Summary
Artikkelen beskriver metoden for å isolere betinget immortaliserte glomerulære endotelceller fra nyrene til transgene mus som uttrykker termolabile simian virus 40 og fotoaktiverbare mitokondrier, PhAMskåret ut. Vi beskriver prosedyren for glomeruli-isolasjon fra hele nyrer ved hjelp av perler, fordøyelsestrinn, såing og dyrking av GECs-CD31 positiv.
Abstract
Glomerulær endotelcelledysfunksjon (GEC) kan initiere og bidra til nedbrytning av glomerulær filtreringsbarriere. Økt mitokondriell oksidativt stress har blitt foreslått som en mekanisme som resulterer i GEC dysfunksjon i patogenesen av noen glomerulære sykdommer. Historisk sett har isolasjonen av GECs fra in vivo-modeller vært notorisk utfordrende på grunn av vanskeligheter med å isolere rene kulturer fra glomeruli. GEC-er har komplekse vekstkrav in vitro og en svært begrenset levetid. Her beskriver vi prosedyren for isolering og dyrking av betinget udødeliggjorte GEC-er med fluorescerende mitokondrier, noe som muliggjør sporing av mitokondrielle fisjons- og fusjonshendelser. GEC ble isolert fra nyrene til en dobbel transgen mus som uttrykker termolabil SV40 TAg (fra Immortomouse), betinget fremme proliferasjon og undertrykke celledifferensiering, og et fotokonvertibelt fluorescerende protein (Dendra2) i alle mitokondrier (fra fotoaktiverbar mitokondrier [PhAMskåret ut] mus). Den stabile cellelinjen som genereres tillater celledifferensiering etter inaktivering av det immortaliserende SV40 TAg-genet og fotoaktivering av en delmengde mitokondrier som forårsaker en bryter i fluorescens fra grønn til rød. Bruken av mitoDendra2-GECs muliggjør levende avbildning av fluorescerende mitokondriers distribusjon, fusjon og fisjonshendelser uten å farge cellene.
Introduction
Glomerulus er kritisk for blodfiltrering ved å begrense passasjen av store molekyler gjennom glomerulær filtreringsbarriere 1,2. Glomerulus inneholder fire celletyper: parietale epitelceller, podocytter (viscerale epitelceller), glomerulære endotelceller (GEC) og mesangialceller3. Det glomerulære endotelet er preget av en unik vaskulær struktur, i henhold til tilstedeværelsen av fenestrae som kreves for store filtreringsvolumer4. Den apikale overflaten av det glomerulære endotelet er dekket med et negativt ladet glykokalyxlag og et lag kalt endoteloverflatelaget som skaper et mellomrom mellom endotelet og blodet. Denne strukturen gir høy ladningsselektivitet som begrenser passasjen av negativt ladede molekyler som albumin og forhindrer leukocytt- og blodplateadhesjon5.
GEC er svært følsomme for metabolske endringer, for eksempel hyperglykemi forbundet med diabetisk miljø. Faktisk fører diabetes til økt sirkulasjon av skadelige stoffer, metning av glukosemetabolismeveier og forstyrret cellulær redoksbalanse 3,6. Videre induserer økningen i reaktive oksygenarter mitokondriell dysfunksjon, noe som påvirker endotelfunksjonen7.
Det overordnede målet med den nåværende protokollen er å isolere udødelige glomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrielle egenskaper. Faktisk har cellekulturen til primære GEC-er en begrenset proliferativ syklus og tidlig aldring8. I tillegg bidrar tilstedeværelsen av fluorescerende mitokondrier til å undersøke fisjons- og fusjonshendelser som respons på hyperglykemi eller annen behandling. Som en alternativ metode brukte andre laboratorier h-TERT for å udødeliggjøre celler in vitro9.
Metoden beskrevet her tillater isolering av betinget udødelige mitoDendra2 glomerulære endotelceller fra 4-6 uker gamle dyr (figur 1). Denne detaljerte protokollen beskriver bruken av transgene mus (H-2K b-tsA58) som inneholder simian virus 40 large tumor antigen (SV40 TAg) genet10,11 for å generere termolabile betinget udødeliggjorte celler. TSA58 TAg-genproduktet er funksjonelt ved den tillatte temperaturen på 33 °C under kontroll av den induserbare 5' flankerende promotoren av musens H-2Kb-gen, som økes over basale nivåer ved eksponering for interferon gamma (IFNγ), og opprettholder derfor den betingede proliferasjonsfenotypen12. H-2Kb nedbrytes raskt ved den ikke-permissive temperaturen på 37 °C i fravær av IFNγ, noe som fjerner den immortaliserende funksjonen til tsA58Tag i celler og lar cellene utvikle en mer differensiert fenotype13,14,15. Valgfri kryssing av H-2Kb-tsA58 transgene mus med PhAM-mus, som uttrykker en mitokondrie-spesifikk (underenhet VIII av cytokrom c-oksidase) Dendra2-grønn, tillater levende deteksjon av fluorescerende mitokondrier16. Dendra2 grønn fluorescens bytter til rød fluorescens etter eksponering for en 405 nm laser16. Når mitokondrier smelter sammen etter fotobytte, danner de langstrakte former som ser gule ut fra utvekslingen av grønt og gult materiale eller ser røde ut når de gjennomgår fisjon 7,17. MitoDendra2-GECs er et flott verktøy for å studere de cellulære responsene til GEC-mitokondrier til forskjellige stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer beskrevet her ble godkjent av IACUC ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Vi brukte tre mannlige mus (H-2Kb-tsA58 transgene mus med fotoaktiverbare mitokondrier [PhAM]) kjøpt fra Jackson lab og holdt på en normal chow diett.
1. Arbeidsforhold og forberedelser
- Rengjør arbeidsområdet inne i den laminære strømningshetten med 70% etanol og UV-C-lys.
- Forbered perlens vaskebuffere. Lag buffer-1 ved bruk av 0,1 M natriumfosfat ved pH 7,4-8,0, buffer-2 ved bruk av 1x fosfatbufret saltvann (PBS) uten kalsium og magnesium supplert med 0,1% bovint serumantigen (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 og buffer-3 ved bruk av 0,2 M Tris med 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Magnetisk partikkelkonsentrator
- Fremstilling av magnetiske perler
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør blandes forsiktig 200 μL magnetiske perler (4 x 108 perler) med 200 μL buffer-1.
MERK: Forbered 200 μL magnetiske perler per mus 1 dag før vevshøsting. Perlene vil bli brukt til å høste glomeruli. - Plasser røret i en magnetisk partikkelkonsentrator i 1 min, og aspirer deretter supernatanten forsiktig. Fjern røret fra magneten og resuspend de vasket perlene i 200 μL buffer-1.
- Plasser røret som inneholder magnetiske perler i den magnetiske partikkelkonsentratoren i 1 min og aspirer forsiktig supernatanten.
- Inaktiver de frie tosylgruppene ved å vaske de magnetiske perlene 2x, 5 min hver, ved å bruke 200 μL buffer-2 ved å plassere røret i den magnetiske partikkelkonsentratoren og kaste bort bufferen.
- Inkuber magnetkulene i 200 μL buffer-3 i 24 timer ved 4 °C, eller i 4 timer ved 37 °C, for å inaktivere de gjenværende frie tosylgruppene. Plasser røret i magnetkonsentratoren i 1 min, aspirer supernatanten forsiktig og kast den.
- Vask magnetperlene 1x med 200 μL buffer-2 i 5 minutter ved 4 °C. Plasser røret tilbake i magnetkonsentratoren i 1 minutt og aspirer supernatanten forsiktig. Fjern røret fra magnetkonsentratoren og resuspend de magnetiske perlene i 200 μL buffer-2 for å oppnå 4 x 108 perler / ml.
MERK: På dette stadiet er det mulig å la perlene stå ved 4 °C i opptil 15 dager.
- I et 1,5 ml mikrosentrifugerør blandes forsiktig 200 μL magnetiske perler (4 x 108 perler) med 200 μL buffer-1.
3. Isolering av mus nyre glomerulære celler
- Klargjør perfusjonsmaterialet: 30 ml sprøyte, 25 G sommerfuglnål. Forbered isolasjonsmaterialet: steril 10 cm tallerken, skalpell, magnetisk partikkelkonsentrator, 40 μm cellesil, 100 μm cellesil.
- Forbered 100 ml 1x Hanks balanserte saltløsning (HBSS) supplert med 1% antibiotika og juster pH til 7,35. Filtrer løsningen med et 0,2 μm filter og hold den under panseret for å unngå forurensning.
- Bland 200 μL magnetiske perler fra trinn 2.1.6 med 20 ml 1x HBSS.
MERK: For hver mus vil det være behov for 200 μL perler fortynnet i 20 ml HBSS 1x. - Forklar en 1 ml aliquot kollagenase type-II (125 CDU / mg) ved 1 mg / ml i 1x HBSS løsning, pH 7,35. Forvarm RPMI med 10% FCS medium i et vannbad ved 37 ° C. Forvarm endotelcellekulturmediet ved 37 °C (se materialtabell for detaljer).
MERK: RPMI vil bli brukt til å nøytralisere kollagenasen. - Forbelegg to brønner på en 6-brønns plate med 2 ml 10 μg/ml kollagen IV (1 ml/brønn) i 45 minutter ved romtemperatur. Vask platen 3x med 1x PBS for å fjerne eddiksyren som brukes til å fortynne kollagenet. De belagte platene skal brukes umiddelbart eller oppbevares ved 2-8 °C i opptil 4 uker.
NOTAT: Tetting av platen (e) med en gjennomsiktig film er foretrukket for å forhindre uttørking. Kollagenbelegget letter festingen av celler til platen. - Rengjør og steriliser alle kirurgiske instrumenter i figur 2 ved å bruke 70% etanol og deretter autoklavere dem i 30 minutter. Rengjør det kirurgiske arbeidsområdet med 70% etanol.
- Bedøv musene med en intraperitoneal injeksjon av ketamin/xylazin (10 mg/ml ketamin og 1 mg/ml xylazin). For å bekrefte at dyret er fullt bedøvet, sjekk for tåklyperefleksen.
- Fest musens poter med 19 G nåler for å holde den på plass på en disseksjonsplattform. Rengjør brystet og buken med 70 % etanol, og åpne buken langs brystet med saks a (figur 2).
- Stikk en sommerfuglnål inn i venstre ventrikkel (figur 3A) og injiser ca. 100 μL av dråpeoppløsningen (fra trinn 1.2) for å utvide blodsirkulasjonen.
- Bryt forsiktig den nedre vena cava under nyrene med en 19 G nål (figur 3A). Fortsett perfusjonen som ble startet i trinn 3.9.
MERK: Alternativt kan en minipumpe brukes med hastighet: 18,0+, tid: 5 min. God perfusjon er viktig for å høste et stort antall glomeruli bærende magnetiske perler. Dette er en ikke-overlevelse / terminal prosedyre. - Fjern fettvevet forsiktig med pinsett og excise begge nyrene med tynn kirurgisk saks c (figur 2) og legg dem i en tallerken med 1 ml 1x HBSS på is. Hakk nyren med saks b (figur 2) deretter med en steril skalpell til 1 mm små biter som vist i figur 3B.
- Deretter inkuberer du den hakkede nyren med 1 ml kollagenase type II fra trinn 3.4 i 35 minutter ved 37 °C med forsiktig vipping ved hjelp av en horisontal shaker. Vevet skal fordøyes fullstendig etter dette trinnet, som vist i figur 3C.
- Tilsett 4 ml RPMI med 10% FBS (fra trinn 3.4) for å nøytralisere kollagenasen. Filtrer det fordøyede vevet gjennom en steril 100 μm cellesil i et 50 ml rør. Bruk bunnen av et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør for å røre det fordøyede vevet mot silen for å la glomeruli gå gjennom.
- Skyll cellesilen med 15 ml 1x HBSS og sentrifuger deretter gjennomstrømningen ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. På dette tidspunktet inneholder pelleten tre lag; perlene med glomeruli er synlige i det midterste laget av røret, det øvre laget består av mindre strukturer som tubuli, og bunnlaget er rusk (figur 3D).
- Aspirer forsiktig supernatanten og det øverste hvite laget. Den gjenværende pelleten inneholder perlene som bærer glomeruli og rusk (figur 3D). Resuspend pelleten med 1,5 ml 1x HBSS og overfør til et 2 ml rør.
- Plasser røret i magnetkonsentratoren (figur 3E), aspirer supernatanten, og vask deretter perlene 2x med 1 ml 1x HBSS; På dette stadiet legger du 20 μL av cellesuspensjonen på et lysbilde for å verifisere tilstedeværelsen av glomeruli under mikroskopet (figur 3F, en glomerulus [svart pil] og noen perler [gule piler] i suspensjonen).
- Aspirer supernatanten forsiktig, resuspender pelleten i endotelcellevekstmedium (Table of Materials), og overfør den til et rent 2 ml rør. Tilsett 2 μL IFNγ (100 U/ml) i røret og plate cellene på en brønn på en 6-brønns plate. Inkuber cellene ved 33 °C.
- Etter 3 dager med kultur, bytt forsiktig mediet ved å pipettere ut 1 ml av mediet og erstatte det med 1 ml friske medier. På dette stadiet er cellene heterogene med en blanding av glomerulære celler (figur 4G).
MERK: I den utvoksende kulturen vil det være en blanding av glomerulære celler og noen magnetiske perler (figur 4G). Legg merke til at alle cellene skal vise grønne, fluorescerende mitokondrier. - Etter 7 dager med kultur, aspirer mediet fullstendig og erstatt det med et friskt 2 ml endotelcellevekstmedium supplert med IFNγ (100 U / ml). På dette stadiet begynner cellene å spre seg, men er fortsatt heterogene (figur 4A).
- Etter 10 dagers kultur når cellene når ~ 80% sammenløp, passerer cellene ved hjelp av trypsin som beskrevet i trinn 5.1 og overfører dem deretter til en T25-kolbe belagt med kollagen IV.
- Etter 1 uke (totalt ~ 21 dager med kultur), passasje cellene til en T75 kolbe belagt med kollagen IV.
4. Klargjøring av perler for endotelcelleisolasjon
- Start med å belegge sauenes antirotteperler med et rotteantimus CD31-antistoff 3,18,19. Bruk 10 μL perler for hver T75-kolbe.
- Vask 10 μL perler 3x med 200 μL 1x PBS supplert med 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Plasser røret i konsentratormagneten for å pipette vaskebufferen hver gang.
- Resuspend perlene i 200 μL PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Tilsett 4,8 μL CD31-antistoff 7,18,19 fra rotter, plasser røret på en horisontal shaker og bland forsiktig i 1 time ved romtemperatur, og hold deretter røret ved 4 °C over natten.
5. Isolering av glomerulære endotelceller med CD31-belagte perler
- Tilsett 3 ml 0,25 % trypsin til en T75-kolbe og inkuber cellene ved 37 °C i 5 minutter. Nøytraliser trypsinet med 3 ml endotelvekstmedium, overfør cellene til et 15 ml rør, og sentrifuger deretter ved 200 x g i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten og vask cellene i 1 ml PBS som inneholder 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Resuspend pelleten i 200 μL belagte perler tilberedt i trinn 4, og tilsett 800 μL PBS som inneholder 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Inkuber cellene i 45 minutter med kontinuerlig risting ved 37 °C, 5 % CO2.
- Plasser røret i magnetkonsentratoren og vask cellene 4x med 1x PBS som inneholder 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Resuspend cellene i 3 ml endotelvekstmedium supplert med 100 U / ml IFNγ.
- Plate 1,5 ml celler/brønn i kollagen IV-belagte brønner på en 6-brønns plate. Dyrk cellene under permissive forhold ved 33 °C.
MERK: De isolerte cellene uttrykker simian virus 40 (SV40) stort T-antigen tsA58, noe som muliggjør aktivering av kontinuerlig proliferasjon ved 33 °C (permissiv tilstand). - Etter 4 dager i kultur, fjern 750 μL av mediet og erstatt det med samme volum friskt medium supplert med 100 U / ml IFNγ.
- Etter 10 dager til 14 dager med kultur, sjekk for voksende CD31-positive GEC-kolonier (figur 4C) som uttrykker fluorescerende mitokondrier ved hjelp av et epifluorescensmikroskop med et 488 nm filter.
- Etter 21 dager med kultur kan cellene ha nådd 80% -90% sammenløp; overfør dem til en T25-kolbe. Etter å ha nådd sammenløp, kan celler opprettholdes med RPMI vekstmedium og 10% FCS.
MERK: Før de når sammenløp, kan cellene se heterogene ut (figur 4B). Men når de er sammenflytende, får de en brosteinsmorfologi. - På dette stadiet kan cellene bli kryopreservert. Etter å ha nådd 80% sammenløp, tilsett 3 ml 0,25% trypsin til cellene og inkuber dem ved 37 ° C i 5 minutter. Nøytraliser trypsinet med et likt volum vekstmedium supplert med 10% FBS.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min. Kast supernatanten og resuspend cellene i 3 ml frysemedium (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquot cellene i cryo-rør og lagre dem i flytende nitrogen damp temperatur.
6. Dyrking av mitoDendra2-GECs
- Tine cellene fra kryoalikoten fra trinn 5.10 i et vannbad ved 37 °C og overfør dem til et 15 ml rør med 10 ml forvarmet endotelvekstmedium.
- Sentrifuge suspensjonen ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern mediet, og overfør pelleten til kollagen IV-belagt T25 cm2 cellekulturkolbe med forvarmet endotelcellevekstmedium supplert med 100 U / ml IFNγ og inkuber ved 33 ° C.
- Bytt medium neste dag. Når cellene når 70% -80% sammenløp, vanligvis etter 5 dager, overfør dem til en T75 cm2 cellekulturkolbe.
- For å differensiere cellene til endotelfenotype, overfør cellene til ikke-permissive forhold ved 37 °C i vekstmedier uten IFNγ.
7. Passaging av mitoDendra2-GECs
- Fjern mediet, vask cellene med PBS, og tilsett 3 ml varm 0,25% trypsin-EDTA-løsning (T75 cm2 kolbe), inkuber ved 37 ° C i 5 minutter.
- Når cellene er løsrevet, tilsett 5 ml vekstmedium og pipette opp og ned. Sentrifuger suspensjonen ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur og overfør cellene til en ny kollagen IV-belagt kolbe eller plate.
MERK: Passaging bør gjøres en gang i uken i forholdet 1: 4.
8. Karakterisering av mitoDendra2-GECs
- Utfør immunfluorescensfarging for CD31 på differensierte celler 7,18,19,20 (figur 4D). Bruk andre markører som vWF og Isolectin-B4 også20.
- For å bekrefte mitokondriell spesifisitet av Dendra2, merk celler med mitokondriespesifikke markører ved å inkubere cellene i vekstmedium som inneholder 100 nM mitokondriell tracker i 30 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
- Fjern mediet og vask cellene forsiktig med forvarmet medium uten fenolrødt for å utføre levende bildebehandling.
MERK: Alternativt kan celler festes ved hjelp av formaldehydfiksativer (4%) i 30 minutter etterfulgt av vask flere ganger i PBS. Faste celler kan lagres ved 4 °C i 1x PBS til bruk. En bekreftelse med flowcytometri er også mulig: merke celler med anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. GEC bør flekke negativt for podocyttmarkører (synaptopodin, Nphs1, Podxl), mesangialcellemarkører (PDGFRβ, angiotensinogen) og rørformede cellemarkører (Aquaporin, Aminopeptidase-N). Disse markørene fungerer som negative kontroller. På grunn av det mitokondriespesifikke Dendra2-uttrykket til disse cellene, unngå å bruke FITC-kanalen.
9. Levende celleavbildning av mitokondrier strukturelle endringer som respons på oksidativt stress eller høy glukose
- Plate 1 x 105 GEC på en 35 mm glassbunnskål belagt med kollagen IV ved bruk av endotelcellevekstmedium (Table of Materials). Etter 24 timer, bytt til medium uten fenolrødt. Cellene har grønne, fluorescerende mitokondrier.
- Sett miljøkammeret på 37 °C, 5 % fuktighet og 5 % CO2 1 time før eksperimentet starter.
- Under et konfokalt mikroskop, bruk et 40x / 1,2 W mål for å justere fokuset og velg interesseområdet. Inkuber cellene med 2 ml 5 mM eller 25 mM glukose i 60 minutter.
- Utsett cellene for en 405 nm laser (4% lasereffekt) for å fotokonvertere en underpopulasjon av mitokondrier fra grønn til rød (figur 5A-B, D-E).
- Bruk 561 nm laser for å opphisse Dendra2 i uomvendt tilstand for å visualisere den røde fluorescensen. Se den detaljerte fotobytteprotokollen som tidligere beskrevet16. Fusjonshendelsene vises som gul fluorescens etter flere minutter på grunn av grønn matrise og rød matriksfusjon (figur 4C, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikkelen beskrives en detaljert protokoll for isolering av betinget udødelige glomerulære endotelceller med stabile fluorescerende mitokondrier (mitoDendra2-GECs) (figur 1). Bruken av unge 6-10 uker gamle mus er viktig for å få et betydelig antall friske celler. Etter 3 dager med kultur begynner celler å vokse sakte fra den isolerte glomeruli, som vist i figur 3G. Etter 7 dager er cellene heterogene, og viser andre glomerulære celletyper, som podocytter, parietale epitelceller og mesangialceller (figur 4A). Etter å ha nådd 70% til 80% sammenheng, ble andre glomerulære celler fjernet ved hjelp av et positivt utvalg av endotelceller med magnetiske CD31-merkede perler (figur 4B-C). MitoDendra2-GECene uttrykte CD31 (figur 4D) og var negative for podocyttmarkør som vist ved synaptopodinnegativ farging (figur 4E-F).
Den fluorescerende mitokondrielle funksjonen i mitoDendra2-GECs gjør det mulig å studere mitokondrier morfologi under ulike forhold in vitro. Her testet vi effekten av høy glukose (25mM) på mitokondrienes struktur av mitoDendra2-GEC (figur 5D-F). Sammenlignet med de langstrakte mitokondriene som er synlige i celler under normal glukose (5mM; Figur 5A-C), høy glukoseindusert fragmentering eller fisjon av mitokondrier observert ved fremtredende sfæroidformede mitokondrier (figur 5E). Videre brukte vi en 405 nm laser for å fotokonvertere en valgt underpopulasjon av mitokondrier i en enkelt levende mitoDendra2-GEC (figur 5A, D). I figur 5B og figur 5E presenteres vellykket fotobytte av mitokondrier fra grønt (488 nm) til rødt (561 nm) i det valgte området. Det er viktig at det tillot å være vitne til fusjonshendelsene i mitoDendra2-GECs dyrket under normal glukose, som det kan observeres av den gule sammenslåtte grønne og røde fluorescensen som følge av mitokondriermatrisefusjon (figur 5C). I motsetning til dette, i den høye glukosebehandlede mitoDendra2-GEC, var mitokondriene fragmentert og hovedsakelig røde (figur 5F), noe som tyder på at fisjons- / fusjonshendelsene i tidsrammen som ble testet, ble forsinket eller hemmet på grunn av skaden forårsaket av høy glukosebehandling, og dette er i samsvar med tidligere rapporter18,19.
Figur 1: Representativ beskrivelse av murine GEC-isolasjon. Diagrammet representerer de signifikante trinnene i GEC-isolasjon, fra perfusing mus hjerte med magnetiske perler for å isolere nyreglomeruli, fordøyelsen av kollagenase, kulturen av glomerulære celler, og til slutt rensing av GEC ved hjelp av CD31-belagte perler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Beskrivelse av nyredisseksjon. Representativt bilde av alle de sterile kirurgiske instrumentene som trengs for disseksjonen. Saks (a) er nødvendig for å åpne musens hud, og en egen saks (b, c) er nødvendig for å isolere nyrene. Pinsett (d) og (e) er nødvendig for å holde huden. Pinsett (f) er nødvendig for å samle den dissekerte nyren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Beskrivelse av glomerulihøsting . (A) Fest venstre ventrikkel med HBSS-perleoppløsningen ved hjelp av en 20 ml sprøyte. Perforere den dårligere vena cava med en 19 G nål. (B) Etter perfusjon, fjern fettet fra nyrene og kutt det i 1 mm stykker. (C) Fordøy vevet med kollagenase type II. (D) Etter fordøyelse og sentrifugering dannes tre lag; Perlene som bærer glomeruli er i mellomlaget, som indikert av den svarte pilen. (E) Skill de isolerte perlene som bærer glomeruli ved hjelp av magnetkonsentratoren. (F) Representativt bilde av nyisolert glomeruli. (G) Voksende celler fra isolerte glomeruli etter 3 dager. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Mitokondriell analyse in vitro. (A) Glomerulære celler etter 3 dager med kultur. (B) GEC etter 7 dager. (D) Rensing av GEC med CD31-merkede perler. Mikroskopisk avbildning av CD31-farging. (E) GECs er negative for synaptopodin. (F) Podocytter farget med synaptopodin (488 nm, grønn fluorescens) som en negativ kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Mikroskopisk avbildning av fluorescerende mitokondriell fusjon in vitro. Bilder ble anskaffet med et konfokalt mikroskop ved hjelp av et 40x vannmål. (AB) Valgt område (rød sirkel) ble opplyst med en 405 nm linje (4% lasereffekt) for 300 bleking iterasjoner med en hastighet på 6,3-12,61 / piksel, som tidligere beskrevet16. (A-C) Celler i vekstmedier som inneholder 5 mM glukose; Grønn fluorescens (488 nm) viser sunne mitokondrier. (B,E) Mitokondrier ble fotobyttet til rødt (567 nm). (C) Gul fluorescens oppdager en aktiv fusjonshendelse av GEC behandlet med 5mM glukose. (D) Cellene ble behandlet med høy glukose 25 mM i 30 minutter. Grønn fluorescens viser fragmenterte mitokondrier og (E) en del som ble fotobyttet til rødt. (F) Figuren viser en redusert fusjonshendelse som vist ved redusert gul fluorescens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrier er kritiske for cellulær metabolisme, homeostase og stressresponser, og deres dysfunksjon er knyttet til mange sykdommer, inkludert nyresykdom. Mitokondrier har en rolle i patologisk generering av overdreven reaktive oksygenarter (ROS), regulering av intracellulære kalsiumnivåer, celledødsveier og cytoskeletal dynamikk21,22,23.
Isoleringen av murine GEC er utfordrende på grunn av deres lille antall, størrelse, matrisefaktorer og gjensidig avhengige natur med andre glomerulære celler som er avgjørende for deres overlevelse. Den nåværende artikkelen presenterer en detaljert protokoll for mus GEC-isolasjon. Spesielt brukte vi transgene mus som et verktøy for å oppnå betinget udødelige cellelinjer med høyt proliferasjonspotensial. De transgene musene, som uttrykker simian virus 40 (SV40) stort T-antigen tsA58, muliggjør aktivering av kontinuerlig spredning under permissive forhold ved 33 ° C og ble her krysset med PHAMutskårne mus som uttrykker mitokondrie-spesifikk fluorescens. De doble transgene musene tilbød et utmerket verktøy for å studere mitokondrierstruktur. Faktisk har PHAMskåret ut mus mitokondrie-spesifikke (underenhet VIII av cytokrom c oksidase) Dendra2 grønn, noe som tillater levende deteksjon av fluorescerende mitokondrier og observasjon av fisjons- og fusjonshendelser gjennom grønn-rød fotobytte16.
Protokollen består av tre viktige trinn: ekstrahering av glomeruli ved hjelp av perler, spredning av glomerulære celler og etterfølgende rensing av GEC ved bruk av CD31-perler når cellene er i kultur. Bruken av bare en fordøyelse med kollagenase er tilstrekkelig til å isolere glomerulære celler. Andre protokoller benytter seg av en andre fordøyelse med DNAse og proteinase24. Vi har imidlertid lagt merke til bedre celleutbytter med bare ett fordøyelsestrinn. DNAse kan forbli aktiv og bremse spredning av cellene. Videre kan GEC isoleres ved hjelp av differensiell sikting som tidligere beskrevet20, noe som ikke alltid er lett når man bruker mus nyrer.
Det er avgjørende å autoklav alle kirurgiske verktøy før du starter isoleringen av nyrene og glomeruli for å unngå forurensning. Videre er det viktig å filtrere og supplere løsningene med antibiotika for å eliminere enhver forurensningskilde. Mykoplasmainfeksjoner kan faktisk forårsake cytopatologi som følgelig forstyrrer hver parameter målt i cellekultur25.
Isoleringen av glomeruli er avhengig av intra-kardial perfusjon av perler. Sikkert, langsom perfusjon med 20 ml 1x HBSS-holdige perler er avgjørende for å høste et høyt antall glomeruli. Perlene vil bli fanget i glomeruli, noe som letter rensingen ved hjelp av en magnetisk konsentrator. Perlene kan tilberedes og oppbevares ved 4 °C i opptil 15 dager før de brukes for å lette den eksperimentelle prosedyren.
Videre er fordøyelse av glomeruli med kontinuerlig risting avgjørende for å skille et stort antall glomeruli fra nyrene. På den annen side er isoleringen av murine GECs utfordrende på grunn av deres lille størrelse og tilstedeværelsen av andre glomerulære celler. Derfor er den trinnvise isoleringen av glomeruli, veksten av alle glomerulære celler i kultur og den påfølgende bruken av CD31-belagte perler for å rense endotelceller, spesielt for å oppnå mer signifikante antall levedyktige og betinget proliferative GEC. Likevel er det nødvendig å validere renheten til celler med immunostaining og flowcytometri.
I tillegg beskriver protokollen karakteriseringen av GEC-fenotypen og mitokondrienes fusjons-/fisjonsanalyse in vitro. MitoDendra2-GEC-ene er et utmerket verktøy for å studere de cellulære responsene til GEC-mitokondrier til forskjellige stimuli in vitro uten behov for transfeksjon eller farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Cijiang He og Dr. Fu Jia for deres innsikt i musens endotelcelleisolasjon og takker professor Mone Zaidi for å gi PhAMutskårne mus og verdifulle diskusjoner. Forfatterne vil også gjerne anerkjenne Microscopy CORE ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai og ansatte for veiledningen vi mottok. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health grant R01DK097253 og Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 til I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M.
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
