המאמר מתאר את השיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים מותנים מכליות של עכברים מהונדסים המבטאים את נגיף סימיאן התרמולבילי 40 ואת המיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית, PhAMנכרת. אנו מתארים את ההליך לבידוד גלומרולי מכליות שלמות באמצעות חרוזים, שלבי עיכול, זריעה וגידול של GECs-CD31 חיובי.
תפקוד לקוי של תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) יכול ליזום ולתרום לפירוק מחסום סינון גלומרולרי. עקה חמצונית מיטוכונדריאלית מוגברת הוצעה כמנגנון הגורם לתפקוד לקוי של GEC בפתוגנזה של מחלות גלומרולריות מסוימות. מבחינה היסטורית, הבידוד של GECs ממודלים in vivo היה מאתגר לשמצה בשל קשיים בבידוד תרבויות טהורות מגלומרולי. ל-GECs יש דרישות גידול מורכבות במבחנה ותוחלת חיים מוגבלת מאוד. במאמר זה נתאר את הליך הבידוד וההתרבות של GECs מונצחים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית, מה שמאפשר מעקב אחר ביקוע מיטוכונדריאלי ואירועי היתוך. GECs בודדו מכליות של עכבר מהונדס כפול המבטא את התרמולביל SV40 TAg (מה-Immortomouse), מקדם באופן מותנה התפשטות ודיכוי התמיינות תאים, וחלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה (Dendra2) בכל המיטוכונדריה (מהעכבר המיטוכונדריה הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAMנכרת]). קו התאים היציב שנוצר מאפשר התמיינות תאים לאחר השבתה של הגן האמונטלי SV40 TAg והפעלה פוטו-אקטיבית של תת-קבוצה של מיטוכונדריה הגורמת למתג בפלואורסצנטיות מירוק לאדום. השימוש ב-mitoDendra2-GECs מאפשר הדמיה חיה של אירועי התפלגות, איחוי וביקוע של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מבלי להכתים את התאים.
הגלומרולוס חיוני לסינון הדם על ידי הגבלת המעבר של מולקולות גדולות דרך מחסום הסינון הגלומרולרי 1,2. הגלומרולוס מכיל ארבעה סוגי תאים: תאי אפיתל קודקודיים, פודוציטים (תאי אפיתל קרביים), תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) ותאים מסנגיאליים3. האנדותל הגלומרולרי מאופיין במבנה כלי דם ייחודי, בהתאם לנוכחות של fenestrae הנדרשת לנפחי סינון גדולים4. המשטח האפיקלי של האנדותל הגלומרולרי מכוסה בשכבת גליקוקליקס טעונה שלילית ובשכבה הנקראת שכבת פני השטח של האנדותל היוצרת רווח בין האנדותל לדם. מבנה זה מספק סלקטיביות מטען גבוהה המגבילה את המעבר של מולקולות טעונות שלילית כגון אלבומין ומניעת הידבקות לויקוציטים וטסיות דם5.
GECs רגישים מאוד לשינויים מטבוליים, כגון היפרגליקמיה הקשורה לסביבה הסוכרתית. ואכן, סוכרת מובילה לזרימת דם מוגברת של חומרים רעילים, לרוויה של מסלולי חילוף החומרים של הגלוקוז ולהפרעה במאזן החיזור התאי 3,6. יתר על כן, העלייה בכמות החמצן הריאקטיבי גורמת לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מה שמשפיע על תפקוד האנדותל7.
המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לבודד תאי אנדותל גלומרולריים מונצחים עם תכונות מיטוכונדריאליות פלואורסצנטיות. ואכן, לתרבית התאים של GECs ראשוניים יש מחזור התפשטות מוגבל וסנסנציה מוקדמת8. בנוסף, נוכחות של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מסייעת לבחון אירועי ביקוע ואיחוי בתגובה להיפרגליקמיה או כל טיפול אחר. כשיטה חלופית, מעבדות אחרות השתמשו ב-h-TERT כדי להנציח תאים במבחנה9.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת בידוד של תאי האנדותל הגלומרולריים mitoDendra2 המונצחים מותנה מחיות בנות 4-6 שבועות (איור 1). פרוטוקול מפורט זה מתאר את השימוש בעכברים מהונדסים (H-2K b-tsA58) המכילים את נגיף הסימיאן 40 אנטיגן גידולי גדול (SV40 TAg) גן10,11 ליצירת תאים אימורטליים מותנים תרמולביליים. תוצר הגן tsA58 TAg מתפקד בטמפרטורה המתירנית של 33 מעלות צלזיוס תחת שליטתו של מקדם האגפים 5′ הבלתי ניתן להשראה של הגן H-2K b של העכבר, אשר מוגבר מעל הרמות הבסיסיות עם חשיפה לגמא אינטרפרון (IFNγ), ובכך שומר על פנוטיפ ההתפשטות המותנה12. H-2Kb מתפרק במהירות בטמפרטורה הלא מתירנית של 37 מעלות צלזיוס בהיעדר IFNγ, מסיר את הפונקציה המונצחת של tsA58Tag בתאים ומאפשר לתאים לפתח פנוטיפ ממוין יותר13,14,15. חצייה אופציונלית של עכברי H-2Kb-tsA58 מהונדסים עם עכברי PhAM, המבטאים מיטוכונדריה ספציפית (תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז) דנדרה2-ירוקה, מאפשרת זיהוי חי של מיטוכונדריה פלואורסצנטית16. פלואורסצנציה ירוקה של Dendra2 עוברת לפלואורסצנציה אדומה לאחר חשיפה ללייזר 405 ננומטר16. כאשר המיטוכונדריה מתמזגים לאחר החלפת תמונות, הם יוצרים צורות מוארכות שנראות צהובות מחילופי חומרים ירוקים וצהובים או נראות אדומות כאשר הן עוברות ביקוע 7,17. MitoDendra2-GECs הם כלי נהדר לחקר התגובות התאיות של מיטוכונדריה של GEC לגירויים שונים.
מיטוכונדריה חיונית לחילוף החומרים בתאים, להומאוסטזיס ולתגובות סטרס, ותפקוד לקוי שלהם קשור למחלות רבות, כולל מחלות כליות. למיטוכונדריה יש תפקיד ביצירה הפתולוגית של מיני חמצן תגובתי יתר (ROS), בוויסות רמות הסידן התוך-תאי, במסלולי המוות של התאים ובדינמיקה הציטוסקטלית 21,22,23.<s…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לפרופסור צ’יג’יאנג הוא ולד”ר פו ג’יה על התובנות שלהם בבידוד תאי אנדותל בעכברים ומודים לפרופסור מונה זיידי על שסיפקו את העכבריםשנכרתו על ידי PhAM ודיונים חשובים. המחברים רוצים גם להודות למיקרוסקופיה CORE בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני ולצוות על ההדרכה שקיבלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות מענק R01DK097253 ומענק CDMRP של משרד ההגנה E01 W81XWH2010836 ל- I.S.D.
100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
25G butterfly | BD | 367298 | |
3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
40 µm nylon mesh | |||
Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
CD31 | abcam | ab7388 | |
Collagenase type I | Corning | 354236 | |
Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
IFNg | Cell Science | CRI001B | |
Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
RPMI | GIBCO | 3945 | |
Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |