Denne undersøgelse præsenterer en ny protokol til direkte at anvende mekanisk kraft på cellekernen gennem magnetiske mikroperler leveret ind i cytoplasmaet og til at udføre samtidig levende celle fluorescerende billeddannelse.
Et grundlæggende spørgsmål i mekanobiologi er, hvordan levende celler sanser ekstracellulære mekaniske stimuli i forbindelse med cellefysiologi og patologi. Den cellulære mekano-fornemmelse af ekstracellulære mekaniske stimuli menes at være gennem membranreceptorerne, det tilknyttede proteinkompleks og cytoskelettet. Nylige fremskridt inden for mekanobiologi viser, at cellekernen i cytoplasma selv uafhængigt kan mærke mekaniske stimuli samtidigt. Imidlertid mangler en mekanistisk forståelse af, hvordan cellekernen sanser, transducerer og reagerer på mekaniske stimuli, hovedsageligt på grund af de tekniske udfordringer med at få adgang til og kvantificere kernemekanikken ved hjælp af konventionelle værktøjer. Dette papir beskriver design, fremstilling og implementering af en ny magnetisk kraftaktuator, der anvender præcise og ikke-invasive 3D mekaniske stimuli til direkte deformering af cellekernen. Ved hjælp af CRISPR /Cas9-manipulerede celler viser denne undersøgelse, at dette værktøj kombineret med højopløselig konfokal fluorescerende billeddannelse muliggør afsløring af realtidsdynamikken i et mekano-følsomt ja-associeret protein (YAP) i enkeltceller som en funktion af kernedeformation. Denne enkle metode har potentialet til at bygge bro over det nuværende teknologigab i mekanobiologisamfundet og give svar på den videnskløft, der findes i forholdet mellem kernemekanotransduktion og cellefunktion.
Denne undersøgelse sigter mod at udvikle og anvende en ny teknik til at belyse kernemekanobiologi ved at kombinere de magnetiske aktuatorer, der anvender mekanisk kraft direkte på cellekernen og den konfokale fluorescensmikroskopi, der samtidig afbilder de strukturelle og funktionelle subcellulære ændringer. Celler registrerer ekstracellulære biofysiske signaler, herunder vævsstivhed 1,2,3,4, interstitiel væsketryk og forskydningsspænding 5,6,7, overfladetopologi/geometri 8,9,10,11,12 og spændings-/kompressionsspænding13,14, 15,16. Biofysiske signaler omdannes til biokemiske signaler og udløser potentielle nedstrøms ændringer af genekspression og celleadfærd – en proces kendt som mekanotransduktion 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . For at studere mekanotransduktionsprocesser er der udviklet et utal af teknikker til at anvende mekanisk kraft på cellerne, såsom atomkraftmikroskopi28, cellestrækningsenhed29, bio-MEMS (mikroelektromekaniske systemer) kraftsensor 15,30,31, forskydningsreologi 32 og Stereo Vision System 33 . En nylig gennemgang opsummerer tilgangene til at anvende ekstracellulære mekaniske signaler og forstyrre mekanosensing34. Til dato anvender de fleste af disse metoder kraft på celleplasmamembranen, og celler modtager direkte disse ekstracellulære biofysiske signaler via membranreceptorer såsom integrin, cadherin, ionkanaler og G-proteinkoblede receptorer. Derefter sender de signalet til det intracellulære cytoskelet og kernen. For eksempel ved hjælp af ja-associeret protein (YAP) translokation som en indikator for mekano-sensing, viser celler at fornemme de mekaniske signaler af substratstivhed og ekstracellulær spænding fra cellemembranen og transmittere dem gennem cytoskelettet ind i kernen for at inducere YAP-cytoplasma-til-kernetranslokation28,35.
Nylige beviser tyder på, at selve cellekernen er en uafhængig mekano-sensor 8,36,37. Dette er bevist ved eksperimenter udført på den isolerede kerne høstet fra celler, hvor det blev afsløret, at kerner adaptivt ændrer deres stivhed som reaktion på den mekaniske kraft, der påføres demdirekte 36. Under mange fysiologiske tilstande fornemmer kerner i både tumor og sunde celler ekstracellulære biofysiske signaler og ændrer deres mekaniske egenskaber og samlinger38,39,40. For eksempel ved ekstravasation falder tumorcellernes nukleare stivhed og opretholder blødhed i over 24 timer38. Under migration gennem begrænset interstitielt rum mister kernerne i tumorceller ofte og genvinder deres strukturelle integritet39. Den måde, hvorpå kernen registrerer det biofysiske signal, er imidlertid ukendt, selvom flere nukleare kuvertproteiner og familier af proteiner har vist sig at være involveret, såsom Lamin A / C og linker af nukleoskelet og cytoskelet (LINC) kompleks38,41. Derfor vil nye ikke-invasive metoder, der direkte kan anvende kraft på kernen, afkoble effekten af kraftoverførsel fra celle-plasmamembranen og cytoskelettet og vil hjælpe med at belyse de tidligere utilgængelige molekylære mekanismer for nuklear mekano-sensing.
Forskning, der anvendte optisk pincet til at manipulere organeller42 og mikroperler injiceret i celler43, viste den teknologiske evne til direkte at anvende kraft på kernen. Den optiske pincetteknik har imidlertid flere begrænsninger: (1) optiske pincet med lav kapacitet manipulerer ofte kun en celle eller mikrokugle ad gangen; og (2) potentiel fotoskade og temperaturartefaktdeformation af atomkraft kræver snesevis af pN36, og den tilsvarende nødvendige lasereffekt er ca. 10 mW pr. pN44,45. En sådan laserintensitet er tilstrækkelig til at udløse fotoskader i cellerne og forstyrre cellefunktionerne under eksperimentet46.
Magnetisk kraft påført gennem mikroperler i levende celler viser potentialet til direkte at anvende kraft på kernen og overvinde begrænsningerne ved optisk pincet. Når mikroperler er leveret ind i cytoplasmaet, kan et magnetfelt udøve en magnetisk kraft på flere mikroperler samtidigt på en måde med høj kapacitet. Magnetfeltet påvirker ikke cellefunktioner47, men genererer kraft fra pN til nN, hvilket er nok til at inducere nuklear deformation 36,48,49. Hidtil er manipulation af magnetiske mikroperler blevet anvendt på celleplasmamembran48, inde i cytoplasma50, på F-actin51, inde i kernen47 og på den isolerede kerne36. Imidlertid er magnetisk manipulation af mikroperler aldrig blevet brugt til at anvende direkte mekanisk kraft på atomkuverten for at studere mekanotransduktion i kernen.
I dette papir udvikles en simpel teknik til ikke-invasivt at levere magnetiske mikroperler ind i cytoplasmaet og bruge disse mikroperler til at anvende mekanisk kraft på kernen (figur 1). Her bruges CRISPR/Cas9-konstruerede menneskelige normale B2B-cellelinjer, der endogent udtrykker mNeonGreen21-10/11-mærket YAP, til at validere metoden. YAP er et mekanofølsomt protein, og translokationen af YAP reguleres af nuklear mekano-sensing14,28. Den CRISPR/Cas9-regulerede knock-in-tilgang blev valgt til at mærke endogen YAP med et fluorescerende protein (FP) mNeonGreen21-10/11. Selvom CRISPR-redigering er kendt for at have ufuldstændig effektivitet og off-target effekt, integrerede protokollerne i tidligere publikationer fluorescenssortering for at vælge korrekt åben læserammeindsættelse52,53,54. Med dette ekstra selektionslag blev der ikke observeret nogen tagginghændelse uden for målet i 20+ cellelinjer, der tidligere genererede52,53,54,55. Dette er en delt fluorescerende proteinkonstruktion, men i princippet kan ethvert udtryksfuldt fluorescerende mærke være brugbart. Denne mærkningsmetode er bedre end transgene eller antistofmetoder. For det første, i modsætning til transgenekspressionen, opretholder det mærkede protein enkeltkopi-gendosering og udtrykker sig i den fysiologiske sammenhæng med det native genregulerende netværk, hvilket begrænser afvigelser i proteinkoncentration, lokalisering og interaktion. Mærkningsmetoden, der anvendes i denne undersøgelse, opnår over en størrelsesorden højere gennemstrømning og effektivitet end fuld FP-mærkning. Det undgår også udfordringer forbundet med immunfluorescens på grund af fikseringsartefakter og den begrænsede tilgængelighed af antistoffer af høj kvalitet og høj specificitet. For det andet gør den tilgang, der anvendes i dette papir, minimal forstyrrelse af cellefysiologien og muliggør realtidsåbenbaring af alle endogene YAP’er autentisk. I modsætning hertil fører andre almindelige transgene metoder ofte til overekspression af YAP. Den resulterende kunstige fordeling kan potentielt forårsage cytotoksicitet og påvirke mekano-sensing af celler56,57,58.
Denne undersøgelse præsenterer en protokol til direkte at anvende kraft på kernen gennem magnetiske mikroperler leveret ind i cytoplasmaet og til at udføre samtidig levende celle fluorescerende billeddannelse. Sammenfattende viser de protokoller, der præsenteres her, hvordan man (1) leverer magnetiske mikroperler ind i cellen, mens de er uden for kernen, (2) manipulerer mikroperlerne til at anvende magnetisk kraft på kernen, (3) udfører konfokal fluorescerende billeddannelse af cellerne under manipulation og (4) kvantitativt analyserer YAP-nuklear / cytoplasma (N / C) -forholdet gennem kraftpåføringsprocessen. Resultaterne tyder på, at (1) gennem endocytose kan magnetiske mikroperler ikke-invasivt leveres til cytoplasmaet af B2B-celler inden for 7 timer (figur 2 og figur 3); og (2) kvantificeret magnetisk kraft, der påføres direkte på kernen (figur 4, figur 5 og figur 6) alene kan udløse forskellige ændringer i YAP N / C-forhold i CRISPR / Cas9-konstruerede B2B-celler (figur 7 og figur 8).
Internalisering af magnetiske mikroperler (afsnit 2.2) er kritisk, fordi ekstracellulære mikroperler ikke kan anvende kraft direkte på kernen. Kraftanvendelse og billeddannelse (afsnit 5.3) er kritiske trin i dette eksperiment, og den kraft, der er nødvendig for at deformere kernen og fremkalde meningsfulde biologiske konsekvenser, kan være prøveafhængig. Kraftstørrelsen i dette eksperiment (0,8 nN og 1,4 nN) kan øges yderligere for at udløse nuklear mekano-sensing i mindre følsomme celler.
<p class="jove_c…The authors have nothing to disclose.
Dette projekt er finansieret af UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. og Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) og UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Vi sætter stor pris på de intellektuelle diskussioner med og den tekniske støtte fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurokirurgi), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institut for Kvantitative Systemer Farmakologi), Dr. David Hahn (University of Arizona), og supportteam af Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Vi er dybt taknemmelige for den effektive støtte fra alle medlemmer af Tangs, Yamaguchis, Sharmas, Au’s, Siemanns og Guans forskningslaboratorier og alle medarbejdere i UF MAE Department.
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
A1R confocal system | Nikon | ||
Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |