Deze studie presenteert een nieuw protocol om direct mechanische kracht uit te oefenen op de celkern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren.
Een fundamentele vraag in de mechanobiologie is hoe levende cellen extracellulaire mechanische stimuli waarnemen in de context van celfysiologie en pathologie. De cellulaire mechano-sensatie van extracellulaire mechanische stimuli wordt verondersteld zich te bevinden via de membraanreceptoren, het bijbehorende eiwitcomplex en het cytoskelet. Recente ontwikkelingen in de mechanobiologie tonen aan dat de celkern in het cytoplasma zelf onafhankelijk mechanische stimuli tegelijkertijd kan waarnemen. Een mechanistisch begrip van hoe de celkern mechanische stimuli detecteert, transduceert en erop reageert, ontbreekt echter, voornamelijk vanwege de technische uitdagingen bij het openen en kwantificeren van de kernmechanica met conventionele hulpmiddelen. Dit artikel beschrijft het ontwerp, de fabricage en de implementatie van een nieuwe magnetische krachtactuator die nauwkeurige en niet-invasieve 3D-mechanische stimuli toepast om de celkern direct te vervormen. Met behulp van CRISPR/Cas9-engineered cellen toont deze studie aan dat deze tool, in combinatie met hoge resolutie confocale fluorescerende beeldvorming, de onthulling mogelijk maakt van de real-time dynamiek van een mechano-gevoelig yes-associated protein (YAP) in enkele cellen als functie van kernvervorming. Deze eenvoudige methode heeft het potentieel om de huidige technologische kloof in de mechanobiologiegemeenschap te overbruggen en antwoorden te bieden op de kenniskloof die bestaat in de relatie tussen nucleusmechanotransductie en celfunctie.
Deze studie heeft tot doel een nieuwe techniek te ontwikkelen en toe te passen om kernmechanobiologie op te helderen door de magnetische actuatoren die mechanische kracht rechtstreeks op de celkern uitoefenen te combineren met de confocale fluorescentiemicroscopie die tegelijkertijd de structurele en functionele subcellulaire veranderingen in beeld brengt. Cellen detecteren extracellulaire biofysische signalen, waaronder weefselstijfheid 1,2,3,4, interstitiële vloeistofdruk en schuifspanning 5,6,7, oppervlaktetopologie/geometrie 8,9,10,11,12 en spanning/compressiespanning 13,14, 15,16. Biofysische signalen worden omgezet in biochemische signalen en veroorzaken potentiële stroomafwaartse veranderingen van genexpressie en celgedrag – een proces dat bekend staat als mechanotransductie 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Om mechanotransductieprocessen te bestuderen, zijn talloze technieken ontwikkeld om mechanische kracht op de cellen uit te oefenen, zoals atoomkrachtmicroscopie28, celrekapparaat29, bio-MEMS (micro-elektromechanische systemen) krachtsensor 15,30,31, afschuifreologie 32 en Stereo Vision System33 . Een recente review vat de benaderingen samen om extracellulaire mechanische signalen toe te passen en te interfereren met mechanosensing34. Tot op heden oefenen de meeste van deze methoden kracht uit op het celplasmamembraan en cellen ontvangen deze extracellulaire biofysische signalen rechtstreeks via membraanreceptoren zoals integrine, cadherine, ionkanalen en G-eiwit-gekoppelde receptoren. Vervolgens geven ze het signaal door aan het intracellulaire cytoskelet en de kern. Bijvoorbeeld, met behulp van yes-associated protein (YAP) translocatie als een indicator van mechano-sensing, wordt aangetoond dat cellen de mechanische signalen van substraatstijfheid en extracellulaire spanning van het celmembraan detecteren en deze via het cytoskelet naar de kern overbrengen om YAP-cytoplasma-naar-kerntranslocatie te induceren28,35.
Recent bewijs suggereert dat de celkern zelf een onafhankelijke mechano-sensoris 8,36,37. Dit wordt bewezen door experimenten uitgevoerd op de geïsoleerde kern geoogst uit cellen, waar werd onthuld dat kernen adaptief hun stijfheid veranderen als reactie op de mechanische kracht die direct op hen wordt uitgeoefend36. Tijdens veel fysiologische omstandigheden voelen kernen in zowel tumor- als gezonde cellen extracellulaire biofysische signalen en veranderen hun mechanische eigenschappen en assemblages 38,39,40. Bijvoorbeeld, bij extravasatie neemt de nucleaire stijfheid van tumorcellen af en handhaaft de zachtheid gedurende meer dan 24 h38. Tijdens de migratie door de besloten interstitiële ruimte verliezen en herstellen de kernen van tumorcellen vaak hun structurele integriteit39. De manier waarop de kern het biofysische signaal waarneemt, is echter onbekend, hoewel verschillende nucleaire enveloppe-eiwitten en families van eiwitten betrokken zijn gebleken, zoals Lamin A / C en linker van nucleoskelet en cytoskelet (LINC) complex38,41. Vandaar dat nieuwe niet-invasieve methoden die direct kracht kunnen uitoefenen op de kern het effect van krachtoverdracht van het cel-plasmamembraan en cytoskelet zullen loskoppelen en zullen helpen de voorheen ontoegankelijke moleculaire mechanismen van nucleaire mechano-detectie op te helderen.
Onderzoek waarbij optische pincetten werden gebruikt om organellen42 te manipuleren en microbeads geïnjecteerd in cellen43 toonde het technologische vermogen aan om direct kracht uit te oefenen op de kern. De optische pincettechniek heeft echter verschillende beperkingen: (1) optische pincetten met lage doorvoer manipuleren vaak maar één cel of microbead tegelijk; en (2) potentiële fotoschade en temperatuurartefact-vervorming van kernenergie vereist tientallen pN36, en het overeenkomstige benodigde laservermogen is ongeveer 10 mW per pN 44,45. Een dergelijke laserintensiteit is voldoende om fotoschade in de cellen te veroorzaken en de functies van de perturbcel tijdens het experimentte verstoren 46.
Magnetische kracht toegepast door microbeads in levende cellen toont het potentieel om direct kracht uit te oefenen op de kern en overwint de beperkingen van optische pincetten. Zodra microbeads in het cytoplasma worden afgeleverd, kan een magnetisch veld een magnetische kracht uitoefenen op meerdere microbeads tegelijkertijd op een manier met hoge doorvoer. Het magnetisch veld beïnvloedt de celfuncties niet47, maar genereert kracht van pN naar nN, wat voldoende is om nucleaire vervorming te induceren 36,48,49. Tot op heden is manipulatie van magnetische microbeads toegepast op celplasmamembraan48, in het cytoplasma50, op F-actine51, in de kern47 en op de geïsoleerde kern36. Magnetische manipulatie van microbeads is echter nooit gebruikt om directe mechanische kracht op de nucleaire envelop toe te passen om mechanotransductie in de kern te bestuderen.
In dit artikel wordt een eenvoudige techniek ontwikkeld om niet-invasief magnetische microbeads in het cytoplasma af te leveren en deze microbeads te gebruiken om mechanische kracht op de kern uit te oefenen (figuur 1). Hier worden CRISPR / Cas9-engineered menselijke normale B2B-cellijnen gebruikt die endogeen mNeonGreen21-10 / 11-gelabelde YAP uitdrukken om de methode te valideren. YAP is een mechano-gevoelig eiwit en de translocatie van YAP wordt gereguleerd door nucleaire mechano-sensing14,28. De CRISPR/Cas9-gereguleerde knock-in benadering werd gekozen om endogene YAP te taggen met een fluorescerend eiwit (FP) mNeonGreen21-10/11. Hoewel bekend is dat CRISPR-bewerking onvolledige efficiëntie en off-target effect heeft, integreerden de protocollen in eerdere publicaties fluorescentiesortering om te selecteren op correcte open leesframe-invoeging 52,53,54. Met deze extra selectielaag werd geen off-target tagginggebeurtenis waargenomen in meer dan 20 cellijnen die eerder52,53,54,55 genereerden. Dit is een gesplitst fluorescerend eiwitconstruct, maar in principe zou elke expresseerbare fluorescerende tag bruikbaar kunnen zijn. Deze etiketteringsbenadering is superieur aan transgene- of antilichaammethoden. Ten eerste, in tegenstelling tot de transgene expressie, handhaaft het getagde eiwit single-copy gendosering en expressie in de fysiologische context van het inheemse gen regulerende netwerk, waardoor afwijkingen in eiwitconcentratie, lokalisatie en interactie worden beperkt. De taggingmethode die in deze studie wordt gebruikt, bereikt een orde van grootte hogere doorvoer en efficiëntie dan volledige FP-tagging. Het vermijdt ook uitdagingen in verband met immunofluorescentie als gevolg van fixatieartefacten en de beperkte beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen met hoge specificiteit. Ten tweede zorgt de benadering die in dit artikel wordt gebruikt voor minimale verstoring van de celfysiologie en maakt de real-time openbaring van alle endogene YAP’s op authentieke wijze mogelijk. Andere gangbare transgene methoden leiden daarentegen vaak tot overexpressie van YAP. De resulterende kunstmatige distributie kan mogelijk cytotoxiciteit veroorzaken en de mechano-detectie van cellen beïnvloeden 56,57,58.
Deze studie presenteert een protocol om direct kracht uit te oefenen op de kern door middel van magnetische microbeads die in het cytoplasma worden afgeleverd en om gelijktijdige live-cell fluorescerende beeldvorming uit te voeren. Samenvattend laten de hier gepresenteerde protocollen zien hoe (1) magnetische microbeads in de cel kunnen worden afgeleverd terwijl ze zich buiten de kern bevinden, (2) de microbeads manipuleren om magnetische kracht op de kern uit te oefenen, (3) confocale fluorescerende beeldvorming van de cellen uitvoeren tijdens manipulatie, en (4) kwantitatief de YAP-verhouding tussen nucleair en cytoplasma (N / C) analyseren tijdens het krachttoepassingsproces. De resultaten suggereren dat (1) door endocytose magnetische microbeads niet-invasief kunnen worden afgeleverd in het cytoplasma van B2B-cellen binnen 7 uur (figuur 2 en figuur 3); en (2) gekwantificeerde magnetische kracht die rechtstreeks op de kern wordt uitgeoefend (figuur 4, figuur 5 en figuur 6) alleen kan leiden tot diverse veranderingen in de YAP N/C-verhouding in CRISPR/Cas9-gemanipuleerde B2B-cellen (figuur 7 en figuur 8).
Internalisatie van magnetische microbeads (sectie 2.2) is van cruciaal belang omdat extracellulaire microbeads niet rechtstreeks kracht kunnen uitoefenen op de kern. Krachttoepassing en beeldvorming (paragraaf 5.3) zijn kritieke stappen in dit experiment en de kracht die nodig is om de kern te vervormen en zinvolle biologische gevolgen te veroorzaken, kan steekproefafhankelijk zijn. De krachtmagnitude in dit experiment (0,8 nN en 1,4 nN) kan verder worden verhoogd om nucleaire mechano-detectie in minder gevoelige cellen …
The authors have nothing to disclose.
Dit project wordt gefinancierd door UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), de UFHCC Pilot Award (X. T. en Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) en UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). We waarderen oprecht de intellectuele discussies met en de technische ondersteuning van Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE &ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurochirurgie), Dr. Tian He (Harvard University), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Polytechnic University), Dr. Jessie L-S Au (Institute of Quantitative Systems Pharmacology), Dr. David Hahn (Universiteit van Arizona), en ondersteuningsteam van Nikon (Drs. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon en Jon Ekman). We zijn zeer dankbaar voor de effectieve steun van alle leden van Tang’s, Yamaguchi’s, Sharma’s, Au’s, Siemann’s en Guan’s onderzoekslaboratoria en alle medewerkers van de UF MAE-afdeling.
0.05 % Trypsin | Corning | 25-051-CI | |
25 cm2 flask | Corning | 156340 | |
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeads | N/A | N/A | |
A1R confocal system | Nikon | ||
Carbonyl Iron Powder CM | BASF | 30042253 | Magnetic microbead |
Culture medium (RPMI-1640) | Gibco | 11875093 | |
Desktop Computer | Dell | with Windows 10 operating system | |
Environmental chamber TIZB | Tokai Hit | TIZB | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140 | |
Fiji ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Glass-bottom petri dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Magnet | K&J Magnetics, Inc. | D99-N52 | |
Monochrome Camera | FLIR | BFS-U3-70S7M-C | |
NIS-Elements software platform | Nikon | software platform | |
Nucleus mask ImageJ macro | https://github.com/KOLIUG/Nuclear mask | ||
NucSpot Live 650 | Biotium | #40082 | Nuclear stain |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010023 | |
Ti2-E inverted microscope | Nikon | ||
XYZ mover (CAD files) | https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover |