34. Serikbaeva, A., Tvorogova, A., Kauanova, S., Vorobjev, I. A. Analysis of microtubule dynamics heterogeneity in cell culture. Methods in Molecular Biology. 1745, 181-204 (2018).
  35. Schnurr, M. E., Yin, Y., Scott, G. R. Temperature during embryonic development has persistent effects on metabolic enzymes in the muscle of zebrafish. Journal of Experimental Biology. 217 (8), 1370-1380 (2014).
  36. Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).
  37. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  38. Wu, J. S., et al. Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms. Translational Oncology. 14 (1), 100899 (2021).
  39. Hamilton, L., Astell, K. R., Velikova, G., Sieger, D. A zebrafish live imaging model reveals differential responses of microglia toward glioblastoma cells in vivo. Zebrafish. 13 (6), 523-534 (2016).
  40. Gillespie, S., Monje, M. An active role for neurons in glioma progression: making sense of Scherer's structures. NeuroOncology. 20 (10), 1292-1299 (2018).
  41. Wolf, K. J., et al. A mode of cell adhesion and migration facilitated by CD44-dependent microtentacles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11432-11443 (2020).
  42. Zhou, Y. X., et al. Transcriptional upregulation of microtubule-associated protein 2 is involved in the protein kinase A-induced decrease in the invasiveness of glioma cells. Neuro-Oncology. 17 (12), 1578-1588 (2015).
  43. Monzo, P., et al. Mechanical confinement triggers glioma linear migration dependent on formin FHOD3. Molecular Biology of the Cell. 27 (8), 1246-1261 (2016).
  44. Vollmann-Zwerenz, A., Leidgens, V., Feliciello, G., Klein, C. A., Hau, P. Tumor cell invasion in glioblastoma. International Journal of Molecular Science. 21 (6), 1932 (2020).
  45. Feng, H., et al. EGFRvIII stimulates glioma growth and invasion through PKA-dependent serine phosphorylation of Dock180. Oncogene. 33 (19), 2504-2512 (2014).
  46. Liu, R., et al. Cdk5-mediated regulation of the PIKE-A-Akt pathway and glioblastoma cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (21), 7570-7575 (2008).
  47. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trends in Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  48. Baxendale, S., van Eeden, F., Wilkinson, R. The power of zebrafish in personalised medicine. Personalised Medicine: Lessons from Neurodegeneration to Cancer. 1007, 179-197 (2017).
  49. Cramer, S. W., et al. Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain. Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100 (2021).
  50. Stanchi, F., Matsumoto, K., Gerhardt, H. Imaging glioma progression by intravital microscopy. Methods in Molecular Biology. 1862, 227-243 (2019).

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Peglion, F., Coumailleau, F., Etienne-Manneville, S. Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (185), e64093, doi:10.3791/64093 (2022).

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