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Biology

फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सशर्त रूप से अमर माउस ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64147
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Nephrology, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

लेख ट्रांसजेनिक चूहों के गुर्दे से सशर्त रूप से अमर ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने की विधि का वर्णन करता है जो थर्मोलेबिल सिमियन वायरस 40 और फोटो-एक्टिवेबल माइटोकॉन्ड्रिया, पीएचएएमएक्साइज्ड को व्यक्त करता है। हम मोतियों, पाचन चरणों, बीजारोपण और जीईसी-सीडी 31 पॉजिटिव के संवर्धन का उपयोग करके पूरे गुर्दे से ग्लोमेरुली अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

Abstract

ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल सेल (जीईसी) डिसफंक्शन ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा टूटने में शुरू और योगदान कर सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि को एक तंत्र के रूप में सुझाया गया है जिसके परिणामस्वरूप कुछ ग्लोमेरुलर रोगों के रोगजनन में जीईसी शिथिलता होती है। ऐतिहासिक रूप से विवो मॉडल से जीईसी का अलगाव ग्लोमेरुली से शुद्ध संस्कृतियों को अलग करने में कठिनाइयों के कारण कुख्यात रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। जीईसी में विट्रो में जटिल विकास आवश्यकताएं हैं और बहुत सीमित जीवनकाल है। यहां, हम फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सशर्त रूप से अमर जीईसी को अलग करने और संवर्धन करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन घटनाओं की ट्रैकिंग सक्षम होती है। जीईसी को एक डबल ट्रांसजेनिक माउस के गुर्दे से अलग किया गया था जो थर्मोलेबिल एसवी 40 टीएजी (इम्मोर्टोमोज़ से), सशर्त रूप से प्रसार को बढ़ावा देता है और सेल भेदभाव को दबाता है, और सभी माइटोकॉन्ड्रिया में एक फोटो-परिवर्तनीय फ्लोरोसेंट प्रोटीन (डेंडर 2) (फोटो-एक्टिवेबल माइटोकॉन्ड्रिया [पीएचएएमएक्साइज्ड] माउस से)। उत्पन्न स्थिर सेल लाइन अमर एसवी 40 टीएजी जीन की निष्क्रियता और माइटोकॉन्ड्रिया के उप-समूह के फोटो-सक्रियण के बाद सेल भेदभाव की अनुमति देती है जिससे हरे से लाल रंग में प्रतिदीप्ति में स्विच होता है। MitoDendra2-GECs का उपयोग कोशिकाओं को धुंधला किए बिना फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के वितरण, संलयन और विखंडन घटनाओं की लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है।

Introduction

ग्लोमेरुलस ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा 1,2 के माध्यम से बड़े अणुओं के पारित होने को प्रतिबंधित करके रक्त निस्पंदन के लिए महत्वपूर्ण है। ग्लोमेरुलस में चार सेल प्रकार होते हैं: पार्श्विका उपकला कोशिकाएं, पोडोसाइट्स (आंत उपकला कोशिकाएं), ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (जीईसी), और मेसंगियल कोशिकाएं3। ग्लोमेरुलर एंडोथेलियम को एक अद्वितीय संवहनी संरचना की विशेषता है, बड़े निस्पंदन वॉल्यूम4 के लिए आवश्यक फेनेस्ट्री की उपस्थिति के अनुसार। ग्लोमेरुलर एंडोथेलियम की एपिकल सतह एक नकारात्मक रूप से चार्ज ग्लाइकोकैलिक्स परत और एंडोथेलियल सतह परत नामक एक कोट से ढकी होती है जो एंडोथेलियम और रक्त के बीच एक जगह बनाती है। यह संरचना एल्बुमिन जैसे नकारात्मक रूप से चार्ज अणुओं के पारित होने को प्रतिबंधित करने और ल्यूकोसाइट और प्लेटलेट आसंजन को रोकने के लिए उच्च चार्ज चयनात्मकता प्रदान करतीहै।

जीईसी चयापचय परिवर्तनों के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं, जैसे कि मधुमेह के वातावरण से जुड़े हाइपरग्लेसेमिया। दरअसल, मधुमेह हानिकारक पदार्थों के परिसंचरण में वृद्धि, ग्लूकोज चयापचय मार्गों की संतृप्ति और परेशान सेलुलर रेडॉक्स संतुलन 3,6 की ओर जाता है। इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में वृद्धि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को प्रेरित करती है, जो एंडोथेलियल फ़ंक्शन 7 को प्रभावित करतीहै।

वर्तमान प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल विशेषताओं के साथ अमर ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करना है। दरअसल, प्राथमिक जीईसी की सेल संस्कृति में एक सीमित प्रोलिफेरेटिव चक्र और प्रारंभिक शिथिलता8 है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति हाइपरग्लेसेमिया या किसी अन्य उपचार के जवाब में विखंडन और संलयन घटनाओं की जांच करने में मदद करती है। एक वैकल्पिक विधि के रूप में, अन्य प्रयोगशालाओं ने विट्रो9 में कोशिकाओं को अमर करने के लिए एच-टीआरटी का उपयोग किया।

यहां वर्णित विधि 4-6 सप्ताह के जानवरों से सशर्त रूप से अमर माइटोडेंद्र 2 ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देती है (चित्रा 1)। यह विस्तृत प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक चूहों (एच -2 केबी-टीएसए 58) के उपयोग का वर्णन करता है जो थर्मोलेबिल सशर्त रूप से अमर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए सिमियन वायरस 40 बड़े ट्यूमर एंटीजन (एसवी 40 टीएजी) जीन 10,11 को आश्रय देता है। टीएसए 58 टीएजी जीन उत्पाद माउस एच -2 केबी जीन के इंड्यूसेबल 5 'फ्लैंकिंग प्रमोटर के नियंत्रण में 33 डिग्री सेल्सियस के अनुमेय तापमान पर कार्यात्मक है, जो इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन) के संपर्क में आने पर बेसल स्तर से ऊपर बढ़ जाता है, इसलिए सशर्त प्रसार फेनोटाइप12 को बनाए रखता है। एच -2 केबी आईएफएन की अनुपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस के गैर-अनुमेय तापमान पर तेजी से अवक्रमित होता है, कोशिकाओं में टीएसए 58 टैग के अमर कार्य को हटा देता है और कोशिकाओं को अधिक विभेदित फेनोटाइप 13,14,15 विकसित करने की अनुमति देता है। पीएचएएम चूहों के साथ एच -2 केबी-टीएसए 58 ट्रांसजेनिक चूहों का वैकल्पिक क्रॉसिंग, जो माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट (साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज के सबयूनिट VIII) डेंडर 2-ग्रीन को व्यक्त करता है, फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया16 का लाइव पता लगाने की अनुमति देता है। 405 एनएम लेजर16 के संपर्क में आने के बाद डेंड्रा 2 ग्रीन फ्लोरेसेंस लाल फ्लोरेसेंस में बदल जाता है। जब माइटोकॉन्ड्रिया फोटो-स्विचिंग के बाद फ्यूज होते हैं, तो वे लम्बी आकृतियों का निर्माण करते हैं जो हरे और पीले पदार्थ के आदान-प्रदान से पीले दिखाई देते हैं या विखंडन7,17 से गुजरने पर लाल दिखाई देते हैं। मिटोडेंड्रा 2-जीईसी विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए जीईसी माइटोकॉन्ड्रिया की सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण हैं।

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Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं को माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में आईएसीयूसी द्वारा अनुमोदित किया गया था। हमने जैक्सन लैब से खरीदे गए तीन नर चूहों (एच -2केबी-टीएसए 58 ट्रांसजेनिक चूहों के साथ फोटो-एक्टिवेबल माइटोकॉन्ड्रिया [पीएचएएम]) का उपयोग किया और एक सामान्य चाउ आहार पर रखा।

1. काम करने की स्थिति और तैयारी

  1. 70% इथेनॉल और यूवी-सी प्रकाश का उपयोग करके लामिनार प्रवाह हुड के अंदर काम करने की जगह को साफ करें।
  2. मोती के धोने के बफर तैयार करें। पीएच 7.4-8.0 पर 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट का उपयोग करके बफर -1 बनाएं, कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना 1 एक्स फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) का उपयोग करके बफर -2 को 0.1% गोजातीय सीरम एंटीजन (बीएसए), 3 एमएम ईडीटीए, पीएच 7.4, और बफर -3 का उपयोग करके 0.1% बीएसए, पीएच 8.5 के साथ 0.2 एम ट्रिस का उपयोग करके।

2. चुंबकीय कण कंसंट्रेटर

  1. चुंबकीय मोतियों की तैयारी
    1. एक 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, धीरे से 200 μL चुंबकीय मोती (4 x 108 मोती) को 200 μL बफर -1 के साथ मिलाएं।
      नोट: ऊतक कटाई से 1 दिन पहले प्रति माउस 200 μL चुंबकीय मोती तैयार करें। ग्लोमेरुली की कटाई के लिए मोतियों का उपयोग किया जाएगा।
    2. ट्यूब को 1 मिनट के लिए चुंबकीय कण सांद्रक में रखें, फिर सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। चुंबक से ट्यूब को हटा दें और धोए गए मोतियों को बफर -1 के 200 μL में पुन: निलंबित करें।
    3. चुंबकीय मोतियों वाली ट्यूब को चुंबकीय कण सांद्रक में 1 मिनट के लिए रखें और धीरे से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
    4. चुंबकीय कण सांद्रक में ट्यूब रखकर और बफर को त्यागकर बफर -2 के 200 μL का उपयोग करके चुंबकीय मोतियों को 2x, 5 मिनट धोकर मुक्त टोसिल समूहों को निष्क्रिय करें।
    5. शेष मुक्त टोसिल समूहों को निष्क्रिय करने के लिए, 24 घंटे के लिए बफर -3 के 200 μL में चुंबकीय मोतियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर या 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब को चुंबकीय कंसंट्रेटर में 1 मिनट के लिए रखें, धीरे से सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और इसे छोड़ दें।
    6. चुंबकीय मोतियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बफर -2 के 200 μL के साथ 1x धोएं। ट्यूब को 1 मिनट के लिए चुंबकीय कंसंट्रेटर में वापस रखें और धीरे से सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें। चुंबकीय कंसंट्रेटर से ट्यूब को हटा दें और 4 x 108 मोती / एमएल प्राप्त करने के लिए बफर -2 के 200 μL में चुंबकीय मोतियों को फिर से निलंबित करें।
      नोट: इस स्तर पर, मोतियों को 15 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ना संभव है।

3. माउस किडनी ग्लोमेरुलर कोशिकाओं का अलगाव

  1. छिड़काव सामग्री तैयार करें: 30 एमएल सिरिंज, 25 ग्राम तितली सुई। अलगाव सामग्री तैयार करें: बाँझ 10 सेमी डिश, स्केलपेल, चुंबकीय कण संकेंद्रक, 40 μm सेल स्ट्रेनर, 100 μm सेल छन्नी।
  2. 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक 1x Hank के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 100 एमएल तैयार करें और पीएच को 7.35 तक समायोजित करें। घोल को 0.2 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें और संदूषण से बचने के लिए इसे हुड के नीचे रखें।
  3. चरण 2.1.6 से 200 μL चुंबकीय मोतियों को 1x HBSS के 20 mL के साथ मिलाएं।
    नोट: प्रत्येक माउस के लिए, 20 एमएल एचबीएसएस 1 एक्स में पतला 200 μL मोतियों की आवश्यकता होगी।
  4. 1x HBSS समाधान, pH 7.35 में 1 mg/mL पर कोलेजनेस टाइप-II (125 CDU/mg) का 1 mL एलिकोट तैयार करें। आरपीएमआई को 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 10% एफसीएस माध्यम के साथ प्री-वार्म करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एंडोथेलियल सेल कल्चर माध्यम को पूर्व-गर्म करें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: आरपीएमआई का उपयोग कोलेजनेज को बेअसर करने के लिए किया जाएगा।
  5. कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 10 μg / mL कोलेजन IV (1 एमएल / वेल) के 2 एमएल के साथ 6-वेल प्लेट के दो कुओं को प्री-कोट करें। कोलेजन को पतला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एसिटिक एसिड को हटाने के लिए प्लेट 3x को 1x PBS के साथ धोएं। लेपित प्लेटों का तुरंत उपयोग करें या उन्हें 4 सप्ताह तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: पारदर्शी फिल्म के साथ प्लेट (ओं) को सील करना सूखने से रोकने के लिए पसंद किया जाता है। कोलेजन कोटिंग प्लेट में कोशिकाओं के लगाव की सुविधा प्रदान करती है।
  6. 70% इथेनॉल का उपयोग करके चित्रा 2 में सभी सर्जिकल उपकरणों को साफ और निष्फल करें और बाद में उन्हें 30 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करें। 70% इथेनॉल के साथ सर्जिकल कार्यक्षेत्र को साफ करें।
  7. केटामाइन / ज़ाइलाज़िन (10 मिलीग्राम / एमएल केटामाइन और 1 मिलीग्राम / एमएल ज़ाइलज़िन) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। यह पुष्टि करने के लिए कि जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है, पैर की अंगुली पिंच रिफ्लेक्स की जांच करें।
  8. माउस के पंजे को 19 जी सुइयों के साथ ठीक करें ताकि इसे विच्छेदन मंच पर रखा जा सके। छाती और पेट को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें, और कैंची ए (चित्रा 2) के साथ छाती के साथ पेट खोलें।
  9. बाएं वेंट्रिकल (चित्रा 3 ए) में एक तितली सुई डालें और रक्त परिसंचरण का विस्तार करने के लिए मोती समाधान (चरण 1.2 से) के लगभग 100 μL इंजेक्ट करें।
  10. सावधानीपूर्वक 19 ग्राम सुई के साथ गुर्दे के नीचे अवर वेना कावा को तोड़ें (चित्रा 3 ए)। चरण 3.9 में शुरू किए गए छिड़काव को जारी रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक मिनी पंप का उपयोग गति पर किया जा सकता है: 18.0 +, समय: 5 मिनट। चुंबकीय मोतियों वाले ग्लोमेरुली की एक बड़ी संख्या की कटाई के लिए अच्छा छिड़काव महत्वपूर्ण है। यह एक गैर-उत्तरजीविता / टर्मिनल प्रक्रिया है।
  11. धीरे से चिमटी के साथ वसा ऊतक को हटा दें और पतली सर्जिकल कैंची सी (चित्रा 2) के साथ दोनों गुर्दे का उत्पादन करें और उन्हें बर्फ पर 1 एमएल 1 एक्स एचबीएसएस के साथ एक प्लेट में डालें। कैंची बी (चित्रा 2) के साथ गुर्दे को कीमा करें, फिर बाँझ स्केलपेल के साथ 1 मिमी छोटे टुकड़ों तक जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है।
  12. इसके बाद, क्षैतिज शेकर का उपयोग करके कोमल झुकाव के साथ चरण 3.4 से 37 डिग्री सेल्सियस पर चरण 3.4 से 1 एमएल कोलेजनेज टाइप II के साथ कीमा वाले गुर्दे को इनक्यूबेट करें। इस चरण के बाद ऊतक को पूरी तरह से पच जाना चाहिए, जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है।
  13. कोलेजनेज को बेअसर करने के लिए 10% एफबीएस (चरण 3.4 से) के साथ आरपीएमआई के 4 एमएल जोड़ें। एक बाँझ 100 μm सेल छन्नी के माध्यम से पचे हुए ऊतक को 50 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें। ग्लोमेरुली को गुजरने की अनुमति देने के लिए छन्नी के खिलाफ पचे हुए ऊतक को हिलाने के लिए बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल का उपयोग करें।
  14. सेल छन्नी को 15 एमएल 1x HBSS के साथ धोएं और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर प्रवाह को सेंट्रीफ्यूज करें। इस बिंदु पर, गोली में तीन परतें होती हैं; ग्लोमेरुली के साथ मोती ट्यूब की मध्य परत में दिखाई देते हैं, ऊपरी परत में नलिकाओं जैसी छोटी संरचनाएं होती हैं, और नीचे की परत मलबे होती है (चित्रा 3 डी)।
  15. सुपरनैटेंट और शीर्ष सफेद परत को ध्यान से एस्पिरेट करें। शेष गोली में ग्लोमेरुली और मलबे वाले मोती होते हैं (चित्रा 3 डी)। 1x HBSS के 1.5 mL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और 2 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  16. ट्यूब को चुंबकीय कंसंट्रेटर (चित्रा 3 ई) में रखें, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और फिर मोतियों को 1x HBSS के 1 एमएल के साथ 2x धोएं; इस स्तर पर, माइक्रोस्कोप के तहत ग्लोमेरुली की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए एक स्लाइड पर सेल निलंबन के 20 μL डालें (चित्रा 3 एफ; एक ग्लोमेरुलस [काला तीर], और निलंबन में कुछ मोती [पीले तीर]।।
  17. सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें, एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम (सामग्री की तालिका) में गोली को फिर से निलंबित करें, और इसे एक साफ 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब में 2 μL IFN (100 U / mL) जोड़ें और कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट के एक कुएं पर प्लेट करें। कोशिकाओं को 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  18. 3 दिनों की संस्कृति के बाद, माध्यम के 1 एमएल को हटाकर और इसे 1 एमएल ताजा मीडिया के साथ बदलकर माध्यम को सावधानीपूर्वक बदलें। इस स्तर पर, ग्लोमेरुलर कोशिकाओं (चित्रा 4 जी) के मिश्रण के साथ कोशिकाएं विषम होती हैं।
    नोट: आउटग्रोथिंग कल्चर में, ग्लोमेरुलर कोशिकाओं और कुछ चुंबकीय मोतियों का मिश्रण होगा (चित्रा 4 जी)। ध्यान दें कि सभी कोशिकाओं को हरे, फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया दिखाना चाहिए।
  19. 7 दिनों की संस्कृति के बाद, माध्यम को पूरी तरह से एस्पिरेट करें और इसे आईएफएन (100 यू / एमएल) के साथ पूरक एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम के एक ताजा 2 एमएल के साथ बदलें। इस स्तर पर, कोशिकाएं फैलना शुरू कर देती हैं लेकिन अभी भी विषम हैं (चित्रा 4 ए)।
  20. 10 दिनों की संस्कृति के बाद जब कोशिकाएं ~ 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो चरण 5.1 में वर्णित ट्रिप्सिन का उपयोग करके कोशिकाओं को पारित करें और फिर उन्हें कोलेजन IV के साथ लेपित टी 25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  21. 1 सप्ताह (संस्कृति के कुल ~ 21 दिनों) के बाद, कोशिकाओं को कोलेजन IV के साथ लेपित टी 75 फ्लास्क में पारित करें।

4. एंडोथेलियल सेल अलगाव के लिए मोतियों की तैयारी

  1. भेड़ विरोधी चूहे के मोतियों को चूहे विरोधी सीडी 31एंटीबॉडी 3,18,19 के साथ कोटिंग करके शुरू करें। प्रत्येक T75 फ्लास्क के लिए 10 μL मोतियों का उपयोग करें।
  2. 10%1% बीएसए, 2 एमएम ईडीटीए, 1% पेनिसिलिन /स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 1x PBS के 200 μL के साथ 3x मोतियों को धोएं। हर बार वॉशिंग बफर को पाइप करने के लिए कंसंट्रेटर चुंबक में ट्यूब रखें।
  3. पीबीएस के 200 μL, 1% बीएसए, 2 mM EDTA, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन में मोतियों को पुन: निलंबित करें। चूहे के एंटी-माउस सीडी 31 एंटीबॉडी 7,18,19 के 4.8 μL जोड़ें, ट्यूब को क्षैतिज शेकर पर रखें और कमरे के तापमान पर धीरे से 1 घंटे के लिए मिलाएं, और फिर ट्यूब को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

5. सीडी 31-लेपित मोतियों के साथ ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करना

  1. एक T75 फ्लास्क में 0.25% ट्रिप्सिन का 3 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। एंडोथेलियल विकास माध्यम के 3 एमएल के साथ ट्रिप्सिन को बेअसर करें, कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और फिर 5 मिनट के लिए 200 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें और 1% बीएसए, 2 एमएम ईडीटीए, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को धोएं। 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  3. चरण 4 में तैयार किए गए लेपित मोतियों के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और 1% बीएसए, 2 mM EDTA, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पीबीएस के 800 μL जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर निरंतर झटकों के साथ 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. ट्यूब को चुंबकीय कंसंट्रेटर में रखें और कोशिकाओं को 1% बीएसए, 2 एमएम ईडीटीए, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त 1 एक्स पीबीएस के साथ 4 गुना धोएं। एंडोथेलियल विकास माध्यम के 3 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया गया, जो 100 यू / एमएल आईएफएन के साथ पूरक है।
  5. 6-वेल प्लेट पर कोलेजन IV-लेपित कुओं में 1.5 एमएल कोशिकाओं / 33 डिग्री सेल्सियस पर अनुमेय परिस्थितियों में कोशिकाओं को कल्चर करें।
    नोट: पृथक कोशिकाएं सिमियन वायरस 40 (एसवी 40) बड़े टी एंटीजन टीएसए 58 को व्यक्त करती हैं, जो 33 डिग्री सेल्सियस (अनुमेय स्थिति) पर निरंतर प्रसार के सक्रियण को सक्षम करती हैं।
  6. संस्कृति में 4 दिनों के बाद, माध्यम के 750 μL को हटा दें और इसे 100 U / mL IFN के साथ पूरक ताजा माध्यम की समान मात्रा के साथ प्रतिस्थापित करें।
  7. संस्कृति के 10 दिनों से 14 दिनों के बाद, बढ़ते सीडी 31 पॉजिटिव जीईसी कॉलोनियों (चित्रा 4 सी) की जांच करें जो 488 एनएम फिल्टर के साथ एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया को व्यक्त करते हैं।
  8. संस्कृति के 21 दिनों के बाद, कोशिकाएं 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच सकती हैं; उन्हें टी 25 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के बाद, कोशिकाओं को आरपीएमआई विकास माध्यम और 10% एफसीएस के साथ बनाए रखा जा सकता है।
    नोट: संगम तक पहुंचने से पहले, कोशिकाएं विषम दिख सकती हैं (चित्रा 4 बी)। हालांकि, एक बार जब वे संकुचित हो जाते हैं, तो वे एक कोबल-पत्थर आकृति विज्ञान प्राप्त करते हैं।
  9. इस स्तर पर, कोशिकाओं को क्रायोसंरक्षित किया जा सकता है। 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने पर, कोशिकाओं में 0.25% ट्रिप्सिन के 3 एमएल जोड़ें और उन्हें 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ट्रिप्सिन को 10% एफबीएस के साथ पूरक विकास माध्यम की समान मात्रा के साथ बेअसर करें।
  10. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और कोशिकाओं को 3 एमएल फ्रीजिंग माध्यम (आरपीएमआई, 20% एफबीएस, 10% डीएमएसओ) में पुन: निलंबित करें। क्रायो-ट्यूबों में कोशिकाओं को एलिकोट करें और उन्हें तरल नाइट्रोजन वाष्प तापमान में संग्रहीत करें।

6. मिटोडेंद्र 2-जीईसी की खेती

  1. क्रायोएलिकोट से कोशिकाओं को चरण 5.10 से, 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में पिघलाएं और उन्हें 10 एमएल पूर्व-गर्म एंडोथेलियल विकास माध्यम के साथ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। माध्यम को हटा दें, और पेलेट को कोलेजन IV-लेपित T25 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें, जिसमें पूर्व-गर्म एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम 100 U / mL IFN के साथ पूरक हो और 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. अगले दिन माध्यम बदलें। जब कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो आमतौर पर 5 दिनों के बाद, उन्हें टी 75 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
  4. कोशिकाओं को एंडोथेलियल फेनोटाइप में अलग करने के लिए, कोशिकाओं को आईएफएन के बिना विकास मीडिया में 37 डिग्री सेल्सियस पर गैर-अनुमेय स्थितियों में स्थानांतरित करें।

7. MitoDendra2-GECs का पासिंग

  1. माध्यम को हटा दें, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, और 3 एमएल गर्म 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान (टी 75 सेमी2 फ्लास्क) जोड़ें, 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. जब कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, तो 5 एमएल विकास माध्यम जोड़ें और पिपेट ऊपर और नीचे करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और कोशिकाओं को एक नए कोलेजन IV-लेपित फ्लास्क या प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: पासिंग सप्ताह में एक बार 1: 4 के अनुपात में किया जाना चाहिए।

8. MitoDendra2-GECs का लक्षण वर्णन

  1. विभेदित कोशिकाओं 7,18,19,20 (चित्रा 4 डी) पर सीडी 31 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग करें। अन्य मार्करों जैसे वीडब्ल्यूएफ और आइसोलेक्टिन-बी 4 के साथ-साथ20 का उपयोग करें।
  2. डेंड्रा 2 की माइटोकॉन्ड्रियल विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए, कोशिकाओं को माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट मार्करों के साथ लेबल करें, जिसमें विकास माध्यम में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 30 मिनट के लिए 100 एनएम माइटोकॉन्ड्रियल ट्रैकर युक्त होता है।
  3. माध्यम को हटा दें और लाइव इमेजिंग करने के लिए फिनोल लाल के बिना पूर्व-गर्म माध्यम के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए फॉर्मलाडेहाइड फिक्सेटिव (4%) का उपयोग करके तय किया जा सकता है, इसके बाद पीबीएस में कई बार धोया जा सकता है। उपयोग तक निश्चित कोशिकाओं को 1x PBS में 4 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है। फ्लो साइटोमेट्री के साथ एक पुष्टि भी संभव है: एंटी-सीडी 31, एंटी-पीईसीएएम, एंटी-सीडी 45 के साथ लेबल कोशिकाएं। जीईसी को पोडोसाइट्स मार्करों (सिनैप्टोपोडिन, एनपीएचएस 1, पॉडएक्सएल), मेसांगियल सेल मार्कर (पीडीजीएफआर, एंजियोटेंसिनोजेन), और ट्यूबलर सेल मार्कर (एक्वापोरिन, एमिनोपेप्टिडेस-एन) के लिए नकारात्मक दाग देना चाहिए। ये मार्कर नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। इन कोशिकाओं की माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट डेंड्रा 2 अभिव्यक्ति के कारण, एफआईटीसी चैनल का उपयोग करने से बचें।

9. ऑक्सीडेटिव तनाव या उच्च ग्लूकोज के जवाब में माइटोकॉन्ड्रिया संरचनात्मक परिवर्तनों की लाइव सेल इमेजिंग

  1. एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके कोलेजन IV के साथ लेपित 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश पर प्लेट 1 x 105 जीईसी। 24 घंटे के बाद, फिनोल लाल के बिना माध्यम में बदलें। कोशिकाओं में हरे, फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं।
  2. प्रयोग की शुरुआत से पहले पर्यावरण कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% आर्द्रता और 5% सीओ2 1 घंटे पर सेट करें।
  3. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत, फोकस को समायोजित करने और रुचि के क्षेत्र का चयन करने के लिए 40x / 1.2 W उद्देश्य का उपयोग करें। कोशिकाओं को 60 मिनट के लिए 5 mM या 25 mM ग्लूकोज के 2mL के साथ इनक्यूबेट करें।
  4. कोशिकाओं को 405 एनएम लेजर (4% लेजर शक्ति) के संपर्क में रखें ताकि माइटोकॉन्ड्रिया की एक उप-जनसंख्या को हरे से लाल रंग में परिवर्तित किया जा सके (चित्रा 5 ए-बी, डी-ई)।
  5. लाल प्रतिदीप्ति की कल्पना करने के लिए अपरिवर्तित अवस्था में डेंड्रा 2 को उत्तेजित करने के लिए 561 एनएम लेजर का उपयोग करें। पहले वर्णित16 के रूप में विस्तृत फोटो-स्विचिंग प्रोटोकॉल देखें। हरे मैट्रिक्स और लाल मैट्रिक्स संलयन (चित्रा 4 सी, एफ) के कारण संलयन घटनाएं कई मिनटों के बाद पीले प्रतिदीप्ति के रूप में दिखाई देती हैं।

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Representative Results

इस लेख में, स्थिर फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया (माइटोडेंड्रा 2-जीईसी) के साथ सशर्त रूप से अमर ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है (चित्रा 1)। स्वस्थ कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए युवा 6-10 सप्ताह के चूहों का उपयोग आवश्यक है। संस्कृति के 3 दिनों के बाद, कोशिकाएं पृथक ग्लोमेरुली से धीरे-धीरे बढ़ने लगती हैं, जैसा कि चित्रा 3 जी में दिखाया गया है। 7 दिनों के बाद, कोशिकाएं विषम होती हैं, जो अन्य ग्लोमेरुलर सेल प्रकार दिखाती हैं, जैसे कि पोडोसाइट्स, पार्श्विका उपकला कोशिकाएं और मेसंगियल कोशिकाएं (चित्रा 4 ए)। 70% से 80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के बाद, अन्य ग्लोमेरुलर कोशिकाओं को चुंबकीय सीडी 31 लेबल वाले मोतियों के साथ एंडोथेलियल कोशिकाओं के सकारात्मक चयन का उपयोग करके हटा दिया गया था (चित्रा 4 बी-सी)। माइटोडेंडर 2-जीईसी ने सीडी 31 (चित्रा 4 डी) व्यक्त किया और पोडोसाइट्स मार्कर के लिए नकारात्मक थे जैसा कि सिनैप्टोपोडिन नकारात्मक धुंधलापन (चित्रा 4 ई-एफ) द्वारा दिखाया गया है।

माइटोडेंद्र 2-जीईसी में फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल सुविधा विट्रो में विभिन्न परिस्थितियों में माइटोकॉन्ड्रिया आकृति विज्ञान का अध्ययन करने की अनुमति देती है। यहां, हमने मिटोडेंडर 2-जीईसी (चित्रा 5 डी-एफ) की माइटोकॉन्ड्रिया संरचना पर उच्च ग्लूकोज (25 एमएम) के प्रभाव का परीक्षण किया। सामान्य ग्लूकोज (5 एमएम) के तहत कोशिकाओं में दिखाई देने वाले लम्बी माइटोकॉन्ड्रिया की तुलना में; चित्रा 5 ए-सी), माइटोकॉन्ड्रिया के उच्च ग्लूकोज-प्रेरित विखंडन या विखंडन जैसा कि प्रमुख स्फेरॉइड के आकार के माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 5 ई) द्वारा देखा गया है। इसके अलावा, हमने माइटोकॉन्ड्रिया की एक चयनित उप-जनसंख्या को एकल जीवित मिटोडेंडर 2-जीईसी (चित्रा 5 ए, डी) में फोटो-परिवर्तित करने के लिए 405 एनएम लेजर का उपयोग किया। चित्रा 5 बी और चित्रा 5 ई में, चयनित क्षेत्र में हरे (488 एनएम) से लाल (561 एनएम) में माइटोकॉन्ड्रिया का सफल फोटो-स्विचिंग प्रस्तुत किया गया है। महत्वपूर्ण रूप से, इसने सामान्य ग्लूकोज के तहत उगाए गए माइटोडेंद्र 2-जीईसी में संलयन घटनाओं को देखने की अनुमति दी, जैसा कि माइटोकॉन्ड्रिया मैट्रिक्स संलयन (चित्रा 5 सी) के परिणामस्वरूप पीले विलय वाले हरे और लाल प्रतिदीप्ति द्वारा देखा जा सकता है। इसके विपरीत, उच्च ग्लूकोज-उपचारित मिटोडेंद्र 2-जीईसी में, माइटोकॉन्ड्रिया खंडित थे और मुख्य रूप से लाल थे (चित्रा 5 एफ), यह सुझाव देते हुए कि, परीक्षण की गई समय सीमा में, उच्च ग्लूकोज उपचार के कारण होने वाले नुकसान के कारण विखंडन / संलयन घटनाओं में देरी या बाधित किया गया था, और यह पिछली रिपोर्ट18,19 के अनुरूप है।

Figure 1
चित्रा 1: मुराइन जीईसी अलगाव का प्रतिनिधि विवरण। आरेख जीईसी अलगाव के महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व करता है, जो गुर्दे के ग्लोमेरुली को अलग करने के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ चूहों के दिल को फैलाने से शुरू होता है, कोलेजनेज का पाचन, ग्लोमेरुलर कोशिकाओं की संस्कृति, और अंत में, सीडी 31-लेपित मोतियों का उपयोग करके जीईसी का शुद्धिकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: गुर्दे विच्छेदन का विवरण। विच्छेदन के लिए आवश्यक सभी बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों की प्रतिनिधि छवि। माउस की त्वचा को खोलने के लिए कैंची (ए) की आवश्यकता होती है, और गुर्दे को अलग करने के लिए कैंची (बी, सी) की एक अलग जोड़ी की आवश्यकता होती है। त्वचा को पकड़ने के लिए चिमटी (डी) और (ई) की आवश्यकता होती है। विच्छेदित गुर्दे को इकट्ठा करने के लिए चिमटी (एफ) की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: ग्लोमेरुली कटाई का विवरण। (A) 20 mL सिरिंज का उपयोग करके HBSS-मोती समाधान के साथ बाएं वेंट्रिकल को प्रभावित करें। 19 ग्राम सुई के साथ अवर वेना कावा को छिद्रित करें। (बी) छिड़काव के बाद, गुर्दे से वसा को निकालें और इसे 1 मिमी टुकड़ों में काट लें। (सी) कोलेजनेज टाइप II के साथ ऊतक को पचाएं। (डी) पाचन और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, तीन परतें बनती हैं; ग्लोमेरुली वाले मोती मध्य परत में होते हैं, जैसा कि काले तीर द्वारा इंगित किया गया है। (ई) चुंबकीय सांद्रक का उपयोग करके ग्लोमेरुली वाले पृथक मोतियों को अलग करें। (एफ) ताजा पृथक ग्लोमेरुली की प्रतिनिधि छवि। (जी) 3 दिनों के बाद पृथक ग्लोमेरुली से बढ़ती कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: विट्रो में माइटोकॉन्ड्रियल परख( ए) संस्कृति के 3 दिनों के बाद ग्लोमेरुलर कोशिकाएं। (बी) 7 दिनों के बाद जीईसी। (डी) सीडी 31-लेबल वाले मोतियों के साथ जीईसी का शुद्धिकरण। सीडी 31 धुंधला होने की माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग। (ई) जीईसी सिनैप्टोपोडिन के लिए नकारात्मक हैं। (एफ) पोडोसाइट्स एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सिनैप्टोपोडिन (488 एनएम, हरे प्रतिदीप्ति) से सना हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: विट्रो में फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल संलयन की माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग। छवियों को 40x जल उद्देश्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था। (A-B) चयनित क्षेत्र (लाल सर्कल) को 6.3-12.61 / पिक्सेल की गति से 300 ब्लीचिंग पुनरावृत्तियों के लिए 405 एनएम लाइन (4% लेजर पावर) के साथ रोशन किया गया था, जैसा कि पहलेवर्णित 16 था। (ए-सी) विकास मीडिया में कोशिकाएं जिनमें 5 एमएम ग्लूकोज होता है; हरे रंग की प्रतिदीप्ति (488 एनएम) स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया दिखाती है। (B, E) माइटोकॉन्ड्रिया को लाल (567 एनएम) में फोटो-स्विच किया गया था। (सी) पीला प्रतिदीप्ति 5 एमएम ग्लूकोज के साथ इलाज किए गए जीईसी की एक सक्रिय संलयन घटना का पता लगाता है। (डी) कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए उच्च ग्लूकोज 25 एमएम के साथ इलाज किया गया था। ग्रीन फ्लोरेसेंस खंडित माइटोकॉन्ड्रिया और (ई) एक हिस्सा दिखाता है जिसे लाल रंग में फोटो-स्विच किया गया था। (एफ) आंकड़ा कम पीले प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाए गए अनुसार एक कम संलयन घटना दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर चयापचय, होमियोस्टैसिस और तनाव प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, और उनकी शिथिलता गुर्दे की बीमारी सहित कई बीमारियों से जुड़ी हुई है। माइटोकॉन्ड्रिया की अत्यधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की पैथोलॉजिकल पीढ़ी, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम के स्तर, कोशिका मृत्यु मार्ग और साइटोस्केलेटल गतिशीलता21,22,23 के विनियमन में भूमिका है।

मुराइन जीईसी का अलगाव उनकी छोटी संख्या, आकार, मैट्रिक्स कारकों और अन्य ग्लोमेरुलर कोशिकाओं के साथ अन्योन्याश्रित प्रकृति के कारण चुनौतीपूर्ण है जो उनके अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं। वर्तमान लेख माउस जीईसी अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। विशेष रूप से, हमने ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग उच्च प्रसार क्षमता के साथ सशर्त रूप से अमर सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया। ट्रांसजेनिक चूहे, सिमियन वायरस 40 (एसवी 40) बड़े टी एंटीजन टीएसए 58 को व्यक्त करते हुए, 33 डिग्री सेल्सियस पर अनुमेय परिस्थितियों में निरंतर प्रसार के सक्रियण को सक्षम करते हैं और यहां माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट प्रतिदीप्ति व्यक्त करने वाले पीएचएएमउत्पादित चूहों के साथ पार किए गए थे। डबल ट्रांसजेनिक चूहों ने माइटोकॉन्ड्रिया संरचना का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण की पेशकश की। दरअसल, पीएचएएमएक्साइज्ड चूहों में माइटोकॉन्ड्रियल-विशिष्ट (साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज के सबयूनिट VIII) डेंड्रा 2 ग्रीन होते हैं, जिससे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया का लाइव पता लगाने और हरे-लाल फोटो-स्विचिंग16 के माध्यम से विखंडन और संलयन घटनाओं का अवलोकन होता है।

प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण चरण होते हैं: मोतियों का उपयोग करके ग्लोमेरुली निकालना, ग्लोमेरुलर कोशिकाओं का प्रसार, और कोशिकाओं के संस्कृति में होने के बाद सीडी 31 मोतियों का उपयोग करके जीईसी का बाद में शुद्धिकरण। कोलेजनेज के साथ केवल एक पाचन का उपयोग ग्लोमेरुलर कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त है। अन्य प्रोटोकॉल डीएनएस और प्रोटीन24 के साथ दूसरे पाचन का उपयोग करते हैं। हालांकि, हमने केवल एक पाचन चरण के साथ बेहतर सेल पैदावार देखी है। डीएनएस सक्रिय रह सकता है और कोशिकाओं के प्रसार को धीमा कर सकता है। इसके अलावा, जीईसी को पहले वर्णित20 के रूप में विभेदक चोरी का उपयोग करके अलग किया जा सकता है, जो चूहों के गुर्दे का उपयोग करते समय हमेशा आसान नहीं होता है।

संदूषण से बचने के लिए गुर्दे और ग्लोमेरुली के अलगाव को शुरू करने से पहले सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, दूषित पदार्थों के किसी भी स्रोत को खत्म करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ समाधान को फ़िल्टर और पूरक करना महत्वपूर्ण है। दरअसल, माइकोप्लाज्मा संक्रमण साइटोपैथोलॉजी का कारण बन सकता है जिसके परिणामस्वरूप सेल कल्चर25 में मापा गया हर पैरामीटर में हस्तक्षेप होता है।

ग्लोमेरुली का अलगाव मोतियों के इंट्रा-कार्डियक छिड़काव पर निर्भर करता है। निश्चित रूप से, ग्लोमेरुली की उच्च संख्या की कटाई के लिए 1x HBSS युक्त मोतियों के 20 एमएल के साथ धीमी गति से छिड़काव आवश्यक है। मोती ग्लोमेरुली में फंस जाएंगे, जो चुंबकीय संकेंद्रक का उपयोग करके उनके शुद्धिकरण को आसान बनाता है। प्रयोगात्मक प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए उपयोग करने से पहले मोतियों को 15 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार और संग्रहीत किया जा सकता है।

इसके अलावा, लगातार झटकों के साथ ग्लोमेरुली को पचाना गुर्दे से ग्लोमेरुली की एक अच्छी संख्या को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरी ओर, मुराइन जीईसी का अलगाव उनके छोटे आकार और अन्य ग्लोमेरुलर कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण है। इसलिए, ग्लोमेरुली का चरणबद्ध अलगाव, संस्कृति में सभी ग्लोमेरुलर कोशिकाओं का विकास, और एंडोथेलियल कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए सीडी 31-लेपित मोतियों का बाद में उपयोग महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से व्यवहार्य और सशर्त प्रोलिफेरेटिव जीईसी की अधिक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए। फिर भी, इम्यूनोस्टेनिंग और फ्लो साइटोमेट्री के साथ कोशिकाओं की शुद्धता को मान्य करने की आवश्यकता है।

इसके अलावा, प्रोटोकॉल जीईसी फेनोटाइप और विट्रो में माइटोकॉन्ड्रिया संलयन / विखंडन परख के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है। माइटोडेंद्र 2-जीईसी अभिकर्मक या धुंधलापन की आवश्यकता के बिना विट्रो में विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए जीईसी माइटोकॉन्ड्रिया की सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखकों ने प्रोफेसर सिजियांग हे और डॉ फू जिया को चूहों एंडोथेलियल सेल अलगाव में उनकी अंतर्दृष्टि के लिए धन्यवाद दिया और प्रोफेसर मोने जैदी को पीएचएएमउत्पादित चूहों और मूल्यवान चर्चाओं को प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया। लेखक माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में माइक्रोस्कोपी कोर और हमें प्राप्त मार्गदर्शन के लिए कर्मचारियों को भी स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान R01DK097253 और रक्षा विभाग CDMRP अनुदान E01 W81XWH2010836 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainer Fisher 22-363-549
1ml Insulin Syringes BD 329424
25G butterfly BD 367298
3 mm cutting edge scissors F.S.T 15000-00
30ml syringe BD Biooscience 309650
40 µm cell strainer Fisher 22-363-547
40 µm nylon mesh
Bonn Scissors F.S.T 14184-09
Bovine serum albumin Fisher BP1600-100
CD31 abcam ab7388
Collagenase type I Corning 354236
Collagenase type II SIGMA C6885 125CDU/mg
Collagene type IV SIGMA C5533-5M
Dnase-I Qiagen 79254
Dynabeads 450 Thermofisher Scientific 14013
endothelial cells growth medium Lonza cc-3156
Extra fine graefe forceps F.S.T 11150-10
FBS Gemini 100-106 Heat inactivated
Fibronectin Thermofisher 33016015
Fine forceps F.S.T Dumont E6511
HBSS GIBCO 14065-056
IFNg Cell Science CRI001B
Immortomouse Jackson laboratory 32619 Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-Glutamine 100x Thermofisher Scientific 25030081
Magnetic particle concentrator Thermofisher Scientific 12320D
mitotracker Thermofisher Scientific M7512
PBS 1X Corning 46-013-CM
penecillin streptomycin 100x Thermofisher Scientific 10378016
PhaM mice Jackson laboratory 18397 B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J
Protease (10 mg/ml) SIGMA P6911
RPMI GIBCO 3945
Sodium Pyruvate 100mM Thermofisher Scientific 11360070
Standard pattern forceps  F.S.T 11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt F.S.T 14008-14
synaptopodin Santa Cruz sc-515842
Trypsin 0.05% Thermofisher Scientific 25300054

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References

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फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सशर्त रूप से अमर माउस ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव
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Bouchareb, R., Yu, L., Lassen, E., Daehn, I. S. Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria. J. Vis. Exp. (187), e64147, doi:10.3791/64147 (2022).

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