Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Fosfolipid mediator indusert transformasjon i tredimensjonale kulturer

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64146
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research, 2Department of Biology, Center for Genomics and Systems Biology, New York University, 3Enveda Therapeutics India Pvt Ltd.

Summary

Den nåværende protokollen beskriver oppsettet av 3D 'on top ' kulturer av en ikke-transformert brystepitelcellelinje, MCF10A, som har blitt modifisert for å studere blodplateaktiverende faktor (PAF) indusert transformasjon. Immunfluorescens har blitt brukt til å vurdere transformasjonen og diskuteres i detalj.

Abstract

Flere modeller er utviklet for å studere kreft, som gnagermodeller og etablerte cellelinjer. Verdifull innsikt i karsinogenese er gitt ved studier med disse modellene. Cellelinjer har gitt en forståelse av dereguleringen av molekylær signalering assosiert med brysttumorigenese, mens gnagermodeller er mye brukt til å studere cellulære og molekylære egenskaper ved brystkreft in vivo. Etableringen av 3D-kulturer av brystepitel- og kreftceller hjelper til med å bygge bro over gapet mellom in vivo og in vitro-modeller ved å etterligne in vivo-forholdene in vitro. Denne modellen kan brukes til å forstå dereguleringen av komplekse molekylære signalhendelser og de cellulære egenskapene under brystkarsinogenese. Her er et 3D-kultursystem modifisert for å studere en fosfolipidmediatorindusert (Platelet Activating Factor, PAF) transformasjon. Immunmodulatorer og andre utskilte molekyler spiller en viktig rolle i tumorinitiering og progresjon i brystet. I denne studien er 3D-acinarkulturer av brystepitelceller utsatt for PAF-viste transformasjonsegenskaper som tap av polaritet og endrede cellulære egenskaper. Dette 3D-kultursystemet vil hjelpe til med å kaste lys over genetiske og / eller epigenetiske forstyrrelser indusert av forskjellige små molekylenheter i tumormikromiljøet. I tillegg vil dette systemet også gi en plattform for identifisering av nye så vel som kjente gener som kan være involvert i transformasjonsprosessen.

Introduction

Et mylder av modeller er tilgjengelige for å studere utviklingen av kreft, hver av dem er unik og representerer en subtype av denne komplekse sykdommen. Hver modell gir unik og verdifull innsikt i kreftbiologi og har forbedret måten å etterligne den faktiske sykdomstilstanden. Etablerte cellelinjer dyrket som et monolag har gitt verdifull innsikt i vitale prosesser in vitro, som spredning, invasivitet, migrasjon og apoptose1. Selv om todimensjonal (2D) cellekultur har vært det tradisjonelle verktøyet for å undersøke responsen fra pattedyrceller til flere miljøforstyrrelser, virker ekstrapolering av disse funnene for å forutsi responser på vevsnivå ikke tilstrekkelig overbevisende. Den største begrensningen av 2D-kulturene er at mikromiljøet som er opprettet, i stor grad skiller seg fra brystvevet selv2. 2D-kultur mangler samspillet mellom cellene og den ekstracellulære matrisen, noe som er avgjørende for veksten av noe vev. Også strekkkrefter opplevd av cellen i monolagskulturer hindrer polariteten til disse cellene, og endrer dermed cellesignalering og oppførsel 3,4,5. Tredimensjonale (3D) kultursystemer har åpnet en ny vei innen kreftforskning med deres evne til å etterligne in vitro-forholdene in vitro. Mange viktige mikromiljøsignaler som går tapt i 2D-cellekultur, kan reetableres ved hjelp av 3D-kulturer av lamininrik ekstracellulær matrise (lrECM)6.

Ulike studier har identifisert betydningen av tumormikromiljøet i karsinogenese 7,8. Inflammasjonsassosierte faktorer er en stor del av mikromiljøet. Platelet Activating Factor (PAF) er en fosfolipidmediator utskilt av forskjellige immunceller som formidler flere immunresponser 9,10. Høye nivåer av PAF utskilles av forskjellige brystkreftcellelinjer og er forbundet med økt spredning11. Studier fra vårt laboratorium har vist at langvarig tilstedeværelse av PAF i acinarkulturer fører til transformasjon av brystepitelceller12. PAF aktiverer PAF-reseptoren (PAFR), og aktiverer PI3K/Akt-signalaksen13. PAFR er også rapportert å være assosiert med EMT, invasjon og metastase14.

Denne protokollen demonstrerer et modellsystem for å studere PAF-indusert transformasjon, ved hjelp av 3D-kulturer av brystepitelceller, som tidligere er beskrevet av Chakravarty et al.12. Brystepitelcellene som vokser på den ekstracellulære matrisen (3D-kulturer) har en tendens til å danne polariserte vekstarresterte sfæroider. Disse kalles acini og ligner acini av brystvev, den minste funksjonelle enheten i brystkjertelen, in vivo15. Disse sfæroidene (figur 1A,B) består av et monolag av tettpakkede polariserte epitelceller som omgir et hult lumen og festes til kjellermembranen (figur 1C). Denne prosessen med morfogenese er godt beskrevet i litteratur16. Når de sås på lrECM, gjennomgår cellene deling og differensiering for å danne en klynge av celler, som deretter polariserer fra dag 4 og utover. Ved dag 8 består acini av en gruppe polariserte celler som er i direkte kontakt med den ekstracellulære matrisen og en klynge av upolariserte celler innelukket i de ytre polariserte cellene, uten kontakt med matrisen. Disse upolariserte cellene er kjent for å gjennomgå apoptose innen dag 12 av kulturen, og danner et hult lumen. På dag 16 dannes vekstarresterte strukturer16.

Figure 1
Figur 1: Kjerner av celler i acini farget med en kjernefysisk flekk . (A) 3D-konstruksjon av acini. (B) Fasekontrastbilde av MCF10A acini dyrket på Matrigel i 20 dager. (C) Den midterste delen viser tilstedeværelsen av et hult lumen. Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I motsetning til 2D-kulturer, hjelper acinarkulturer med å skille normale og transformerte celler gjennom tilsynelatende morfologiendringer. Ikke-transformerte brystepitelceller danner acini med et hult lumen, som etterligner det normale menneskelige bryst acini. Disse sfæroider, ved transformasjon, viser en forstyrret morfologi preget av et stort tap av polaritet (et av kjennetegnene ved kreft), fravær av lumen eller forstyrrelse av det hule lumen (på grunn av unnvikelse av apoptose) som kan induseres på grunn av deregulering av forskjellige gener17,18,19,20 . Disse transformasjonene kan studeres ved hjelp av vanlige teknikker som immunfluorescens. Dermed kan 3D-cellekulturmodellen fungere som en enkel metode for å undersøke prosessen med brystacinarmorfogenese og brystkarsinogenese. Etablering av et 3D-kultursystem for å forstå effekten av en fosfolipidmediator, PAF, vil hjelpe til med høy gjennomstrømning preklinisk legemiddelscreening.

Dette arbeidet har tilpasset 3D 'on top' kulturprotokoll16,21 for å studere transformasjon indusert av PAF 22. De fenotypiske forandringene indusert av eksponering av acini for fosfolipidmediatoren ble studert ved bruk av immunfluorescens. Ulike polaritets- og epitelmarkører (EMT)12,16 ble brukt i studien. Tabell 1 nevner deres normale lokalisering og deres forventede fenotype ved transformasjon.

Antistoffer Merker Normal lokalisering Transformert fenotype
α6-Integrin Basolateral Basal med svak sideflekk Sterk lateral / apikal flekk
β-Catenin Celle-celle-kryss Basolateral Unormal / nukleær eller cytoplasmatisk lokalisering
Vimentin Emt Fraværende/svak tilstedeværelse Opp-regulering

Tabell 1: Markører brukt i studien. Ulike markører brukes med lokalisering i nærvær og fravær av PAF-behandling.

Denne metoden kan best brukes til å studere / screene plausible stoffer og målrette gener for ulike brystkreftundertyper. Dette kan gi en narkotikaresponsdata nærmere in vivo-scenariet, noe som bidrar til raskere og mer pålitelig narkotikautvikling. Dette systemet kan også brukes til å studere molekylær signalering assosiert med legemiddelrespons og stoffresistens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Seeding MCF10A-celler i lrECM

  1. Opprettholde MCF10A-celler (adherente brystepitelceller) i vekstmediet. Passasje cellene hver 4.
    MERK: Sammensetning av vekstmedium: DMEM med høy glukose uten natriumpyruvat som inneholder hesteserum (5%), insulin (10 μg/ml), hydrokortison (0,5 μg/ml), epidermal vekstfaktor, EGF (20 ng/ml), koleratoksin (100 ng/ml) og penicillin-streptomycin (100 enheter/ml) (se materialfortegnelse).
  2. Tin lrECM (se Materialfortegnelse) på is 20 min før forsøksstart. Dagen for såing av cellene regnes generelt som dag 0.
  3. For trypsinisering av cellene, aspirer mediet og vask med 2 ml PBS. Tilsett 900 μL 0,05% trypsin-EDTA og inkuber ved 37 ° C i ~ 15 min eller til cellene er helt trypsinisert.
  4. Forbered en seng av lrECM i åtte brønner av et kamret dekselglassglass (se Materialtabell).
    1. Når cellene trypsiniserer, belegg hver brønn med 60 μL lrECM og legg den i en 37 °C CO2 inkubator i maksimalt 15 minutter.
  5. Klargjør cellesuspensjonen ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Etter fullstendig fjerning av celler, tilsett 5 ml re-suspensjonsmedium for å slukke trypsinaktivitet og spinn cellene ved 112 x g i 10 minutter ved 25 ° C.
      MERK: Sammensetning av re-suspensjonsmedium: høy glukose DMEM uten natriumpyruvat, supplert med hesteserum (20%) og penicillin-streptomycin (100 enheter / ml).
    2. Aspirer det brukte mediet og suspender cellene på nytt i 2 ml analysemedium. Bland suspensjonen godt for å sikre dannelsen av en enkeltcellesuspensjon.
      MERK: Sammensetning av analysemedium: DMEM med høy glukose uten natriumpyruvat, supplert med hesteserum (2%), hydrokortison (0,5 μg / ml), koleratoksin (100 ng / ml), insulin (10 μg / ml) og penicillin-streptomycin (100 enheter / ml).
    3. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og beregne volumet av cellesuspensjon som trengs for å frø 6 x 103 celler i hver brønn.
      MERK: Det er generelt foretrukket å inkludere en ekstra brønn i beregningen for å ta hensyn til eventuelle pipetteringsfeil.
    4. I henhold til antall brønner som kreves, fortynn cellesuspensjonen i overleggsmedium.
      MERK: Overleggsmediumsammensetning for en enkelt brønn er som følger: 400 μL analysemedium, 8 μL lrECM (2% endelig) og 0,02 μL 100 μg / ml EGF (5 ng / ml endelig).
  6. Utfør såing av cellene.
    1. Tilsett 400 μL av den fortynnede cellesuspensjonen i de tilberedte lrECM-sengene (trinn 1.4), og sørg for at lrECM-sengen ikke forstyrres. Inkuber ved 37 °C i en fuktet 5 % CO 2-inkubator.

2. PAF-behandling

  1. Tilsett PAF 3 timer etter såing av celler. Forbered en 100 μM lager av PAF i PBS og legg til ønsket volum på 0,2 μL i hver brønn (som tilsvarer 200 nM).
  2. Legg til samme konsentrasjon av PAF under hver medieendring.

3. Fôring med ferske medier

  1. Fyll på cellene med ferskt medium hver 4. dag (dvs. dag 4, dag 8, dag 12 og dag 16).

4. Immunfluorescensstudie for å oppdage fenotypiske endringer indusert av langvarig PAF-eksponering

  1. Etter 20 dager med dyrking, pipette forsiktig ut mediet fra hver brønn og vask brønnene med 400 μL forvarmet PBS.
  2. Fest acinarstrukturene ved å tilsette 400 μL 4% paraformaldehyd (tilberedt ved å fortynne 16% paraformaldehyd i 1x PBS) og inkubere i 20 minutter ved romtemperatur.
  3. Skyll brønnene en gang med iskald PBS og permeabiliser med PBS inneholdende 0,5 % Triton X-100 i 10 minutter ved 4 °C.
  4. Etter 10 minutter pipetter du Triton-X 100-løsningen umiddelbart, men forsiktig, og skyll med 400 μL PBS-glycin (tilberedt ved å tilsette en klype glycin i 1x PBS). Dette gjentas tre ganger i 15 minutter hver.
  5. Tilsett 400 μL av den primære blokkeringsløsningen som består av 10 % geiteserum (se materialfortegnelse) i immunfluorescens (IF) buffer og inkuber ved romtemperatur i 60 minutter.
    MERK: Sammensetning av IF-buffer: 0,05 % natriumazid, 0,1 % BSA, 0,2 % Triton-X 100 og 0,05 % Tween (20 i 1 PBS).
  6. Fjern den primære blokkeringsløsningen, tilsett 200 μL av 2% sekundært blokkerende antistoff (F(ab')2 fragment av antistoff oppdratt i geit mot museantigen, se Materialfortegnelse) fremstilt i primær blokkeringsløsning, og la den stå i 45-60 minutter ved romtemperatur.
  7. Klargjør det primære antistoffet (se Materialfortegnelse) i 2 % sekundærblokkerende antistoffoppløsning i en 1:100 fortynning. Etter at den sekundære blokkeringsløsningen er fjernet, tilsett det tilberedte antistoffet og inkuber over natten ved 4 °C.
  8. Det forrige trinnet kan fremkalle flytendegjøring av kjellermembranen. Før du fortsetter med eksperimentet, vent til lysbildet når romtemperatur. Pipette den primære antistoffoppløsningen forsiktig og vask den tre ganger med 400 μL IF-buffer.
  9. Under siste vask med IF-buffer, lag en 1:200 fortynning av det fluoroforkonjugerte sekundære antistoffet (se materialfortegnelse) i den primære blokkeringsløsningen. Inkuber lysbildene i den sekundære antistoffløsningen i 40-60 minutter ved romtemperatur.
  10. Skyll lysbildene med 400 μL IF-buffer i 20 minutter, etterfulgt av to vasker med PBS i 10 minutter hver.
  11. Motfarge kjernene med PBS inneholdende 0,5 ng/ml kjernefysisk flekk (se materialtabell) i 5-6 minutter ved romtemperatur. Vask lysbildene tre ganger med 400 μL PBS for å fjerne overflødig flekk.
  12. Piplegg forsiktig ut hele PBS og sørg for fjerning av restoppløsningen. Tilsett en dråpe monteringsreagens (se Materialfortegnelse) i hver brønn og la den stå i romtemperatur over natten.
  13. Oppbevar lysbildene ved romtemperatur og avbilde lysbildene så snart som mulig.
  14. Bilde under 40x eller 63x forstørrelse på et konfokalt mikroskop (se materialfortegnelse), med optiske Z-seksjoner på 0,6 mm trinnstørrelse (NA = 1,4).
  15. Åpne de anskaffede bildene med et bildebehandlingsprogram (se Materialfortegnelse). Demonstrere de morfologiske forskjellene ved hjelp av 3D-projeksjoner.
    MERK: Det midterste optiske Z-snittet kan best brukes til å vise forskjeller i lokaliseringen av polaritetsmarkører. Disse kan kvantifiseres manuelt for å representere prosentandelen av sfæroider som viser det spesifikke fargemønsteret.
  16. For å illustrere forskjeller i uttrykket av proteiner, utfør en semikvantitativ analyse som måler gjennomsnittlig gråverdi eller beregne korrigert total cellefluorescens (CTCF)23. Representere dataene som fiolin- eller punktdiagram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MCF10A-celler, ved eksponering for PAF-behandling, danner acinarstrukturer med svært forskjellige fenotyper. α6-integrin ble funnet å være feillokalisert med mer apikal farging. Noen få acini viste også diskontinuerlig farging (figur 2A). Begge disse fenotypene indikerer tap av basalpolaritet, som det fremgår av litteratur24,25. Tidligere rapporter indikerer den kontroversielle rollen som α6-integrin i kreftmetastase. α6-integrin er til stede som en dimer med enten β1- eller β4-integrin. α6β4-underenheten har vist seg å spille en betydelig rolle i dannelsen av hemidesmosomer i epitelceller26. Nedreguleringen av dette integrinet er funnet i prostata og noen tilfeller av brystkreft, hvor tap av α6β4-integrin ble funnet i duktalt karsinom i brystet (grad III). Tapsfenotypen ses i cellene som metastaserer til parenkymen og pleurahulen27,28,29. GM130 er et cis-Golgi lokalisert protein; Golgi-legemer er apically lokalisert i MCF10A acinarkulturer16,30. PAF-behandling førte til feillokalisering av GM130, noe som tyder på apikal polaritetsforstyrrelse (figur 2B). Vimentin er et mellomliggende filament som er involvert i cellemigrasjon; det oppreguleres når epitelceller gjennomgår epitel til mesenkymal overgang (EMT)31. PAF-behandling av MCF10A acinarkulturer førte til forhøyede vimentinnivåer observert ved fargeintensiteten (figur 2C), noe som tyder på EMT.

Figure 2
Figur 2: PAF forstyrrer polariteten og induserer EMT-lignende endringer i MCF10A brystacini. MCF10A-celler ble dyrket som 3D 'on top' kulturer i lrECM. Kulturene ble behandlet med PAF på dag 0, 4, 8, 12 og 16. Kulturene ble opprettholdt i 20 dager og deretter immunostained for α6-integrin (grønn) og kjernefysisk flekk (blå) (A), (B) GM130 (grønn), en markør for apikal polaritet, og (C) Vimentin (rød), en EMT-markør. Den midterste stabelen av de respektive aciniene er vist. De representative dataene er for 40-50 acini fra tre biologisk uavhengige eksperimenter. Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etablerte cellelinjebaserte modeller er mye brukt til å studere prosessen med karsinogenese. Monolagskulturer av celler fortsetter å gi innsikt i de forskjellige molekylære signalveiene som formidler karakteristiske endringer i kreftceller32. Studier på rollen til kjente onkogener som Ras, MyC og mutert p53 ble først rapportert ved bruk av monolagskulturer som modellsystemet33,34,35,36. 2D-kulturmodellen mangler imidlertid mange viktige strukturelle og funksjonelle parametere som er tilstede in vivo. Drug screening studier i 2D-kulturer viser ofte en signifikant respons (celledød eller målhemming), selv ved lavere konsentrasjoner, mens de ikke viser noen signifikant effekt når de blir forsinket hos mus37. En viktig årsak til dette er varierende legemiddeltilgjengelighet og opptak i en 2D-monolagskultur vs. 3D-kultur38.

Konseptet med 3D-kulturer har dukket opp som et kraftig verktøy for å studere utviklingen av kreft i det siste tiåret. 3D-kulturer involverer voksende celler på en ekstracellulær matrise, noe som resulterer i dannelsen av strukturer som ligner funksjonelle enheter tilstede i vevet in vivo16. 3D-kulturer etterligner in vivo mikromiljøet i stor grad og overvinner dermed begrensningene i 2D-kulturer39. Dessuten, siden cellene som dyrkes i 3D er av menneskelig opprinnelse og systemet er mer mottagelig for å studere tidlige hendelser, er det enklere og mer elegant enn gnagermodellene.

Ved hjelp av denne plattformen demonstreres en modell for å studere transformasjonsprosessen etter eksponering for en fosfolipidmediator som PAF. Studier fra vårt laboratorium har identifisert at PAF-behandling kan transformere den ikke-tumorogene brystepitelcellelinjen, MCF10A12. Denne metoden er optimalisert for kontinuerlig å eksponere cellene for PAF, på samme måte som in vivo-scenariet , der PAF er tilstede i mikromiljøet.

MCF10A-celler, når de vokser i 2D, må passeres hver 4. Hvis de ikke opprettholdes i henhold til protokollen, oppfører de seg veldig annerledes, noe som bare er synlig når de dyrkes på ECM16. Cellenes passasjenummer må holdes så lavt som mulig. Denne metoden har også begrensninger på grunn av variasjonen i proteinkonsentrasjon i forskjellige partier av lrECM. Dette kan overvinnes ved å teste de forskjellige batchene ved ganske enkelt å plating celler på en lrECM seng og observere størrelsesfordelingen av acini. Hvis det ikke er stor variasjon i størrelse, kan lrECM-batchen anses som passende for eksperimenter.

Vurdering av transformasjonen gjøres vanligvis ved immunfluorescens, som er demonstrert i videoen. Ved immunfluorescens er trinnene som involverer inkubasjon ved 4 °C kritiske; pipettering av løsningen når lrECM-laget er i flytende tilstand, gjør laget ujevnt, noe som fører til tap av acinarstrukturer. En av måtene å takle ujevnhetsproblemet på er å lagre lysbildene ved 4 °C på en jevn plattform over natten eller endre forstørrelsen der avbildningen gjøres. For å unngå pipettering av acinarstrukturene, fjern kammeret forsiktig fra 4 °C-lageret og fjern tre fjerdedeler av volumet som ble tilsatt innledningsvis, og ta deretter ut resten under de påfølgende vaskene.

Et annet stort problem er den høye bakgrunnen på grunn av lrECM. For å overvinne dette problemet kan man bruke et 2% sekundært blokkerende antistoff i stedet for 1%. Økende sekundær blokkering tjener imidlertid ikke formålet med å farge apikale markører og E-cadherin. I slike tilfeller anbefales det å utsette kammerdekselglasset etter dag 20 til PBS-EDTA i 15 minutter ved 4 °C, og deretter fikse acini etter samme protokoll som vist i videoen. PBS-EDTA løser delvis opp lrECM, og reduserer dermed bakgrunnen. Men hvis inkubasjonstiden overskrides, kan denne behandlingen føre til tap av strukturer mens pipettering av løsningen. Derfor må det utvises stor forsiktighet mens du utfører denne prosedyren. Det har også blitt observert at lagring av lysbildene i lengre perioder kan føre til en økning i bakgrunnssignalet. Derfor må bildebehandling gjøres så snart som mulig. Det anbefales å avbilde minst 15 acini per eksperiment for å bestemme en endring i fenotype.

3D-acinarkulturer har visse begrensninger, for eksempel vanskeligheter med å spore enkeltceller under levende celleavbildning. Visse studier, for eksempel effekter på cellesyklus, må utføres ved hjelp av levende celleavbildning for å opprettholde romlig og tidsmessig informasjon. På grunn av konstante endringer i struktur er det imidlertid vanskelig å spore slike parametere i 3D-acinarkulturer ved bruk av vanlige konfokale mikroskoper. Dette garanterer bruk av avanserte mikroskopiske teknikker som superoppløsningsmikroskopi eller Airyscan-mikroskopi. Det vil også kreve dislodging av acinarstrukturene for visse transformasjonsanalyser som sårheling, forankringsuavhengig vekst og in vivo tumorigenisitetsanalyser. Denne dislodging ville resultere i tap av viktig romlig og tidsmessig informasjon. Proteinlysater samlet fra kulturer blir ofte fortynnet på grunn av tilstedeværelsen av IrECM, noe som gir problemer med lasting av tilstrekkelig mengde lysater. Dette kan imidlertid overvinnes i større grad ved å løsne acini-strukturene og samle dem før lysis.

Her er det vist et modellsystem for å studere fosfolipidmediator/immunassosiert faktorindusert transformasjon. Denne modellen kan belyse genetiske og / eller epigenetiske veier som kan bli de-regulert, noe som fører til drastiske endringer i morfologi. Denne metoden kan også brukes til å skjerme potensielle terapier. Slike legemiddelscreeningstudier vil gi bedre suksess enn screeninger utført i 2D-kulturer38. Et stort høydepunkt i denne metoden er tilpasningsevnen i henhold til studiens krav. Behandlingsregimet og analysemetodene kan modifiseres etter behov. Videre kan denne metoden gi innsikt i den molekylære signaleringen som påvirkes ved behandling40. Teknikken vil også bidra til å forutsi mulig forekomst av stoffresistens. Videre vil det også bidra til å belyse mekanismen som er involvert i stoffresistens og identifisere plausible mål for å overvinne det samme. Studier har etablert muligheter for samdyrking av flere celletyper i 3D, som videre kan modifiseres for å imøtekomme behandlingsregimet41. Slike muligheter vil gi større innsikt i egenskapene og molekylære endringer som skjer in vivo under initiering og progresjon av brystkreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen potensielle interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker IISER Pune Microscopy Facility for tilgang til utstyr og infrastruktur og støtte til eksperimentene. Denne studien ble støttet av et tilskudd fra Institutt for bioteknologi (DBT), Indias govt. (BT / PR8699 / MED / 30/1018/2013), Science and Engineering Research Board (SERB), Indias govt. (EMR / 2016 / 001974) og delvis av IISER, Pune Core-finansiering. A. K. ble finansiert av CSIR-SRF-stipend, LA ble finansiert gjennom DST-INSPIRE-fellesskap, V.C. ble finansiert av DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA Invitrogen 25300062
16% paraformaldehyde Alfa Aesar AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488 Invitrogen A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488 Invitrogen A-11008
BSA Sigma A7030
Chamber Coverglass Nunc 155409
Cholera Toxin Sigma C8052-1MG 1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope Leica Leica SP8
DMEM Gibco 11965126
EDTA Sigma E6758
EGF Sigma E9644-0.2MG 100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen Jackson Immunoresearch 115-006-006
GM130 antibody Abcam ab52649
Goat Serum Abcam ab7481
Hoechst Invitrogen 33258
Horse Serum Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma H0888 1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software ImageJ
Insulin Sigma I1882 10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel) Corning 356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) Invitrogen S36937
Nuclear Stain  (Hoechst) Invitrogen 33258
PAF Cayman Chemicals 91575-58-5 Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin Lonza 17-602E
Sodium Azide Sigma S2002
Tris Base Sigma B9754
Triton X-100 Sigma T8787
Tween 20 Sigma P9416
Vimentin antibody Abcam ab92547
α6-integrin antibody Millipore MAB1378

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
  2. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  3. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  4. Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
  5. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  6. Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
  7. Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
  8. Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
  9. Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
  10. Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
  11. Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
  12. Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
  13. Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
  14. Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  17. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  18. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  19. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
  20. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
  21. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  22. Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
  23. Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
  24. Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
  25. Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
  26. Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
  27. Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
  28. Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
  29. Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
  30. Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
  31. Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
  32. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  33. Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
  34. McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
  35. Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
  36. Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
  37. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  38. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  39. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  40. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  41. Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).

Tags

Cancer Research Fosfolipid mediator MCF10A celler tredimensjonale kulturer transformasjon PAF
Fosfolipid mediator indusert transformasjon i tredimensjonale kulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuttanamkuzhi, A., Anandi, L.,… More

Kuttanamkuzhi, A., Anandi, L., Chakravarty, V., Lahiri, M. Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (185), e64146, doi:10.3791/64146 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter