Summary
本文描述了从表达热不稳定猿病毒40和光激活线粒体PhAM切除的转基因小鼠的肾脏中分离条件永生化肾小球内皮细胞的方法。我们描述了使用磁珠、消化步骤、播种和培养 GEC-CD31 阳性从整个肾脏中分离肾小球的程序。
Abstract
肾小球内皮细胞（GEC）功能障碍可引发并导致肾小球滤过屏障破坏。线粒体氧化应激增加被认为是导致某些肾小球疾病发病机制中GEC功能障碍的机制。从历史上看，由于难以从肾小球中分离纯培养物，因此从 体内 模型中分离GECs一直具有挑战性。GEC在 体外 具有复杂的生长要求，并且寿命非常有限。在这里，我们描述了用荧光线粒体分离和培养有条件永生化GEC的程序，从而能够跟踪线粒体裂变和融合事件。GECs从表达不稳定性的SV40 TAg（来自Immortomouse）的双转基因小鼠的肾脏中分离，有条件地促进增殖和抑制细胞分化，以及所有线粒体中的光转换荧光蛋白（Dendra2）（来自光激活线粒体[PhAM切除]小鼠）。产生的稳定细胞系允许在永生化SV40 TAg基因失活和线粒体亚群的光活化后进行细胞分化，从而导致荧光从绿色切换到红色。使用mitoDendra2-GEC可以对荧光线粒体的分布，融合和裂变事件进行实时成像，而不会对细胞进行染色。
Introduction
肾小球通过限制大分子通过肾小球滤过屏障而对血液滤过至关重要1，2。肾小球包含四种细胞类型：壁上皮细胞、足细胞（内脏上皮细胞）、肾小球内皮细胞 （GEC） 和系膜细胞3。肾小球内皮的特征在于独特的血管结构，根据大过滤量所需的Fenestrae的存在4。肾小球内皮的顶端表面覆盖着带负电荷的糖萼层和称为内皮表层的涂层，该涂层在内皮和血液之间形成空间。这种结构提供了高电荷选择性，限制了带负电荷的分子（如白蛋白）的通过，并防止了白细胞和血小板粘附5。
GEC对代谢变化非常敏感，例如与糖尿病环境相关的高血糖症。事实上，糖尿病会导致有害物质循环增加，葡萄糖代谢途径饱和，并扰乱细胞氧化还原平衡3，6。此外，活性氧的增加诱发线粒体功能障碍，从而影响内皮功能7。
当前方案的总体目标是分离具有荧光线粒体特征的永生化肾小球内皮细胞。事实上，原代GEC的细胞培养具有有限的增殖周期和早期衰老8。此外，荧光线粒体的存在有助于检查高血糖或任何其他治疗的裂变和融合事件。作为一种替代方法，其他实验室使用h-TERT在体外使细胞永生化9。
这里描述的方法允许从4-6周龄的动物中分离有条件永生化的mitoDendra2肾小球内皮细胞（图1）。该详细协议描述了使用携带猿病毒40大肿瘤抗原（SV40 TAg）基因10，11的转基因小鼠（H-2K b-tsA58）来产生热不稳定的条件永生化细胞。tsA58 TAg基因产物在小鼠H-2Kb基因的诱导5'侧翼启动子的控制下在33°C的允许温度下起作用，该启动子在暴露于干扰素γ（IFNγ）时升高到基础水平以上，因此维持条件增殖表型12。在没有IFNγ的情况下，H-2Kb在37°C的非允许温度下迅速降解，消除了细胞中tsA58Tag的永生化功能，并允许细胞发展出更分化的表型13，14，15。H-2Kb-tsA58转基因小鼠与PhAM小鼠的选择性杂交，PhAM小鼠表达线粒体特异性（细胞色素c氧化酶亚基VIII）Dendra2-green，允许活检测荧光线粒体16。Dendra2 绿色荧光在暴露于 405 nm 激光16 后切换到红色荧光。当线粒体在光开关后融合时，它们形成细长的形状，由于绿色和黄色物质的交换而呈现黄色，或者在发生裂变时呈现红色7，17。mitoDendra2-GEC是研究GEC线粒体对不同刺激的细胞反应的好工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这里描述的所有动物程序都得到了西奈山伊坎医学院的IACUC的批准。我们使用从杰克逊实验室购买的三只雄性小鼠（H-2Kb-tsA58转基因小鼠，具有光激活线粒体[PhAM]），并保持正常的食物饮食。
1. 工作条件和准备
- 使用 70% 乙醇和 UV-C 光清洁层流罩内的工作空间。
- 准备珠子的洗涤缓冲液。使用 pH 7.4-8.0 的 0.1 M 磷酸钠制备缓冲液-1，使用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 制备缓冲液-2，不含钙和镁，并补充有 0.1% 牛血清抗原 （BSA）、3 mM EDTA、pH 7.4 和缓冲液-3，使用 0.2 M Tris 和 0.1% BSA，pH 8.5。
2. 磁粉浓缩器
- 磁珠的制备
- 在 1.5 mL 微量离心管中，将 200 μL 磁珠（4 x 108 颗磁珠）与 200 μL 缓冲液-1 轻轻混合。
注意：在组织收获前1天，每只小鼠准备200μL磁珠。珠子将用于收获肾小球。 - 将管放入磁粉浓缩器中1分钟，然后小心地吸出上清液。从磁体上取下试管，将洗涤过的珠子重悬于200 μL缓冲液-1中。
- 将含有磁珠的管放入磁粉浓缩器中1分钟，轻轻吸出上清液。
- 通过将试管放入磁粉浓缩器中并丢弃缓冲液，使用 200 μL 缓冲液-2 洗涤磁珠 2 次，每次 5 分钟，灭活游离甲苯磺酰基团。
- 将磁珠在 200 μL 缓冲液-3 中在 4 °C 下孵育 24 小时，或在 37 °C 下孵育 4 小时，以灭活剩余的游离甲苯磺酰基。将管放入磁性浓缩器中1分钟，轻轻吸出上清液，然后丢弃。
- 用200μL缓冲液-2在4°C下洗涤磁珠1x5分钟。 将管放回磁性浓缩器中1分钟，轻轻吸出上清液。从磁集中器中取出试管，将磁珠重悬于 200 μL 缓冲液-2 中，以获得 4 x 108 磁珠/mL。
注意：在此阶段，可以将珠子在4°C下放置长达15天。
- 在 1.5 mL 微量离心管中，将 200 μL 磁珠（4 x 108 颗磁珠）与 200 μL 缓冲液-1 轻轻混合。
3.小鼠肾小球细胞的分离
- 准备灌注材料：30 mL注射器，25 G蝶针。准备隔离材料：无菌10厘米培养皿，手术刀，磁粉浓缩器，40μm细胞过滤器，100μm细胞过滤器。
- 准备 100 mL 补充有 1% 抗生素的 1x Hank 平衡盐溶液 （HBSS），并将 pH 值调节至 7.35。用0.2μm过滤器过滤溶液并将其保持在引擎盖下以避免污染。
- 将步骤 2.1.6 中的 200 μL 磁珠与 20 mL 1x HBSS 混合。
注意：对于每只小鼠，将需要 200 μL 在 20 mL HBSS 1x 中稀释的磁珠。 - 在 pH 7.35 的 1x HBSS 溶液中以 1 mg/mL 的比例制备 1 mL 等分试样的 II 型胶原酶 （125 CDU/mg）。在37°C的水浴中用10%FCS培养基预热RPMI。 在37°C下预热内皮细胞培养基（详见 材料表 ）。
注意：RPMI将用于中和胶原酶。 - 在室温下用 2 mL 的 10 μg/mL 胶原蛋白 IV（1 mL/孔）预涂 6 孔板的两个孔 45 分钟。用1x PBS清洗板3次，以除去用于稀释胶原蛋白的乙酸。立即使用涂层板或在2-8°C下储存长达4周。
注意：最好用透明薄膜密封板以防止干燥。胶原蛋白涂层有助于细胞附着在板上。 - 使用70%乙醇清洁并消毒 图2 中的所有手术器械，随后高压灭菌30分钟。用70%乙醇清洁手术工作区。
- 用腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪（10mg / mL氯胺酮和1mg / mL甲苯噻嗪）麻醉小鼠。要确认动物是否完全麻醉，请检查脚趾捏反射。
- 用 19 G 针固定鼠标的爪子，将其固定在解剖平台上。用70%乙醇清洁胸部和腹部，并用剪刀a沿胸部打开腹部（图2）。
- 将蝶针插入左心室（图3A）并注入约100μL珠溶液（来自步骤1.2）以扩大血液循环。
- 小心地用19G针头打破肾脏下方的下腔静脉（图3A）。继续在步骤3.9中启动的灌注。
注意：或者，可以使用迷你泵，速度：18.0+，时间：5分钟。良好的灌注对于收获大量含肾小球的磁珠很重要。这是一个非生存/终末期手术。 - 用镊子轻轻去除脂肪组织，并用细手术剪刀c（图2）切除两个肾脏，并将它们放入冰上装有1mL 1x HBSS的平板中。用剪刀b（图2）切碎肾脏，然后用无菌手术刀切成1毫米的小块，如图 3B所示。
- 接下来，将切碎的肾脏与步骤3.4中的1mLII型胶原酶在37°C下孵育35分钟，并使用水平振荡器轻轻倾斜。在此步骤之后，组织应完全消化，如图 3C所示。
- 加入 4 mL 含有 10% FBS（来自步骤 3.4）的 RPMI 以中和胶原酶。通过无菌的100μm细胞过滤器将消化的组织过滤到50 mL管中。使用无菌 1.5 mL 微量离心管的底部将消化的组织搅拌到过滤器上，以使肾小球通过。
- 用 15 mL 的 1x HBSS 冲洗细胞过滤器，然后在室温下以 200 x g 离心流出物 5 分钟。此时，颗粒包含三层;在管的中间层可以看到带有肾小球的珠子，上层由较小的结构（例如小管）组成，下层是碎片（图3D）。
- 小心地吸出上清液和顶部白色层。剩余的颗粒包含带有肾小球和碎片的珠子（图3D）。用 1.5 mL 的 1x HBSS 重悬沉淀，并转移到 2 mL 管中。
- 将管放入磁性浓缩器（图3E），吸出上清液，然后用1mL的1x HBSS洗涤珠子2次;在此阶段，将 20 μL 细胞悬液放在载玻片上以在显微镜下验证肾小球的存在（图 3F;悬液中有一个肾小球 [黑色箭头]，一些珠子 [黄色箭头]）。
- 小心吸出上清液，将沉淀重悬于内皮细胞生长培养基中（材料表），并将其转移到干净的2 mL管中。向管中加入 2 μL IFNγ （100 U/mL），并将细胞接种到 6 孔板的一个孔中。将细胞在33°C孵育。
- 培养 3 天后，通过移出 1 mL 培养基并用 1 mL 新鲜培养基替换来小心更换培养基。在这个阶段，细胞是异质的，肾小球细胞的混合物（图4G）。
注意：在生长的培养物中，将有肾小球细胞和一些磁珠的混合物（图4G）。请注意，所有细胞都应显示绿色荧光线粒体。 - 培养 7 天后，完全吸出培养基，并用补充有 IFNγ （100 U/mL） 的新鲜 2 mL 内皮细胞生长培养基替换。在这个阶段，细胞开始增殖，但仍然是异质的（图4A）。
- 培养10天后，当细胞达到~80%汇合时，如步骤5.1中所述使用胰蛋白酶传代细胞，然后将它们转移到涂有胶原蛋白IV的T25烧瓶中。
- 1周后（总共~21天的培养），将细胞传代到涂有胶原蛋白IV的T75烧瓶中。
4. 内皮细胞分离用磁珠的制备
- 首先用大鼠抗鼠CD31抗体3，18，19涂覆绵羊抗鼠珠。每个 T75 烧瓶使用 10 μL 珠子。
- 用补充有 0.1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素的 200 μL 1x PBS 洗涤 3 次 10 μL 珠子。将试管放入浓缩器磁铁中，每次移液洗涤缓冲液。
- 将磁珠重悬于 200 μL PBS、1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素中。加入4.8μL大鼠抗小鼠CD31抗体7，18，19，将管放在水平振荡器上并在室温下轻轻混合1小时，然后将管在4°C下保持过夜。
5.用CD31包被的珠子分离肾小球内皮细胞
- 向T75烧瓶中加入3mL 0.25%胰蛋白酶，并将细胞在37°C孵育5分钟。用3mL内皮生长培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移到15mL管中，然后以200× g 离心5分钟。
- 吸出上清液并在含有 1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素的 1 mL PBS 中洗涤细胞。以200 x g 离心5分钟。
- 将沉淀重悬于步骤 4 中制备的 200 μL 包被珠中，并加入含有 1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素的 800 μL PBS。将细胞在37°C，5%CO2下连续振荡孵育45分钟。
- 将试管放入磁浓缩器中，用含有1%BSA，2mM EDTA，1%青霉素/链霉素的1x PBS洗涤细胞4倍。将细胞重悬于补充有 100 U/mL IFNγ 的 3 mL 内皮生长培养基中。
- 在 6 孔板上的胶原蛋白 IV 包被孔中板 1.5 mL 细胞/孔中。在33°C的允许条件下培养细胞。
注意：分离的细胞表达猿病毒40（SV40）大T抗原tsA58，能够在33°C（允许条件）下激活连续增殖。 - 培养 4 天后，取出 750 μL 培养基，并用补充有 100 U/mL IFNγ 的相同体积的新鲜培养基代替。
- 培养 10 天至 14 天后，使用带有 488 nm 滤光片的落射荧光显微镜检查表达荧光线粒体的生长 CD31 阳性 GEC 集落（图 4C）。
- 培养21天后，细胞可能达到80%-90%汇合;将它们转移到T25烧瓶中。达到汇合后，可以用RPMI生长培养基和10%FCS维持细胞。
注意：在达到汇合之前，细胞可能看起来是异质的（图4B）。然而，一旦它们汇合，它们就会获得鹅卵石形态。 - 在这个阶段，细胞可以被冷冻保存。达到80%汇合度后，向细胞中加入3mL的0.25%胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟。用补充有10%FBS的等体积生长培养基中和胰蛋白酶。
- 以200 x g 离心5分钟。弃去上清液并将细胞重悬于3mL冷冻培养基（RPMI，20%FBS，10%DMSO）中。将细胞分装在冷冻管中，并将其储存在液氮蒸气温度下。
6. 培养有丝分裂树2-GEC
- 从步骤5.10开始，在37°C的水浴中解冻来自冷冻等分试样的细胞，并将它们转移到带有10mL预热内皮生长培养基的15mL管中。
- 在室温下以200× g 离心悬浮液5分钟。除去培养基，并将沉淀转移到胶原蛋白IV包被的T25cm2 细胞培养瓶中，该培养瓶中装有补充有100U / mL IFNγ的预热内皮细胞生长培养基，并在33°C下孵育。
- 第二天更换培养基。当细胞达到70%-80%汇合时，通常在5天后，将它们转移到T75cm2 细胞培养瓶中。
- 为了将细胞分化为内皮表型，将细胞转移到37°C的无IFNγ生长培养基中的非允许条件。
7. 丝裂树2-GEC的传代
- 取出培养基，用PBS洗涤细胞，并加入3mL温热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（T75cm2 烧瓶），在37°C孵育5分钟。
- 细胞分离后，加入 5 mL 生长培养基并上下移液。在室温下以200× g 离心悬浮液5分钟，并将细胞转移到新的胶原蛋白IV包被烧瓶或平板中。
注意：传代应每周进行一次，比例为1：4。
8. 丝分裂树2-GEC的表征
- 对分化的细胞7，18，19，20进行CD31的免疫荧光染色（图4D）。使用其他标志物，如vWF和异凝集素-B4以及20。
- 为了确认Dendra2的线粒体特异性，通过将细胞在含有100nM线粒体追踪器的生长培养基中在37°C，5%CO2下孵育30分钟，用线粒体特异性标记标记细胞。
- 取出培养基，用不含酚红的预热培养基轻轻洗涤细胞以进行实时成像。
注意：或者，可以使用甲醛固定剂（4%）固定细胞30分钟，然后在PBS中洗涤几次。固定电池可以在4°C下储存在1x PBS中直至使用。流式细胞术也可以进行确认：用抗CD31，抗PECAM，抗CD45标记细胞。GEC 的足细胞标志物（突触足素、Nphs1、Podxl）、系膜细胞标志物（PDGFRβ、血管紧张素原）和肾小管细胞标志物（水通道蛋白、氨基肽酶-N）应呈阴性。这些标记物用作阴性对照。由于这些细胞的线粒体特异性Dendra2表达，请避免使用FITC通道。
9. 响应氧化应激或高葡萄糖的线粒体结构变化的活细胞成像
- 使用内皮细胞生长培养基在涂有胶原蛋白IV的35毫米玻璃底培养皿上板1 x 105 GEC（材料表）。24小时后，换成不含酚红的培养基。细胞具有绿色荧光线粒体。
- 在实验开始前1小时将环境室置于37°C，5%湿度和5%CO2 小时。
- 在共聚焦显微镜下，使用40x/1.2 W物镜调整焦点并选择感兴趣区域。将细胞与 2mL 的 5 mM 或 25 mM 葡萄糖孵育 60 分钟。
- 将细胞暴露在405nm激光（4%激光功率）下，将线粒体亚群从绿色光转换为红色（图5A-B，D-E）。
- 使用 561 nm 激光在未转换状态下激发 Dendra2，以可视化红色荧光。详见前面描述的光切换协议16。由于绿色基质和红色基质融合，融合事件在几分钟后显示为黄色荧光（图4C，F）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在本文中，描述了用于分离具有稳定荧光线粒体（mitoDendra2-GEC）的条件永生化肾小球内皮细胞的详细方案（图1）。使用年轻的6-10周龄小鼠对于获得大量健康细胞至关重要。培养3天后，细胞开始从分离的肾小球缓慢生长，如图3G所示。7天后，细胞呈异质性，显示其他肾小球细胞类型，如足细胞，壁上皮细胞和系膜细胞（图4A）。达到70%至80%汇合后，使用具有磁性CD31标记磁珠的内皮细胞的阳性选择去除其他肾小球细胞（图4B-C）。mitoDendra2-GEC表达CD31（图4D），足细胞标志物呈阴性，如突触足素阴性染色所示（图4E-F）。
线粒体2-GEC中的荧光线粒体特征允许在体外各种条件下研究线粒体形态。在这里，我们测试了高葡萄糖（25mM）对线粒体结构的影响 线虫Dendra2-GECs（图5D-F）。与正常葡萄糖（5mM;图5A-C），高葡萄糖诱导的线粒体碎裂或裂变，如突出的球状线粒体观察到的那样（图5E）。此外，我们使用 405 nm 激光在单个活的 mitoDendra2-GEC 中对选定的线粒体亚群进行光转换（图 5A，D）。在图5B和图5E中，显示了线粒体在选定区域中从绿色（488nm）到红色（561nm）的成功光转换。重要的是，它允许见证在正常葡萄糖下生长的线粒腺2-GEC中的融合事件，正如线粒体基质融合导致的黄色合并的绿色和红色荧光所观察到的那样（图5C）。相比之下，在高葡萄糖处理的线状腺2-GEC中，线粒体是破碎的，主要是红色的（图5F），这表明，在测试的时间范围内，裂变/聚变事件由于高葡萄糖处理造成的损害而被延迟或抑制，这与以前的报告一致18，19。
图1：鼠GEC分离的代表性描述。 该图代表了GEC分离的重要步骤，从用磁珠灌注小鼠心脏以分离肾小球，消化胶原酶，培养肾小球细胞，最后使用CD31包被的磁珠纯化GEC。 请点击此处查看此图的大图。
图2：肾脏夹层的描述。 解剖所需的所有无菌手术器械的代表性图像。需要剪刀（a）来打开小鼠的皮肤，需要一把单独的剪刀（b，c）来隔离肾脏。需要镊子（d）和（e）来固定皮肤。需要镊子（f）来收集解剖的肾脏。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：肾小球收获的描述 。 （A）使用20mL注射器用HBSS珠溶液灌注左心室。用19G针穿孔下腔静脉。（B）灌注后，从肾脏中取出脂肪并将其切成1毫米的碎片。（C）用II型胶原酶消化组织。（四）消化离心后，形成三层;带有肾小球的珠子位于中间层，如黑色箭头所示。（E）使用磁集中器分离带有肾小球的分离珠子。（F）新鲜分离的肾小球的代表性图像。（G）3天后从孤立的肾小球中生长细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图4：体外线粒 体测定 。 （A）培养3天后的肾小球细胞。（B） 7 天后的 GEC。（D）用CD31标记的磁珠纯化GEC。CD31染色的显微成像。（E）GEC对突触足素呈阴性。（F）用突触足素（488nm，绿色荧光）染色的足细胞作为阴性对照。 请点击此处查看此图的大图。
图5：体外荧光线粒体融合的显微成像。使用共聚焦显微镜使用40倍水镜获取图像。（A-B）用405nm线（4%激光功率）以6.3-12.61/像素的速度照射选定的区域（红色圆圈）进行300次漂白迭代，如前所述16。（A-C）含有5mM葡萄糖的生长培养基中的细胞;绿色荧光（488nm）显示健康的线粒体。（乙，东）线粒体被光切换到红色（567nm）。（C）黄色荧光检测到用5mM葡萄糖处理的GEC的活性融合事件。（D）用高葡萄糖25mM处理细胞30分钟。绿色荧光显示碎片状线粒体和（E）光转换为红色的部分。（F）该图显示了减少的聚变事件，如减少的黄色荧光所示。请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
线粒体对细胞代谢、稳态和应激反应至关重要，其功能障碍与许多疾病有关，包括肾脏疾病。线粒体在过量活性氧（ROS）的病理生成，细胞内钙水平，细胞死亡途径和细胞骨架动力学的调节中起作用21，22，23。
小鼠GEC的分离具有挑战性，因为它们的数量，大小，基质因子很少，并且与其他肾小球细胞的相互依赖性，而这些细胞对其生存至关重要。本文介绍了小鼠GEC分离的详细方案。具体来说，我们使用转基因小鼠作为工具获得具有高增殖潜力的条件永生化细胞系。表达猿病毒40（SV40）大T抗原tsA58的转基因小鼠能够在33°C的允许条件下激活连续增殖，并在这里与表达线粒体特异性荧光的 PHAM切除 小鼠杂交。双转基因小鼠为研究线粒体结构提供了极好的工具。事实上， PHAM切除的 小鼠携带线粒体特异性（细胞色素c氧化酶的亚基VIII）Dendra2绿色，允许活体检测荧光线粒体并通过绿 - 红色光切换观察裂变和聚变事件16。
该方案包括三个重要步骤：使用磁珠提取肾小球，肾小球细胞的增殖，以及一旦细胞培养后使用CD31磁珠纯化GEC。仅使用一次胶原酶消化就足以分离肾小球细胞。其他方案利用DNA酶和蛋白酶24进行第二次消化。然而，我们注意到只有一个消化步骤即可获得更好的细胞产量。DNA酶可以保持活性并减缓细胞的增殖。此外，可以使用前面描述的20的差分筛分来分离GEC，这在使用小鼠肾脏时并不总是容易的。
在开始分离肾脏和肾小球之前，对所有手术工具进行高压灭菌以避免污染至关重要。此外，重要的是用抗生素过滤和补充溶液以消除任何污染物来源。事实上，支原体感染可能导致细胞病理学，从而干扰细胞培养中测量的每个参数25。
肾小球的分离依赖于磁珠的心内灌注。当然，用 20 mL 含 1x HBSS 的磁珠缓慢灌注对于收获大量肾小球至关重要。磁珠将被困在肾小球中，这可以使用磁性浓缩器轻松纯化它们。在使用珠子之前，可以制备并在4°C下储存长达15天，以简化实验过程。
此外，通过持续摇晃消化肾小球对于将大量肾小球与肾脏分离至关重要。另一方面，小鼠GEC的分离具有挑战性，因为它们体积小且存在其他肾小球细胞。因此，逐步分离肾小球，培养中所有肾小球细胞的生长以及随后使用CD31包被的磁珠纯化内皮细胞至关重要，特别是对于获得更多数量的活的和有条件增殖的GEC。然而，需要用免疫染色和流式细胞术验证细胞的纯度。
此外，该协议描述了GEC表型的表征和体外线粒 体融合/裂变测定。mitoDendra2-GEC是研究GEC线粒体对 体 外不同刺激的细胞反应的绝佳工具，无需转染或染色。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有竞争性的经济利益需要声明。
Acknowledgments
作者感谢何慈江教授和傅佳博士在小鼠内皮细胞分离方面的见解，感谢Mone Zaidi教授为PhAM切除 小鼠提供有价值的讨论。作者还要感谢西奈山伊坎医学院的显微镜CORE和工作人员为我们提供的指导。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01DK097253和国防部CDMRP拨款E01 W81XWH2010836对I.S.D.的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M.
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
