Summary
提示されたプロトコルは、マイクロ流体動的培養チャネルおよび従来の固定ウェル静的培養チャンバーにおける接着細胞層構造を視覚化するための共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いたファロイジンベースの糸状アクチン染色技術の開発と使用について説明しています。このアプローチは、細胞層のコンフルエント性、単層形成、および層厚の均一性を評価するのに役立ちます。
Abstract
in vitro マイクロ流体実験は、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)や人工呼吸器誘発性肺損傷(VILI)などの状態で発生する微小生理学的現象に関する多くの洞察を明らかにする大きな可能性を秘めています。しかし、ヒト肺の細気管支末に生理学的に関連する寸法を有するマイクロ流体チャネルの研究は、特に所与の培養環境内で培地流量を含む適切な細胞培養条件を確立することが困難であるため、現在いくつかの課題に直面している。提示されたプロトコルは、ヒト肺の末端細気管支に生理学的に関連する寸法を有する酸素不透過性マイクロ流体チャネルで培養されたNCI-H441ヒト肺上皮細胞の構造を評価するための画像ベースのアプローチを説明している。ファロイジンベースの糸状アクチン染色を使用して、細胞の細胞骨格構造が共焦点レーザー走査顕微鏡によって明らかにされ、個々の細胞および層状の細胞の視覚化が可能になります。その後の定量は、採用されている細胞培養条件が、さらなる実験に適した均一な単層を産生しているかどうかを判断します。このプロトコルは、マイクロ流体チャネルおよび従来の固定ウェル環境における細胞培養および層評価方法について説明しています。これには、チャネル構築、細胞培養と必要な条件、固定、透過処理と染色、共焦点顕微鏡イメージング、画像処理、およびデータ分析が含まれます。
Introduction
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)は、肺実質の損傷に対する侮辱および損傷の伝播から生じる急性状態であり、肺胞の肺水腫、不十分なガス交換、およびその後の低酸素血症をもたらします1。これにより、炎症誘発性サイトカイン放出、好中球動員、毒性メディエーター放出、および組織損傷のサイクルが開始され、それ自体がさらなる炎症反応を引き起こします2。さらに、気道を安定させ、反復的な動員/脱動員(R / D)によって引き起こされる損傷を防ぐ肺サーファクタントは、ARDS中に発生する化学プロセスによって不活性化されるか、そうでなければ機能不全になり、周囲の実質にさらなるストレスと損傷をもたらす可能性があります3。十分な損傷が続く場合は、適切な全身酸素化を確保するために機械的換気が必要になる場合があります4。しかし、人工呼吸器は、過膨張中に課せられる機械的ストレス(体積外傷)および/または流体閉塞気道の気液界面のR / D(無テレトラウマ)によって引き起こされる肺実質の損傷として特徴付けられる人工呼吸器誘発性肺損傷(VILI)の可能性を含む、独自の課題と外傷を課します5.無遠外傷モデルにおいて(流体閉塞細気管支のように)気液界面に曝露された上皮細胞が経験する圧力勾配は、透過性に起因する閉塞反応(POOR)をもたらし、損傷のPOOR-get-POORerの好循環につながる可能性があります6,7,8。
in vitro 実験は、これらの現象に対するマイクロスケールの洞察を提供することができますが、生理学的に関連する次元を持つマイクロ流体チャネル環境での現在の研究は、いくつかの課題に直面しています9。一つには、細胞培養条件の最適化は、培地フローパラメータ、培養期間、およびその他の培養条件が最適な細胞層形成を可能にする狭い交差点が存在するため、マイクロ流体環境での細胞培養研究への参入に大きな障壁をもたらします。これには、マイクロ流体培養チャネルエンクロージャの酸素不透過性によって課せられる拡散制限が含まれます。低流速は細胞、特に入口から最も遠い細胞から酸素を奪う可能性があるため、これには媒体流量パラメータを慎重に検討する必要があります。一方、流速が高いと、細胞が培養チャネルから押し出されたり、不適切または不均一な層発達が生じたりする可能性があります。拡散の制限は、気液界面(ALI)培養装置でポリジメチルシロキサン(PDMS)などの酸素透過性材料を使用することで対処できます。しかしながら、電気セル−基質インピーダンスセンシング(ECIS)システムのもののような多くの従来のマイクロ流体培養チャネルは、製造されたエンクロージャ10の性質を考えると、本質的に酸素不透過性である。このプロトコルは、酸素不透過性のエンクロージャーで培養された細胞層を分析するための技術を提供することを目的としています。
培養条件の生存率を比較する場合、単層の存在、表面トポロジー、コンフルエンシー、層厚の均一性などの特定の層特性の観察は、特定の一連の培養条件によって生成された細胞層が所望の仕様を満たし、実際に実験計画に関連しているかどうかを判断するために必要です。フローアレイ内の金電極上で培養した細胞の電気絶縁膜によって課される高周波交流(AC)に対する抵抗(インピーダンス)によって生じる電位(電圧)の測定を利用するECISなどの方法で限定的な評価を行うこともできます。細胞に印加されるACの周波数を調節することにより、表面接着強度、タイトジャンクション形成、細胞増殖またはコンフルエンシーなど、細胞および細胞層の特定の周波数依存性を標的とし、調べることができます11。ただし、これらの間接的な形式の測定値は、実験の開始時に解釈するのがやや困難であり、細胞層の関連するすべての側面を定量化するとは限りません。位相差顕微鏡で細胞層を観察するだけで、コンフルエンシーなどの特定の性質の性質が明らかになる場合があります。しかしながら、単層の存在および層厚の均一性などの多くの関連する特性は、明視野、位相コントラスト、または蛍光顕微鏡イメージングでは不可能な3次元(3D)評価を必要とする12。
本研究の目的は、単分子膜のイメージングによる検証と共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いた細胞層の均一性の評価を可能にする糸状アクチン染色技術を開発することでした。糸状アクチン(F-アクチン)は、F-アクチンが細胞膜にしっかりと追従し、細胞体積全体の視覚的近似を可能にする方法もあって、蛍光色素複合体の適切な標的であると考えられました13。F-アクチンを標的とするもう一つの重要な利点は、F-アクチンの染色が、細胞が受けるストレスや株によって課せられる細胞骨格の破壊や変化を視覚的に解明する方法です。メタノールなどの脱水固定剤は細胞を平らにし、細胞層を大きく歪め、その特性を変化させる傾向があるため、メタノールを含まないホルムアルデヒドによる架橋固定は、細胞と細胞層の形態を維持するために使用されました14,15。
これらの課題を軽減する層評価技術の能力を判断するために、細胞を従来の8ウェル培養チャンバーおよびマイクロ流体チャネルで培養し、産生された細胞層の違いがある場合はそれを評価しました。固定培養ウェルには、8ウェルチャンバーカバーガラスユニットを使用した。マイクロ流体培養の場合、フローアレイ(チャネル長50 mm、幅5 mm、深さ0.6 mm)を最適化して、ヒト肺の呼吸ゾーンに存在する末端細気管支に生理学的に関連する寸法の環境で不死化ヒト肺上皮(NCI-H441)細胞を培養しました16。このプロトコルは、ECISフローアレイの培養環境を念頭に置いて開発されましたが、培養細胞層の特性や培養条件の評価が必要な酸素不透過性の動的培養環境に適用できます。
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Protocol
NCI-H441ヒト上皮性肺細胞株を本研究に使用した( 材料表参照)。
1. マイクロ流体チャネルでの細胞培養
- マイクロ流体流路を作製し、以下の手順で前処理を行います。
- シングルチャネルフローアレイ( 材料表を参照)を取得し、上部をポリカーボネートベースプレートから分離します。
- 寸法60 mm x 22 mmの#1.5長方形カバーガラス(厚さ0.17 mm)を入手します。超音波浴でカバーガラスの表面を洗浄し、片面を0.1 mg/mLのPoly-D-リジン溶液で室温で5分間処理してから、60°Cで30分間乾燥させます。
- フローアレイ上部と流路(長さ50mm、幅5mm)の寸法に合わせてレーザーカットした厚さ0.13mmの両面接着剤( 材料表参照)をフローアレイ上部に貼り付け、流路切り欠き17を正確に位置合わせするように注意します。
- チャネルの切り欠きを正確に位置合わせするように注意しながら、フローアレイの上部と流路の寸法に合わせてレーザーカットされた厚さ0.1 mmのマイラースペーサー( 材料表を参照)を粘着ストリップに貼り付けます。
- 目的のチャネル高さが得られるまで、手順1.1.3と1.1.4を繰り返します(たとえば、チャネルの高さが0.6 mmの場合、2つのスペーサーと3つの粘着ストリップを使用します)。
- 長方形のカバーガラスを一番下の粘着ストリップに貼り付け、ポリ-D-リジン処理された側を接着剤に向けます。組み立てが完了したら、図1に示すように、構造の上部と下部にしっかりと均等な圧力をかけ、 1分間保持します。
注意: カバーガラス、接着剤、スペーサー、フローアレイトップを含むチャネルエンクロージャの構築が完了しました。 - シリンジを使用してチャネルを脱イオン水ですすぎ、同時に漏れをチェックします。
- チャネルエンクロージャを紫外線(UV)滅菌器で30分間滅菌します18.
- 滅菌技術を使用して、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2.0 μg/mLヒトフィブロネクチン( 材料表を参照)でチャネルを処理し、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします19。
- マイクロ流体流路で以下の手順で細胞培養を行う。
- 滅菌層流フードで、マイクロピペットを使用して、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI 1640培地中のNCI-H441細胞の均一な懸濁液を移し( 材料の表を参照)、それぞれ表面密度が150,000細胞/cm2の細胞を持つ2つのマイクロ流体チャネルを播種します。
- 50 mm x 5 mm x 0.6 mm チャンネルの場合は、0.25 mL の 2.5 x 106 細胞/mL懸濁液を使用して、各チャンネルとポートの一部を満たします。明視野顕微鏡を使用して、細胞がチャネル内に均等に分布していることを確認します。
- プログラム可能なシリンジポンプ(材料表を参照)を使用して、2つのチャネルをそれぞれ37°Cで5%CO2で24時間および48時間培養し、使用済み培地をチャネルから引き出し、新鮮な培地をチャネルから引き出し、パラフィンフィルムで覆われたカットオープン20mLシリンジで構成されるチャネル入口に取り付けられた滅菌培地リザーバーからチャネルに新鮮な培地を引き出しました。
- 細胞播種後の10分間の待機期間の後、0.2 μL/minから始まり、4時間10 μL/minまで上昇する可変流量で、リザーバーからチャネルを介して新鮮な培地を導入してポンプで送り、その後その速度を維持します20。
注:この可変流速は、細胞が(1)培養表面に重力的に沈降し、(2)培養表面に接着し、(3)コンフルエントな単層を形成することを可能にする培養条件を提供します。
- 細胞播種後の10分間の待機期間の後、0.2 μL/minから始まり、4時間10 μL/minまで上昇する可変流量で、リザーバーからチャネルを介して新鮮な培地を導入してポンプで送り、その後その速度を維持します20。
- 滅菌層流フードで、マイクロピペットを使用して、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI 1640培地中のNCI-H441細胞の均一な懸濁液を移し( 材料の表を参照)、それぞれ表面密度が150,000細胞/cm2の細胞を持つ2つのマイクロ流体チャネルを播種します。
- ホルムアルデヒド溶液を用いてマイクロ流体チャネル内の細胞固定を行います。
注意: ホルムアルデヒドは有毒であり、適切な化学ヒュームフード21で取り扱う必要があります。- ケミカルヒュームフードで、PBS(メタノールフリー)中の4%ホルムアルデヒドを使用してホルムアルデヒド溶液を調製し( 材料の表を参照)、2つの4 mL部分を作成し、最初のものを1%ホルムアルデヒドの濃度に希釈し、2番目のホルムアルデヒドを希釈剤としてダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS;Ca2+ およびMg2+を含む)を使用します。ホルムアルデヒド溶液を5 mLシリンジに分離し、それに応じてラベルを付けます。20 mLのDPBSを別の20 mLシリンジに吸い込みます。
- 培養装置からマイクロ流体チャネルを取り外し、化学ヒュームフードに入れます。
- 固定および染色装置を組み立てます。
- オスのルアーロックからホースバーブアダプター(材料表を参照)を介して、3方向活栓のサイドポートに10 cmのトランスファーチューブを取り付け、活栓をフローアレイの入口ポートに接続します。
- 次に、同じタイプのホースバーブアダプターを使用して、別の10 cmセグメントのトランスファーチューブをフローアレイの出口ポートに取り付けます。
- 最後に、両方の移送チューブの自由端を、ラベルの付いた空の50 mL円錐形遠沈管など、化学的およびバイオハザードに適した廃棄物容器に固定します。
- 活栓を回してフローアレイ入口ポートを遮断し、廃棄物ラインをDPBSで洗い流します。次に、活栓を回して廃棄物ラインを遮断し、2 mLのDPBSで細胞をゆっくりと洗浄します。毎回新しい溶液を使用してフラッシング手順を繰り返します。新しい溶液(または溶液の濃度)がチャネルに導入されます。
- 2 mLの1%固定液をチャネルにゆっくりと押し込み、5分間放置します22。
- 2 mLの2%固定液をゆっくりとチャネルに押し込み、15分間放置します。
- 2 mLの新鮮なDPBSを3つの別々のインスタンス(各5分)でチャネルにゆっくりと導入することにより、細胞を洗浄します。
- 両方のマイクロ流体チャネルに対して手順1.3.3-1.3.7を並行して実行します。
- 染色、透過処理、およびマイクロ流体チャネル内の細胞への封入剤の添加を行います。
- DPBS1mLあたり1 mgのサポニン( 材料表を参照)を加えて4 mLの溶液を生成し、穏やかにボルテックスして23を混合することにより、0.1%サポニン溶液を調製します。8 mLのDPBSを20 mLシリンジに吸い込みます。
- F-アクチン染色ファロイジン試薬と核染色ヘキスト試薬( 材料表参照)を0.1%サポニン溶液に、サポニン溶液1mLあたり各試薬を2滴(0.1 mL)加えます。調製した染色・透過処理液をアルミホイル24で覆って光から遠ざけてください。
- 少量の染色/透過処理溶液でラインを洗い流し(ステップ1.3.4で説明)、次に2 mLの溶液をマイクロ流体チャネルに導入し、チャネルをアルミホイルで覆ってから、室温で30分間放置します。
- 染色/透過処理溶液を2 mLのDPBSで2回、フラッシュごとに5分間洗い流します。
- 画質を向上させるには、適切な封入メディア(顕微鏡の対物レンズオイルとカバーガラスに屈折率が近い、 材料表を参照)をチャンネルに追加します。
- マイクロピペットを使用して、マイクロ流体チャネルの各ポートに最小量のソフトセット退色防止封入剤を導入し、底面が完全に覆われ、所望のイメージング領域25内に気泡がトラップされないようにする。チャネルの端をシールし、明視野顕微鏡で観察して細胞層の完全性を確認します。
- 両方のマイクロ流体チャネルに対して手順1.4.3〜1.4.5を並行して実行します。
注:最高の画質を得るために、染色後できるだけ早く細胞をイメージしてください。光退色が発生した場合、または長期保存が必要な場合は、退色防止またはサンプル保存特性を備えた他の封入剤を使用できます。硬化しにくい封入剤は、細胞の3D構造、ひいてはセル層を歪めることに注意してください。このため、ソフトセット封入メディア26が好ましい。
- マイクロ流体チャネル内の細胞を以下の手順に従って画像化する。
- レーザー出力、ゲイン、オフセット、スキャン速度、スキャン領域、スキャンフォーマット、解像度、ピンホール直径27などのスキャンパラメータを含む共焦点顕微鏡(材料表を参照)の設定を調整します。
- 目的の画像パラメータと条件が満たされるまで、リファレンススキャンとZスタックを使用して、イメージング位置をテストします。40倍の油浸対物レンズに到達して最適化されるまで、順次高倍率の対物レンズでのダイヤルインパラメータ28.
- フローアレイベースプレートを基準として、入口側の第1電極の予定位置、中心と前の位置の中間、中心、中心と最後の電極の位置(出口側)の中間、および最後の電極の5つの位置にZスタックを構築し、 図 2 に示すように。
- 画像処理とデータ分析を実行します。
- 共焦点顕微鏡ソフトウェアパッケージを使用してXZおよびYZ断面をエクスポートします( 材料表を参照)。
- エッジ検出機能(閾値15.0)を備えた画像処理ソフトウェア(材料表参照)を使用して、画像の外側のマジックワンドツールを使用してピクセル単位の総画像領域を測定し、次にセル層29の画像外側の部分でマジックワンドツールを使用してセル層の総断面積をピクセル単位で除いた領域を測定します。
- データ処理ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、総面積ピクセル値から外部面積ピクセル値を減算し、断面積ピクセル値を求めます。
- 特定の画像の顕微鏡ソフトウェアに示されているように、ピクセル値にμm/ピクセル値の2乗を掛けて、断面積ピクセル値をμm2 値に変換します(40倍油浸レンズでズームなしで1024p解像度で撮影されたZスタックの場合は0.31 μm/ピクセル)。
- データと結果のグラフの平均と標準偏差を計算します。
図1:マイクロ流体チャネル構造の分解図。上部の要素はフローアレイの上部、薄い灰色の要素は粘着ストリップ、薄い青色の要素はマイラースペーサー、下部の要素は長方形のカバーガラスです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロ流体培養チャネルの一貫して層を生成する領域に沿った5つのイメージング位置。 イメージング位置は以下の通りである:入口側、第1電極が無傷のフローアレイ上に位置する場所の近く。入口側の位置とチャネルの中心の中間。チャネルの中心。中心側と出口側の位置の中間、および出口側、最後の電極が無傷のフローアレイ上にある場所の近く。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. 8ウェルチャンバーカバーガラスでの細胞培養
- 8ウェルチャンバーカバーガラスの前処理を行います。
- #1.5カバーガラスと細胞接着性を高める表面処理で製造された滅菌8ウェルチャンバーカバーガラスを入手します(図3、 材料表を参照)。
- 滅菌技術を用いて、培養ウェルの表面をPBS中の2.0 μg/mLヒトフィブロネクチンで処理し、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします19。
- チャンバー付きカバーガラス内で、以下の手順で細胞培養を行います。
- 滅菌層流フード内で、10%FBSを含むRPMI 1640培地に均一に懸濁したNCI-H441細胞の溶液を体積密度81,000、162,000、および324,000細胞/mLで0.5 mLずつ移し、それぞれ45,000、90,000、および180,000細胞/cm2の表面密度で培養ウェルに播種します。明視野顕微鏡を使用して、細胞がウェル内に均等に分布していることを確認します。
- 細胞を5%CO2で37°Cで24時間、48時間、および96時間培養し、毎日培地を交換した。
- ホルムアルデヒド固定を8ウェルチャンバーカバーガラスで行います。
注意: ホルムアルデヒドは有毒であり、適切な化学ヒュームフード21で取り扱う必要があります。- 化学ヒュームフードで、PBS(メタノールフリー)で4%ホルムアルデヒドを2回に分けて調製し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS;Ca2+ およびMg2+)を希釈剤として使用して、最初のホルムアルデヒドを1%の濃度に希釈し、もう1つを2%ホルムアルデヒドの濃度に希釈します。
- インキュベーターから8ウェル培養チャンバー付きカバーガラスを取り出し、ケミカルヒュームフードに入れます。
- マイクロピペットを使用して、各ウェルの角の上部に沿って液体をゆっくりと導入することにより、0.5 mLのDPBSで細胞を穏やかに洗浄します。
- マイクロピペットを使用してウェルの隅からゆっくりと抽出することにより、各ウェル内の既存の液体を除去します。液体導入法(ステップ2.3.3)を使用して、0.5 mLの1%固定液を各ウェルに導入し、5分間放置します22。
- ステップ2.3.4で説明した液体抽出方法を使用して、各ウェル内の既存の液体を除去します。ステップ2.3.3で説明した液体導入方法を使用して、0.5 mLの2%固定液を各ウェルに導入し、15分間放置します。
- 液体導入および抽出方法(ステップ2.3.3および2.3.4)を使用して、0.5 mLの新鮮なDPBSを3つの別々のインスタンスでそれぞれ5分間導入および除去することにより、細胞を洗浄します。
- 染色、透過処理、および封入剤の添加を8ウェルチャンバーカバーガラスで行います。
- DPBS1 mLあたり1 mgのサポニンを加えて0.1%サポニン溶液を調製し、穏やかにボルテックスして23を混合します。
- 0.1%サポニン溶液に、サポニン溶液1mLあたりF-アクチン染色ファロイジン試薬と核染色ヘキスト試薬をそれぞれ2滴(0.1 mL)加えます。調製した溶液をアルミホイル24で覆って光から遠ざけてください。
- 各ウェルに0.2 mLの染色/透過処理溶液を導入し、チャンバーカバーガラスをアルミホイルで覆ってから、室温で30分間放置します。
- 染色/透過処理溶液を0.5 mLのDPBSで2回洗い流します。
- 画質を向上させるには、適切な封入剤(顕微鏡の対物レンズオイルとカバーガラスに屈折率が近い)をウェルに追加します。
- マイクロピペットを使用して、各ウェルに最小量のソフトセット退色防止封入剤を導入し、底面が完全に覆われ、所望のイメージング領域25内に気泡が閉じ込められないようにする。明視野顕微鏡で観察することにより、細胞層の完全性を確認します。
注:最高の画質を得るために、染色後できるだけ早く細胞をイメージしてください。光退色が発生した場合、または長期保存が必要な場合は、退色防止またはサンプル保存特性を備えた他の封入剤を使用できます。ハード硬化型封入剤はセルの3D構造を歪め、ひいてはセル層を歪めるため、ソフト硬化型封入剤が好ましいことに注意してください26。
- マイクロピペットを使用して、各ウェルに最小量のソフトセット退色防止封入剤を導入し、底面が完全に覆われ、所望のイメージング領域25内に気泡が閉じ込められないようにする。明視野顕微鏡で観察することにより、細胞層の完全性を確認します。
- 8ウェルチャンバーカバーガラスでイメージングを行います。
- レーザー出力、ゲイン、オフセット、スキャン速度、スキャン領域、スキャンフォーマット、解像度、ピンホール直径27などのスキャンパラメータを含む共焦点顕微鏡の設定を調整します。
- 目的の画像パラメータと条件が満たされるまで、リファレンススキャンとZスタックを使用して、イメージング位置をテストします。40倍の油浸対物レンズに到達して最適化されるまで、順次高倍率の対物レンズでのダイヤルインパラメータ28.
- 各播種密度/培養期間の一致で3つのランダムな位置のZスタックを構築します。
- 画像処理とデータ分析を実行します。
- 共焦点顕微鏡ソフトウェアパッケージを使用してXZおよびYZ断面をエクスポートします。
- エッジ検出機能を備えた画像処理ソフトウェア(閾値15.0)を用いて、画像の外側のマジックワンドツールを使用してピクセル単位の総画像領域を測定し、次に、セル層29の外側の画像の部分でマジックワンドツールを使用して、セル層の全断面積をピクセル単位で除いた面積を測定します。
- データ処理ソフトウェアを使用して、総面積ピクセル値から外部面積ピクセル値を減算し、断面積ピクセル値を求めます。
- 特定の画像の顕微鏡ソフトウェアに示されているように、ピクセル値にμm/ピクセル値の2乗を掛けて、断面積ピクセル値をμm2 値に変換します(40倍油浸レンズでズームなしで1024p解像度で撮影されたZスタックの場合は0.31μm/ピクセル)。
- 平均と標準偏差を計算し、結果をグラフ化します。
図3:固定ウェル培養、染色、およびイメージング実験に用いた8ウェルチャンバーカバーガラスの図で、細胞層の形成に対する初期細胞播種密度と培養期間の影響を比較しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
提示された方法は、マイクロ流体培養チャネルで培養された上皮細胞層の可視化を可能にし、検証として従来の固定ウェル細胞培養環境でのデモンストレーションを使用します。取得した画像は、品質、シグナル強度、および細胞ターゲット特異性のスペクトル上に存在します。成功した画像は高コントラストを示し、その後の統計的評価のための画像分析とデータの定量化を可能にします。失敗した画像は、薄暗い、ぼやけた、ぼやけた、または主観的または定量的な評価に使用できなくなります。一部の画像は、主観的な層特性の決定に適しているが、定量分析には品質が不十分な場合があります。したがって、プロトコルが従う程度と注意は、統計分析のデータソースとして機能する特定の画像の適合性に直接影響します。
図4は、マイクロ流体動的培養環境のコンテキストでのこの技術の使用の成功を表しており、2つのマイクロ流体デバイスの入口と出口での画像取得を示しています。図4A、Bは24時間培養された層の例を示し、図4C、Dは48時間培養された層の例を示す。 図5は、各培養期間から図2に示す5つのマイクロ流体チャネルイメージング位置のそれぞれから3つのサンプルを組み込んだ、マイクロ流体チャネル実験から収集された関連データを示す。エラーバーは標準偏差を示します。
図6はマイクロ流体チャネルの中心にあるXY平面の2D画像を示し、図7は深度色分けされた同じ場所の3Dビューを示しています。図8は、8ウェルチャンバーカバーガラス環境におけるNCI-H441細胞層形成に対する初期細胞播種密度と培養期間の影響を分析した密度持続時間実験における成功した画像取得を表しています。図8A〜Cは、それぞれ24時間、48時間、および96時間の培養時間を示す。図8X−Zは、それぞれ180,000、90,000、および45,000細胞/cm2の初期細胞播種密度を示す。図9は、密度と持続時間の各マッチングにおける3つの場所からのサンプルを含む、8ウェルチャンバーカバーガラス実験から収集された定量データを示しています。エラーバーは標準偏差を表し、p値検定を実行して、明らかに近い値間の統計的に有意な差を判断しました。
動的マイクロ流体および静的8ウェル環境におけるこれら2つの代表的な実験は、生理学的に関連する単層の有無を視覚的に確認することにより、この技術が実験結果を文脈化する方法を実証する明確なユースケース例です。
図4:マイクロ流体チャネルで24時間および48時間培養したNCI-H441細胞層を、図2に示すように入口側および出口側の位置で画像化。 (a)24時間、入口側。(B)24時間、出口側。(C)48時間、入口側。(D)48時間、出口側。青は核染色を表し、緑は糸状アクチンの染色を表す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:24〜48時間のマイクロ流体チャネルイメージング実験中に収集されたデータのグラフ表示。 これには、マイクロ流体チャネルの関連する長さに沿った5つの場所のそれぞれからの6つの断面積サンプルが含まれます( 図2に示すように)。エラーバーは標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マイクロ流体チャネル内の中央位置のXY平面で撮影された2D画像。 青は核染色を表し、緑は糸状アクチンの染色を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:図6と同じマイクロ流体チャネル位置の3Dモデル。色分けは深度データを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:8ウェルチャンバーカバーガラスで培養したNCI-H441細胞層。 24時間(A)、48時間(B)、および96時間(C)の初期播種密度で180,000(X)、90,000(Y)、および45,000(Z)細胞/cm2。青は核染色を表し、緑は糸状アクチンの染色を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:密度-持続時間8ウェル培養実験中に収集されたデータのグラフ表示。 これには、各密度-持続時間の一致からの6つの断面積サンプルが含まれます。エラーバーは標準偏差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示されたプロトコルは、シングルチャンネルマイクロ流体フローアレイの動的環境、および従来の8ウェルチャンバーカバーガラスの静的環境におけるNCI-H441ヒト肺上皮細胞の培養、架橋固定、染色、透過処理、および共焦点顕微鏡可視化について説明しています。マイクロ流体細胞培養プロトコルでは、高速フローが細胞を洗い流したり、細胞単層の正常な組み立てを妨げたりする可能性があるため、細胞培養培地のフロー条件が最も重要です。一方、低速流は、マイクロ流体チャネルの不透過性の性質ならびに流動特性によって課せられる拡散制限のために、細胞層を「飢餓」または「窒息させる」(それぞれ不十分な栄養および酸素の利用可能性)可能性がある30。10分間の待機期間(その間、細胞は元々チャネルを満たしたのと同じ培地に懸濁されたままになります)から始めて、0.2 μL/minの流速に進み、最終的に4時間かけて10 μL/minまで上昇することで、これらの競合するニーズはバランスが取れており、細胞の接着と生存の両方を促進します。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、構築と前処理を含むマイクロ流体チャネルの適切な準備です。漏れや潜在的な汚染を避けるために、カバーガラスがチャンバー構造に適切に取り付けられていることを確認するように注意する必要があります。カバーガラスの適切な取り付けは、チャネルの高さが一貫しており、異なる構造のユニットを使用した連続した試行間で正確に再現されるようにするためにも必要です。わずかな変動は、使用される粘着ストリップの厚さの許容誤差および相対的な圧縮性によってもたらされ得る。ばらつきを最小限に抑えることで、実験結果の一貫性を高めることができます。構築されたチャネルの適切な前処理は、細胞がガラス表面に接着して増殖を開始することを保証するために重要です。ガラスの超音波洗浄は、ポリ-D-リジンの接着を改善し、フィブロネクチンへの付着を促進します。ヒト上皮細胞によって自然に合成および分泌される糖タンパク質であるフィブロネクチンを添加すると、NCI-H441細胞のカバーガラス表面への接着がさらに促進され、正常な細胞単層発達が可能になります31。
さらに、このプロトコルの最も重要な側面の1つは、イメージング場所です。慎重に制御された調製にもかかわらず、2つのチャネル開口部の領域で利用可能な柱状体積のために、適切な細胞培養技術に付着している場合でも、これらの開口部の真下および隣接する領域のカバーガラス表面により多くの細胞が存在します。このため、開口部の近くの領域は、そこで著しい多層化/細胞スタッキングが起こるため、「正常な」培養細胞層の一部と見なすべきではありません。代わりに、マイクロ流体チャネルの中央領域は、開口部付近のチャネル高さ変動によって課せられる誤差によってこの位置が乱されないため、画像化に適した領域である。フローアレイ上の電極位置は、イメージング位置を導くために使用でき、経験則として、マイクロ流体チャネルの状態を真に表す層をキャプチャすることを目的としたすべてのスキャンは、フローアレイ上の最も離れた2つの電極の境界内の類似の場所で撮影する必要があります。さらに、説明されているプロトコルでは、40倍の倍率の対物レンズが使用のために指定されています。ただし、これはユーザーのニーズに合わせて変更される場合があります。統計的に有効なサンプルとして機能するのに十分な数の細胞を保持しながら、高解像度、高倍率のイメージングを提供できるため、40倍の倍率が最適な倍率として選択されました。
マイクロ流体チャネルに対して行うことができる1つの変更は、チャネル高さの変更を含み、これは、マイクロ流体チャネルを構築するために使用されるスペーサおよび接着剤の数を変えることによって達成することができる。チャネルの高さを変更すると、せん断応力が供給中に細胞を除去しないように流量パラメータを調整する必要があります。そのため、チャネルの高さにばらつきがあると、理想的な初期レート、ランプアップ率、およびメディアフローの最終レートに影響します。この記事に記載されているプロトコルは、ECISなどの間接的な方法と組み合わせて、適切な流量を実験的に導き出す手段として役立つ可能性があります。さらに、異なる細胞株のニーズに合わせて流速を変更する場合があり、最適な条件を確立するための適応が必要になる場合があります。このプロトコルのステップにいくつかの追加を加えて行うことができる別の変更は、セル層の断面積の相対的な比較を超えて、記載された技術のユースケースを拡大することである。既知の寸法のマイクロスフェアまたはマイクロビーズを使用して適切なキャリブレーションを行うことで、正確な体積、トポロジー、および絶対断面積の測定を行うことができます。この場合、共焦点顕微鏡のZ解像度が限られており、共焦点スキャンシステムが提供するZスタックステップサイズを手動で制御するため、Z次元でオーバーサンプリングまたはアンダーサンプリングが発生する可能性があるため、参照オブジェクトを使用したキャリブレーションが必要です32。
このプロトコルの1つの制限は、垂直キャリブレーションステップがないため、真の体積測定がないことです。上記のキャリブレーションと既知の寸法の蛍光マイクロビーズを利用した検証技術は、実際のスケーリングに使用できます。さらに、本プロトコルは、事前に調製された、すぐに使用できる染色剤の使用を含む。一次抗体および二次抗体を用いた免疫蛍光染色では、多くの場合、本稿で説明するプロトコルよりも複雑な数日間のプロトコルが必要です。ただし、この方法で免疫蛍光染色を利用することは可能かもしれませんが、ワークフローを最適化するにはいくつかの実験が必要になる場合があります。免疫蛍光染色プロトコルには追加のステップが含まれるため、最終的に評価される細胞層の特性が変化し、その後の結論が無効になる可能性があるため、多数の洗浄ステップ中に培養細胞層がせん断されないように注意する必要があります。この技術のさらなる発展には、断面積決定のための関心領域(ROI)検出および定量化を含む、画像およびデータ分析の自動化が含まれる場合があります。さらに、この技術をさまざまな細胞内および細胞外の標的構造(おそらくタイトジャンクションタンパク質などの標的の染色)を含むように拡張することで、この方法のユースケースをマイクロ流体細胞培養デバイス内の3D共局在に広げる可能性があります。
最も生理学的に代表的な細胞層を生成するには、肺上皮細胞を培養表面に気液界面(ALI)を有するマイクロ流体チャネルで培養する必要があり、これは通常、μmスケールの細孔の導入によって透過性のある柔軟な材料であるポリジメチルシロキサン(PDMS)を使用して達成されます。ALI培養条件は、 in vivo 肺上皮33の生理学的特徴に最も近い細胞層の形成を可能にする。技術的には可能であるが、動的マイクロ流体環境におけるPDMS培養表面を有するALI培養環境でECISを使用することは、そのような複雑な細胞培養アセンブリ34のための市販の装置がないので、ほとんどの研究者にとって実用的ではなく、アクセスできない。この難しさの理由の1つは、ECIS測定の目的で固体電極として機能することができる透過性の培養表面に対する逆説的な必要性である可能性があります。そのため、ECISフローアレイに存在するような酸素非透過性の培養環境で培養された細胞層の特性や生理学的関連性を視覚的に検証する方法が求められています。
この方法は、2次元顕微鏡を使用して適切なコンフルエンシーを確保する従来の方法を拡張して、3D視覚化を可能にし、観察、定量化、および分析できる細胞層特性の数を大幅に広げます。さらに、これにより、単層の存在、層の均一性、および実験目的に関連すると考えられるその他の特性を主観的に決定することができます。このプロトコルは、無遠外傷に曝露された上皮細胞のバリア機能特性を評価するECIS実験など、多くの酸素不透過性環境で生成される細胞層の視覚的検証と評価の手段として機能するため、重要です。これは、一連の動的マイクロ流体培養条件が、さらなる実験に関連し、適切な細胞層を生成するかどうかを判断するために、将来の研究で使用できる方法としても機能します。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、マイクロ流体チャネル構築に使用される3M接着剤とマイラーシートの切断パターンを設計し、細胞培養培地の流量とシリンジポンプのプログラミングをテストしたAlan Shepardsonを認めています。資金は、NIH R01 HL0142702、NSF CBET 1706801、およびニューカム-チューレーン大学学部長の助成金によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A1R HD25 Confocal Microscope System | Nikon | A1R HD25 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications |
| ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) | Invitrogen | R37110 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110 |
| Adhesive Transfer Tape Double Linered | 3M | 468MP | https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/ |
| Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes | Air-Tite RL5 | 14-817-53 | https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml |
| BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet | BAISDY | AS022 | https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC |
| Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | 15-336-100 | https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100 |
| Corning Fibronectin, Human | Fisher Scientific | CB-40008 | https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 |
| ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array | Applied BioPhysics | 1F8x10E PC | https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E |
| Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White | Enterprise Technology Solutions | 50-211-1163 | https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 |
| Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes | Thermo Scientific | 4642090 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090 |
| Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 06-443-21 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269 |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) | Fisher Scientific | 12-544-GP | https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-458 | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458 |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093 |
| Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) | Invitrogen | FB002 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002 |
| ImageJ Fiji | ImageJ | ImageJ Fiji | https://imagej.net/downloads |
| Immersion Oil F 30 cc | Nikon | MXA22168 | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/accessories/immersion-oil/specifications |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel | Thermo Scientific | 3950 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950 |
| Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System | Laxco | LMC3BF1 | https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1 |
| Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK | Masterflex | ZY-45505-31 | https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no& gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB |
| Microsoft Excel | Microsoft | 0016 | https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547 |
| National Target All-Plastic Disposable Syringes | Thermo Scientific | 03-377-24 | https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8 |
| NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-174 | https://www.atcc.org/products/htb-174 |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | https://www.syringepump.com/NE-16001800.php |
| NIS Elements AR | Nikon | NIS Elements AR | https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605 |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Scientific | 155411 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361 |
| Parafilm M Wrapping Film | Fisher Scientific | S37441 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441 |
| PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch | PendoTech | ZY-19406-49 | https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649 |
| Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023 |
| Poly-D-Lysine | Gibco | A3890401 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401 |
| Reynolds Aluminum Wrap Foil | Reynolds | 458742928317 | https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M |
| Saponin | Millipore Sigma (Sigma Aldrich) | 47036 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036 |
| SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant | Invitrogen | S36917-5X2ML | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML |
| Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package | Thermo Scientific | 13-100-752PM | https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood |
| Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft | Cole-Parmer | EW-95702-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01 |
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