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Biology

Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/64098
Automatic Translation
1,5, 1,5, 1, 1, 2, 3,5, 4, 5,6,7, 1, 1,5,8,9
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, 3Department of Biostatistics, University of Florida, 4Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), 5UF Health Cancer Center, University of Florida, 6Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, 7Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, 8J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 9Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

Summary

Este estudo apresenta um novo protocolo para aplicar diretamente força mecânica no núcleo celular através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas.

Abstract

Uma questão fundamental na mecanobiologia é como as células vivas sentem estímulos mecânicos extracelulares no contexto da fisiologia e patologia celular. Acredita-se que a sensação mecano-celular de estímulos mecânicos extracelulares seja através dos receptores de membrana, do complexo proteico associado e do citoesqueleto. Avanços recentes na mecanobiologia demonstram que o núcleo celular no próprio citoplasma pode sentir independentemente estímulos mecânicos simultaneamente. No entanto, falta uma compreensão mecanicista de como o núcleo celular detecta, transduz e responde a estímulos mecânicos, principalmente por causa dos desafios técnicos no acesso e quantificação da mecânica do núcleo por ferramentas convencionais. Este artigo descreve o projeto, fabricação e implementação de um novo atuador de força magnética que aplica estímulos mecânicos 3D precisos e não invasivos para deformar diretamente o núcleo celular. Usando células modificadas por CRISPR/Cas9, este estudo demonstra que esta ferramenta, combinada com imagens fluorescentes confocais de alta resolução, permite a revelação da dinâmica em tempo real de uma proteína associada ao sim (YAP) mecanósquia em células individuais em função da deformação do núcleo. Este método simples tem o potencial de preencher a lacuna tecnológica atual na comunidade de mecanobiologia e fornecer respostas para a lacuna de conhecimento que existe na relação entre a mecanotransdução do núcleo e a função celular.

Introduction

Este estudo tem como objetivo desenvolver e aplicar uma nova técnica para elucidar a mecanobiologia do núcleo, combinando os atuadores magnéticos que aplicam força mecânica diretamente no núcleo celular e a microscopia de fluorescência confocal que simultaneamente visualiza as alterações estruturais e funcionais subcelulares. As células detectam sinais biofísicos extracelulares, incluindo rigidez tecidual 1,2,3,4, pressão do fluido intersticial e tensão de cisalhamento 5,6,7, topologia/geometria da superfície 8,9,10,11,12 e tensão de tensão/compressão13,14, 15,16. Os sinais biofísicos são convertidos em sinais bioquímicos e desencadeiam potenciais alterações a jusante da expressão gênica e dos comportamentos celulares - um processo conhecido como mecanotransdução 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Para estudar os processos de mecanotransdução, uma infinidade de técnicas foram desenvolvidas para aplicar força mecânica nas células, como microscopia de força atômica28, dispositivo de alongamento celular29, sensor de força bio-MEMS (sistemas microeletromecânicos) 15,30,31, reologia de cisalhamento 32 e Sistema de Visão Estéreo 33 . Uma revisão recente resume as abordagens para aplicar pistas mecânicas extracelulares e interferir no mecananosense34. Até o momento, a maioria desses métodos aplica força na membrana plasmática celular, e as células recebem diretamente esses sinais biofísicos extracelulares por meio de receptores de membrana, como integrina, caderina, canais iônicos e receptores acoplados à proteína G. Posteriormente, eles transmitem o sinal para o citoesqueleto e núcleo intracelular. Por exemplo, usando a translocação de proteína associada ao sim (YAP) como um indicador de mecanosensoriamento, as células mostram sentir os sinais mecânicos de rigidez do substrato e tensão extracelular da membrana celular e transmiti-los através do citoesqueleto para o núcleo para induzir a translocação citoplasma para núcleo YAP28,35.

Evidências recentes sugerem que o próprio núcleo celular é um mecano-sensor independente 8,36,37. Isso é comprovado por experimentos realizados no núcleo isolado colhido de células, onde foi revelado que os núcleos mudam adaptativamente sua rigidez em resposta à força mecânica diretamente aplicada sobre eles36. Durante muitas condições fisiológicas, os núcleos em células tumorais e saudáveis detectam sinais biofísicos extracelulares e alteram suas propriedades mecânicas e montagens38,39,40. Por exemplo, após o extravasamento, a rigidez nuclear das células tumorais diminui e mantém a maciez por mais de 24 h38. Durante a migração através do espaço intersticial confinado, os núcleos das células tumorais frequentemente perdem e recuperam sua integridade estrutural39. No entanto, a forma como o núcleo detecta o sinal biofísico é desconhecida, embora várias proteínas do envelope nuclear e famílias de proteínas tenham sido encontradas envolvidas, como a lamina A / C e o ligador do complexo nucleoesqueleto e citoesqueleto (LINC)38,41. Assim, novos métodos não invasivos que podem aplicar força diretamente ao núcleo dissociarão o efeito da transmissão de força da membrana plasmática celular e do citoesqueleto e ajudarão a elucidar os mecanismos moleculares anteriormente inacessíveis do mecanismo nuclear.

Pesquisas que empregaram pinças ópticas para manipular organelas42 e microesferas injetadas nas células43 mostraram a capacidade tecnológica de aplicar diretamente força no núcleo. No entanto, a técnica óptica-pinça tem várias limitações: (1) pinças ópticas de baixo rendimento geralmente manipulam apenas uma célula ou microesferas de cada vez; e (2) o potencial fotodano e a temperatura artefato-deformação do nuclear requerem dezenas de pN36, e a potência necessária correspondente do laser é de cerca de 10 mW por pN44,45. Essa intensidade de laser é suficiente para desencadear fotodanos nas células e perturbar as funções celulares durante o experimento46.

A força magnética aplicada através de microesferas dentro de células vivas mostra o potencial de aplicar força diretamente no núcleo e supera as limitações das pinças ópticas. Uma vez que as microesferas são entregues no citoplasma, um campo magnético pode exercer uma força magnética em várias microesferas simultaneamente de uma maneira de alto rendimento. O campo magnético não influencia as funções celulares47, mas gera força de pN a nN, o que é suficiente para induzir a deformação nuclear 36,48,49. Até o momento, a manipulação de microesferas magnéticas tem sido aplicada na membrana plasmática celular48, no interior do citoplasma50, na actina F51, no interior do núcleo47 e no núcleo isolado36. No entanto, a manipulação magnética de microesferas nunca foi usada para aplicar força mecânica direta no envelope nuclear para estudar a mecanotransdução no núcleo.

Neste trabalho, uma técnica simples é desenvolvida para entregar microesferas magnéticas no citoplasma de forma não invasiva e usar essas microesferas para aplicar força mecânica no núcleo (Figura 1). Aqui, linhagens celulares B2B humanas normais projetadas por CRISPR/Cas9 que expressam endogenamente o YAP marcado com mNeonGreen21-10/11 são usadas para validar o método. A YAP é uma proteína mecano-sensível, e a translocação da YAP é regulada pela detecção mecânica nuclear14,28. A abordagem knock-in regulada por CRISPR/Cas9 foi escolhida para marcar YAP endógeno com uma proteína fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Embora a edição CRISPR seja conhecida por ter eficiência incompleta e efeito fora do alvo, os protocolos em publicações anteriores integraram a classificação por fluorescência para selecionar a inserção correta do quadro de leitura aberta52,53,54. Com essa camada adicional de seleção, nenhum evento de marcação fora do alvo foi observado em mais de 20 linhagens celulares geradas anteriormente52,53,54,55. Esta é uma construção de proteína fluorescente dividida, mas, em princípio, qualquer tag fluorescente expressável poderia ser utilizável. Esta abordagem de marcação é superior aos métodos transgênicos ou de anticorpos. Primeiro, ao contrário da expressão transgênica, a proteína marcada mantém a dosagem do gene de cópia única e se expressa no contexto fisiológico da rede reguladora de genes nativos, limitando desvios na concentração, localização e interação da proteína. O método de marcação usado neste estudo alcança uma taxa de transferência e eficiência mais altas do que a marcação completa de FP. Também evita desafios associados à imunofluorescência devido a artefatos de fixação e à disponibilidade limitada de anticorpos de alta qualidade e alta especificidade. Em segundo lugar, a abordagem usada neste artigo faz uma perturbação mínima para a fisiologia celular e permite a revelação em tempo real de todos os YAPs endógenos autenticamente. Em contraste, outros métodos transgênicos comuns muitas vezes levam à superexpressão de YAP. A distribuição artificial resultante pode potencialmente causar citotoxicidade e afetar a detecção mecanogênica das células56,57,58.

Este estudo apresenta um protocolo para aplicar diretamente força sobre o núcleo através de microesferas magnéticas entregues no citoplasma e para realizar imagens fluorescentes simultâneas de células vivas. Em resumo, os protocolos aqui apresentados demonstram como (1) entregar microesferas magnéticas na célula enquanto estão fora do núcleo, (2) manipular as microesferas para aplicar força magnética no núcleo, (3) realizar imagens fluorescentes confocais das células durante a manipulação e (4) analisar quantitativamente a relação YAP nuclear/citoplasma (N/C) durante todo o processo de aplicação da força. Os resultados sugerem que (1) através da endocitose, as microesferas magnéticas podem ser entregues de forma não invasiva no citoplasma das células B2B dentro de 7 h (Figura 2 e Figura 3); e (2) a força magnética quantificada aplicada diretamente no núcleo (Figura 4, Figura 5 e Figura 6) isoladamente pode desencadear diversas alterações da relação N/C YAP em células B2B projetadas por CRISPR/Cas9 (Figura 7 e Figura 8).

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Protocol

1. Manutenção de células B2B projetadas por CRISPR/Cas9

  1. Cultura de células B2B em frasco T25 com RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Manter as células B2B em incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2.
  3. Subcultura das células B2B quando a confluência atingir 70% a 80%.
  4. Armazenar a linhagem celular B2B em meio de cultura RPMI-1640 com 10% (v/v) de DMSO em um freezer de -80 °C.
  5. Use as células B2B com um número de passagem menor que 10 nos experimentos.

2. Cultura celular

  1. Semeie as células em uma placa de Petri com fundo de vidro.
    1. Deslocar o balão que contém células B2B no seu interior da incubadora para o armário de biossegurança.
    2. Retirar o meio de cultura no balão utilizando uma pipeta aspiradora com uma bomba de vácuo ligada.
    3. Lavar o balão com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
    4. Remova o PBS usando a pipeta de aspiração.
    5. Adicionar 0,5 ml de solução de tripsina a 0,05% para separar as células do fundo do substrato do balão.
    6. Colocar o balão na incubadora durante 5 minutos.
    7. Deslocar o balão para o armário de biossegurança. Adicionar 5 ml de novo meio de cultura ao balão e pipetar a solução para cima e para baixo.
    8. Deposite 50 μL do meio com células (300 células/μL) na placa de Petri com fundo de vidro. Adicionar 2 mL de meio de cultura à placa de Petri.
    9. Coloque a placa de Petri na incubadora. Aguarde 12 h para que as células se liguem.
  2. Cultive as células com microesferas magnéticas.
    1. Pesar 0,2 g de microesferas de ferro carbonilo de diâmetro médio de 7 μm (a seguir designadas por microesferas de 7 μm, ver Tabela de Materiais).
    2. Use uma pipeta para suspender as microesferas em 1 mL de meio de cultura RPMI-1640.
    3. Leve a placa de Petri com células B2B para o gabinete de biossegurança.
    4. Adicionar 200 μL do meio contendo microesferas à placa de Petri.
      NOTA: Adicione o meio rapidamente para evitar a precipitação das microesferas.
    5. Coloque a placa de Petri de volta na incubadora até que as microesferas sejam internalizadas pelas células. Verifique a internalização a cada 6 h para determinar o tempo ideal para internalização para diferentes linhas celulares.
    6. Para verificar a internalização, realize imagens de fluorescência confocal para visualizar o limite de microesferas e celular. Se a microesfera for internalizada pela célula, ela estará dentro do limite celular.

3. Visualização do núcleo

  1. Aquecer 1,5 mL do meio de cultura na incubadora por 15 min.
  2. Desligue a luz do armário de biossegurança. Leve a placa de Petri que contém a célula, o meio de cultura aquecido, a mancha nuclear e o Verapamil HCl para o gabinete de biossegurança.
    NOTA: Os componentes de coloração nuclear são sensíveis à luz. Evite a exposição à luz durante a operação.
  3. Diluir 1000x a mancha nuclear por DMSO a 100x.
  4. Diluir 100 mM Verapamil HCl por DMSO a 10 mM.
  5. Adicionar 15 μL de 100x de coloração nuclear e 15 μL de 10 mM de Verapamil HCl a 1,5 mL de meio de cultura. Misture bem pipetando para cima e para baixo.
  6. Retire o meio de cultura da placa de Petri. Adicionar o meio de cultura contendo coloração nuclear na placa de Petri.
  7. Coloque as células de volta na incubadora por mais de 2 h.

4. Preparação do hardware de aplicação de força magnética

  1. Imprima em 3D todas as peças usando acrilonitrila butadieno estireno (ABS) e monte-as seguindo o projeto CAD (Figura 1A). O projeto CAD está incluído na Tabela de Materiais.
  2. Use fita dupla face para conectar o ímã ao dispositivo de movimentação de ímã (Figura 1A).
  3. Coloque o dispositivo de movimento magnético ao lado do estágio do microscópio. Use os três botões para ajustar a localização espacial do ímã até que ele possa se mover acima da placa de Petri entre 13 mm e 120 mm.
    NOTA: Certifique-se de que o limite superior da distância entre o ímã e a placa de Petri seja o maior possível para evitar a aplicação de força indesejada nas microesferas magnéticas. 120 mm é o valor máximo nesta configuração experimental. Certifique-se de que o ímã não interfira com as peças do microscópio, incluindo objetivos e estágios motorizados.
  4. Ajuste o ímã para a posição z mais alta (a 120 mm).

5. Forçar a aplicação e a imagem de células vivas

  1. Configuração da câmara ambiental para imagens de longo prazo
    1. Aplique solução de etanol a 75% para esterilizar e limpar completamente a câmara ambiental.
    2. Coloque a câmara ambiente no estágio motorizado do microscópio invertido.
    3. Abra o tanque de CO 2 e defina a taxa de entrada de CO2 para 160 mL/min.
    4. Ajuste a temperatura da câmara para 44 °C (Topo), 42 °C (Banho) e 40 °C (Palco).
    5. Adicione 20 mL de água purificada no banho da câmara ambiente para manter 90% de umidade.
    6. Retire a placa de Petri com fundo de vidro que contém células-alvo da incubadora de cultura de tecidos e coloque-a na câmara.
    7. Aplique a braçadeira de metal da câmara ambiente para fixar a posição da placa de Petri.
      NOTA: A placa de Petri deve ser firmemente presa na câmara, porque a força magnética pode mover a placa se ela não estiver presa.
    8. Feche a tampa da câmara.
  2. Otimização de parâmetros de imagem
    1. Otimize o tamanho do pinhole: O pinhole bloqueia os fótons fora de foco. Um tamanho de pinhole maior produz mais fótons fora de foco, mas uma imagem mais brilhante. Um tamanho de pinhole menor produz uma imagem mais focada e mais fraca. Certifique-se de otimizar o tamanho do orifício para obter imagens confocais em foco com a relação sinal-ruído apropriada.
    2. Otimize a intensidade do laser: A intensidade do laser determina a intensidade da excitação e, portanto, a emissão de luz. A baixa intensidade do laser proporciona uma baixa relação sinal-ruído. Uma intensidade de laser muito alta causará fotobranqueamento. Ajuste a intensidade do laser de acordo.
    3. Otimize o tamanho e as etapas da etapa: as etapas e o tamanho da etapa determinam quantas imagens serão obtidas em uma pilha Z. Tamanhos de passos menores e mais passos aumentarão a resolução da pilha Z, mas também aumentarão o fotobranqueamento. Neste experimento, o tamanho do passo de 1 μm foi usado para as células com ~15 μm de altura celular.
    4. Otimizar o tempo de exposição: O tempo de exposição determina quanto tempo a célula ficará exposta ao laser de excitação. Um baixo tempo de exposição diminuirá a relação sinal-ruído. Um alto tempo de exposição causará fotobranqueamento. Um tempo de exposição de 1 quadro por 4 s foi utilizado neste experimento.
    5. Otimização dos parâmetros de imagem: Altere um dos quatro parâmetros iterativamente e mantenha os outros parâmetros consistentes. A cada vez, meça a relação YAP N/C de cada imagem e compare a mudança da relação YAP N/C para determinar o nível de fotobranqueamento. Repita o processo de otimização até obter um equilíbrio entre a relação sinal-ruído, a velocidade da imagem e o fotobranqueamento.
    6. Defina as configurações de imagem usando os parâmetros de imagem otimizados para configurações de imagem mais rápidas durante os experimentos.
      NOTA: As configurações utilizadas neste estudo estão descritas na secção 5.3 dos parâmetros de imagiologia. Para otimizar os parâmetros de imagem das configurações na seção 5.3, use o mesmo método da etapa 5.2.5.
  3. Aplicação de força pequena e imagem confocal
    NOTA: O microscópio Nikon Ti2-E foi usado para imagens neste estudo, e as etapas detalhadas para a aquisição de imagens são dadas abaixo.
    1. Abra o microscópio invertido. Abra o aplicativo de software Elements.
    2. Defina magnetic_find de configuração. Verifique apenas o canal FITC. Defina PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidade do laser = 10. Defina a velocidade de digitalização para 1 quadro por 2 s clicando no botão 1/2 . Defina o tamanho do orifício para 1,2 UA clicando no botão 1,2 UA . Essa configuração será usada na etapa 5.3.5.
    3. Defina magnetic_YAP_Nucleus de configuração. Verifique o canal FITC. Defina PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidade do laser = 10. Defina a velocidade de digitalização para 1 quadro por 4 s clicando no botão 1/2 . Defina o tamanho do orifício para 1,2 UA clicando no botão 1,2 UA . Para obter a imagem do limite do núcleo e da intensidade da mancha nuclear, verifique o canal Cy5. Defina PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidade do laser = 10. O tamanho do orifício é otimizado para imagens 3D YAP. Não clique no botão 1.2 A.U . novamente depois de verificar o canal Cy5. Essa configuração será usada na etapa 5.3.7.
    4. Ative o DIA por meio do Elements, se necessário. Abra o SpinView, use um campo brilhante e ajuste o foco do objeto para obter uma imagem clara em foco das células. Use um objetivo de 10x para encontrar várias células únicas apropriadas em três condições: com uma única microesferas dentro, com várias microesferas dentro e sem nenhuma microesferas dentro. Mude para o objetivo de 40x. Nomeie esta posição com o número de posição apropriado.
    5. Elementos abertos. Clique em magnetic_find. Clique no botão Remover intertravamento.
    6. Clique em Digitalizar e ajuste a posição Z do plano focal. Clique nos botões Superior e Inferior para definir o limite inferior e superior para a pilha Z das células selecionadas. Pare a varredura clicando em Verificar novamente.
    7. Alterne para a configuração magnetic_YAP_Nucleus . Defina o nome do arquivo como before_small_force.nd2. Clique no botão Executar com a pilha Z gravada.
    8. Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 46 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante. Confira o vídeo para confirmar que as microesferas mostram o deslocamento induzido pela força magnética.
    9. Repita as etapas 5.3.5-5.3.7; defina o nome do arquivo como after_small_force.nd2.
    10. Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Em seguida, abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 120 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante.
    11. Repita as etapas 5.3.5-5.3.7 e defina o nome do arquivo como before_large_force.nd2.
  4. Aplicação de grande força e imagem confocal
    1. Remova a tampa da câmara ambiente para permitir que o ímã atinja 13 mm acima do fundo da placa de Petri.
    2. Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 13 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante. Confira o vídeo para confirmar que as microesferas mostram o deslocamento induzido pela força magnética.
    3. Repita as etapas 5.3.5-5.3.7 e defina o nome do arquivo como after_large_force.nd2.
    4. Alterne para o caminho de luz direito e ative o DIA. Em seguida, abra o SpinView e clique no botão Gravação . Enquanto isso, gire o botão do dispositivo de movimento magnético para mover o ímã até 120 mm acima do fundo da placa de Petri. Salve a sequência de imagens ou o vídeo de campo brilhante.
    5. Repita as etapas 5.3.5-5.3.7; defina o nome do arquivo como retract_large_force.nd2.
    6. Feche a tampa da câmara ambiente.
  5. Repita as etapas 5.2 e 5.3 para vários campos de exibição para obter mais dados, se necessário.

6. Processamento de imagens e análise de dados

  1. Quantificação da relação N/C YAP
    1. Abra o Fiji ImageJ. Abra as imagens .nd2 tiradas na etapa 5.
    2. Clique em Analisar > Definir Medidas. Área de verificação, densidade integrada, valor cinza médio e descritores de forma.
    3. Use o canal Cy5 para identificar o núcleo. Clique em Seleções à mão livre para usar a ferramenta de seleção livre para delinear o núcleo. Além disso, verifique a macro de máscara nuclear automática no ImageJ (consulte a Tabela de materiais).
    4. Clique em Analisar > Medir no canal FITC. O valor medido da Média é a intensidade média do YAP nuclear DN.
    5. Use o canal Cy5 para identificar o núcleo. Use o canal FITC para identificar a célula. Clique em Seleções à mão livre para usar a ferramenta de seleção livre para selecionar uma região de interesse dentro do citoplasma e evitar a microesferas magnéticas. Esta região de interesse não deve incluir o núcleo.
    6. Clique em Analisar > Medir no canal FITC. O valor medido da Média é a intensidade média citoplasmática do YAP DC.
    7. Calcule a razão YAP N/C = D N / DC.
  2. Quantificação da forma nuclear e intensidade da coloração nuclear normalizada
    1. Abra o Fiji ImageJ. Abra as imagens .nd2 tiradas na etapa 5.
    2. Clique em Analisar > Definir Medidas. Área de verificação, densidade integrada, valor cinza médio e descritores de forma.
    3. Use o canal Cy5 para identificar o núcleo. Clique em Seleções à mão livre para usar a ferramenta de seleção livre para delinear o núcleo.
    4. Clique em Analisar > Medir no canal Cy5. O valor medido da Média é a intensidade da mancha nuclear. O valor medido de Circ. é a circularidade nuclear.
    5. Para comparar a intensidade da mancha nuclear em diferentes estados de força, toda a intensidade da mancha nuclear é dividida pela intensidade da mancha nuclear em "before_small_force.nd2" para gerar a intensidade da mancha nuclear normalizada.

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Representative Results

Projeto de um dispositivo de movimento magnético e aplicação de força magnética
Para aplicar força no núcleo através das microesferas magnéticas, um dispositivo de movimento magnético foi projetado e construído para controlar a posição espacial do ímã. O dispositivo de movimento magnético contém uma estrutura central, três botões e trilhos para mover o ímã conectado nas direções x, y e z independentemente na resolução espacial de 1,59 mm por ciclo (Figura 1A). Uma vez que o ímã é movido para perto das microesferas de 7 μm entregues nas células (Figura 1B), ele atrai magneticamente as microesferas e aplica força no núcleo (Figura 1C). A direção e a magnitude da força são controladas pela posição relativa entre o ímã e as microesferas .

Neste trabalho, duas magnitudes de força diferentes foram aplicadas às microesferas: (1) uma força relativamente pequena quando o ímã foi colocado 46 mm acima da célula; e (2) uma força relativamente grande quando o ímã foi colocado 13 mm acima da célula. A força magnética aplicada à microesferas F pode ser calculada pela equação59: Equation 1, onde Nd é o fator de desmagnetização (0,33 para uma esfera), μ é a permeabilidade no vácuo (6,3 × 10-3 H/m para o ferro), Vp é o volume da microesfera (178 μm 3 para uma microesferas de 7 μm), e H é a intensidade do campo magnético com a unidade A/m. H é proporcional à densidade de fluxo magnético B com a unidade Tesla. Uma vez que se esperava que a força magnética que atuava sobre uma única microesferas de 7 μm fosse extremamente pequena e difícil de detectar por um transdutor de força, a densidade de fluxo magnético B como referência foi medida para indicar a magnitude da força magnética aplicada sobre as microesferas . Um sensor Hall foi introduzido no local do fundo da placa de Petri para medir a densidade do fluxo magnético, e o ímã foi colocado a uma distância de 13 mm ou 46 mm do fundo da placa de Petri. Como as microesferas de 7 μm influenciam o campo magnético, a densidade do fluxo magnético foi medida com e sem microesferas Independentemente da presença das microesferas de 7 μm, obteve-se a mesma densidade de fluxo magnético: B = 60,1 mT a uma distância de 13 mm e B = 3,7 mT a uma distância de 46 mm. Esta medida mostra que o efeito de microesferas de 7 μm sobre o campo magnético gerado pelo ímã cilíndrico com 12,7 mm de diâmetro e 12,7 mm de altura (ver Tabela de Materiais) não foi detectável pelo sensor Hall utilizado neste estudo. No entanto, a densidade do fluxo magnético no caso com uma distância de 13 mm foi cerca de 16 vezes maior do que a de 46 mm. A calibração experimental da força magnética é descrita na seção a seguir (Figura 6).

Entrega de microesferas magnéticas no citoplasma
12 h após a semeadura das células na placa de Petri com fundo de vidro, são adicionadas ao meio de cultura microesferas de 7 μm. As microesferas são internalizadas espontaneamente pelas células. Como as microesferas não emitem fluorescência sob excitação a laser no canal FITC ou Cy5, a localização das microesferas internalizadas pode ser identificada pela localização da cavidade escura com a imagem confocal de fluorescência de YAP e núcleo. Ambas as imagens 2D e 3D mostram que a microesfera está no citoplasma enquanto está fora do núcleo (Figura 2).

Os níveis de internalização das microesferas nas células dependem da duração da co-cultura de células e microesferas. Assim, as células foram categorizadas em três tipos de acordo com a quantidade de microesferas internalizadas - sem microesferas, microesferas únicas e multiesferas (Figura 3A). Às 7 h de cocultura, 62% das células internalizaram nenhuma microesfera, 15% das células internalizaram uma única microesferas e 23% das células internalizaram multimicroesferas (número total de células = 13). Às 12 h de cocultura, 53% das células internalizaram nenhuma microesfera, 26% das células internalizaram uma única microesferas e 21% das células internalizaram multimicroesferas (número total de células = 62). Em 24 h de cocultura, 20% das células internalizaram nenhuma microesfera, 28% das células internalizaram uma única microesferas e 53% das células internalizaram multimicroesferas (número total de células = 40) (Figura 3B).

Microesferas no citoplasma não influenciam a forma nuclear e a atividade do YAP
Para examinar o efeito da internalização de microesferas na forma nuclear e na atividade proteica, a forma nuclear foi primeiramente quantificada pela circularidade e a atividade YAP pela relação N/C YAP, respectivamente. A circularidade é calculada pela circularidade = 4μ (área/perímetro2). As etapas detalhadas para quantificar a relação YAP N/C foram descritas em publicação anterior60. Resumidamente, a relação N/C YAP foi calculada dividindo-se a intensidade média de YAP no núcleo pela intensidade média de YAP no citoplasma. Considerando a possibilidade de que a co-cultura de microesferas e células possa influenciar a forma nuclear mesmo que nenhuma microesfera seja internalizada, as células sem co-cultura (pontos pretos, controle #1, Circularidade = 0,806 ± 0,037, n = 20), células co-cultivadas com microesferas mas sem internalização (pontos cinzentos, controle #2, Circularidade = 0,806 ± 0,035, n = 22), células internalizando microesferas únicas (pontos vermelhos, microesferas únicas, Circularidade = 0,793 ± 0,048, n = 15) e células internalizando multi-microesferas (pontos azuis, multi-microesferas n = 7) (Figura 3C) foram comparadas. O resultado mostra que, entre os quatro grupos testados, a circularidade nuclear não apresentou diferença significativa (Figura 3C).

Em seguida, para examinar se a relação YAP N/C é influenciada pela internalização de microesferas, as células co-cultivadas com microesferas mas sem internalização (pontos cinzentos, controle #2, relação YAP N/C = 1,155 ± 0,074, n = 35) foram comparadas apenas com as células com internalização de microesferas únicas ou múltiplas (pontos vermelhos, célula com microesferas, relação YAP N/C = 1,140 ± 0,078, n = 36) na12ª hora de cocultura (Figura 3D). As células sem cocultura não foram comparadas, pois o prato com microesferas apresenta menor densidade celular, o que pode influenciar a relação N/CYAP 12. O resultado não mostra diferença significativa (valor de p = 0,667) na relação N/C YAP entre os dois grupos, indicando que a internalização das microesferas não influencia a atividade da APP (Figura 3D).

A força magnética deforma o núcleo
Primeiro, a deformação do núcleo é mostrada. A deformação do núcleo é causada pela força de compressão aplicada pelas microesferas (Figura 4A e Figura 4A1-3) em células que contêm citoesqueleto. Esses dados (ou seja, o núcleo sendo deformado pela compressão da microbead) sustentam que a microesferas está de fato aplicando uma força no núcleo no citoplasma lotado. Um vídeo de campo brilhante mostrando o processo de aplicação de força está incluído no material do suplemento (Vídeo Suplementar 1). Em segundo lugar, como é possível que a microesfera aplique simultaneamente força sobre o citoesqueleto circundante e deforme o núcleo indiretamente, os experimentos de compressão foram repetidos em células que possuem os filamentos de actina interrompidos (tratamento de Cyto D (2,5 μM, 1 h); Figura 4B). Este estudo mostra que os filamentos de actina são de fato despolimerizados (Figura 4B), e o núcleo é deformado pelas microesferas (Figura 4B1-3). Esses dados sustentam que as microesferas estão aplicando uma força diretamente no núcleo na ausência de citoesqueleto circundante entrelaçado. Coletivamente, esses dados mostram que os protocolos e ferramentas podem aplicar uma força diretamente no núcleo.

Controle espacial e temporal de microesferas magnéticas intracelulares
Para alcançar o controle espacial das microesferas foram utilizados um par de ímãs para mover a microesferas e controlar sua localização do recuo no núcleo (Figura 5A). O talão só pode ser movido com até 2,2 μm de deslocamento (Figura 5A1-4), mas pode aplicar indentação de forma flexível no núcleo nos locais correspondentes. O citoesqueleto de actina circundante pode restringir o movimento das microesferas. Portanto, o citoesqueleto da actina foi interrompido pelo tratamento com Cyto D (2,5 μM, 1 h), e a localização da microesferas foi manipulada, mas apresentou resultados semelhantes. Portanto, uma hipótese pode ser proposta: a microesferas pode se ligar física/quimicamente com o núcleo e outras organelas circundantes no citoplasma, o que restringe seu grande movimento espacial (>2,2 μm).

Para alcançar o controle espacial das microesferas foi utilizado um par de ímãs que controla as microesferas para aplicar e liberar a força duas vezes (com magnitude de força diferente) no mesmo local do núcleo (Figura 5B e Figura 5B1-B4). A duração do tempo atual para um ciclo de aplicação e liberação de força é de 12 s. A velocidade do controle temporal é determinada pela velocidade de operação do motor XYZ.

Calibração da força magnética
A força aplicada ao grânulo sobre o núcleo foi estimada medindo experimentalmente a força aplicada por uma microscopia de força atômica calibrada (AFM) que causa uma deformação semelhante do núcleo. Especificamente, o citoesqueleto de actina foi dissolvido pela primeira vez por CytoD (2,5 μM; 1 h, Figura 4B) porque o AFM aplica força na superfície apical da célula, e a remoção do córtex de actina e citoesqueleto permite um contato mais direto entre a ponta da AFM e o núcleo celular. As células que têm seu córtex de actina e citoesqueleto dissolvidos estão vivas com base na comparação da forma nuclear e da intensidade da coloração nuclear com as de células saudáveis (Figura Suplementar 1). Em segundo lugar, a ponta AFM não funcionalizada (semiesférica, raio = 5 μm) que tem um tamanho e forma semelhantes aos das microesferas foi usada para recuar a superfície apical da célula de forma controlada por força e, simultaneamente, adquirir imagens confocais 3D dos corpos celulares e nucleares (Figura 6A). A magnitude da força de compressão de 0,8 nN a 2,0 nN foi escolhida porque, com base na literatura24, sabe-se que a força de magnitude 1,5 nN deforma suficientemente o núcleo. Em terceiro lugar, a deformação normal do núcleo causada pelo recuo da AFM foi medida por meio de análise quantitativa de imagem. Também foi obtida a curva de calibração que fornece a relação quantitativa força-deslocamento do AFM (Figura 6B). Em quarto lugar, uma força compressiva foi aplicada à superfície lateral do núcleo, controlando microesferas que têm tamanho e forma semelhantes (raio = 7 μm; Figura 6C), e a deformação da membrana nuclear foi medida por meio de análise de imagem. A força aplicada por contas é estimada com base na relação força-deslocamento AFM.

Por exemplo, na Figura 6C, a deformação do núcleo causada por microesferas magnéticas (diâmetro = ~7 μm) em "grande força" é de cerca de 1,5 μm. Na Figura 6D, uma ponta AFM que possui uma sonda semisférica de 5 μm foi usada para recuar a célula no topo do núcleo para atingir 1,5 μm de deformação nuclear. A força correspondente registrada pelo AFM é de 1,4 nN. Assim, a força aplicada pelas microesferas é estimada em ~1,4 nN. Seguindo a mesma abordagem, a força magnética em "pequena força" é calibrada como 0,8 nN, e causou 0,4 μm de indentação nuclear.

Este estudo considera que a força medida por AFM pode representar a força aplicada por microesferas com base nas seguintes suposições: (1) A rigidez do núcleo dentro de diferentes células é semelhante. (2) As propriedades mecânicas do núcleo não dependem das instalações nucleares em que o recuo foi aplicado. A força magnética é aplicada horizontalmente nos lados laterais do núcleo, enquanto a força AFM é aplicada verticalmente nos lados apicais do núcleo. A diferença mecânica entre eles é assumida como insignificante. (3) Em experimentos de AFM, a sonda está aplicando diretamente força através da membrana celular e do citoesqueleto no núcleo. Depois de interromper os filamentos de actina, a força aplicada por AFM no núcleo é semelhante à força aplicada por microesferas no núcleo, apesar da membrana ainda estar localizada entre a sonda AFM e o núcleo no primeiro caso.

Força magnética desencadeia mudança da relação YAP N/C
Para provar que a força magnética aplicada sobre as microesferas pode deformar o núcleo e induzir a translocação YAP, a relação YAP N/C das células com internalização de microesferas foi quantificada em três estágios: (1) antes da aplicação da força, (2) após a aplicação da força e (3) após a liberação da força. Algumas células apresentaram mudança de forma nuclear e relação YAP N/C quando a força foi aplicada ou liberada (Figura 7A,C). As mudanças de intensidade no YAP podem ser atribuídas por dois mecanismos possíveis: (1) as proteínas YAP-FP translocam do citoplasma para o núcleo após a aplicação da força. Neste caso, a coloração nuclear não deve mostrar alterações de sinal. A intensidade da coloração nuclear não deve mudar muito; (2) As proteínas YAP-FP não se translocam após a aplicação forçada. As mudanças de intensidade YAP observadas são devidas à mudança de volume nuclear induzida pela força e à mudança de concentração YAP-FP resultante. Neste caso, a intensidade da coloração nuclear deve mudar em uma tendência semelhante à intensidade nuclear do YAP, porque a concentração do corante de coloração também muda à medida que o volume do núcleo se altera. Portanto, a mudança de intensidade de coloração nuclear do canal vermelho (excitação: 650 nm; emissão: 681 nm) foi medida. A intensidade muda no YAP no canal verde, mas não há mudanças de intensidade na coloração do núcleo no canal vermelho. Assim, o primeiro mecanismo provavelmente existe (Figura 7B). Coletivamente, os resultados mostram que a deformação nuclear induzida pela força magnética desencadeia a translocação YAP.

Em seguida, a variação líquida da relação YAP N/C foi quantificada dentro de dois grupos de células: (1) células sem microesferas internalizadas (pontos cinzentos, controle, n = 9); e (2) células selecionadas com microesferas internalizadas que mostram mudança da relação N/C YAP (pontos verdes para força pequena, pontos vermelhos para força grande, n = 11). Com força de 0,8 nN, as células com microesferas internalizadas apresentam variação líquida da relação YAP N/C = -0,030 ± 0,029, n = 11; as células de controle mostram variação líquida da relação YAP N/C = -0,003 ± 0,012, n = 9. Com força de 1,4 nN, as células com microesferas internalizadas apresentam variação líquida da relação YAP N/C = 0,011 ± 0,040, n = 11; as células de controle mostram a variação líquida da relação YAP N/C = 0,005 ± 0,005, n = 9 (Figura 8A). Com força de 0,8 nN, as células com microesferas internalizadas apresentam variação da relação YAP N/C líquida absoluta = 0,057 ± 0,017, n = 11; as células de controle mostram a mudança líquida da relação YAP N/C = 0,021 ± 0,007, n = 9. A diferença é significativa (valor de p = 0,0093, **). Com força de 1,4 nN, as células com microesferas internalizadas apresentam variação da relação YAP N/C líquida absoluta = 0,070 ± 0,020, n = 11; as células de controle mostram variação líquida da relação YAP N/C = 0,010 ± 0,003, n = 9. A diferença é significativa (valor de p = 0,0007, ***) (Figura 8B). Juntos, esses resultados corroboram que a força magnética aplicada às microesferas dentro do citoplasma pode, de fato, induzir a translocação de YAP e alterar a relação N/C YAP.

Figure 1
Figura 1: Projeto do dispositivo móvel magnético e aplicação de força esquemática na célula por microesferas magnéticas . (A) Esquema tridimensional do dispositivo implementado para segurar o ímã e movê-lo nas direções x, y e z. O dispositivo consiste em uma base de 241,3 mm de largura e 104,1 mm de altura, dois botões, uma barra e um ímã. Os botões serão estriados na direção correta de rotação da operação, o que fornecerá movimento na direção correspondente. O ímã será abaixado mais perto / levantado ainda mais do prato para aplicar força magnética com diferentes magnitudes e direções em microesferas magnéticas. (B) Imagem de microscópio eletrônico de varredura (MEV) de 7 μm de microesferas de ferro. (C) As microesferas magnéticas entregues dentro do citoplasma podem aplicar força às organelas, como o núcleo, quando um campo magnético é aplicado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens representativas mostrando microesferas magnéticas (oco preto apontado pela seta azul) é internalizado na célula (indicado pelo YAP) e fora do núcleo. (A) Seção transversal X-Y de uma célula de YAP (verde), núcleo (vermelho) e campo brilhante. (B) Reconstrução 3D da célula. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: As microesferas internalizadas pelas células não afetam a forma nuclear e a relação YAP N/C . (A) Imagens representativas de campo brilhante e fluorescência de células sem microbead, microesferas únicas e internalização de multimicroesferas . As setas azuis indicam a posição das microesferas dentro do citoplasma. (B) Às 7 h (n = 13), 12 h (n = 62) e 24 h (n = 40) de cocultura, a porcentagem de células que não apresentaram internalização de microesferas, microesferas únicas e multimicroesferas . (C) A circularidade nuclear não mostra diferença significativa entre as células de controle e as células com internalização de microesferas. Controle #1 (sem cocultura de microesferas): Circularidade = 0,806 ± 0,037, n = 20; Controle #2 (com cocultura de microesferas, sem internalização de microesferas): Circularidade = 0,806 ± 0,035, n = 22; Internalização de microesferas únicas: Circularidade = 0,793 ± 0,048, n = 15; internalização de multi-microesferas: Circularidade = 0,780 ± 0,061, n = 7. (D) A relação N/C YAP não mostrou diferença significativa (valor de p = 0,667) entre células controle (com cocultura de microesferas sem internalização de microesferas e razão N/C YAP = 1,155 ± 0,074, n = 35) e células com internalização de microesferas (relação YAP N/C = 1,140 ± 0,078, n = 36). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Aplicação de força direta no núcleo com e sem filamentos de actina. (A) As células mostram filamentos de actina (amarelo). (A1) Imagem do núcleo quando nenhuma força é aplicada. (A2) Imagem do núcleo após a aplicação da força. (A3) A imagem de sobreposição da fronteira nuclear antes e depois da aplicação da força mostra o recuo nuclear. (B) As células apresentam filamentos de actina interrompidos (amarelo) após o tratamento com Cyto D (2,5 μM, 1 h). (B1) Imagem do núcleo quando nenhuma força é aplicada. (B2) Imagem do núcleo após a aplicação da força. (B3) A imagem de sobreposição do limite nuclear antes e depois da aplicação da força mostra o recuo nuclear com o citoesqueleto de actina interrompido. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Controle espacial e temporal da microesferas magnéticas intracelulares. (A) Um par de ímãs controla espacialmente a microesferas magnéticas. (A1) Imagem de campo brilhante do limite celular (linha verde), limite nuclear (linha vermelha) e microesferas magnéticas (linha amarela) na posição 1. (A2) A microesferas magnéticas recua o núcleo na posição 1. (A3) A microesferas magnéticas é movida para a posição 2 (linha amarela). A posição 1 é mostrada como uma referência (linha tracejada amarela). (A4) A microesferas magnéticas recua o núcleo na posição 2. (B) Um par de ímãs controla temporalmente a microesferas magnéticas. (B1) Imagem de campo brilhante de uma célula sem força aplicada no ponto de tempo I. (B2) A microesferas magnéticas aplica uma força no núcleo no ponto de tempo II. (B3) A microesferas magnéticas libera a força do núcleo no ponto de tempo III. (B4) A microesferas magnéticas aplica uma força maior no núcleo no ponto de tempo IV. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6. Calibração da força aplicada por microesferas no núcleo usando indentação AFM. (A) Ilustração esquemática do processo de calibração. A microesferas magnéticas aplica compressão horizontal no núcleo (à esquerda) e a sonda AFM recua verticalmente no núcleo. (B) Força de recuo AFM vs. deformação nuclear. (C) Imagem representativa da deformação do núcleo (1,5 μm) antes e após a aplicação da força por microesferas magnéticas. (D) Imagem representativa de deformação de núcleo semelhante (1,5 μm) antes e após o recuo da AFM com força de 1,4 nN. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Dados representativos mostrando que a mudança de relação YAP N/C é induzida pela aplicação e liberação de força magnética. (A) Seção transversal X-Y da imagem fluorescente YAP (verde) e núcleo (vermelho) da célula sem força, força sobre e força para fora. Na condição de força-on, a intensidade citoplasmática de YAP diminui no local apontado por uma seta amarela, enquanto a intensidade de YAP nuclear aumenta. A relação N/C YAP aumenta. (B) A relação N/C YAP aumenta quando a força liga (de 1,0791 para 1,2327) e diminui quando a força é desligada (de 1,2327 para 1,1548). A intensidade da coloração nuclear normalizada mostra pequena alteração com a aplicação da força (1,00117) e liberação (0,95578). (C) Seção transversal X-Z da imagem YAP (verde) e núcleo (vermelho) da célula sem força, força ligada e desativada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Mudança da relação YAP N/C induzida pela aplicação de força magnética. (A) Na força de 0,8 nN, as células com microesferas internalizadas mostram mudança líquida da relação YAP N/C = -0,030 ± 0,029, n = 11; as células de controle mostram variação líquida da relação YAP N/C = -0,003 ± 0,012, n = 9. Com força de 1,4 nN, as células com microesferas internalizadas apresentam variação líquida da relação YAP N/C = 0,011 ± 0,040, n = 11; as células de controle mostram a mudança líquida da relação YAP N/C = 0,005 ± 0,005, n = 9. (B) Com força de 0,8 nN, as células com microesferas internalizadas apresentam variação da relação YAP N/C líquida absoluta = 0,057 ± 0,017, n = 11; as células de controle mostram a mudança líquida da relação YAP N/C = 0,021 ± 0,007, n = 9. A diferença é significativa (valor de p = 0,0093, **). Com força de 1,4 nN, as células com microesferas internalizadas apresentam variação da relação YAP N/C líquida absoluta = 0,070 ± 0,020, n = 11; as células de controle mostram variação líquida da relação YAP N/C = 0,010 ± 0,003, n = 9. A diferença é significativa (valor de p = 0,0007, ***) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1 suplementar: Forma nuclear e intensidade da coloração nuclear. (A) Sem tratamento com Cyto D, (B) Com tratamento com Cyto D e (C) Célula morta. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 1: Um vídeo de campo brilhante mostrando o processo de aplicação de força. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

A internalização das microesferas magnéticas (secção 2.2) é crítica porque as microesferas extracelulares não podem aplicar força diretamente ao núcleo. A aplicação de força e a imagem (secção 5.3) são etapas críticas nesta experiência, e a força necessária para deformar o núcleo e induzir consequências biológicas significativas pode ser dependente da amostra. A magnitude da força neste experimento (0,8 nN e 1,4 nN) pode ser aumentada ainda mais para desencadear a detecção de mecano nuclear em células menos sensíveis.

Para aplicar a força magnética de forma quantitativa com alto rendimento, a internalização de uma única microesferas é uma abordagem ideal. Neste estudo, a porcentagem de células com internalização de microesferas únicas foi semelhante em 12 h (26%) e 24 h (28%), enquanto as células sem internalização de microesferas foram maiores em 12 h (53%) do que em 24 h (20%) (Figura 3B). Considera-se que 12 h é o momento ideal para o experimento de aplicação forçada, porque mais microesferas únicas podem ser incluídas e as células podem ser controladas. Para diferentes linhagens celulares e tamanhos de microesferas, o tempo de co-cultura e a concentração de microesferas devem ser testados para determinar as condições ideais correspondentes.

Nos experimentos, as microesferas não foram revestidas para se ligarem especificamente ao núcleo. Portanto, a força transmitida diretamente das microesferas para o núcleo é provavelmente apenas compressiva. Os resultados mostram que a relação N/C YAP aumenta e diminui a população celular (Figura 8A). Uma possível razão é que a força magnética aplicada através das microesferas pode causar alteração de tensão positiva ou negativa dentro do citoesqueleto e regular a relação YAP N/C para aumentar ou diminuir, respectivamente28. Pesquisas anteriores mostram que a força compressiva sobre o núcleo induz um aumento na relação N/CYAP 28. Em experimentos futuros, a fim de estudar a detecção direta de força do núcleo, o citoesqueleto pode ser interrompido para eliminar a transmissão de força do citoesqueleto para o núcleo.

Existem duas desvantagens potenciais nos métodos atuais. Primeiramente, nesses experimentos, o motor 3D (Figura 1A) foi utilizado para ajustar o movimento das contas, que é monitorado por imagens confocais em tempo real e tem como objetivo aplicar uma força compressiva sobre o núcleo. No entanto, devido à natureza escorregadia da membrana nuclear e ao ambiente complexo no citoplasma, a direção da força aplicada pelas contas pode não ser puramente compressiva (ou seja, não absolutamente perpendicular à superfície da membrana nuclear). Essa imperfeição pode fazer com que uma força de cisalhamento seja aplicada à membrana nuclear. Em segundo lugar, as microesferas atuais usadas neste estudo não são conjugadas com o anticorpo para se ligar ao núcleo, porque a mobilidade espacial das esferas é crítica no experimento atual para demonstrar a vantagem do atuador magnético sem contato. Assim, o método atual não pode aplicar tensão à membrana nuclear.

No futuro, (1) esferas com anticorpo anti-nesprina-1 serão conjugadas para se ligarem especificamente ao núcleo. Isso pode garantir a transmissão direta e específica de força entre as microesferas e as proteínas-alvo. (2) A direção da força será calibrada pela manipulação da única microesferas magnéticas em hidrogel macio embutido com esferas fluorescentes. O deslocamento 3D de esferas fluorescentes pode ser usado para calcular o campo de deformação do hidrogel e determinar a direção da força em função do campo magnético aplicado. Depois que a microesfera é quimicamente ligada ao núcleo, a aplicação de uma força com uma direção conhecida determinará o tipo de força (tensão, compressão ou cisalhamento). (3) A imagem 3D da coloração nuclear será usada para construir um modelo FEM de simulação 3D do núcleo. A direção da força pode ser verificada comparando a deformação nuclear antes e depois da aplicação da força magnética.

A técnica única desenvolvida neste estudo fornece várias vantagens potenciais: (1) Em comparação com o recuo vertical por sondas AFM, as microesferas magnéticas podem aplicar força em qualquer direção. Células cultivadas em superfícies de substrato 2D podem ter distribuição e orientação proteicas heterogêneas em suas superfícies verticais e horizontais da membrana plasmática e do envelope nuclear. A aplicação de força horizontalmente pode induzir respostas de detecção de mecano não observadas anteriormente. (2) Uma vez que as microesferas são funcionalmente revestidas para se ligar aos núcleos, as forças de empurrar e puxar podem ser aplicadas diretamente no núcleo para estudar mais profundamente o sensoriamento mecânico nuclear diferencial devido às direções de força distintas. (3) Ao controlar a ligação específica das microesferas a determinadas proteínas do envelope nuclear, podem ser elucidados mecanismos de detecção da força nuclear anteriormente pouco investigados. Evidências emergentes mostram que o núcleo é provavelmente um mecano-sensor36, e o mechano-sensing nuclear é o regulador mais direto da translocação YAP28. O mecanismo de translocação YAP regulado por energia nuclear é estudado ativamente e vários candidatos a mecanismo-sensor ou parâmetros no núcleo são propostos, incluindo o tamanho do poro nuclear28, a forma nuclear 25,61, o complexo LINC e a tensão do envelope nuclear20. A manipulação das microesferas magnéticas abre a possibilidade de exploração detalhada de tais mecanismos por aplicação de força direta no complexo LINC e regula controladamente a tensão e a forma do envelope nuclear. (4) Além de aplicar forças no núcleo, as microesferas também são adequadas para serem projetadas para se ligarem ao lado interno da membrana plasmática para revelar como os domínios intracelulares das proteínas da membrana e seu complexo respondem a sinais biofísicos.

Em resumo, este trabalho demonstrou um método que (1) fornece microesferas de ferro de tamanho micro no citoplasma sem afetar a morfologia nuclear e as funções proteicas, (2) aplica força no núcleo por microesferas magnéticas e (3) realiza imagens de células vivas de fluorescência confocal durante a aplicação da força. Essas ferramentas não invasivas abrem as possibilidades de manipulação epigenética direta de organelas em células únicas, interrogação baseada em imagens de superresolução da mecanotransdução do núcleo e exploração detalhada da organização cromossômica 3D regulada pela força (em combinação com Hi-C: captura de confirmação cromossômica de alta resolução) e reprogramação nos contextos da fisiologia celular e da biologia.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Este projeto é financiado pelo UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), o UFHCC Pilot Award (X. T. e Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) e UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Agradecemos sinceramente as discussões intelectuais e o apoio técnico do Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurocirurgia), Dr. Tian He (Universidade de Harvard), Dr. Youhua Tan (Universidade Politécnica de Hong Kong), Dr. Jessie L-S Au (Instituto de Farmacologia de Sistemas Quantitativos), Dr. David Hahn (Universidade do Arizona), e Equipe de Suporte da Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon e Jon Ekman). Estamos profundamente gratos pelo apoio efetivo de todos os membros dos laboratórios de pesquisa de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann e Guan e todos os membros da equipe do Departamento de MAE da UF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 % Trypsin Corning 25-051-CI
25 cm2 flask Corning 156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads N/A N/A
A1R confocal system Nikon
Carbonyl Iron Powder CM BASF 30042253 Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640) Gibco 11875093
Desktop Computer Dell with Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZB Tokai Hit TIZB
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140
Fiji ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dish MatTek P35G-1.5-14-C
Magnet K&J Magnetics, Inc. D99-N52
Monochrome Camera FLIR BFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platform Nikon software platform
Nucleus mask ImageJ macro https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650 Biotium #40082 Nuclear stain
Penicillin-streptomycin Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Ti2-E inverted microscope Nikon
XYZ mover (CAD files) https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Combinando o Atuador de Força Magnética 3D e a Imagem de Fluorescência Multifuncional para Estudar a Mecanologia do Núcleo
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Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., … More

Huang, M., Wang, H., Delgado, A. A., Reid, T. A., Long, J., Wang, S., Sussman, H., Guan, J., Yamaguchi, H., Tang, X. Combining 3D Magnetic Force Actuator and Multi-Functional Fluorescence Imaging to Study Nucleus Mechanobiology. J. Vis. Exp. (185), e64098, doi:10.3791/64098 (2022).

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