Summary
Este protocolo detalha o estabelecimento de enteróides, um modelo intestinal tridimensional, a partir do tecido intestinal fetal. Imagens imunofluorescentes de biomarcadores epiteliais foram utilizadas para caracterização do modelo. A exposição apical de lipopolissacarídeos, uma endotoxina bacteriana, utilizando a técnica de microinjeção induziu a permeabilidade epitelial de forma dose-dependente medida pelo vazamento de dextrano fluorescente.
Abstract
Os enteróides derivados do tecido fetal humano estão emergindo como um modelo in vitro promissor para estudar lesões intestinais em bebês prematuros. Os enteróides exibem polaridade, consistindo de um lúmen com uma borda apical, junções apertadas e uma camada externa basolateral exposta a meios de crescimento. As consequências das lesões intestinais incluem inflamação da mucosa e aumento da permeabilidade. Testar a permeabilidade intestinal em seres humanos prematuros vulneráveis muitas vezes não é viável. Assim, um modelo intestinal in vitro derivado de tecido fetal é necessário para estudar lesões intestinais em prematuros. Os enteróides podem ser usados para testar alterações na permeabilidade epitelial regulada por proteínas de junção apertada. Nos enteróides, as células-tronco intestinais se diferenciam em todos os tipos de células epiteliais e formam uma estrutura tridimensional em uma matriz de membrana basal secretada por células de sarcoma de camundongo. Neste artigo, descrevemos os métodos utilizados para estabelecer enteroides a partir do tecido intestinal fetal, caracterizando as proteínas da junção apertada enteróide com imagens imunofluorescentes e testando a permeabilidade epitelial. Como a disbiose bacteriana dominante gram-negativa é um conhecido fator de risco para lesão intestinal, utilizamos o lipopolissacarídeo (LPS), uma endotoxina produzida por bactérias gram-negativas, para induzir a permeabilidade nos enteróides. O dextrano marcado com fluoresceína foi microinjetado no lúmen enteróide, e as concentrações seriadas de dextrano vazadas para o meio de cultura foram medidas para quantificar as alterações na permeabilidade paracelular. O experimento mostrou que a exposição apical ao LPS induz a permeabilidade epitelial de maneira dependente da concentração. Esses achados reforçam a hipótese de que a disbiose dominante gram-negativa contribui para o mecanismo de lesão intestinal em prematuros.
Introduction
Bebês prematuros são expostos a inflamações frequentes e prolongadas que os colocam em maior risco de lesão intestinal, resultando em incapacidade ou morte a longo prazo1. A pesquisa nesta área é desafiada pela capacidade limitada de realizar experimentos em bebês prematuros vulneráveis. Além disso, a falta de modelos adequados tem dificultado o estudo abrangente do ambiente intestinal prematuro2. Os modelos in vitro e in vivo existentes não conseguiram representar de forma abrangente o ambiente intestinal humano prematuro. Especificamente, linhagens celulares fetais epiteliais únicas podem não formar junções apertadas, e os modelos animais exibem respostas inflamatórias e imunológicas diferentes dos bebês prematuros humanos. Com a descoberta da sinalização Wnt como uma via primária na proliferação e diferenciação de células-tronco de cripta intestinal e as novas células-tronco teciduais Lgr5+, organoides derivados de tecidos intestinais, como enteroides e colonóides, foram estabelecidos como modelos in vitro 3,4,5. Utilizando essa tecnologia, é possível criar e utilizar modelos enteroides tridimensionais (3D) que são desenvolvidos a partir de tecido inteiro ou biópsia de um intestino para estudar as respostas epiteliais ao ambiente intestinal 6,7.
Em contraste com as linhagens celulares intestinais típicas cultivadas em cultura, os enteróides exibem polaridade com um lúmen conectado por proteínas de junção apertada8. Isso permite a exposição à borda basolateral no meio de crescimento, bem como a microinjeção luminal para avaliar a borda apical. Além disso, os enteroides apresentam características genéticas, fisiológicas e imunológicas semelhantes às do epitélio humano 9,10. Os enteróides derivados do tecido fetal permitem o exame do papel da prematuridade na função epitelial. As características únicas dos enteroides podem se assemelhar mais ao ambiente intestinal prematuro9. Os enteróides derivados de tecidos podem ser usados para testar a integridade da junção apertada como uma forma de monocamada ou como estruturas 3D incorporadas em uma mistura de proteínas de membrana basal solidificada. Uma técnica de microinjeção é necessária para a última forma, se uma exposição apical for desejada. A medição das respostas epiteliais em modelos enteroides inclui a expressão gênica por sequenciamento de RNA, biomarcadores por imunoensaio enzimático (ELISA) ou técnicas avançadas de imagem. A técnica aqui apresentada oferece outra opção viável para medir a permeabilidade bruta com fluorometria.
A lesão intestinal em prematuros tem uma patogênese multifatorial que inclui o desequilíbrio da comunidade microbiana intestinal. Os enteroides podem fornecer excelentes modelos para estudar certos aspectos de doenças intestinais prematuras, como a enterocolite necrosante, que envolvem funções epiteliais11. Os enteroides apresentam características semelhantes às do intestino fetal humano10. A exposição de enteroides a lipopolissacarídeos (LPS), uma endotoxina produzida por bactérias gram-negativas, no meio de cultura como uma exposição basolateral induz a expressão gênica que pode levar ao aumento da inflamação e da permeabilidade intestinal7. Este estudo tem como objetivo avaliar as alterações na permeabilidade epitelial macroscópica após exposição apical a produtos bacterianos como o LPS. Os resultados podem fornecer informações sobre as interações micróbio-epitelial envolvidas na patogênese da lesão intestinal. O método projetado para testar a permeabilidade grosseira requer configuração e habilidade de microinjeção.
Protocol
A coleta de tecido humano foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Washington (estudo ID: STUDY380 e CR ID: CR3603) e realizada pelo Laboratório de Pesquisa de Defeitos Congênitos. O Laboratório de Pesquisa de Defeitos Congênitos foi apoiado pelo prêmio NIH número 5R24HD000836 do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver. Os espécimes foram coletados dos participantes consentidos e enviados como desidentificados e sem qualquer informação de saúde. Os espécimes do intestino delgado foram armazenados em solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco gelada e enviados durante a noite para o laboratório receptor.
1. Preparação do reagente
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de reagentes e números de catálogo; os volumes recomendados são para uma placa de 6 poços, salvo indicação em contrário.
- Preparar a 0,1% de albumina sérica bovina (BSA) dissolvendo 50 mg de pó de BSA em 50 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 100 μg/mL de um antibiótico primocina de amplo espectro para revestir todo o material plástico e pontas que entram em contato com tecidos ou enteróides.
- Para revestir com BSA, coloque pontas de pipeta não filtradas em um tubo cônico de 50 mL com BSA suficiente para cobrir as pontas, adicione 1-2 mL de BSA para cobrir a superfície da placa de Petri ou encha tubos cônicos de 15 mL com BSA por pelo menos 20-30 min à temperatura ambiente antes do uso.
- Preparar o meio DPBS misturando 50 mL de DPBS com 100 μg/mL de primocina e 50 μg/mL de gentamicina. Prepare este meio com e sem 2,5 μg/mL de anfotericina.
- Preparar meios de crescimento enteróides misturando 2 mL de meio de crescimento organoide, 100 μg/mL de primocina, 10 μM Y27632 e 2,5 μM CHIR99021. Faça meios frescos diariamente e aqueça-os em uma incubadora de cultura de células a 37 °C.
NOTA: O fator de diluição para Y27632 é 1:250. Para CHIR99021, diluir a solução-mãe CHIR para 1:100 em meio quente e, em seguida, para 1:40 em meio de crescimento enteróide para obter uma diluição 1:4000. - Prepare a mistura da matriz da membrana basal adicionando à matriz da membrana basal do estoque 10 μM Y27632 e 2,5 μM CHIR99021. Faça um total de 285 μL da mistura final da matriz de membrana basal a uma concentração de proteína de 8 mg/mL para um poço de uma placa de 6 poços.
NOTA: A matriz da membrana basal precisa ser gelada para permanecer na forma líquida e se solidificará em temperaturas mais quentes. A concentração de proteína da matriz de membrana basal do estoque determina o volume necessário para fazer uma concentração de proteína final de 8 mg/mL usando a equação:
Volume 1 × Concentração 1 = Volume 2 × Concentração 2 - Preparar 4% de paraformaldeído (PFA) diluindo o PFA de 32% em PBS por 1:8 e armazenar à temperatura ambiente. Faça 0,5 mL para cada poço de enteróides a serem fixados.
- Prepare o tampão de bloqueio adicionando 5% de soro de cabra e 0,5% de Triton X-100 em PBS. Prepare 1 mL para o primeiro anticorpo por poço e 0,5 mL para o anticorpo adicional por poço.
NOTA: Utilizar soro da mesma espécie que o hospedeiro dos anticorpos secundários - Preparar anticorpos primários e secundários, diluídos em tampão de bloqueio na concentração recomendada pelo fabricante para cada anticorpo.
- Preparar 5 μg/ml de Dmidino-2-fenilindol (DAPI) diluindo a 1:200 a partir de 1 mg/ml de solução-mãe em PBS. Faça 0,5 mL por poço de enteróides corados.
- Prepare 70% de glicerol em PBS e faça 0,5 mL para montar os enteróides em lâminas de microscópio.
- Preparar 5 mg/ml de dextrano-FITC (Fluoresceína-Isotiocianato) diluindo a solução-mãe de 25 mg/ml em PBS numa proporção de 1:5. Faça 20 μL para microinjeção.
- Preparar lipopolissacarídeos (LPS) e dextrano-FITC reconstituindo o pó de LPS em PBS para uma solução-mãe de 5 mg/mL. Diluir soluções-estoque de LPS e dextrano em PBS a 0,1 mg/mL e 0,5 mg/mL de LPS e 5 mg/mL de dextran-FITC. Faça 20 μL para microinjeção.
- Preparar o ácido etilenoglicol-bis(éter β-aminoetílico)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) fazendo uma solução-mãe de 0,2 M dissolvendo o pó EGTA em água destilada e ajustando o pH para aproximadamente 8 utilizando ácido clorídrico (HCl). Preparar uma concentração de ensaio de 2 mM em meios de cultura através da realização de uma diluição de 1:100.
2. Recolha de espécimes
- Uma vez recebidas as amostras, realizar o isolamento e o plaqueamento das células epiteliais em até 24 h da coleta do espécime.
3. Revestimento de células epiteliais intestinais na matriz da membrana basal de espécimes inteiros
NOTA: Este procedimento segue protocolos modificados do Laboratório de Modelagem de Tecidos Translacionais da Universidade de Michigan12,13,14. O uso de meios de crescimento com um alto fator Wnt produz resultados consistentes para o estabelecimento enteróide. Uma vez que os enteróides estão estabelecidos, use o mesmo meio com um alto fator Wnt para conduzir os enteróides a formas esféricas para microinjeção.
- Transfira os segmentos intestinais para uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm com DPBS gelado com anfotericina e mergulhe por 20 minutos no gelo. Enquanto o tecido fica de molho, identifique as regiões (duodeno, jejuno ou íleo) do intestino delgado e remova o tecido conjuntivo e os vasos sanguíneos com pinça e tesoura. Lave o teor de lúmen conforme necessário usando uma pequena agulha de 23-25 G e uma seringa de 3 mL sem interromper o epitélio.
- Corte os segmentos do intestino em pedaços de 3-5 mm usando um bisturi e coloque 1-2 pedaços (para chapeamento em um poço de uma placa de 6 poços) em uma placa de Petri de 35 mm x 15 mm que contenha 0,5-1 mL de meio de crescimento organoide no gelo.
- Usando micro tesouras e pinças dissecantes, corte o tubo intestinal longitudinalmente. Use a ponta da pinça para raspar as células epiteliais da fáscia sob um microscópio estéreo de 10x. Remova a fáscia e gire o prato para quebrar os aglomerados de células.
- Use uma ponta de corte de pipeta de 20 μL para transferir as células e o meio no incremento de 5-10 μL para a mistura da matriz da membrana basal para fazer uma solução de 285 μL a uma concentração de proteína da matriz de 8 mg/mL. Pipete para cima e para baixo lentamente 20x para misturar células na matriz da membrana basal no gelo usando uma ponta de corte de 200 μL.
- Coloque cinco tiras de 50 μL da mistura da matriz da membrana basal da célula em um poço de uma placa de 6 poços pré-aquecida mantida em um tijolo de espuma quente. Incubar a placa na incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO2 por 10 min para permitir que a matriz da membrana basal polimerize e endureça.
- Adicione 2 mL do meio de crescimento enteróide no poço das tiras de matriz de membrana basal solidificada e coloque de volta dentro da incubadora de cultura celular. Mude a mídia diariamente para aumentar o crescimento enteróide. Verifique a diferenciação intestinal de células-tronco sob um microscópio invertido de 10x diariamente.
- Após 10-14 dias, passe os enteróides em um poço de uma placa de 12 ou 6 poços, dependendo da densidade enteróide. Comece a mudar a mídia a cada dois dias e passe em uma proporção de 1: 2 a cada 5-7 dias à medida que os enteróides começam a prosperar.
- Remova as células que não se diferenciam em enteróides com a camada de matriz da membrana basal durante as passagens. Crie um estoque congelado de enteróides com uma passagem baixa, congelando-os em 80% de meios de crescimento, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), se necessário.
4. Coloração imunofluorescente de enteróides
NOTA: O processo de fixação e coloração leva 3 dias. Neste protocolo, fixamos e coramos para núcleos (DAPI), marcadores epiteliais (vilina, CDX2), lisozima, mucina e proteínas de junção apertada (claudina 2, claudina 3, ocludina, zonula ocludente-1) utilizando um protocolo modificado15. As imagens fluorescentes foram obtidas por microscópio confocal.
- Fixação
NOTA: Este processo é geralmente feito ao mesmo tempo que a passagem enteróide ou procedimento de congelamento.- Coloque a placa enteróide no gelo. Remova o meio de crescimento e lave suavemente 2x com DPBS frio.
- Identifique os enteróides a serem fixados e corados. Transfira-os para uma placa de 12 poços pipetando-os cuidadosamente com uma ponta de corte de 200 μL ou usando um loop de inoculação de 1 μL. Coloque enteróides em poços separados se a coloração com anticorpos diferentes deve ser feita.
- Remova o máximo de líquido possível com uma ponta de 200 μL sem interromper os enteróides. Adicionar 0,5 mL de PFA a 4% e incubar por 30 min à temperatura ambiente. Gire a placa ocasionalmente para facilitar o descolamento dos enteróides da matriz da membrana basal.
- Examine grosseiramente para determinar o descolamento dos enteróides da matriz da membrana basal. Aspirar e descartar cuidadosamente o PFA líquido sem interromper os enteróides. Lave com PBS 3x para remover o PFA e qualquer matriz residual de membrana basal
NOTA: Aspirar o líquido sob um microscópio estéreo pode ser útil para evitar os enteróides. Os enteróides fixos podem ser armazenados em PBS a 4 °C por até 1 mês.
- Bloqueio
- Remova cuidadosamente o PBS residual com uma pipeta de 200 μL, sem interromper os enteróides. Adicionar 0,5 mL de tampão de bloqueio e incubar por 2 h à temperatura ambiente.
- Remova e descarte o tampão de bloqueio com uma pipeta de 200 μL, tomando cuidado para evitar interromper os enteróides.
- Coloração de anticorpos
- Adicione 500 μL de anticorpo primário em tampão de bloqueio a cada poço com enteróides. Para anticorpos primários e para lisozima, o fator de diluição é 1:100, para CDX2 o fator de diluição é 1:100, e para vilina o fator de diluição é 1:50. Incubar a 4 °C durante a noite.
- No dia seguinte, retire a solução de anticorpos e lave 3x com PBS. Aguarde 10-15 min de tempo de incubação para cada lavagem.
- Repita as etapas 4.3.1.-4.3.2. para o anticorpo secundário com um fator de diluição de 1:400.
- Adicionar 500 μL de DAPI a 5 μg/mL em PBS e incubar à temperatura ambiente por 15 min. Após a incubação, lave 3x com PBS e reserve 10-15 min de tempo de incubação para cada lavagem
- Montagem
- Remova o máximo de PBS possível. Lave os enteróides corados com 70% de glicerol 1x.
- Levante os enteróides para fora da placa usando um laço de inoculação de 1 μL ou uma ponta de corte de 200 μL e monte com 70% de glicerol em uma lâmina de microscópio de vidro.
- Para preservar a estrutura 3D dos enteróides, certifique-se de um espaço de 0,5-1 mm entre a lâmina de vidro inferior e a tampa. Use recortes de folha de borracha de silício fina ou folha de vidro para criar um espaço entre a lâmina de vidro e a folha de cobertura. Os enteróides agora podem ser fotografados com um microscópio confocal.
5. Preparação para microinjeção de enteróides
NOTA: O protocolo de microinjeção é um protocolo modificado de Hill et al.16 para se adequar aos recursos e à configuração. Algumas das etapas de preparação precisam ser concluídas com alguns dias de antecedência.
- Configurando a configuração de microinjeção
- Instalar o aparelho microinjector no interior de um armário de biossegurança ou num balcão limpo, dependendo do objectivo das experiências, da seguinte forma: um microscópio estéreo para visualização, um micromanipulador com botões de controlo dos eixos X, Y e Z montados num suporte pesado junto ao microscópio, um suporte de micropipeta montado no braço do micromanipulador, um tubo microinjector que liga o suporte da micropipeta e uma seringa com uma torneira de três vias, em seguida, a uma bomba pneumática e a uma fonte de ar de parede conectada à bomba (Figura 1).
- Desinfetar o aparelho de microinjeção com etanol a 70% antes do uso experimental e depois. Testar o posicionamento do microscópio e do micromanipulador para se adequar às especificações físicas desejadas, incluindo a movimentação dos botões do eixo para garantir que a micropipeta possa alcançar a amostra alvo.
- Preparação da micropipeta
Observação : execute essas etapas com antecedência.- Use um extrator de micropipeta para puxar os tubos capilares de vidro para as micropipetas.
- Sob o microscópio estéreo, coloque a micropipeta em um suporte de micropipeta horizontal (Figura 2), concentre-se nas pontas e corte as pontas usando um par de microtesouras enquanto olha através das oculares do microscópio. Prepare cerca de 10-15 micropipetas em um tamanho de ponta semelhante para cada experimento.
- Teste o tamanho da ponta puxando 0,5-1 μL de líquido e conte quantas bombas são necessárias para esvaziar o volume. Teste vários tamanhos de ponta para encontrar o tamanho apropriado para o experimento. Um tamanho de ponta apropriado ejeta aproximadamente 10-30 nL de volume por bomba.
- Guarde as micropipetas de vidro cortadas numa caixa ou tubo limpo sem danificar as pontas.
NOTA: Micropipetas pré-cortadas estão disponíveis comercialmente.
- Preparação enteróide
- Coloque uma placa de enteróides principalmente grandes e esféricos no gelo. Substitua o meio de crescimento antigo pelo meio fresco.
- Dissociar suavemente os pontos da matriz da membrana basal da placa com um elevador de células. Gire os pontos de gel de um lado para o outro no gelo para quebrar a matriz da membrana basal sem perturbar os enteróides.
- Selecione cerca de 10-15 enteróides esféricos com uma ponta de pipeta cortada de 20 μL sob um microscópio estéreo e adicione à matriz da membrana basal para fazer 285 μL de mistura de concentração de proteína de 8 mg / mL.
- Pipete para cima e para baixo suavemente com uma ponta de corte de 200 μL para misturar os enteróides sem quebrá-los. Placa de cinco pontos de gel de 50 μL no centro de uma placa de Petri redonda de 35 mm x 10 mm de cultura celular ou uma com dimensões semelhantes.
- Incubar os pontos de gel enteróide a 37 °C durante 10 minutos para solidificar. Em seguida, adicione 1 mL de meio de crescimento fresco ao prato. Incubar os enteróides por pelo menos 2-3 dias para estabilização e até que os enteróides atinjam um tamanho apropriado de 0,5-1 μL.
NOTA: É importante ter um prato com uma parede baixa para facilitar o acesso aos enteróides e um pequeno diâmetro para menor volume de meio de crescimento.
- Microinjeção de dextrano-FITC e material testado
- Desligue a torneira de três vias para a bomba pneumática. Encha a micropipeta com o material injetado, neste caso dextrano-FITC com ou sem LPS.
- Prepare uma placa de Petri coberta com uma tira de filme transparente. Coloque dois a quatro pontos de 1 μL de material injetado no filme.
- Use o micromanipulador para conduzir a ponta da micropipeta para dentro do líquido, mas acima do filme, sob a visualização de um microscópio estéreo. Puxe suavemente a seringa para retirar o material injetado na micropipeta.
- Encha a micropipeta com 2-4 μL de material injetado e empurre a seringa para remover qualquer ar na ponta da micropipeta. Inspecione a coluna de material injetado na micropipeta para se certificar de que não há bolsa de ar. Registre o volume de material injetado que se retirou dentro da micropipeta.
NOTA: O líquido é visível em uma cor esverdeada devido ao dextran-FITC. - Ligue a fonte de ar conectada à bomba pneumática, que fornece uma pressão de ar de aproximadamente 60 psi. Ligue a bomba e defina a duração da bomba para 10-15 ms. Gire a torneira na seringa para abrir a linha da bomba para a micropipeta.
NOTA: A duração mais longa da bomba permite que mais material seja liberado por bomba. Recomenda-se usar a mesma duração da bomba e micropipetas com tamanhos de ponta semelhantes para todo o experimento para estimativa do volume injetado. - Remova os enteróides da incubadora de cultura de células e coloque os pratos em cima de um tijolo de espuma quente em um recipiente coberto para limitar a exposição à luz após a microinjeção.
- Coloque a placa de Petri com enteróides sob o microscópio estéreo e mova os botões do micromanipulador para colocar a ponta da micropipeta em um ângulo de cerca de 35°-45° em relação à superfície horizontal (Figura 3). Isso requer alguma prática com antecedência.
- Visualize e mapeie os enteróides em cada placa de Petri sob o microscópio para fazer um plano para injetar cerca de 3-5 enteróides esféricos por prato.
- Uma vez que a ponta da micropipeta esteja perto da superfície do líquido, olhe para as oculares do microscópio para avançar a ponta em direção ao enteróide alvo.
- Perfure o enteróide com a ponta da micropipeta avançando o botão do eixo z usando um movimento lento preciso. A parede enteróide irá deprimir e estourar para trás uma vez que a ponta passa pela superfície enteróide, momento em que o avanço deve parar.
- Toque no pedal da bomba com um pé e encha o enteróide com a solução esverdeada de dextrano-FITC até que esteja ligeiramente expandido. Registre o número de bombas para calcular o volume bombeado e a concentração de dextrano.
- Retire a ponta da micropipeta após terminar a microinjeção e passe para o próximo enteróide. Com a prática, o processo pode correr bem.
- Se a ponta quebrar, substitua-a por outra micropipeta com um tamanho de ponta semelhante. Puxe volume suficiente de material injetado para todos os enteróides no mesmo grupo de exposição e troque a micropipeta entre os materiais injetados para evitar a contaminação cruzada.
- Coloque o prato enteróide injetado sob a cobertura para evitar a exposição à luz.
- Coleta e medição Dextran-FITC
- Após o procedimento de microinjeção, remova imediatamente o meio de cultura. Lave com meios de crescimento frescos 2x para remover qualquer dextran-FITC residual. Adicione mídia nova e registre o tempo como tempo 0 após a microinjeção.
NOTA: Você pode precisar de uma segunda pessoa para realizar esta etapa sem interromper o processo de microinjeção. - Coletar 200 μL de meio de cultura em um tubo de microfuga opaco de 0,5 mL e, em seguida, substituir o meio de cultura removido pelo mesmo volume de meio de crescimento fresco em microinjeções de 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h e 12 h.
NOTA: O intervalo de tempo pode variar dependendo do experimento. Com uma exposição basolateral, o meio de substituição deve conter a exposição na mesma concentração. - Armazenar os meios de cultura coletados a 4 °C e medir a concentração de dextrano dentro de 24 h. Armazene as sobras de mídia a -80 °C para outras análises. No final da coleta do meio de cultura, colha os enteróides para extração de RNA ou imagem, se necessário.
- Meça as concentrações de dextrano-FITC com um leitor de microplacas de fluorescência. Construir uma curva padrão para cada placa usando diluições seriadas e ajustando uma linha de regressão linear, conforme mostrado na Figura 4.
- Corrigir a absorvância para o volume removido de meio de cultura contendo dextran que foi substituído por meio de crescimento fresco sem dextran da seguinte forma: a remoção de 200 μL de 2 mL de meio de cultura é de 10% em volume.
Absorbância corrigida a 2 h = (absorvância a 1 h x 10%) + absorbância medida a 2 h
A absorvância do primeiro meio corrigido não precisa de correção. Em seguida, calcule a concentração de dextrano a partir do valor de absorbância corrigido usando a equação de curva padrão. - Para normalização, divida a concentração de dextrano pelo número total de bombas para cada placa de Petri e, em seguida, multiplique pelo maior número total de bombas por prato.
NOTA: Todas as exposições são realizadas em triplicados (três placas de Petri por exposição com 3-5 enteróides microinjetados por prato). Os valores médios dos triplicados são comparados entre as exposições usando o teste t de Student.
- Após o procedimento de microinjeção, remova imediatamente o meio de cultura. Lave com meios de crescimento frescos 2x para remover qualquer dextran-FITC residual. Adicione mídia nova e registre o tempo como tempo 0 após a microinjeção.
Representative Results
Estabelecemos uma linhagem celular enteróide a partir de tecido fetal de íleo doado seguindo protocolos modificados fornecidos por nossos colaboradores do Laboratório de Modelagem de Tecidos Translacionais da Universidade de Michigan12. A linhagem celular enteróide foi negativa para infecção por Mycoplasma . Os enteroides foram corados positivos para vilina, CDX2, lisozima, mucina, claudina, occludina e zónula-ocludeno 1 (Figura 5), confirmando sua origem epitelial do intestino delgado. Os enteroides foram microinjetados com 4 kDa dextrano-FITC a 5 mg/mL em PBS (Figura 6). As exposições testadas foram LPS em diferentes concentrações, 0,1 mg/mL e 0,5 mg/mL, misturadas com dextrano-FITC para exposição apical. Como controle positivo, utilizou-se EGTA 2 mM e adicionou-o ao meio de cultura às 4 h pós-microinjeção de dextrano. EGTA é um quelante de cálcio que aumenta a permeabilidade de junções apertadas. Os controles negativos foram microinjetados com dextrano-FITC apenas na PBS. Para a exposição basolateral, o meio de substituição para a coleta de meios de cultura seriada teve a mesma concentração da exposição (ou seja, EGTA de 2 mM). Os resultados mostram um claro aumento na concentração de dextrano em meios de cultura após a adição de EGTA em comparação com o controle negativo, PBS. A exposição apical do LPS induziu maior permeabilidade do dextran iniciando aproximadamente 8 h após a exposição de forma dependente da concentração (Figura 7).
Figura 1: Configuração do microinjetor. A configuração inclui um microscópio estéreo, micromanipulador montado em um suporte magnético em uma placa de base de aço pesado, um suporte de micropipeta conectado a uma seringa com uma torneira de três vias e uma bomba pneumática. O fornecimento de ar de parede fornece a pressão do ar, que é regulada pela bomba para gerar um volume de bomba consistente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Suporte de micropipeta horizontal. Esta plataforma de plástico é projetada para segurar a micropipeta após a tração do tubo capilar de vidro para cortar a ponta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Posicionamento da micropipeta. Um ângulo de 35°-45° é ideal para injetar enteróides localizados no meio da placa de Petri. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curva padrão de Dextran. A curva foi construída com absorvância fluorescente de 10 diluições seriadas de dextrano em duplicatas. Uma linha de regressão linear foi ajustada para gerar uma equação de regressão. As barras de erro são SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Biomarcadores fluorescentes de enteróides. DAPI para coloração do núcleo é azul. Os seguintes biomarcadores são mostrados: (A) vilina, (B) CDX2, (C) lisozima, (D) mucina, (E) claudina, (F) oclusão e (G) zônula-oclusão 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Enteróides em diferentes estágios . (A) Um enteróide com 7-10 dias de idade é pequeno e com uma parede espessa. (B) Um enteróide que está pronto para microinjeção com um tamanho grande, um lúmen e uma parede de pensamento, e (C) dextran-FITC fluorescente dentro de um enteróide 2 dias após a microinjeção. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Permeabilidade do dextran-FITC pós-microinjeção . (A) Os níveis de dextrano medidos no meio foram maiores após a adição de EGTA em comparação com PBS. (B) O LPS microinjetado 0,5 mg/mL induziu maior vazamento de dextrano do lúmen enteróide para o meio do que o LPS microinjetado 0,1 mg/mL a partir das 8 h após a injeção. *p-valor < 0,05, as barras de erro são MEV, n = 3, um teste t de Student foi utilizado para calcular a significância. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo detalha o estabelecimento de enteroides a partir do tecido intestinal fetal, bem como a caracterização do modelo com coloração imunofluorescente e teste de permeabilidade epitelial. A permeabilidade dos enteroides foi testada por meio de uma técnica de microinjeção e medidas seriadas do curso temporal da concentração de dextran-FITC vazada no meio de cultura. A novidade desse protocolo é a exposição apical que mais se assemelha à fisiologia intestinal humana em comparação com a exposição basolateral nos meios de cultura7. Em estudos anteriores, Hill et al. utilizaram imagens seriadas e cálculo da intensidade de fluorescência ao longo do tempo16. Ares e col. expuseram a membrana basolateral de um modelo epitelial ao LPS e, em seguida, compararam o padrão de expressão gênica celular7. Em comparação, utilizamos a exposição apical dos reagentes testados e, em seguida, examinamos possíveis alterações na permeabilidade bruta medindo as concentrações seriadas de dextrano vazado no meio de cultura. Nosso método também permite a análise comparativa seriada de citocinas produzidas por células epiteliais em meios de cultura e expressão gênica por meio da coleta de mRNA celular. O LPS tem sido comumente utilizado para estudar lesões intestinais em modelos animais e in vitro, devido à sua capacidade de induzir permeabilidade e inflamação 7,17. Quando o LPS foi testado neste modelo, a permeabilidade epitelial foi diferenciada pela concentração de exposição. Este protocolo pode ser expandido para estudar outras patologias da doença usando diferentes materiais microinjetados e medidas de resultados.
As etapas críticas neste protocolo incluem o estabelecimento de enteróides a partir de tecidos intestinais fetais, a caracterização enteróide e a técnica de microinjeção. A integridade deste estudo depende de uma amostragem celular precisa. O uso de marcos anatômicos e vasos sanguíneos é útil para garantir a seleção de células do intestino delgado. Devido ao crescimento robusto e diferenciação de células-tronco intestinais fetais, um procedimento extenso para isolar as células-tronco de outras células epiteliais não é necessário. Após o estabelecimento dos enteróides, é importante confirmar as características do modelo por coloração para proteínas e marcadores celulares. Neste protocolo, os enteroides foram corados para enterócitos com vilina e CDX2, células de Paneth com lisozima e células caliciformes com mucina, todas as células encontradas no epitélio do intestino delgado18,19,20. Em contraste com as linhagens celulares únicas tradicionais que exibem um tipo de célula, os enteróides estabelecem todos os tipos de células a partir das células-tronco progenitoras intestinais8. A parte de coloração deste protocolo pode ser modificada para os marcadores celulares específicos de interesse. Crucial para a confiabilidade deste protocolo é a técnica de microinjeção. A consistência das pontas da micropipeta pode ser verificada medindo o volume por bomba usando a solução dextran-FITC e visualizando o diâmetro das pontas sob o microscópio. Devido ao risco de contaminação, a mesma micropipeta não pode ser usada para mais de uma exposição. Além disso, a forma e o crescimento dos enteróides podem ser influenciados pelo conteúdo de seus meios de crescimento. Descobrimos que os enteróides esféricos em vez de em forma de couve-flor forneceram melhores modelos para microinjeção. A forma esférica pode ser induzida por um maior fator Wnt no meio21.
Este protocolo depende em grande parte da habilidade do executante em microinjeção para reduzir variações, especialmente em medições sensíveis ao tempo. As variações podem ser minimizadas por ter o mesmo executor experiente com técnicas consistentes, usando a mesma origem celular para evitar a variação genética, testando na mesma passagem para remover o viés de maturidade e cultivando as células no mesmo tipo de meio para diferenciação celular semelhante. Os componentes dos meios de crescimento podem induzir diferenciação variável de células-tronco in vitro e não em um ambiente in vivo . Por exemplo, in vivo, a lisozima não é expressa até as semanas 22-24 do desenvolvimento gestacional, quando as células de Paneth se formam e se tornam funcionais22. No entanto, fomos capazes de detectar lisozima em nossos enteróides estabelecidos a partir de intestinos fetais de 10 semanas. Este método pode limitar o número de exposições testadas de uma só vez devido à alta habilidade técnica necessária para a microinjeção. O vazamento de dextrano do orifício de punção de microinjeção pode afetar a avaliação da permeabilidade. Para eliminar este efeito, as lavagens triplas imediatamente após a microinjeção são recomendadas para remover o dextrano residual do procedimento. A concentração de dextrano no meio deve ser medida de hora em hora por 4-6 h após a microinjeção. Experimentos com um aumento significativo na concentração de dextrano dentro de 2-4 h após a injeção devem ser excluídos da análise final.
Este método tem várias vantagens. Requer um custo mais baixo e menos recursos em comparação com as monocamadas derivadas de enteróides no transwell. Além disso, pode ser expandido para outras exposições, como bactérias vivas ou vírus, para estudar a interação inicial entre os micróbios intestinais e o epitélio. O lúmen fechado do enteroide pode manter um crescimento estável de bactérias vivas microinjetadas sem contaminação do meio de crescimento13. Ao contrário da monocamada exposta a meios de crescimento e oxigênio de incubação, o lúmen fechado é um espaço apertado e isolado. Um lúmen fechado não permite comunicação com o meio de crescimento e um teor de oxigênio luminal que é menor ao longo do tempo com o crescimento bacteriano vivo13.
O uso de tecido intestinal fetal retrata com maior precisão o epitélio intestinal de prematuros em comparação com células-tronco intestinais adultas ou modelos animais7. Além disso, a polaridade dos enteróides permite exposições e medidas apicais e basolaterais23. Os enteroides formam um lúmen fechado com menor concentração de oxigenação, que mais se aproxima da concentração de oxigenação dos intestinos24. Em contraste com protocolos tecnologicamente mais avançados16, o uso de medidas de meios grossos permite maior acessibilidade a essa técnica. O experimento demonstrou que o extravasamento epitelial pode ser induzido pela exposição apical ao LPS e é dependente da concentração. Uma vez que este método examina as mudanças na concentração vazada de dextrano, é útil para detectar alterações funcionais grosseiras em junções apertadas. A coleta de RNA mensageiro e o sequenciamento dos enteroides expostos e a análise de western blot podem complementar a análise das alterações funcionais grosseiras. Este modelo estuda a integridade do epitélio intestinal em um sistema que se assemelha muito ao ambiente prematuro e, portanto, pode ser usado para obter uma melhor compreensão das lesões intestinais prematuras e outras patologias da doença.
Disclosures
Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Ian Glass e ao pessoal do Laboratório de Pesquisa de Defeitos Congênitos da Universidade de Washington por compartilhar os tecidos fetais. Também agradecemos ao Dr. Michael Dame e ao Dr. Jason Spence no Laboratório de Modelagem de Tecidos Translacionais da Universidade de Michigan por seu apoio e orientação infinitos durante todo o processo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin 250 uL/mL | Gibco | 15-290-026 | |
| Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal | Biogenex | MU392A-5UC | |
| Anti-Claudin 2 antibody (ab53032) | abcam | ab53032 | |
| Anti-Claudin 3 antibody (ab15102) | abcam | ab15102 | |
| Anti-LYZ antibody produced in rabbit | Millipore Sigma | HPA066182-100UL | |
| Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032 | Santa Cruz | sc-515032 | |
| Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal | Biogenex | NUA42-5UC | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Millipore Sigma | A8806 | |
| Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1395 | |
| Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates | USA Scientific Inc | 50-754-1560 | |
| Centrifuge with 15 mL tube buckets | Eppendorf | 05-413-110 | |
| CHIR 99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Confocal microscope | Olympus FV1200 | N/A | Or a similar microscope |
| Conical centrifuge tubes, 15 ml | Falcon | 05-527-90 | |
| Cover glass for microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-DP | |
| Disposable scalpels | Mopec | 22-444-272 | |
| Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL) | Fisher Scientific | 62248 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X) | Fisher Scientific | AAJ67802K2 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA) | Millipore Sigma | E8145-10G | |
| Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa | Millipore Sigma | 46944 | |
| Fuorescence microplate reader | Agilent BioTek | Synergy HTX | |
| Gentamicin 50 mg/mL | Gibco | 15-750-060 | |
| Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling) | A-M systems | 626500 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | Fisher Scientific | A32742 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Fisher Scientific | A32731 | |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16210064 | |
| ImageJ software | NIH | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technologies | 06010 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Millipore Sigma | L4391-1MG | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | protein concentration > 9 mg/mL preferably |
| Micro forceps | Fisher Scientific | 13-820-078 | |
| Micro scissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | SU-P1000 | Or a similar equipment |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-034486 | |
| Occludin Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 71-1500 | |
| Paraformaldehyde 32% aqueous solution | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | RT 15714 | |
| Petri Dishes, 35x10 mm | Fisher Scientific | 150318 | |
| Petri Dishes, 60x15 mm | Fisher Scientific | 12-565-94 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | 10010031 | |
| PicoPump foot switch | World Precision Instruments | 3260 | |
| Pipette tips, non-filtered, 1000 uL | Fisher Scientific | 21-402-47 | |
| Pipette tips, non-filtered, 20 uL | Fisher Scientific | 21-402-41 | |
| Pipette tips, non-filtered, 200 uL | Fisher Scientific | 21-236-54 | |
| Pneumatic PicoPump system | World Precision Instruments | SYS-PV820 | or a similar picopump system |
| Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Steel base plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereo microscope | Zeiss stemi 350 | Or a similar microscope | |
| ThermoSafe PolarPack Foam Bricks | Sonoco | 03-531-53 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Wall air supply | N/A | N/A | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 | |
| ZO-1 Polyclonal Antibody | Fisher Scientific | 61-7300 |
References
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