Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kombination af 3D magnetisk kraftaktuator og multifunktionel fluorescensbilleddannelse for at studere kernemekanobiologi

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

Denne undersøgelse præsenterer en ny protokol til direkte at anvende mekanisk kraft på cellekernen gennem magnetiske mikroperler leveret ind i cytoplasmaet og til at udføre samtidig levende celle fluorescerende billeddannelse.

Abstract

Et grundlæggende spørgsmål i mekanobiologi er, hvordan levende celler sanser ekstracellulære mekaniske stimuli i forbindelse med cellefysiologi og patologi. Den cellulære mekano-fornemmelse af ekstracellulære mekaniske stimuli menes at være gennem membranreceptorerne, det tilknyttede proteinkompleks og cytoskelettet. Nylige fremskridt inden for mekanobiologi viser, at cellekernen i cytoplasma selv uafhængigt kan mærke mekaniske stimuli samtidigt. Imidlertid mangler en mekanistisk forståelse af, hvordan cellekernen sanser, transducerer og reagerer på mekaniske stimuli, hovedsageligt på grund af de tekniske udfordringer med at få adgang til og kvantificere kernemekanikken ved hjælp af konventionelle værktøjer. Dette papir beskriver design, fremstilling og implementering af en ny magnetisk kraftaktuator, der anvender præcise og ikke-invasive 3D mekaniske stimuli til direkte deformering af cellekernen. Ved hjælp af CRISPR /Cas9-manipulerede celler viser denne undersøgelse, at dette værktøj kombineret med højopløselig konfokal fluorescerende billeddannelse muliggør afsløring af realtidsdynamikken i et mekano-følsomt ja-associeret protein (YAP) i enkeltceller som en funktion af kernedeformation. Denne enkle metode har potentialet til at bygge bro over det nuværende teknologigab i mekanobiologisamfundet og give svar på den videnskløft, der findes i forholdet mellem kernemekanotransduktion og cellefunktion.

Introduction

Denne undersøgelse sigter mod at udvikle og anvende en ny teknik til at belyse kernemekanobiologi ved at kombinere de magnetiske aktuatorer, der anvender mekanisk kraft direkte på cellekernen og den konfokale fluorescensmikroskopi, der samtidig afbilder de strukturelle og funktionelle subcellulære ændringer. Celler registrerer ekstracellulære biofysiske signaler, herunder vævsstivhed 1,2,3,4, interstitiel væsketryk og forskydningsspænding 5,6,7, overfladetopologi/geometri 8,9,10,11,12 og spændings-/kompressionsspænding13,14, 15,16. Biofysiske signaler omdannes til biokemiske signaler og udløser potentielle nedstrøms ændringer af genekspression og celleadfærd - en proces kendt som mekanotransduktion 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . For at studere mekanotransduktionsprocesser er der udviklet et utal af teknikker til at anvende mekanisk kraft på cellerne, såsom atomkraftmikroskopi28, cellestrækningsenhed29, bio-MEMS (mikroelektromekaniske systemer) kraftsensor 15,30,31, forskydningsreologi 32 og Stereo Vision System 33 . En nylig gennemgang opsummerer tilgangene til at anvende ekstracellulære mekaniske signaler og forstyrre mekanosensing34. Til dato anvender de fleste af disse metoder kraft på celleplasmamembranen, og celler modtager direkte disse ekstracellulære biofysiske signaler via membranreceptorer såsom integrin, cadherin, ionkanaler og G-proteinkoblede receptorer. Derefter sender de signalet til det intracellulære cytoskelet og kernen. For eksempel ved hjælp af ja-associeret protein (YAP) translokation som en indikator for mekano-sensing, viser celler at fornemme de mekaniske signaler af substratstivhed og ekstracellulær spænding fra cellemembranen og transmittere dem gennem cytoskelettet ind i kernen for at inducere YAP-cytoplasma-til-kernetranslokation28,35.

Nylige beviser tyder på, at selve cellekernen er en uafhængig mekano-sensor 8,36,37. Dette er bevist ved eksperimenter udført på den isolerede kerne høstet fra celler, hvor det blev afsløret, at kerner adaptivt ændrer deres stivhed som reaktion på den mekaniske kraft, der påføres demdirekte 36. Under mange fysiologiske tilstande fornemmer kerner i både tumor og sunde celler ekstracellulære biofysiske signaler og ændrer deres mekaniske egenskaber og samlinger38,39,40. For eksempel ved ekstravasation falder tumorcellernes nukleare stivhed og opretholder blødhed i over 24 timer38. Under migration gennem begrænset interstitielt rum mister kernerne i tumorceller ofte og genvinder deres strukturelle integritet39. Den måde, hvorpå kernen registrerer det biofysiske signal, er imidlertid ukendt, selvom flere nukleare kuvertproteiner og familier af proteiner har vist sig at være involveret, såsom Lamin A / C og linker af nukleoskelet og cytoskelet (LINC) kompleks38,41. Derfor vil nye ikke-invasive metoder, der direkte kan anvende kraft på kernen, afkoble effekten af kraftoverførsel fra celle-plasmamembranen og cytoskelettet og vil hjælpe med at belyse de tidligere utilgængelige molekylære mekanismer for nuklear mekano-sensing.

Forskning, der anvendte optisk pincet til at manipulere organeller42 og mikroperler injiceret i celler43, viste den teknologiske evne til direkte at anvende kraft på kernen. Den optiske pincetteknik har imidlertid flere begrænsninger: (1) optiske pincet med lav kapacitet manipulerer ofte kun en celle eller mikrokugle ad gangen; og (2) potentiel fotoskade og temperaturartefaktdeformation af atomkraft kræver snesevis af pN36, og den tilsvarende nødvendige lasereffekt er ca. 10 mW pr. pN44,45. En sådan laserintensitet er tilstrækkelig til at udløse fotoskader i cellerne og forstyrre cellefunktionerne under eksperimentet46.

Magnetisk kraft påført gennem mikroperler i levende celler viser potentialet til direkte at anvende kraft på kernen og overvinde begrænsningerne ved optisk pincet. Når mikroperler er leveret ind i cytoplasmaet, kan et magnetfelt udøve en magnetisk kraft på flere mikroperler samtidigt på en måde med høj kapacitet. Magnetfeltet påvirker ikke cellefunktioner47, men genererer kraft fra pN til nN, hvilket er nok til at inducere nuklear deformation 36,48,49. Hidtil er manipulation af magnetiske mikroperler blevet anvendt på celleplasmamembran48, inde i cytoplasma50, på F-actin51, inde i kernen47 og på den isolerede kerne36. Imidlertid er magnetisk manipulation af mikroperler aldrig blevet brugt til at anvende direkte mekanisk kraft på atomkuverten for at studere mekanotransduktion i kernen.

I dette papir udvikles en simpel teknik til ikke-invasivt at levere magnetiske mikroperler ind i cytoplasmaet og bruge disse mikroperler til at anvende mekanisk kraft på kernen (figur 1). Her bruges CRISPR/Cas9-konstruerede menneskelige normale B2B-cellelinjer, der endogent udtrykker mNeonGreen21-10/11-mærket YAP, til at validere metoden. YAP er et mekanofølsomt protein, og translokationen af YAP reguleres af nuklear mekano-sensing14,28. Den CRISPR/Cas9-regulerede knock-in-tilgang blev valgt til at mærke endogen YAP med et fluorescerende protein (FP) mNeonGreen21-10/11. Selvom CRISPR-redigering er kendt for at have ufuldstændig effektivitet og off-target effekt, integrerede protokollerne i tidligere publikationer fluorescenssortering for at vælge korrekt åben læserammeindsættelse52,53,54. Med dette ekstra selektionslag blev der ikke observeret nogen tagginghændelse uden for målet i 20+ cellelinjer, der tidligere genererede52,53,54,55. Dette er en delt fluorescerende proteinkonstruktion, men i princippet kan ethvert udtryksfuldt fluorescerende mærke være brugbart. Denne mærkningsmetode er bedre end transgene eller antistofmetoder. For det første, i modsætning til transgenekspressionen, opretholder det mærkede protein enkeltkopi-gendosering og udtrykker sig i den fysiologiske sammenhæng med det native genregulerende netværk, hvilket begrænser afvigelser i proteinkoncentration, lokalisering og interaktion. Mærkningsmetoden, der anvendes i denne undersøgelse, opnår over en størrelsesorden højere gennemstrømning og effektivitet end fuld FP-mærkning. Det undgår også udfordringer forbundet med immunfluorescens på grund af fikseringsartefakter og den begrænsede tilgængelighed af antistoffer af høj kvalitet og høj specificitet. For det andet gør den tilgang, der anvendes i dette papir, minimal forstyrrelse af cellefysiologien og muliggør realtidsåbenbaring af alle endogene YAP'er autentisk. I modsætning hertil fører andre almindelige transgene metoder ofte til overekspression af YAP. Den resulterende kunstige fordeling kan potentielt forårsage cytotoksicitet og påvirke mekano-sensing af celler56,57,58.

Denne undersøgelse præsenterer en protokol til direkte at anvende kraft på kernen gennem magnetiske mikroperler leveret ind i cytoplasmaet og til at udføre samtidig levende celle fluorescerende billeddannelse. Sammenfattende viser de protokoller, der præsenteres her, hvordan man (1) leverer magnetiske mikroperler ind i cellen, mens de er uden for kernen, (2) manipulerer mikroperlerne til at anvende magnetisk kraft på kernen, (3) udfører konfokal fluorescerende billeddannelse af cellerne under manipulation og (4) kvantitativt analyserer YAP-nuklear / cytoplasma (N / C) -forholdet gennem kraftpåføringsprocessen. Resultaterne tyder på, at (1) gennem endocytose kan magnetiske mikroperler ikke-invasivt leveres til cytoplasmaet af B2B-celler inden for 7 timer (figur 2 og figur 3); og (2) kvantificeret magnetisk kraft, der påføres direkte på kernen (figur 4, figur 5 og figur 6) alene kan udløse forskellige ændringer i YAP N / C-forhold i CRISPR / Cas9-konstruerede B2B-celler (figur 7 og figur 8).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vedligeholdelse af CRISPR/Cas9-konstruerede B2B-celler

  1. Kultur B2B-celler i en T25-kolbe med RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin.
  2. B2B-cellerne opbevares i en befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
  3. Subkulturer B2B-cellerne, når sammenløbet når 70% til 80%.
  4. Opbevar B2B-cellelinjen i RPMI-1640 dyrkningsmedium med 10% (v/v) DMSO i en -80 °C fryser.
  5. Brug B2B-cellerne med et passagenummer mindre end 10 i eksperimenterne.

2. Cellekultur

  1. Frø cellerne på en glasbundet petriskål.
    1. Flyt kolben, der indeholder B2B-celler, indeni fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet.
    2. Kulturmediet fjernes i kolben ved hjælp af en aspirerende pipette med en tilsluttet vakuumpumpe.
    3. Kolben vaskes med 2 ml fosfatbufferet saltvand (PBS).
    4. Fjern PBS ved hjælp af den aspirerende pipette.
    5. Tilsæt 0,5 ml 0,05% Trypsinopløsning for at løsne celler fra bunden af kolbesubstratet.
    6. Sæt kolben i inkubatoren i 5 min.
    7. Kolben flyttes til biosikkerhedsskabet. Tilsæt 5 ml nyt dyrkningsmedium i kolben og pipetter opløsningen op og ned.
    8. Deponer 50 μL af mediet med celler (300 celler / μL) på glasbunden petriskål. Tilsæt 2 ml kulturmedium i petriskålen.
    9. Placer petriskålen i inkubatoren. Vent i 12 timer på, at cellerne sætter sig fast.
  2. Kultur cellerne med magnetiske mikroperler.
    1. Vejer 0,2 g af 7 μm carbonyljernmikroperler med en gennemsnitlig diameter (herefter kaldet 7 μm mikroperler, se materialetabellen).
    2. Brug en pipette til at suspendere mikroperlerne i 1 ml RPMI-1640 kulturmedium.
    3. Tag petriskålen med B2B-celler med til biosikkerhedsskabet.
    4. Tilsæt 200 μL af mediet indeholdende mikroperler i petriskålen.
      BEMÆRK: Tilsæt mediet hurtigt for at undgå udfældning af mikroperlerne.
    5. Sæt petriskålen tilbage i inkubatoren, indtil mikroperler internaliseres af cellerne. Kontroller internaliseringen hver 6. time for at bestemme den optimale tid til internalisering for forskellige cellelinjer.
    6. For at kontrollere internaliseringen skal du udføre konfokal fluorescensbilleddannelse for at visualisere mikroperle-, atom- og cellegrænsen. Hvis mikroperlen internaliseres af cellen, vil den være inden for cellegrænsen.

3. Visualisering af kernen

  1. Varm 1,5 ml af kulturmediet i inkubatoren i 15 min.
  2. Sluk lyset fra biosikkerhedsskabet. Tag petriskålen, der indeholder cellen, det opvarmede kulturmedium, atompletten og Verapamil HCl ind i biosikkerhedsskabet.
    BEMÆRK: Nukleare farvningskomponenter er følsomme over for lys. Undgå udsættelse for lys under drift.
  3. Fortynd 1000x nuklear plet med DMSO til 100x.
  4. Fortynd 100 mM Verapamil HCl ved DMSO til 10 mM.
  5. Tilsæt 15 μL 100x kerneplet og 15 μL 10 mM Verapamil HCl til 1,5 ml kulturmedium. Bland godt ved at pipettere op og ned.
  6. Fjern kulturmediet fra petriskålen. Tilsæt kulturmediet, der indeholder nuklear farvning, i petriskålen.
  7. Sæt cellerne tilbage i inkubatoren i over 2 timer.

4. Forberedelse af hardware til magnetisk kraftapplikation

  1. 3D-print alle dele ved hjælp af acrylonitrilbutadienstyren (ABS) og saml dem efter CAD-designet (figur 1A). CAD-designet er inkluderet i materialetabellen.
  2. Brug dobbeltsidet tape til at fastgøre magneten til magnetbevægelsesenheden (figur 1A).
  3. Indstil magnetbevægelsesenheden ved siden af mikroskoptrinnet. Brug de tre knapper til at justere magnetens rumlige placering, indtil den kan bevæge sig over petriskålen mellem 13 mm og 120 mm.
    BEMÆRK: Sørg for, at den øvre grænse for afstanden mellem magneten og petriskålen er så stor som muligt for at undgå uønsket kraftpåføring på de magnetiske mikroperler. 120 mm er den maksimale værdi i denne eksperimentelle opsætning. Sørg for, at magneten ikke forstyrrer mikroskopdele, herunder mål og motoriserede trin.
  4. Indstil magneten til den højeste z-position (ved 120 mm).

5. Tving applikation og levende cellebilleddannelse

  1. Opsætning af miljøkammeret til langtidsbilleddannelse
    1. Påfør 75% ethanolopløsning for grundigt at sterilisere og rengøre miljøkammeret.
    2. Placer miljøkammeret på det motoriserede stadium af det omvendte mikroskop.
    3. Åbn CO 2 -tanken, og indstil CO2 -tilstrømningshastigheden til 160 ml / min.
    4. Juster kammerets temperatur til 44 °C (øverst), 42 °C (bad) og 40 °C (trin).
    5. Tilsæt 20 ml renset vand i badet i miljøkammeret for at opretholde 90% fugtighed.
    6. Tag den glasbundne petriskål, der indeholder målceller fra vævskulturinkubatoren, ud og læg den ind i kammeret.
    7. Påfør metalklemmen i miljøkammeret for at fastgøre petriskålens position.
      BEMÆRK: Petriskålen skal fastspændes tæt i kammeret, fordi den magnetiske kraft kan bevæge skålen, hvis den ikke er fastspændt.
    8. Luk låget på kammeret.
  2. Optimering af billedparametre
    1. Optimer pinhole-størrelsen: Pinhole blokerer fotonerne, der er ude af fokus. En større pinhole-størrelse giver flere fotoner uden for fokus, men et lysere billede. En mindre pinhole-størrelse giver et mere fokuseret og svagere billede. Sørg for at optimere pinhole-størrelsen for at få konfokale billeder i fokus med det passende signal-støj-forhold.
    2. Optimer laserintensiteten: Laserintensiteten bestemmer intensiteten af excitation og dermed emissionslys. Den lave laserintensitet giver et lavt signal-støj-forhold. For høj laserintensitet vil forårsage fotobleaching. Juster laserintensiteten i overensstemmelse hermed.
    3. Optimer trinstørrelsen og trinene: Trin og trinstørrelse bestemmer, hvor mange billeder der skal tages i en Z-stack. Mindre trinstørrelser og flere trin vil øge Z-stack-opløsningen, men vil også øge fotobleaching. I dette eksperiment blev 1 μm trinstørrelse brugt til cellerne med ~ 15 μm cellehøjde.
    4. Optimer eksponeringstiden: Eksponeringstiden bestemmer, hvor længe cellen vil blive udsat for excitationslaseren. En lav eksponeringstid vil reducere signal-støj-forholdet. En høj eksponeringstid vil forårsage fotoblegning. En eksponeringstid på 1 ramme pr. 4 s blev brugt i dette eksperiment.
    5. Optimering af billedparametre: Skift en af de fire parametre iterativt, og hold de andre parametre konsistente. Hver gang måles YAP N / C-forholdet for hvert billede, og sammenlign YAP N / C-forholdsændringen for at bestemme fotoblegningsniveauet. Gentag optimeringsprocessen, indtil der opnås en balance mellem signal-støj-forholdet, billedbehandlingshastigheden og fotoblegning.
    6. Definer billedkonfigurationerne ved hjælp af de optimerede billedparametre for hurtigere billedindstillinger under eksperimenterne.
      BEMÆRK: De konfigurationer, der anvendes i denne undersøgelse, er beskrevet i afsnit 5.3 i billedparametrene. Hvis du vil optimere billedparametrene for konfigurationerne i afsnit 5.3, skal du bruge den samme metode som i trin 5.2.5.
  3. Anvendelse med lille kraft og konfokal billeddannelse
    BEMÆRK: Nikon Ti2-E mikroskop blev brugt til billeddannelse i denne undersøgelse, og detaljerede trin til billedoptagelse er angivet nedenfor.
    1. Åbn det omvendte mikroskop. Åbn softwareprogrammet Elements.
    2. Definer konfiguration magnetic_find. Tjek kun FITC-kanal. Indstil PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensitet = 10. Indstil scanningshastigheden til 1 billede pr. 2 s ved at klikke på knappen 1/2 . Indstil pinhole-størrelse til 1,2 AU ved at klikke på knappen 1,2 A.U. Denne konfiguration vil blive brugt i trin 5.3.5.
    3. Definer konfiguration magnetic_YAP_Nucleus. Tjek FITC-kanal. Indstil PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensitet = 10. Indstil scanningshastigheden til 1 billede pr. 4 s ved at klikke på 1/2-knappen . Indstil pinhole-størrelse til 1,2 AU ved at klikke på knappen 1,2 A.U. For at afbilde kernegrænsen og nuklear pletintensitet skal du kontrollere Cy5-kanalen. Indstil PMT HV = 70, Offset = 0, Laserintensitet = 10. Pinhole-størrelsen er optimeret til 3D YAP-billeddannelse. Klik ikke på 1.2 A.U .-knappen igen efter at have kontrolleret Cy5-kanalen. Denne konfiguration vil blive brugt i trin 5.3.7.
    4. Tænd DIA gennem Elements , hvis det er nødvendigt. Åbn SpinView, brug et lysfelt, og juster objektets fokus for at få et klart billede af celler i fokus. Brug et 10x mål til at finde passende flere enkeltceller under tre forhold: med en enkelt mikroperle indeni, med flere mikroperler indeni og uden mikroperler indeni. Skift til 40x mål. Navngiv denne position med det relevante positionsnummer.
    5. Åbn elementer. Klik på magnetic_find. Klik på knappen Fjern lås.
    6. Klik på Scan, og juster fokusplanets Z-position. Klik på knapperne Top og Bund for at angive den nedre og øvre grænse for Z-stakken for de markerede celler. Stop scanningen ved at klikke på Scan igen.
    7. Skift til magnetic_YAP_Nucleus konfiguration. Indstil filnavn som before_small_force.nd2. Klik på knappen Kør med den optagede Z-stak.
    8. Skift til den rigtige lyssti, og tænd for DIA. Åbn SpinView, og klik på Optagelse knap. I mellemtiden skal du dreje knappen på magnetbevægelsesanordningen for at flytte magneten ned til 46 mm over petriskålbunden. Gem lysfeltbilledsekvens eller video. Tjek videoen for at bekræfte, at mikroperler viser forskydning induceret af magnetisk kraft.
    9. Gentag trin 5.3.5-5.3.7; Indstil filnavnet til after_small_force.nd2.
    10. Skift til den rigtige lyssti, og tænd for DIA. Åbn derefter SpinView og klik på Optage knap. I mellemtiden drejes knappen på magnetbevægelsesenheden for at flytte magneten op til 120 mm over petriskålbunden. Gem lysfeltbilledsekvens eller video.
    11. Gentag trin 5.3.5-5.3.7, og indstil filnavnet til before_large_force.nd2.
  4. Anvendelse med stor kraft og konfokal billeddannelse
    1. Fjern låget på miljøkammeret, så magneten kan nå 13 mm over petriskålbunden.
    2. Skift til den rigtige lyssti, og tænd for DIA. Åbn SpinView, og klik på Optagelse knap. I mellemtiden skal du dreje knappen på magnetbevægelsesenheden for at flytte magneten ned til 13 mm over petriskålbunden. Gem lysfeltbilledsekvens eller video. Tjek videoen for at bekræfte, at mikroperler viser forskydning induceret af magnetisk kraft.
    3. Gentag trin 5.3.5-5.3.7, og indstil filnavnet til after_large_force.nd2.
    4. Skift til den rigtige lyssti, og tænd for DIA. Åbn derefter SpinView og klik på Optage knap. I mellemtiden drejes knappen på magnetbevægelsesenheden for at flytte magneten op til 120 mm over petriskålbunden. Gem lysfeltbilledsekvens eller video.
    5. Gentag trin 5.3.5-5.3.7; Indstil filnavnet til retract_large_force.nd2.
    6. Luk låget på miljøkammeret.
  5. Gentag trin 5.2 og 5.3 for flere synsfelter for at få flere data, hvis det er nødvendigt.

6. Billedbehandling og dataanalyse

  1. Kvantificering af YAP N / C-forhold
    1. Åbn Fiji ImageJ. Åbn .nd2-billederne taget i trin 5.
    2. Klik på Analyser > Indstil målinger. Kontrolområde, integreret tæthed, gennemsnitlig grå værdi og formbeskrivelser.
    3. Brug Cy5-kanalen til at identificere kernen. Klik på Frihåndsvalg for at bruge værktøjet til frit valg til at skitsere kernen. Kontroller også den automatiske atommaskemakro i ImageJ (se materialetabellen).
    4. Klik på Analysér > måling i FITC-kanalen. Den målte værdi af middelværdien er den gennemsnitlige nukleare YAP-intensitet DN.
    5. Brug Cy5-kanalen til at identificere kernen. Brug FITC-kanalen til at identificere cellen. Klik på Frihåndsvalg for at bruge værktøjet til frit valg til at vælge et interesseområde inden for cytoplasmaet og undgå den magnetiske mikroperle. Denne interesseregion må ikke omfatte kernen.
    6. Klik på Analysér > måling i FITC-kanalen. Den målte værdi af middelværdien er den gennemsnitlige cytoplasmatiske YAP-intensitet DC.
    7. Beregn YAP N / C-forholdet = D N / DC.
  2. Kvantificering af nuklear form og normaliseret nuklear pletintensitet
    1. Åbn Fiji ImageJ. Åbn .nd2-billederne taget i trin 5.
    2. Klik på Analyser > Indstil målinger. Kontrolområde, integreret tæthed, gennemsnitlig grå værdi og formbeskrivelser.
    3. Brug Cy5-kanalen til at identificere kernen. Klik på Frihåndsvalg for at bruge værktøjet til frit valg til at skitsere kernen.
    4. Klik på Analyser > måling i Cy5-kanalen. Den målte værdi af middelværdien er den nukleare pletintensitet. Den målte værdi af Circ. er nuklear cirkularitet.
    5. For at sammenligne den nukleare pletintensitet ved forskellig krafttilstand divideres al nuklear pletintensitet med den nukleare pletintensitet i "before_small_force.nd2" for at generere den normaliserede nukleare pletintensitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Design af en magnetbevægelsesanordning og anvendelse af magnetisk kraft
For at anvende kraft på kernen gennem de magnetiske mikroperler blev en magnetbevægelsesanordning designet og bygget til at styre magnetens rumlige position. Magnetbevægelsesenheden indeholder en central ramme, tre knapper og skinner til at flytte den vedhæftede magnet i x-, y- og z-retninger uafhængigt ved den rumlige opløsning på 1,59 mm pr. cyklus (figur 1A). Når magneten er flyttet tæt på de 7 μm mikroperler, der leveres ind i cellerne (figur 1B), tiltrækker den magnetisk mikroperlerne og anvender kraft på kernen (figur 1C). Kraftretningen og størrelsen styres af den relative position mellem magneten og mikroperlerne.

I dette papir blev to forskellige kraftstørrelser anvendt på mikroperlerne: (1) en relativt lille kraft, når magneten blev placeret 46 mm over cellen; og (2) en relativt stor kraft, når magneten blev placeret 13 mm over cellen. Den magnetiske kraft, der påføres mikroperlen F, kan beregnes ved ligningen59: Equation 1, hvor Nd er afmagnetiseringsfaktoren (0,33 for en kugle), μ er permeabiliteten i et vakuum (6,3 × 10-3H / m for jern), Vp er mikroperlens volumen (178 μm3 for en 7 μm mikroperle), og H er magnetfeltintensiteten med enheden A / m. H er proportional med magnetisk fluxtæthed B med enhed Tesla. Da den magnetiske kraft, der virker på en enkelt 7 μm mikroperle, forventedes at være ekstremt lille og vanskelig at detektere af en krafttransducer, blev den magnetiske fluxtæthed B som reference målt for at indikere størrelsen af den magnetiske kraft, der blev påført mikroperlerne. En Hall-sensor blev introduceret på stedet for petriskålbunden for at måle den magnetiske fluxtæthed, og magneten blev placeret i en afstand af 13 mm eller 46 mm fra bunden af petriskålen. Fordi 7 μm mikroperlerne påvirker magnetfeltet, blev den magnetiske fluxtæthed målt med og uden mikroperler. Uanset tilstedeværelsen af 7 μm mikroperler blev den samme magnetiske fluxtæthed opnået: B = 60, 1 mT i en afstand på 13 mm og B = 3, 7 mT i en afstand på 46 mm. Denne måling viser, at effekten af 7 μm mikroperler på magnetfeltet genereret af den cylindriske magnet med en diameter på 12,7 mm og en højde på 12,7 mm (se materialetabellen) ikke kunne påvises af Hall-sensoren, der blev brugt i denne undersøgelse. Imidlertid var den magnetiske fluxtæthed i sagen med en afstand på 13 mm ca. 16 gange højere end den med en afstand på 46 mm. Eksperimentel kalibrering af den magnetiske kraft er beskrevet i det følgende afsnit (figur 6).

Levering af magnetiske mikroperler i cytoplasmaet
12 timer efter såning af celler på glasbunden petriskål tilsættes 7 μm mikroperler i kulturmediet. Mikroperler internaliseres spontant af cellerne. Fordi mikroperlerne ikke udsender fluorescens under laser excitation i FITC- eller Cy5-kanalen, kan placeringen af de internaliserede mikroperler identificeres ved placeringen af den mørke hule med den konfokale billeddannelse af fluorescens af YAP og kerne. Både 2D- og 3D-billeder viser, at mikroperlen er i cytoplasmaet, mens den er uden for kernen (figur 2).

Internaliseringsniveauerne af mikroperler i cellerne afhænger af varigheden af co-kulturen af celler og mikroperler. Således blev cellerne kategoriseret i tre typer i henhold til mængden af internaliserede mikroperler - ingen mikroperle, enkelt mikrokugle og multimikroperler (figur 3A). Ved 7 timers samkultur internaliserede 62% af cellerne ingen mikroperle, 15% af cellerne internaliserede en enkelt mikroperle, og 23% af cellerne internaliserede multimikroperler (samlet antal celler = 13). Ved 12 timers samkultur internaliserede 53% af cellerne ingen mikroperle, 26% af cellerne internaliserede en enkelt mikroperle, og 21% af cellerne internaliserede multimikroperler (samlet antal celler = 62). Ved 24 timers samkultur internaliserede 20% af cellerne ingen mikroperle, 28% af cellerne internaliserede en enkelt mikroperle, og 53% af cellerne internaliserede multimikroperler (samlet antal celler = 40) (figur 3B).

Mikroperler i cytoplasma påvirker ikke nuklear form og YAP-aktivitet
For at undersøge effekten af internaliseringen af mikroperler på nuklear form og proteinaktivitet blev den nukleare form først kvantificeret ved henholdsvis cirkularitet og YAP-aktiviteten ved YAP N / C-forhold. Cirkularitet beregnes ved cirkularitet = 4μ (område / omkreds2). De detaljerede trin til kvantificering af YAP N/C-forhold blev beskrevet i en tidligere publikation60. Kort fortalt blev YAP N / C-forhold beregnet ved at dividere den gennemsnitlige YAP-intensitet i kernen med den gennemsnitlige YAP-intensitet i cytoplasmaet. I betragtning af muligheden for, at samkultur af mikroperler og celler kan påvirke den nukleare form, selvom ingen mikroperler internaliseres, cellerne uden samkultur (sorte prikker, kontrol # 1, cirkularitet = 0,806 ± 0,037, n = 20), celler samdyrket med mikroperler, men uden internalisering (grå prikker, kontrol # 2, cirkularitet = 0,806 ± 0,035, n = 22), celler, der internaliserer enkelt mikroperle (røde prikker, enkelt mikroperle, Cirkularitet = 0,793 ± 0,048, n = 15) og celler, der internaliserer multimikroperler (blå prikker, multimikroperler, n = 7) (figur 3C) blev sammenlignet. Resultatet viser, at blandt alle fire testede grupper havde nuklear cirkularitet ingen signifikant forskel (figur 3C).

For at undersøge, om YAP N / C-forholdet er påvirket af internaliseringen af mikroperler, blev cellerne samdyrket med mikroperler, men uden internalisering (grå prikker, kontrol # 2, YAP N / C-forhold = 1,155 ± 0,074, n = 35) kun sammenlignet med cellerne med enkelt- eller multimikroperleinternalisering (røde prikker, celle med mikroperler, YAP N / C-forhold = 1,140 ± 0,078, n = 36) i samkulturens 12. time (figur 3D). Cellerne uden samkultur blev ikke sammenlignet, fordi skålen med mikroperler viser lavere celletæthed, hvilket kan påvirke YAP N / C-forholdet12. Resultatet viser ingen signifikant forskel (p-værdi = 0,667) i YAP N / C-forholdet mellem de to grupper, hvilket indikerer, at internaliseringen af mikroperler ikke påvirker YAP-aktiviteten (figur 3D).

Magnetisk kraft deformerer kernen
For det første vises deformationen af kernen. Deformationen af kernen er forårsaget af kompressionskraften påført af mikroperlerne (figur 4A og figur 4A1-3) i celler, der indeholder cytoskelet. Disse data (dvs. kernen deformeres af mikrobønnens kompression) understøtter, at mikroperlen faktisk anvender en kraft på kernen i den overfyldte cytoplasma. En lysfeltvideo, der viser kraftpåføringsprocessen, er inkluderet i supplementmaterialet (supplerende video 1). For det andet, fordi det er muligt, at mikroperlen samtidig anvender kraft på det omgivende cytoskelet og deformerer kernen indirekte, blev kompressionseksperimenterne gentaget i celler, der har de forstyrrede actinfilamenter (behandling af Cyto D (2,5 μM, 1 time); Figur 4B). Denne undersøgelse viser, at actinfilamenterne faktisk depolymeriseres (figur 4B), og kernen deformeres af mikroperlerne (figur 4B1-3). Disse data understøtter, at mikroperlerne anvender en kraft direkte på kernen i fravær af sammenflettet omgivende cytoskelet. Samlet set viser disse data, at protokollerne og værktøjerne kan anvende en kraft direkte på kernen.

Rumlig og tidsmæssig kontrol af intracellulære magnetiske mikroperler
For at opnå rumlig kontrol af mikroperlerne blev et par magneter brugt til at flytte mikroperlen og kontrollere dens placering af fordybningen på kernen (figur 5A). Perlen kan kun flyttes med op til 2,2 μm forskydning (figur 5A1-4), men kan fleksibelt anvende fordybning på kernen på tilsvarende steder. Det omgivende actincytoskelet kan begrænse bevægelsen af mikroperler. Derfor blev actincytoskelettet forstyrret af Cyto D-behandling (2,5 μM, 1 time), og mikroperleplaceringen blev manipuleret, men viste lignende resultater. Derfor kan der foreslås en hypotese: mikrokuglen kan fysisk/kemisk binde sig til kernen og andre omgivende organeller i cytoplasmaet, hvilket begrænser dens store rumlige bevægelse (>2,2 μm).

For at opnå rumlig kontrol af mikroperlerne blev der brugt et par magneter, der styrer mikroperlerne til at anvende og frigive kraften to gange (med forskellig kraftstørrelse) på samme sted af kernen (figur 5B og figur 5B1-B4). Den aktuelle tidsvarighed for en cyklus af kraftanvendelse og frigivelse er 12 s. Hastigheden af tidsmæssig kontrol bestemmes af XYZ-moverens driftshastighed.

Kalibrering af den magnetiske kraft
Den perlepåførte kraft på kernen blev estimeret ved eksperimentelt at måle den kraft, der blev påført af en kalibreret atomkraftmikroskopi (AFM), der forårsager en lignende deformation af kernen. Specifikt blev actincytoskelettet først opløst af CytoD (2,5 μM; 1 h, figur 4B), fordi AFM anvender kraft på cellens apikale overflade, og fjernelsen af actinbark og cytoskelet tillader mere direkte kontakt mellem AFM-spids og cellekerne. De celler, der har deres actin cortex og cytoskelet opløst, er levende baseret på sammenligning af nuklear form og nuklear farvningsintensitet med dem i raske celler (supplerende figur 1). For det andet blev den ikke-funktionaliserede AFM-spids (semi-sfærisk, radius = 5 μm), der har en lignende størrelse og form som mikroperlernes, brugt til at indrykke cellens apikale overflade på en kraftstyret måde og samtidig erhverve 3D-konfokale billeder af celle- og kernelegemerne (figur 6A). Størrelsen af trykkraften fra 0,8 nN til 2,0 nN blev valgt, fordi kraften ved en størrelse på 1,5 nN baseret på litteraturen24 var kendt for at deformere kernen tilstrækkeligt. For det tredje blev den normale deformation af kernen, der var forårsaget af AFM-indrykningen, målt gennem kvantitativ billeddannelsesanalyse. Kalibreringskurven, der giver det kvantitative AFM-kraftforskydningsforhold (figur 6B), blev også opnået. For det fjerde blev en trykkraft påført kernens laterale overflade ved at kontrollere mikroperler, der har samme størrelse og form (radius = 7 μm; Figur 6C), og deformationen af kernemembranen blev målt via billedanalyse. Den perlepåførte kraft estimeres ud fra AFM-kraftforskydningsforholdet.

For eksempel i figur 6C er deformationen af kernen forårsaget af magnetiske mikroperler (diameter = ~ 7 μm) ved 'stor kraft' omkring 1,5 μm. I figur 6D blev en AFM-spids, der har en 5 μm semisfærisk sonde, brugt til at indrykke cellen oven på kernen for at opnå 1,5 μm nuklear deformation. Den tilsvarende kraft registreret af AFM er 1, 4 nN. Derfor anslås den kraft, der påføres mikroperlerne, at være ~ 1,4 nN. Efter samme fremgangsmåde kalibreres den magnetiske kraft ved 'lille kraft' som 0,8 nN, og den forårsagede 0,4 μm nuklear fordybning.

Denne undersøgelse mener, at den AFM-målte kraft kan repræsentere den mikrobepåførte kraft baseret på følgende antagelser: (1) Stivheden af kernen i forskellige celler er ens. (2) Kernens mekaniske egenskaber afhænger ikke af de nukleare anlæg, hvor fordybningen blev anvendt. Den magnetiske kraft påføres vandret på kernens laterale sider, mens AFM-kraften påføres lodret på kernens apikale sider. Den mekaniske forskel mellem dem antages som ubetydelig. (3) I AFM-eksperimenter anvender sonden direkte kraft gennem cellemembranen og cytoskelettet på kernen. Efter at have forstyrret actinfilamenterne svarer den AFM-påførte kraft på kernen til den mikrobede-påførte kraft på kernen, på trods af at membranen stadig er placeret mellem AFM-sonden og kernen i det førstnævnte tilfælde.

Magnetisk kraft udløser ændring af YAP N / C-forhold
For at bevise, at den magnetiske kraft, der påføres mikroperlerne, kan deformere kernen og inducere YAP-translokation, blev YAP N / C-forholdet mellem cellerne med mikroperlernes internalisering kvantificeret i tre faser: (1) før påføring af kraften, (2) efter påføring af kraften og (3) efter frigivelse af kraften. Nogle celler viste en ændring af nuklear form og YAP N / C-forhold, når kraften blev påført eller frigivet (figur 7A, C). Intensitetsændringerne i YAP kan tilskrives to mulige mekanismer: (1) YAP-FP-proteiner translokerer fra cytoplasmaet til kernen efter kraftpåføring. I dette tilfælde bør nuklear farvning ikke vise signalændringer. Nuklear farvningsintensitet bør ikke ændre sig meget; (2) YAP-FP-proteiner translokerer ikke efter kraftpåføring. De observerede YAP-intensitetsændringer skyldes den kraftinducerede nukleare volumenændring og den resulterende YAP-FP-koncentrationsændring. I dette tilfælde bør den nukleare farvningsintensitet ændre sig i en lignende tendens som YAP-kerneintensiteten, fordi koncentrationen af farvningsfarve også ændres, når kernevolumenet ændres. Derfor blev den nukleare farvningsintensitetsændring fra den røde kanal (excitation: 650 nm; emission: 681 nm) målt. Intensiteten ændres i YAP i den grønne kanal, men der er ingen intensitetsændringer i kernefarvning i den røde kanal. Således findes den første mekanisme sandsynligvis (figur 7B). Samlet viser resultaterne, at den magnetiske kraftinducerede nukleare deformation udløser YAP-translokation.

Dernæst blev nettoændringen af YAP N / C-forholdet kvantificeret inden for to grupper af celler: (1) celler uden mikroperler internaliseret (grå prikker, kontrol, n = 9); og (2) udvalgte celler med internaliserede mikroperler, der viser ændring af YAP N / C-forhold (grønne prikker for lille kraft, røde prikker for stor kraft, n = 11). Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler (er) netto YAP N / C-forholdsændring = -0,030 ± 0,029, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = -0,003 ± 0,012, n = 9. Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler netto YAP N / C-forholdsændring = 0,011 ± 0,040, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = 0,005 ± 0,005, n = 9 (figur 8A). Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler (r) absolut netto YAP N / C-forholdsændring = 0,057 ± 0,017, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = 0,021 ± 0,007, n = 9. Forskellen er signifikant (p-værdi = 0,0093, **). Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler absolut netto YAP N / C-forholdsændring = 0,070 ± 0,020, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = 0,010 ± 0,003, n = 9. Forskellen er signifikant (p-værdi = 0,0007, ***) (figur 8B). Sammen bekræfter disse resultater, at den magnetiske kraft, der påføres mikroperlerne i cytoplasmaet, faktisk kan inducere YAP-translokation og ændre YAP N / C-forhold.

Figure 1
Figur 1: Design af den magnetiske bevægelige enhed og skematisk kraftanvendelse i cellen ved hjælp af magnetiske mikroperler . (A) Tredimensionel skematisk af enheden implementeret for at holde magneten og flytte den i x, y og z retninger. Enheden består af en base 241,3 mm i bredden og 104,1 mm i højden, to knapper, en stang og en magnet. Knapperne splines i den korrekte driftsrotationsretning, hvilket vil levere bevægelse i den tilsvarende retning. Magneten sænkes tættere på/hæves yderligere til fadet for at påføre magnetisk kraft med forskellig størrelse og retning på magnetiske mikroperler. (B) Eksempel på scanningselektronmikroskop (SEM) billede af 7 μm jernmikroperle. (C) Magnetiske mikroperler, der leveres inde i cytoplasmaet, kan anvende kraft på organellerne, såsom kernen, når et magnetfelt påføres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative billeder, der viser magnetisk mikroperler (sort hul spids med blå pil) internaliseres i cellen (angivet med YAP) og uden for kernen . (A) X-Y-tværsnit af en celle af YAP (grøn), kerne (rød) og lysfelt. (B) 3D-rekonstruktion af cellen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Mikroperler internaliseret af cellerne påvirker ikke den nukleare form og YAP N / C-forhold . (A) Repræsentative lysfelt- og fluorescensbilleder af celler uden mikroperle, enkelt mikroperle og internalisering af flere mikroperler. Blå pile angiver placeringen af mikroperler inde i cytoplasmaet. (B) Ved 7 h (n = 13), 12 h (n = 62) og 24 h (n = 40) af samkultur, procentdelen af cellerne viser ingen mikroperle, enkelt mikroperle og multi-mikroperler internalisering. (C) Nuklear cirkularitet viser ingen signifikant forskel mellem kontrolceller og celler med mikroperleinternalisering. Kontrol #1 (uden mikroperle-co-kultur): Cirkularitet = 0,806 ± 0,037, n = 20; Kontrol #2 (med mikroperle-co-kultur, uden mikroperleinternalisering): Cirkularitet = 0,806 ± 0,035, n = 22; Enkelt mikroben internalisering: Cirkularitet = 0,793 ± 0,048, n = 15; multi-mikrobead internalisering: Cirkularitet = 0,780 ± 0,061, n = 7. (D) YAP N / C-forhold viser ingen signifikant forskel (p-værdi = 0,667) mellem kontrolceller (med mikroperle-co-kultur, uden mikroperleinternalisering, YAP N / C-forhold = 1,155 ± 0,074, n = 35) og celler med mikroperleinternalisering (YAP N / C-forhold = 1,140 ± 0,078, n = 36). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Direkte kraftpåføring på kerne med og uden actinfilamenter. (A) Celler viser actinfilamenter (gul). (A1) Billede af kernen, når der ikke påføres nogen kraft. (A2) Billede af kernen efter kraften er påført. (A3) Overlapningsbillede af den nukleare grænse før og efter kraftanvendelsen viser nuklear indrykning. (B) Celler viser forstyrrede actinfilamenter (gule) efter Cyto D-behandling (2,5 μM, 1 time). (B1) Billede af kernen, når der ikke påføres nogen kraft. (B2) Billede af kernen efter kraften er påført. (B3) Overlapningsbillede af den nukleare grænse før og efter kraftpåføringen viser nuklear fordybning med det forstyrrede actincytoskelet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Rumlig og tidsmæssig kontrol af intracellulær magnetisk mikroperle . (A) Et par magneter styrer rumligt den magnetiske mikroperle. (A1) Lysfeltbillede af cellegrænse (grøn linje), nuklear grænse (rød linje) og magnetisk mikroperle (gul linje) på position 1. (A2) Magnetisk mikroperleindrykning kerne i position 1. (A3) Magnetisk mikroperle flyttes til position 2 (gul linje). Position 1 vises som reference (gul stiplet linje). (A4) Magnetisk mikroperleindrykning kerne i position 2. (B) Et par magneter styrer tidsmæssigt magnetisk mikroperle. (B1) Lysfeltbillede af en celle uden kraft påført på tidspunktet I. (B2) Magnetisk mikrokugle anvender en kraft på kernen på tidspunktet II. (B3) Magnetisk mikroperler frigiver kraften fra kernen på tidspunktet for punkt III. (B4) Magnetisk mikroperle anvender en større kraft på kernen på tidspunktet IV. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6. Kalibrering af mikroperlepåført kraft på kernen ved hjælp af AFM-fordybning. (A) Skematisk illustration af kalibreringsprocessen. Magnetisk mikroperle anvender vandret kompression på kernen (til venstre), og AFM-sonde indrykker lodret på kernen. (B) AFM-indrykningskraft vs. nuklear deformation. (C) Repræsentativt billede af kernedeformation (1,5 μm) før og efter kraftpåføring ved magnetisk mikroperle. (D) Repræsentativt billede af lignende kernedeformation (1,5 μm) før og efter AFM-indrykning med 1,4 nN-kraft. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative data, der viser YAP N / C-forholdsændring, induceres ved magnetisk kraftpåføring og frigivelse . (A) X-Y tværsnit af YAP (grøn) og kerne (rød) fluorescerende billede af cellen uden kraft, kraft på og kraft af. I force-on-tilstanden falder cytoplasmatisk YAP-intensitet på det sted, der peges af en gul pil, mens nuklear YAP-intensitet øges. YAP N / C-forholdet stiger. (B) YAP N / C-forholdet øges, når kraften tændes (fra 1,0791 til 1,2327) og falder, når kraften slukkes (fra 1,2327 til 1,1548). Normaliseret nuklear pletintensitet viser mindre ændringer med kraftpåføring (1.00117) og frigivelse (0.95578). (C) X-Z-tværsnit af YAP (grøn) og kerne (rød) billede af cellen uden kraft, kraft på og kraft af. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: YAP N / C-forholdsændring induceret af magnetisk kraftpåføring. (A) Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler netto YAP N / C-forholdsændring = -0,030 ± 0,029, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = -0,003 ± 0,012, n = 9. Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler netto YAP N / C-forholdsændring = 0,011 ± 0,040, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = 0,005 ± 0,005, n = 9. (B) Ved 0,8 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler absolut netto YAP N / C-forholdsændring = 0,057 ± 0,017, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = 0,021 ± 0,007, n = 9. Forskellen er signifikant (p-værdi = 0,0093, **). Ved 1,4 nN-kraft viser celler med internaliserede mikroperler absolut netto YAP N / C-forholdsændring = 0,070 ± 0,020, n = 11; kontrolceller viser netto YAP N / C-forholdsændring = 0,010 ± 0,003, n = 9. Forskellen er signifikant (p-værdi = 0,0007, ***) Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Nuklear form og nuklear farvningsintensitet. (A) uden Cyto D-behandling, (B) med Cyto D-behandling og (C) Dead Cell. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 1: En lysfeltvideo, der viser kraftapplikationsprocessen. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Internalisering af magnetiske mikroperler (afsnit 2.2) er kritisk, fordi ekstracellulære mikroperler ikke kan anvende kraft direkte på kernen. Kraftanvendelse og billeddannelse (afsnit 5.3) er kritiske trin i dette eksperiment, og den kraft, der er nødvendig for at deformere kernen og fremkalde meningsfulde biologiske konsekvenser, kan være prøveafhængig. Kraftstørrelsen i dette eksperiment (0,8 nN og 1,4 nN) kan øges yderligere for at udløse nuklear mekano-sensing i mindre følsomme celler.

For at anvende magnetisk kraft på en kvantitativ måde med høj gennemstrømning er internaliseringen af en enkelt mikroperle en ideel tilgang. I denne undersøgelse var procentdelen af cellerne med enkeltmikroperleinternalisering ens ved 12 timer (26%) og 24 timer (28%), mens cellerne uden mikroperleinternalisering var højere ved 12 timer (53%) end ved 24 timer (20%) (figur 3B). Det vurderes, at 12 timer er det optimale tidspunkt for kraftpåføringseksperiment, fordi flere enkeltmikroperler kan inkluderes, og celler kan kontrolleres. For forskellige cellelinjer og mikroperlestørrelser bør samkulturtid og mikroperlekoncentration testes for at bestemme de tilsvarende optimale forhold.

I eksperimenterne blev mikroperlerne ikke belagt til specifikt at binde til kernen. Derfor er kraften, der overføres direkte fra mikroperlerne til kernen, sandsynligvis kun komprimerende. Resultaterne viser, at YAP N / C-forholdet øger og mindsker cellepopulationen (figur 8A). En mulig årsag er, at den magnetiske kraft, der påføres via mikroperlerne, kan forårsage positiv eller negativ spændingsændring i cytoskelettet og regulere YAP N / C-forholdet til henholdsvis stigning eller fald28. Tidligere forskning viser, at trykkraft på kernen inducerer en stigning i YAP N / C-forholdet28. I fremtidige eksperimenter kan cytoskelettet forstyrres for at studere kernens direkte kraftføling for at eliminere kraftoverførslen fra cytoskelettet ind i kernen.

Der er to potentielle ulemper ved de nuværende metoder. For det første blev 3D-moveren (figur 1A) i disse eksperimenter brugt til at justere perlernes bevægelse, som overvåges af konfokal billeddannelse i realtid og sigter mod at anvende en trykkraft på kernen. På grund af kernemembranens glatte natur og det komplekse miljø i cytoplasmaet er retningen af den påførte kraft muligvis ikke rent komprimerende (dvs. ikke helt vinkelret på kernemembranoverfladen). Denne ufuldkommenhed kan medføre, at der påføres en forskydningskraft på kernemembranen. For det andet er de nuværende mikroperler, der anvendes i denne undersøgelse, ikke konjugeret med antistoffet til at binde med kernen, fordi perlernes rumlige mobilitet er kritisk i det nuværende eksperiment for at demonstrere fordelen ved ikke-kontakt magnetisk aktuator. Derfor kan den nuværende metode ikke anvende spænding på atommembranen.

I fremtiden vil (1) perler med anti-nesprin-1-antistof blive konjugeret til specifikt at binde med kernen. Dette kan garantere den direkte og specifikke kraftoverførsel mellem mikroperler og målproteinerne. (2) Kraftretningen kalibreres ved at manipulere den enkelte magnetiske mikroperle i blød hydrogel indlejret med fluorescerende perler. 3D-forskydningen af fluorescerende perler kan bruges til at beregne hydrogelens deformationsfelt og bestemme kraftretningen som en funktion af det påførte magnetfelt. Efter at mikroperlen er kemisk bundet med kernen, vil anvendelse af en kraft med en kendt retning bestemme krafttypen (spænding, kompression eller forskydning). (3) 3D-billeddannelse af nuklear farvning vil blive brugt til at opbygge en 3D-simulering FEM-model af kernen. Kraftretningen kan verificeres ved at sammenligne den nukleare deformation før og efter den magnetiske kraftpåføring.

Den unikke teknik, der er udviklet i denne undersøgelse, giver flere potentielle fordele: (1) Sammenlignet med lodret fordybning af AFM-sonder kan magnetiske mikroperler anvende kraft i enhver retning. Celler dyrket på 2D-substratoverflader kan have heterogen proteinfordeling og orientering på deres lodrette og vandrette overflader af plasmamembranen og kernekuverten. Anvendelse af kraft vandret kan fremkalde tidligere uobserverede mekano-sensing reaktioner. (2) Når mikroperlerne er funktionelt belagt til at binde til kernerne, kan både skubbe- og trækkræfter påføres direkte på kernen for yderligere at studere den differentielle nukleare mekano-sensing på grund af de forskellige kraftretninger. (3) Ved at kontrollere mikroperlernes specifikke binding til visse nukleare kuvertproteiner kan tidligere underundersøgte mekanismer for nuklear kraftføling belyses. Nye beviser viser, at kernen sandsynligvis er en mekano-sensor36, og nuklear mekano-sensing er den mest direkte regulator af YAP-translokation28. Mekanismen for nuklear reguleret YAP-translokation studeres aktivt, og flere kandidater til mekano-sensor eller parametre i kernen foreslås, herunder nuklear porestørrelse28, nuklear form 25,61, LINC-kompleks og nuklear kuvertspænding20. Manipulation af de magnetiske mikroperler åbner mulighed for detaljeret udforskning af sådanne mekanismer ved direkte kraftanvendelse på LINC-komplekset og kontrollerede reguleringer af kernekuvertspændingen og -formen. (4) Ud over at anvende kræfter på kernen er mikroperler også egnede til at blive konstrueret til at binde til indersiden af plasmamembranen for at afsløre, hvordan de intracellulære domæner af membranproteiner og deres kompleks reagerer på biofysiske signaler.

Sammenfattende demonstrerede dette papir en metode, der (1) leverer jernmikroperler i mikrostørrelse til cytoplasma uden at påvirke nuklear morfologi og proteinfunktioner, (2) anvender kraft på kernen ved magnetiske mikroperler og (3) udfører konfokal fluorescens levende cellebilleddannelse under kraftpåføringen. Disse ikke-invasive værktøjer åbner mulighederne for direkte epigenetisk manipulation af organeller i enkeltceller, superopløsningsbilleddannelsesbaseret forhør af kernemekanotransduktion og detaljeret udforskning af kraftreguleret 3D-kromosomorganisation (i kombination med Hi-C: højopløsningskromosombekræftelsesoptagelse) og omprogrammering i forbindelse med cellefysiologi og patobiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette projekt er finansieret af UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), UFHCC Pilot Award (X. T. og Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) og UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Vi sætter stor pris på de intellektuelle diskussioner med og den tekniske støtte fra Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurokirurgi), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institut for Kvantitative Systemer Farmakologi), Dr. David Hahn (University of Arizona), og supportteam af Nikon (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon og Jon Ekman). Vi er dybt taknemmelige for den effektive støtte fra alle medlemmer af Tangs, Yamaguchis, Sharmas, Au's, Siemanns og Guans forskningslaboratorier og alle medarbejdere i UF MAE Department.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , Springer. Boston, MA. 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Tags

Biologi udgave 185 Nucleus mekanobiologi magnetisk kraft CRISPR / Cas9 mekanotransduktion blødt aktivt stof ja-associeret protein (YAP) fluorescerende funktionel billeddannelse digital billedbehandling optogenetik epigenetik
Kombination af 3D magnetisk kraftaktuator og multifunktionel fluorescensbilleddannelse for at studere kernemekanobiologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter