Summary
所提出的协议描述了基于鬼笔环肽的丝状肌动蛋白染色技术的开发和使用，该技术与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）一起可视化微流体动态培养通道和传统固定孔静态培养室中的贴壁细胞层结构。这种方法有助于评估细胞层融合度、单层形成和层厚均匀性。
Abstract
体外 微流体实验具有巨大的潜力，可以揭示对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和呼吸机引起的肺损伤（VILI）等条件下发生的微生理现象的许多见解。然而，在与人肺终末细支气管相关的尺寸的微流体通道中的研究目前面临一些挑战，特别是由于在给定的培养环境中难以建立适当的细胞培养条件，包括培养基流速。所提出的协议描述了一种基于图像的方法，用于评估在非氧气渗透微流体通道中培养的NCI-H441人肺上皮细胞的结构，其尺寸与人肺的末端细支气管在生理上相关。使用基于鬼笔环肽的丝状肌动蛋白染色，通过共聚焦激光扫描显微镜揭示细胞的细胞骨架结构，从而实现单个和分层细胞的可视化。随后的定量确定所采用的细胞培养条件是否产生适合进一步实验的均匀单层。该协议描述了微流体通道和传统固定孔环境中的细胞培养和层评估方法。这包括通道构建、细胞培养和必要条件、固定、透化和染色、共聚焦显微成像、图像处理和数据分析。
Introduction
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种急性疾病，由肺实质损伤和损伤传播，导致肺泡肺水肿，气体交换不足，随后出现低氧血症1。这启动了促炎细胞因子释放、中性粒细胞募集、毒性介质释放和组织损伤的循环，其本身会引起进一步的炎症反应2。此外，肺表面活性剂可稳定气道并防止重复复张/复张（R/D）造成的损伤，可能会因ARDS期间发生的化学过程而失活或以其他方式使其功能失调，从而导致进一步的压力和对周围实质的伤害3。如果持续足够的损伤，可能需要机械通气以确保足够的全身氧合4.然而，机械通气带来了自身的挑战和创伤，包括呼吸机诱发的肺损伤 （VILI） 的可能性，其特征是过度充气（容积性损伤）期间施加的机械应力和/或液体阻塞气道中气液界面的 R/D （远端外伤）5.在疏距创伤模型中，暴露于气液界面的上皮细胞（如在液体闭塞的细支气管中）所经历的压力梯度可导致通透性引起的阻塞反应 （POOR），从而导致 POOR-GET-POORer 损伤的良性循环 6,7,8。
体外 实验可以提供对这些现象的微观见解，但目前在具有生理相关维度的微流体通道环境中的研究面临几个挑战9。首先，优化细胞培养条件对微流体环境中的细胞培养研究构成了重大障碍，因为存在一个狭窄的交叉点，其中培养基流参数、培养持续时间和其他培养条件允许最佳的细胞层形成。这包括微流体培养通道封闭的不透氧特性所施加的扩散限制。这需要仔细考虑培养基流参数，因为低流速会剥夺细胞的氧气，尤其是那些离入口最远的细胞;另一方面，高流速会将细胞推出培养通道或导致层发育不当或不均匀。扩散限制可以通过在气液界面（ALI）培养设备中使用透氧材料（例如聚二甲基硅氧烷（PDMS）来解决;然而，鉴于制造的外壳10的性质，许多传统的微流体培养通道，例如电池基板阻抗传感（ECIS）系统的通道，本质上是不透氧的。该协议旨在提供一种分析在耐氧不透氧外壳中培养的细胞层的技术。
在比较培养条件的活力时，必须观察特定的层特征，例如单层的存在、表面拓扑、汇合度和层厚度均匀性，以确定一组特定培养条件产生的细胞层是否符合所需的规格，并且确实与实验设计相关。可以通过诸如ECIS之类的方法进行有限的评估，ECIS利用由流阵列内金电极上培养的细胞的电绝缘膜施加的高频交流电（AC）（阻抗）电阻产生的电势（电压）的测量。通过调节施加到细胞上的AC频率，可以靶向和检查细胞和细胞层的特定频率依赖性细胞特性，例如表面粘附强度，紧密连接形成以及细胞增殖或汇合11。然而，这些间接形式的测量在实验开始时有些难以解释，并且可能无法量化细胞层的所有相关方面。简单地在相差显微镜下观察细胞层可以揭示某些质量的性质，例如汇合度;然而，许多相关特征（例如单层的存在和层厚度均匀性）需要进行三维（3D）评估，而明场，相衬或荧光显微成像无法实现12。
本研究的目的是开发一种丝状肌动蛋白染色技术，以允许使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对单层进行基于成像的验证和评估细胞层均匀性。丝状肌动蛋白（F-actin）被认为是荧光团偶联物的合适靶标，部分原因是F-肌动蛋白紧密跟随细胞膜的方式，允许整个细胞体积13的视觉近似。靶向F-肌动蛋白的另一个重要好处是F-肌动蛋白染色在视觉上阐明细胞骨架破坏或细胞经历的应激和应变所施加的改变的方式。使用无甲醇甲醛的交联固定用于保持细胞和细胞层的形态，因为甲醇等脱水固定剂倾向于使细胞变平，严重扭曲细胞层并改变其性质14,15。
为了确定层评估技术缓解这些挑战的能力，在传统的八孔培养室和微流体通道中培养细胞，以评估产生的细胞层中的差异（如果有的话）。对于固定培养孔，使用八孔腔盖玻璃单元。对于微流体培养，对流动阵列（通道长度 50 mm、宽度 5 mm、深度 0.6 mm）进行了优化，以在尺寸与人肺呼吸区中存在的终末细支气管相关的环境中培养永生化的人肺上皮 （NCI-H441） 细胞16.虽然该协议是在考虑ECIS流阵列的培养环境的情况下开发的，但它可能适用于任何需要评估培养细胞层特征或培养条件的不透氧动态培养环境。
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Protocol
NCI-H441人上皮肺细胞系用于本研究（见 材料表）。
1. 微流控通道中的细胞培养
- 制造微流体通道并按照以下步骤进行预处理。
- 获得单通道流阵列（见 材料表）并将上部与聚碳酸酯底板分开。
- 获得尺寸为 60 mm x 22 mm 的 #1.5 矩形盖玻片（厚度 0.17 mm）。在超声波浴中清洁盖玻片的表面，并在室温下用0.1mg / mL聚-D-赖氨酸溶液处理一侧5分钟，然后在60°C下干燥30分钟。
- 将0.13毫米厚的双面粘合剂（见 材料表）贴在流阵列顶部，激光切割以适应流阵列顶部和流道（50毫米长，5毫米宽）的尺寸，注意精确对准通道切口17。
- 将 0.1 mm 厚的聚酯薄膜垫片（见 材料表）激光切割以适应流阵列顶部和流道的尺寸，贴在胶条上，注意精确对齐通道切口。
- 重复步骤 1.1.3 和 1.1.4，直到达到所需的通道高度（例如，对于 0.6 mm 的通道高度，请使用两个垫片和三个粘合条）。
- 将矩形盖玻片贴在最底部的胶带上，经聚-D-赖氨酸处理的一面朝向粘合剂。组装完成后，如图 1所示，对结构的顶部和底部施加牢固且相等的压力并保持1分钟。
注意：通道外壳的构造，包括盖玻片、粘合剂、垫片和流阵列顶部，现已完成。 - 使用注射器用去离子水冲洗通道，同时检查是否有泄漏。
- 在紫外线（UV）灭菌器中对通道外壳进行30分钟的灭菌18。
- 使用无菌技术，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中用2.0μg/ mL人纤连蛋白（参见 材料表）处理通道，并在37°C下孵育至少30分钟19。
- 按照以下步骤在微流体通道中进行细胞培养。
- 在无菌层流罩中，使用微量移液器将NCI-H441细胞的均匀悬浮液转移到RPMI 1640培养基中，并加入10%胎牛血清（FBS）（参见 材料表）以接种两个微流体通道，每个通道的细胞表面密度为150,000个细胞/ cm2。
- 对于 50 mm x 5 mm x 0.6 mm 通道，使用 0.25 mL 的 2.5 x 106 细胞/mL 悬浮液填充每个通道以及部分端口。使用明场显微镜验证细胞是否均匀分布在通道内。
- 使用可编程注射泵（参见材料表）分别在37°C下用5%CO2培养两个通道24小时和48小时，从通道中抽出用过的培养基，并将新鲜培养基从连接到通道入口的无菌培养基储液器中，该容器由覆盖有石蜡膜的切开20mL注射器组成。
- 在细胞接种后 10 分钟的等待期后，以可变流速从储液池引入并泵送新鲜培养基，从 0.2 μL/min 开始，并升至 10 μL/min 持续 4 小时，此后保持该速率20。
注意：这种可变流速提供了培养条件，允许细胞（1）重力沉降到培养表面，（2）粘附在培养表面上，以及（3）形成汇合的单层。
- 在细胞接种后 10 分钟的等待期后，以可变流速从储液池引入并泵送新鲜培养基，从 0.2 μL/min 开始，并升至 10 μL/min 持续 4 小时，此后保持该速率20。
- 在无菌层流罩中，使用微量移液器将NCI-H441细胞的均匀悬浮液转移到RPMI 1640培养基中，并加入10%胎牛血清（FBS）（参见 材料表）以接种两个微流体通道，每个通道的细胞表面密度为150,000个细胞/ cm2。
- 使用甲醛溶液在微流体通道内进行细胞固定。
注意：甲醛是有毒的，必须在适当的化学通风橱中处理21.- 在化学通风橱中，使用 4% 甲醛在 PBS（无甲醇）（参见材料表）中制备甲醛溶液，以产生两个 4 mL 部分，使用 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水（DPBS;以 Ca 2+ 和 Mg2+）作为稀释剂，将第一个稀释至 1% 甲醛，将第二个稀释至 2% 甲醛。将甲醛溶液转移到分离的 5 mL 注射器中并相应地标记。将 20 mL DPBS 吸入单独的 20 mL 注射器中。
- 从培养装置中取出微流体通道并将其放入化学通风橱中。
- 组装固定和染色装置。
- 通过公鲁尔锁 将 一段 10 cm 的传输管连接到三通旋塞阀的侧端口上，以连接到软管倒钩适配器（参见 材料表），然后将旋塞阀连接到流阵列的入口端口。
- 接下来，使用相同类型的软管倒钩适配器将另一段 10 cm 的传输管连接到流阵列的出口端口。
- 最后，将两个转移管的自由端固定在适合化学和生物危害的废物容器中，例如标记的空 50 mL 锥形离心管。
- 转动旋塞阀以堵塞流阵列入口，并用DPBS冲洗废物管路。然后，转动旋塞阀以堵塞废物管路，并用 2 mL DPBS 缓慢洗涤细胞。每次都使用新解决方案重复刷新步骤。将新的溶液（或溶液浓度）引入通道。
- 缓慢推动2mL的1%固定溶液通过通道，然后静置5分钟22。
- 缓慢推动 2 mL 的 2% 固定剂溶液通过通道，然后静置 15 分钟。
- 通过在三个单独的实例中（每个5分钟）将2mL新鲜DPBS缓慢引入通道来洗涤细胞。
- 并联完成两个微流体通道的步骤1.3.3-1.3.7。
- 染色、透化并将安装介质添加到微流体通道中的细胞中。
- 制备0.1%皂苷溶液，每mL DPBS加入1mg皂苷（见 材料表）以产生4mL溶液，并轻轻涡旋以混合23。将 8 mL DPBS 吸入 20 mL 注射器中。
- 将F-肌动蛋白染笔环肽试剂和细胞核染色Hoechst试剂（参见 材料表）加入0.1%皂苷溶液中，每mL皂苷溶液每滴（0.1mL）每种试剂两滴（0.1mL）。用铝箔覆盖使准备好的染色/透化溶液远离光线24.
- 用少量染色/透化溶液冲洗管线（如步骤1.3.4中所述），然后将2mL溶液引入微流体通道并用铝箔覆盖通道，然后让它在室温下静置30分钟。
- 用 2 mL DPBS 冲洗染色/透化溶液两次，每次冲洗 5 分钟。
- 为了获得更好的图像质量，请在通道中加入合适的封片剂（折射率与显微镜物镜油和盖玻片紧密匹配，参见 材料表）。
- 使用微量移液器，向微流体通道的每个端口引入最少量的软固型抗淬灭封片剂，确保底表面被完全覆盖并且没有气泡被困在所需的成像区域25内。密封通道的末端并通过在明场显微镜下观察来验证细胞层的完整性。
- 并联完成两个微流体通道的步骤1.4.3-1.4.5。
注意：染色后尽快对细胞进行成像，以获得最佳图像质量。如果发生光漂白或需要长期储存，可以使用其他具有抗淬灭或样品保存特性的封片剂。请注意，硬固化封片剂会扭曲细胞的 3D 结构，进而扭曲细胞层;因此，优选软设置安装介质26。
- 按照以下步骤对微流体通道中的细胞进行成像。
- 调整共聚焦显微镜（见 材料表）设置，包括激光功率、增益、偏移和扫描参数，如扫描速度、扫描区域、扫描格式、分辨率和针孔直径27.
- 通过进行参考扫描和Z-stack测试成像位置，直到满足所需的图像参数和条件。在依次使用更高放大倍率物镜的拨入参数，直到达到并优化40倍油浸物镜28。
- 使用流阵列底板作为参考，在五个位置构建Z-stacks，在入口侧第一个电极的预期位置，中心和先前位置之间的中间，中心，中心和最后一个电极的位置之间的中间（在出口侧），在最后一个电极， 如图 2 所示。
- 执行图像处理和数据分析。
- 使用共聚焦显微镜软件包导出XZ和YZ横截面（参见 材料表）。
- 使用具有边缘检测功能（阈值15.0）的图像处理软件（参见材料表），使用图像外部的魔棒工具测量总图像区域（以像素为单位），然后使用魔棒工具在图像单元层外部的部分测量不包括细胞层总横截面积的区域（以像素为单位）。
- 使用数据处理软件（参见 材料表），从总面积像素值中减去外部区域像素值，以找到横截面积像素值。
- 通过将像素值乘以μm/像素值的平方，将横截面积像素值转换为μm2 值，如特定图像的显微镜软件所示（以1024p分辨率拍摄的Z堆栈为0.31μm/像素，在40倍油浸镜头上没有变焦）。
- 计算数据的均值和标准差并绘制结果图。
图 1：微流体通道结构的分解图示意图。顶部元件是流动阵列的顶部，薄灰色元件是胶带，蓝色细元件是聚酯薄膜垫片，底部元件是矩形盖玻片。请点击此处查看此图的大图。
图 2：沿微流体培养通道的一致层生成区域的五个成像位置。 成像位置如下：入口侧，靠近第一个电极在完整流阵列上的位置;入口侧位置和通道中心之间的中间位置;通道中心;在中心和出口侧位置之间，以及出口侧之间，靠近最后一个电极在完整流阵列上的位置。 请点击此处查看此图的大图。
2. 八孔腔盖玻片中的细胞培养
- 对八孔腔盖玻片进行预处理。
- 获得用#1.5盖玻片和增加细胞粘附表面处理制造的无菌八孔腔盖玻片（图3，见 材料表）。
- 使用无菌技术，在PBS中用2.0μg/ mL人纤连蛋白处理培养孔的表面，并在37°C下孵育至少30分钟19。
- 按照以下步骤在腔室盖玻片中进行细胞培养。
- 在无菌层流罩中，以 81,000、162,000 和 324,000 个细胞/mL 的体积密度将 0.5 mL 部分 NCI-H441 细胞溶液均匀悬浮在含有 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中，以分别以 45,000、90,000 和 180,000 个细胞/cm2 的表面密度接种培养孔。使用明场显微镜验证细胞是否均匀分布在孔内。
- 用5%CO2在37°C下培养细胞24小时，48小时和96小时，每天更换培养基。
- 在八孔室盖玻片中进行甲醛固定。
注意：甲醛是有毒的，必须在适当的化学通风橱中处理21.- 在化学通风橱中，通过在PBS（无甲醇）中制备两份4%甲醛来制备甲醛溶液，使用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS;以Ca 2+和Mg2+）作为稀释剂，将第一部分稀释至1%甲醛浓度，另一份稀释至2%甲醛。
- 从培养箱中取出八孔培养室盖玻片并将其放入化学通风橱中。
- 使用微量移液器用 0.5 mL DPBS 轻轻洗涤细胞，方法是沿每个孔角的上部缓慢引入液体。
- 通过使用微量移液器从孔的角落缓慢提取每个孔中的现有液体来去除每个孔中的现有液体。使用液体引入方法（步骤2.3.3），将0.5mL的1%固定溶液引入每个孔中，并使其静置5分钟22。
- 使用步骤2.3.4中提到的液体提取方法去除每个孔中的现有液体。使用步骤2.3.3中提到的液体引入方法，将0.5mL的2%固定溶液引入每个孔中，并静置15分钟。
- 使用液体引入和提取方法（步骤2.3.3和2.3.4），通过在三个单独的实例中在每个孔中引入和去除0.5mL新鲜DPBS来洗涤细胞，每次5分钟。
- 在八孔腔盖玻片中进行染色、透化和封片剂添加。
- 每毫升DPBS加入1mg皂苷，制备0.1%皂苷溶液，轻轻涡旋混合23。
- 向 0.1% 皂苷溶液中，每 mL 皂苷溶液加入两滴 （0.1 mL） F-肌动蛋白染笔环肽试剂和细胞核染色 Hoechst 试剂。用铝箔覆盖使制备的溶液远离光线24.
- 向每个孔中引入 0.2 mL 染色/透化溶液，并用铝箔覆盖腔室盖玻片，然后在室温下静置 30 分钟。
- 用 0.5 mL DPBS 冲洗染色/透化溶液两次。
- 为了获得更好的图像质量，将合适的封片剂（折射率与显微镜物镜油和盖玻片紧密匹配）添加到孔中。
- 使用微量移液器，向每个孔中引入最少量的软固型抗淬灭封片剂，确保底面被完全覆盖，并且在所需的成像区域内没有气泡被困住25。通过在明场显微镜下观察来验证细胞层的完整性。
注意：染色后尽快对细胞进行成像，以获得最佳图像质量。如果发生光漂白或需要长期储存，可以使用其他具有抗淬灭或样品保存特性的封片剂。请注意，硬固化封片剂会扭曲细胞的3D结构，进而扭曲细胞层，因此最好使用软固化封片剂26。
- 使用微量移液器，向每个孔中引入最少量的软固型抗淬灭封片剂，确保底面被完全覆盖，并且在所需的成像区域内没有气泡被困住25。通过在明场显微镜下观察来验证细胞层的完整性。
- 在八孔腔盖玻片中进行成像。
- 调整共聚焦显微镜设置，包括激光功率、增益、偏移和扫描参数，如扫描速度、扫描区域、扫描格式、分辨率和针孔直径27.
- 通过进行参考扫描和Z-stack测试成像位置，直到满足所需的图像参数和条件。在依次使用更高放大倍率物镜的拨入参数，直到达到并优化40倍油浸物镜28。
- 在每个播种密度/培养持续时间匹配中构建三个随机位置的 Z 堆栈。
- 执行图像处理和数据分析。
- 使用共聚焦显微镜软件包导出XZ和YZ横截面。
- 使用具有边缘检测功能（阈值15.0）的图像处理软件，通过使用图像外部的魔 棒 工具测量总图像区域（以像素为单位），然后使用 魔棒工具 在图像单元层外部的部分测量不包括细胞层总横截面积的区域（以像素为单位）。
- 使用数据处理软件，从总面积像素值中减去外部区域像素值，以找到横截面积像素值。
- 通过将像素值乘以特定图像的显微镜软件中指示的μm/像素值的平方，将横截面积像素值转换为μm2 值（以1024p分辨率拍摄的Z堆栈为0.31μm/像素，在40倍油浸镜头上没有变焦）。
- 计算均值和标准差并绘制结果图。
图 3：用于固定孔培养、染色和成像实验的八孔腔盖玻片示意图，比较初始细胞接种密度和培养持续时间对细胞层形成的影响。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
所提出的方法允许在微流体培养通道中培养的上皮细胞层的可视化，并使用传统固定孔细胞培养环境中的演示作为验证。采集的图像将存在于质量、信号强度和细胞靶标特异性的光谱上。成功的图像将表现出高对比度，允许对图像进行分析和量化数据以进行后续统计评估。不成功的图像将变得模糊、模糊，或者无法用于主观或定量评估。一些图像可能适用于主观层特征测定，但质量仍不足以进行定量分析。因此，遵循协议的程度和谨慎程度将直接影响给定图像作为统计分析数据源的适用性。
图4显示了该技术在微流体动态培养环境中的成功应用，并显示了两个微流体装置的入口和出口处的图像采集。图4A，B提供了培养24小时的层的示例， 图4C，D提供了培养48小时的层的示例。 图5说明了从微流体通道实验中收集的相关数据，其中包含来自图2所示的五个微流体通道成像位置中每个每个培养持续时间的三个样品。误差线表示标准偏差。
图 6 描绘了微流体通道中心的 XY 平面的 2D 图像，图 7 描绘了具有深度颜色编码的相同位置的 3D 视图。图8表示在密度持续时间实验中成功采集图像，该实验分析了初始细胞接种密度和培养持续时间对八孔腔盖玻片环境中NCI-H441细胞层形成的影响。图8A-C分别表示培养持续时间为24小时，48小时和96小时。图 8X-Z 表示初始细胞接种密度分别为 180,000、90,000 和 45,000 个细胞/cm2。图9显示了从八孔腔盖玻片实验中收集的定量数据，包括每个密度持续时间匹配中来自三个位置的样品。误差条表示标准差，并执行p值检验以确定明显接近的值之间的统计显著差异。
在动态微流体和静态八孔环境中的这两个代表性实验是不同的用例示例，它们展示了该技术如何通过直观地确认生理相关单层的存在与否来将实验结果置于上下文中。
图 4：在微流体通道中培养 24 和 48 小时的 NCI-H441 细胞层，如图 2 所示在入口侧和出口侧位置成像 。 （A）24小时，入口侧。（B） 24小时，出口侧。（C）48小时，入口侧。（D）48小时，出口侧。蓝色代表细胞核染色，绿色代表丝状肌动蛋白染色。 请点击此处查看此图的大图。
图5：在24-48小时微流体通道成像实验期间收集的数据的图形表示。 这包括来自沿微流体通道相关长度的五个位置中的每一个的六个横截面积样品（如图 2所示）。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：在微流体通道内中心位置的 XY 平面中拍摄的 2D 图像。 蓝色代表细胞核染色，绿色代表丝状肌动蛋白染色。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：与图 6 相同的微流体通道位置的 3D 模型。颜色编码描绘深度数据。请点击此处查看此图的大图。
图 8：在八孔腔盖玻片中培养的 NCI-H441 细胞层。 对于24小时（A），48小时（B）和96小时（C），初始接种密度为180,000（X），90,000（Y）和45,000（Z）细胞/ cm 2。蓝色代表细胞核染色，绿色代表丝状肌动蛋白染色。 请点击此处查看此图的大图。
图 9：在密度持续时间八孔培养实验期间收集的数据的图形表示。 这包括来自每个密度持续时间匹配的六个横截面积样本。误差线表示标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
所提出的协议描述了NCI-H441人肺上皮细胞在单通道微流体流阵列的动态环境中以及在传统八孔腔盖玻片的静态环境中的培养，交联固定，染色，透化和共聚焦显微镜可视化。对于任何微流控细胞培养方案，细胞培养基的流动条件都至关重要，因为高速流动有可能冲走细胞或干扰细胞单层的正常组装。同时，由于微流体通道的不渗透性以及流动特性所施加的扩散限制，低速率流动有可能使细胞层“饥饿”或“窒息”（分别营养和氧气供应不足）30。通过从 10 分钟的等待期开始（在此期间细胞保持悬浮在最初填充通道的相同培养基中），然后前进到 0.2 μL/min 的流速，最后在 4 小时内升至 10 μL/min，平衡这些竞争需求以促进细胞粘附和存活。
协议中的另一个关键步骤是微流体通道的正确准备，包括构建和预处理。必须注意确保盖玻片正确安装到腔室结构上，以避免泄漏和潜在污染。正确连接盖玻片也是必要的，以确保在使用不同构造单元的连续试验之间保持一致并准确再现通道高度。所用胶条的厚度公差以及相对可压缩性可能会带来微小的变化。最小化任何变异性将有助于实验结果的一致性。对构建的通道进行适当的预处理对于确保细胞被允许粘附并在玻璃表面上启动增殖非常重要。玻璃的超声波清洁可提高聚-D-赖氨酸的粘附性，促进纤连蛋白的粘附。添加纤连蛋白（一种由人上皮细胞自然合成和分泌的糖蛋白），进一步促进NCI-H441细胞对盖玻片表面的粘附，从而实现正常的细胞单层发育31。
此外，该协议最重要的方面之一是成像位置。尽管精心控制了制备，但由于两个通道开口区域中可用的柱状体积，即使坚持适当的细胞培养技术，这些开口正下方和相邻区域的盖玻片表面上也会存在更多细胞。出于这个原因，开口附近的区域不应被视为“正常”培养细胞层的一部分，因为那里会发生显着的多层/细胞堆叠。相反，微流体通道的中心区域是成像的合适区域，因为该位置不受开口附近通道高度变化施加的误差的干扰。流动阵列上的电极位置可用于指导成像位置，并且根据经验，所有旨在捕获真正代表微流体通道条件的层的扫描都应在流阵列上两个最远电极范围内的类似位置进行。此外，在所描述的协议中，指定使用40倍放大镜;但是，可以对其进行修改以满足用户的需求。40倍放大倍率被选为最佳放大倍率，因为它能够提供高分辨率、高放大倍率成像，同时仍保留足够数量的细胞作为统计上有效的样品。
可以对微流体通道进行的一种修改包括改变通道高度，这可以通过改变用于构建微流体通道的间隔物和粘合剂的数量来实现。通道高度的改变可能需要调整流量参数，以确保剪切应力在喂料过程中不会去除细胞。因此，通道高度的任何变化都会影响理想的初始速率、爬坡速率和媒体流的最终速率。本文中描述的方案可以作为实验推导合适流速的手段，结合间接方法（如ECIS）。此外，可以修改流速以适应不同细胞系的需求，这可能需要进行调整以建立最佳条件。可以进行的另一个修改，对本协议中的步骤进行了一些补充，是将所描述技术的用例扩展到细胞层横截面积的相对比较之外。通过使用已知尺寸的微球或微珠进行适当校准，可以进行准确的体积、拓扑和绝对横截面积测量。在这种情况下，由于共聚焦显微镜的Z分辨率有限，并且由于共聚焦扫描系统提供的对Z-stack步长的手动控制，Z维度上可能出现过度采样或采样不足，因此在这种情况下，使用参考对象进行校准是必要的32。
该协议的一个限制是由于缺乏垂直校准步骤而缺乏真正的体积测量。上述校准和利用已知尺寸的荧光微珠的验证技术可用于逼真的缩放。此外，本协议涉及使用预先制备的即用型染色剂。使用一抗和二抗进行免疫荧光染色通常需要多天方案，该方案比本文讨论的方案更复杂。然而，有可能以这种方式利用免疫荧光染色，尽管可能需要进行一些实验来优化工作流程。鉴于免疫荧光染色方案中涉及的额外步骤，必须注意避免在众多洗涤步骤中剪切培养的细胞层，因为这可能会改变最终评估的细胞层的性质，从而使随后的任何结论无效。该技术的进一步发展可能包括图像和数据分析的自动化，包括用于横截面积确定的感兴趣区域（ROI）检测和量化。此外，扩展该技术以包括不同的细胞内和细胞外靶标结构（可能是对靶标进行染色，例如紧密连接蛋白）可能会将该方法的用例扩展到微流控细胞培养装置中的3D共定位。
为了产生最具生理代表性的细胞层，肺上皮细胞必须在培养表面具有气液界面（ALI）的微流体通道中培养，这通常使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）完成，PDMS是一种通过引入微米级孔而具有渗透性的柔性材料。ALI培养条件允许形成最接近 体内 肺上皮33生理特征的细胞层。虽然技术上可行，但在动态微流体环境中具有PDMS培养表面的ALI培养环境中使用ECIS对于大多数研究人员来说是不切实际且无法获得的，因为没有用于这种复杂细胞培养组件的市售设备34。造成这种困难的一个原因可能是矛盾地需要一种可渗透的培养表面，该表面仍然能够充当用于ECIS测量的固体电极。因此，目前需要一种方法来直观地验证在非透氧培养环境中培养的细胞层的特征和生理相关性，例如ECIS流阵列中存在的细胞层。
该方法通过允许3D可视化扩展了使用二维显微镜确保适当融合的传统方法，这大大拓宽了可以观察，定量和分析的细胞层特征的数量。此外，这允许主观确定单层的存在、层均匀性以及与实验目的相关的其他性质。该协议很重要，因为它可以作为视觉验证和评估在许多不透氧环境中产生的细胞层的手段，例如在评估暴露于远距创伤的上皮细胞的屏障功能特性的ECIS实验中。这也是一种可用于未来工作的方法，以确定一组动态微流体培养条件是否产生相关且适合进一步实验的细胞层。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢Alan Shepardson为微流体通道构建中使用的3M粘合剂和聚酯薄膜设计了切割模式，并测试了细胞培养基流速和注射泵编程。资金由NIH R01 HL0142702，NSF CPET 1706801和Newcomb-Dulane College Dean's Grant提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
| ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
| Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
| Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
| BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
| Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
| Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
| ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
| Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
| Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
| Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
| Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
| ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
| Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
| Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
| Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
| Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
| National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
| NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
| NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
| Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
| PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
| Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
| Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
| Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
| SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
| Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
| Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
References
- Matthay, M. A., et al.
- Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
- Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
- Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
- Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
- Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
- Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
- Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
- Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
- Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
- Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
- EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
- Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
- Sandell, L., Sakai, D.
- New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
- Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
- Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
- Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R.
- Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Ferriera, F., Rasband, W.
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
- Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
- Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
- Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).
