L’article décrit la méthode d’isolement des cellules endothéliales glomérulaires immortalisées conditionnellement des reins de souris transgéniques exprimant le virus simien thermolabile 40 et les mitochondries photo-activables, PhAMexcisée. Nous décrivons la procédure d’isolement des glomérules à partir de reins entiers à l’aide de billes, d’étapes de digestion, d’ensemencement et de culture de GECs-CD31 positifs.
Le dysfonctionnement des cellules endothéliales glomérulaires (GEC) peut initier et contribuer à la dégradation de la barrière de filtration glomérulaire. L’augmentation du stress oxydatif mitochondrial a été suggérée comme un mécanisme entraînant un dysfonctionnement GEC dans la pathogenèse de certaines maladies glomérulaires. Historiquement, l’isolement des GEC des modèles in vivo a été notoirement difficile en raison des difficultés à isoler les cultures pures des glomérules. Les GEC ont des besoins de croissance complexes in vitro et une durée de vie très limitée. Ici, nous décrivons la procédure d’isolement et de culture de GEC conditionnellement immortalisés avec des mitochondries fluorescentes, permettant le suivi des événements de fission et de fusion mitochondriales. Les GEC ont été isolés à partir des reins d’une double souris transgénique exprimant le thermolabile SV40 TAg (de l’Immortomouse), favorisant conditionnellement la prolifération et supprimant la différenciation cellulaire, et une protéine fluorescente photoconvertible (Dendra2) dans toutes les mitochondries (de la souris photo-activable mitochondria [PhAMexcisée]). La lignée cellulaire stable générée permet la différenciation cellulaire après inactivation du gène TAg immortalisant SV40 et la photo-activation d’un sous-ensemble de mitochondries provoquant un passage de la fluorescence du vert au rouge. L’utilisation de mitoDendra2-GECs permet d’imager en direct les événements de distribution, de fusion et de fission des mitochondries fluorescentes sans colorer les cellules.
Le glomérule est essentiel pour la filtration du sang en limitant le passage des grosses molécules à travers la barrière de filtration glomérulaire 1,2. Le glomérule contient quatre types de cellules: les cellules épithéliales pariétales, les podocytes (cellules épithéliales viscérales), les cellules endothéliales glomérulaires (GEC) et les cellules mésangiales3. L’endothélium glomérulaire est caractérisé par une structure vasculaire unique, selon la présence de fenestrae nécessaires pour de grands volumes de filtration4. La surface apicale de l’endothélium glomérulaire est recouverte d’une couche de glycocalyx chargée négativement et d’une couche appelée couche de surface endothéliale qui crée un espace entre l’endothélium et le sang. Cette structure assure une sélectivité de charge élevée limitant le passage des molécules chargées négativement telles que l’albumine et empêchant l’adhésion leucocytaire et plaquettaire5.
Les GEC sont très sensibles aux changements métaboliques, tels que l’hyperglycémie associée au milieu diabétique. En effet, le diabète entraîne une circulation accrue des substances nocives, la saturation des voies métaboliques du glucose, et une perturbation de l’équilibre redoxcellulaire 3,6. De plus, l’augmentation des espèces réactives de l’oxygène induit un dysfonctionnement mitochondrial, ce qui affecte la fonction endothéliale7.
L’objectif global du protocole actuel est d’isoler les cellules endothéliales glomérulaires immortalisées présentant des caractéristiques mitochondriales fluorescentes. En effet, la culture cellulaire des GEC primaires a un cycle prolifératif limité et une sénescence précoce8. De plus, la présence de mitochondries fluorescentes aide à examiner les événements de fission et de fusion en réponse à l’hyperglycémie ou à tout autre traitement. Comme méthode alternative, d’autres laboratoires ont utilisé h-TERT pour immortaliser les cellules in vitro9.
La méthode décrite ici permet d’isoler des cellules endothéliales glomérulaires mitoDendra2 immortalisées sous condition chez des animaux âgés de 4 à 6 semaines (Figure 1). Ce protocole détaillé décrit l’utilisation de souris transgéniques (H-2K b-tsA58) hébergeant le gène 10,11 du grand antigène tumoral du virus simien 40 (SV40 TAg) pour générer des cellules thermolabiles immortalisées sous condition. Le produit du gène TAg tsA58 est fonctionnel à la température permissive de 33 °C sous le contrôle du promoteur flanquant 5′ inductible du gène H-2Kb de la souris, qui est augmenté au-dessus des niveaux basaux lors de l’exposition à l’interféron gamma (IFNγ), maintenant ainsi le phénotype de prolifération conditionnelle12. H-2Kb se dégrade rapidement à la température non permissive de 37 °C en l’absence d’IFNγ, supprimant la fonction immortalisant du tsA58Tag dans les cellules et permettant aux cellules de développer un phénotype 13,14,15 plus différencié. Le croisement optionnel de souris transgéniques H-2Kb-tsA58 avec des souris PhAM, qui expriment un Dendra2-vert spécifique aux mitochondries (sous-unité VIII de la cytochrome c oxydase), permet la détection en direct de mitochondries fluorescentes16. La fluorescence verte Dendra2 passe à la fluorescence rouge après exposition à un laser 405 nm16. Lorsque les mitochondries fusionnent après photo-commutation, elles forment des formes allongées qui apparaissent jaunes à cause de l’échange de matière verte et jaune ou apparaissent rouges lorsqu’elles subissent une fission 7,17. Les mitoDendra2-GECs sont un excellent outil pour étudier les réponses cellulaires des mitochondries GEC à différents stimuli.
Les mitochondries sont essentielles au métabolisme cellulaire, à l’homéostasie et aux réponses au stress, et leur dysfonctionnement est lié à de nombreuses maladies, y compris les maladies rénales. Les mitochondries jouent un rôle dans la génération pathologique d’espèces réactives excessives de l’oxygène (ROS), la régulation des niveaux de calcium intracellulaire, les voies de mort cellulaire et la dynamique cytosquelettique21,22,23</sup…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le professeur Cijiang He et le Dr Fu Jia pour leurs connaissances sur l’isolement des cellules endothéliales chez la souris et remercient le professeur Mone Zaidi d’avoir fourni les sourisexcisées PhAM et des discussions précieuses. Les auteurs aimeraient également remercier le CORE de microscopie de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï et le personnel pour les conseils que nous avons reçus. Ce travail a été soutenu par des subventions de la subvention R01DK097253 des National Institutes of Health et de la subvention CDMRP E01 W81XWH2010836 du ministère de la Défense à I.S.D.
100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
25G butterfly | BD | 367298 | |
3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
40 µm nylon mesh | |||
Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
CD31 | abcam | ab7388 | |
Collagenase type I | Corning | 354236 | |
Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
IFNg | Cell Science | CRI001B | |
Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
RPMI | GIBCO | 3945 | |
Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |