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Bioengineering

Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

El protocolo presentado describe el desarrollo y uso de una técnica de tinción de actina filamentosa basada en faloidina con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para visualizar la estructura de la capa celular adherente en canales de cultivo dinámico microfluídico y cámaras tradicionales de cultivo estático de pozo fijo. Este enfoque ayuda a evaluar la confluencia de la capa celular, la formación de monocapa y la uniformidad del espesor de la capa.

Abstract

La experimentación microfluídica in vitro tiene un gran potencial para revelar muchos conocimientos sobre los fenómenos microfisiológicos que ocurren en afecciones como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y la lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI). Sin embargo, los estudios en canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano se enfrentan actualmente a varios desafíos, especialmente debido a las dificultades para establecer condiciones apropiadas de cultivo celular, incluidas las tasas de flujo de medios, dentro de un entorno de cultivo dado. El protocolo presentado describe un enfoque basado en imágenes para evaluar la estructura de las células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 cultivadas en un canal microfluídico impermeable al oxígeno con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano. Usando tinción de actina filamentosa basada en faloidina, las estructuras citoesqueléticas de las células se revelan mediante microscopía de barrido láser confocal, lo que permite la visualización de células individuales y en capas. La cuantificación posterior determina si las condiciones de cultivo celular empleadas están produciendo monocapas uniformes adecuadas para una mayor experimentación. El protocolo describe el cultivo celular y los métodos de evaluación de capas en canales microfluídicos y entornos tradicionales de pozos fijos. Esto incluye la construcción de canales, el cultivo celular y las condiciones requeridas, la fijación, la permeabilización y la tinción, las imágenes microscópicas confocales, el procesamiento de imágenes y el análisis de datos.

Introduction

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una afección aguda que surge del insulto y la propagación de la lesión en el parénquima pulmonar, que resulta en edema pulmonar de los alvéolos, intercambio gaseoso inadecuado e hipoxemia posterior1. Esto inicia un ciclo de liberación de citoquinas proinflamatorias, reclutamiento de neutrófilos, liberación de mediadores tóxicos y daño tisular, que a su vez incurre en una respuesta inflamatoria adicional2. Además, el surfactante pulmonar, que estabiliza las vías respiratorias y previene el daño causado por el reclutamiento/desreclutamiento repetitivo (R/D), puede ser inactivado o disfuncional por los procesos químicos que ocurren durante el SDRA, lo que resulta en más estrés y lesiones en el parénquima circundante3. Si se sufre un daño suficiente, puede ser necesaria la ventilación mecánica para asegurar una oxigenación sistémica adecuada4. Sin embargo, la ventilación mecánica impone sus propios desafíos y traumas, incluyendo la posibilidad de lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI), caracterizada como lesión del parénquima pulmonar causada por las tensiones mecánicas impuestas durante el sobreinflado (volutrauma) y/o la R/D de la interfaz aire-líquido en la vía aérea ocluida por líquido (atelectrauma)5. El gradiente de presión experimentado por las células epiteliales expuestas a una interfaz aire-líquido (como en un bronquiolo ocluido con líquido) en el modelo de atelectrauma puede resultar en una respuesta obstructiva originada por permeabilidad (POOR), lo que lleva a un ciclo virtuoso de lesión POOR-get-POORer 6,7,8.

La experimentación in vitro puede proporcionar información a microescala sobre estos fenómenos, pero los estudios actuales en entornos de canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes enfrentan varios desafíos9. Por un lado, la optimización de las condiciones de cultivo celular plantea una barrera significativa para la entrada para la investigación de cultivos celulares en entornos microfluídicos, ya que existe una intersección estrecha dentro de la cual los parámetros de flujo del medio, la duración del cultivo y otras condiciones de cultivo permiten la formación óptima de la capa celular. Esto incluye las limitaciones de difusión impuestas por la naturaleza impermeable al oxígeno del recinto del canal de cultivo microfluídico. Esto requiere una cuidadosa consideración de los parámetros de flujo del medio, ya que los bajos caudales pueden privar a las células de oxígeno, especialmente a las más alejadas de la entrada; Por otro lado, los altos caudales pueden empujar a las células fuera del canal de cultivo o dar lugar a un desarrollo inadecuado o desigual de la capa. Las limitaciones de difusión pueden abordarse mediante el uso de materiales permeables al oxígeno como el polidimetilsiloxano (PDMS) en un aparato de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI); sin embargo, muchos canales de cultivo microfluídicos convencionales, como los del sistema de detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica (ECIS), son inherentemente impermeables al oxígeno, dada la naturaleza del recinto fabricado10. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una técnica para analizar las capas celulares cultivadas en un recinto impermeable al oxígeno.

Al comparar la viabilidad de las condiciones de cultivo, las observaciones de características específicas de la capa, como la presencia de una monocapa, la topología de la superficie, la confluencia y la uniformidad del espesor de la capa, son necesarias para determinar si la capa celular producida por un conjunto particular de condiciones de cultivo cumple con las especificaciones deseadas y son realmente relevantes para el diseño experimental. Se puede realizar una evaluación limitada mediante métodos como ECIS, que utiliza mediciones del potencial eléctrico (voltaje) creado por la resistencia a la corriente alterna de alta frecuencia (CA) (impedancia) impuesta por membranas eléctricamente aislantes de células cultivadas en electrodos de oro dentro de la matriz de flujo. Al modular la frecuencia de CA aplicada a las células, las propiedades celulares específicas dependientes de la frecuencia de las células y las capas celulares, como la fuerza de adherencia superficial, la formación de la unión estrecha y la proliferación o confluencia celular, pueden ser dirigidas y examinadas11. Sin embargo, estas formas indirectas de mediciones son algo difíciles de interpretar al inicio de un experimento, y pueden no cuantificar todos los aspectos relevantes de la capa celular. La simple observación de la capa celular bajo un microscopio de contraste de fase puede revelar la naturaleza de ciertas cualidades como la confluencia; sin embargo, muchas características relevantes, como la presencia de una monocapa y la uniformidad del espesor de la capa, requieren una evaluación tridimensional (3D) que no es posible con imágenes microscópicas fluorescentes, de campo claro, contraste de fase o fluorescentes12.

El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica de tinción de actina filamentosa para permitir la verificación basada en imágenes de una monocapa y la evaluación de la uniformidad de la capa celular utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM). La actina filamentosa (F-actina) se consideró un objetivo apropiado para el conjugado fluoróforo, debido en parte a la forma en que la actina F sigue estrechamente la membrana celular, permitiendo una aproximación visual de todo el volumen celular13. Otro beneficio importante de dirigirse a la actina F es la manera en que la tinción de la actina F dilucida visualmente las interrupciones o alteraciones citoesqueléticas impuestas por las tensiones y tensiones experimentadas por las células. La fijación de reticulación con formaldehído libre de metanol fue utilizada para preservar la morfología de las células y la capa celular, ya que los fijadores deshidratantes como el metanol tienden a aplanar las células, distorsionando groseramente la capa celular y alterando sus propiedades14,15.

Para determinar la capacidad de la técnica de evaluación de capas para mitigar estos desafíos, las células se cultivaron en cámaras de cultivo tradicionales de ocho pocillos, así como en canales microfluídicos para evaluar las diferencias, si las hubiera, en las capas celulares que se produjeron. Para los pozos de cultivo fijos, se utilizaron unidades de vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos. Para el cultivo microfluídico, las matrices de flujo (longitud del canal 50 mm, ancho 5 mm, profundidad 0,6 mm) fueron optimizadas para cultivar células epiteliales pulmonares humanas inmortalizadas (NCI-H441) en un ambiente con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales presentes en la zona respiratoria del pulmón humano16. Si bien este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta el entorno de cultivo de las matrices de flujo ECIS, puede aplicarse a cualquier entorno de cultivo dinámico impermeable al oxígeno para el cual es necesaria la evaluación de las características de la capa celular cultivada o las condiciones de cultivo.

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Protocol

Para el presente estudio se utilizó la línea de células pulmonares epiteliales humanas NCI-H441 (ver Tabla de Materiales).

1. Cultivo celular en el canal microfluídico

  1. Fabrica el canal microfluídico y realiza el pretratamiento siguiendo los pasos a continuación.
    1. Obtenga una matriz de flujo de un solo canal (consulte la Tabla de materiales) y separe la parte superior de la placa base de policarbonato.
    2. Obtenga una cubierta de vidrio rectangular #1.5 (espesor 0.17 mm) con dimensiones de 60 mm x 22 mm. Limpie las superficies del vidrio de cobertura en un baño ultrasónico y trate un lado con una solución de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de secar a 60 °C durante 30 minutos.
    3. Coloque un adhesivo de doble cara de 0,13 mm de espesor (consulte la Tabla de materiales), cortado con láser para acomodar las dimensiones de la parte superior de la matriz de flujo y el canal de flujo (50 mm de longitud, 5 mm de ancho), en la parte superior de la matriz de flujo, teniendo cuidado de alinear con precisión los recortes del canal17.
    4. Fije un espaciador mylar de 0,1 mm de espesor (consulte la Tabla de materiales), cortado con láser para acomodar las dimensiones de la parte superior de la matriz de flujo y el canal de flujo, a la tira adhesiva, teniendo cuidado de alinear con precisión los recortes del canal.
    5. Repita los pasos 1.1.3 y 1.1.4 hasta que se alcance la altura de canal deseada (por ejemplo, para una altura de canal de 0,6 mm, utilice dos espaciadores y tres tiras adhesivas).
    6. Fije una cubierta de vidrio rectangular a la tira adhesiva más inferior con el lado tratado con poli-D-lisina orientado hacia el adhesivo. Una vez completado el montaje, como se indica en la Figura 1, aplique una presión firme e igual en la parte superior e inferior de la construcción y mantenga durante 1 minuto.
      NOTA: La construcción del recinto del canal, que incluye vidrio de cobertura, adhesivos, espaciadores y parte superior de la matriz de flujo, ya está completa.
    7. Enjuague el canal con agua desionizada con una jeringa, verificando simultáneamente si hay fugas.
    8. Esterilice la carcasa del canal en un esterilizador ultravioleta (UV) durante 30 min18.
    9. Utilizando la técnica estéril, tratar el canal con 2,0 μg/ml de fibronectina humana (ver Tabla de materiales) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar durante al menos 30 min a 37 °C19.
  2. Realizar cultivo celular en el canal microfluídico siguiendo los pasos a continuación.
    1. En una campana de flujo laminar estéril, use una micropipeta para transferir una suspensión uniforme de células NCI-H441 en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) (ver Tabla de materiales) para sembrar dos canales microfluídicos, cada uno con células a una densidad superficial de 150,000 células / cm2.
      1. Para canales de 50 mm x 5 mm x 0,6 mm, use 0,25 ml de una suspensión de 2,5 x 106 celdas/ml para llenar cada canal, así como una parte de los puertos. Verifique que las células se hayan distribuido uniformemente dentro de los canales utilizando un microscopio de campo claro.
    2. Cultivar los dos canales durante 24 h y 48 h respectivamente a 37 °C con 5% deCO2 utilizando una bomba de jeringa programable (ver Tabla de materiales), extrayendo los medios gastados del canal y los medios frescos en el canal desde un depósito de medios estéril conectado a la entrada del canal compuesto por una jeringa de 20 ml cortada cubierta con película de parafina.
      1. Después de un período de espera de 10 minutos después de la siembra celular, introducir y bombear medios frescos desde el depósito a través del canal a una velocidad de flujo variable que comienza en 0.2 μL / min y aumenta hasta 10 μL / min durante 4 h, manteniendo a esa velocidad a partir de entonces20.
        NOTA: Este caudal variable proporciona condiciones de cultivo que permiten a las células (1) asentarse gravitacionalmente en la superficie de cultivo, (2) adherirse a la superficie de cultivo y (3) formar una monocapa confluente.
  3. Realizar la fijación celular dentro de los canales microfluídicos utilizando solución de formaldehído.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y debe manipularse en una campana extractora química apropiada21.
    1. En una campana extractora química, prepare soluciones de formaldehído usando formaldehído al 4% en PBS (sin metanol) (consulte la Tabla de materiales) para crear dos porciones de 4 ml, diluyendo la primera a una concentración de formaldehído al 1% y la segunda a formaldehído al 2% usando solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; con Ca 2+ y Mg2+) como diluyente. Transfiera las soluciones de formaldehído a jeringas separadas de 5 ml y etiquételas en consecuencia. Extraiga 20 ml de DPBS en una jeringa separada de 20 ml.
    2. Retire los canales microfluídicos del aparato de cultivo y colóquelos en la campana extractora de humos químicos.
    3. Montar el aparato de fijación y tinción.
      1. Conecte un segmento de 10 cm de tubo de transferencia al puerto lateral de una llave de paso de tres vías a través de un adaptador de púa de manguera de bloqueo Luer macho (consulte Tabla de materiales), luego conecte la llave de paso al puerto de entrada de la matriz de flujo.
      2. A continuación, conecte otro segmento de 10 cm de tubo de transferencia al puerto de salida de la matriz de flujo utilizando el mismo tipo de adaptador de púa de manguera.
      3. Finalmente, asegure los extremos libres de ambos tubos de transferencia en un contenedor de desechos químicos y de riesgo biológico, como un tubo de centrífuga cónica vacío de 50 ml etiquetado.
    4. Gire la llave de paso para bloquear el puerto de entrada de la matriz de flujo y enjuague la línea de descarga con DPBS. Luego, gire la llave de paso para bloquear la línea de desechos y lave lentamente las celdas con 2 ml de DPBS. Repita el paso de lavado usando la nueva solución cada vez. Se introduce una nueva solución (o concentración de solución) en el canal.
    5. Empuje lentamente 2 ml de solución fijadora al 1% a través del canal y luego deje reposar durante 5 min22.
    6. Empuje lentamente 2 ml de solución fijadora al 2% a través del canal y luego deje reposar durante 15 minutos.
    7. Lave las células introduciendo lentamente 2 ml de DPBS fresco en el canal en tres instancias separadas (5 min cada una).
    8. Complete los pasos 1.3.3-1.3.7 para ambos canales microfluídicos en paralelo.
  4. Tiñe, permeabiliza y agrega medios de montaje a las celdas en el canal microfluídico.
    1. Prepare una solución de saponina al 0,1% agregando 1 mg de saponina (consulte la Tabla de materiales) por ml de DPBS para producir 4 ml de solución y un vórtice suave para mezclar23. Extraiga 8 ml de DPBS en una jeringa de 20 ml.
    2. Agregue un reactivo de faloidina que tiñe F-actina y un reactivo Hoechst que tiñe el núcleo (consulte la Tabla de materiales) a la solución de saponina al 0,1%, a dos gotas (0,1 ml) de cada reactivo por ml de solución de saponina. Mantenga la solución de tinción/permeabilización preparada lejos de la luz cubriendo con papel de aluminio24.
    3. Enjuague la línea con una pequeña cantidad de solución de tinción/permeabilización (como se describe en el paso 1.3.4), luego introduzca 2 ml de la solución en el canal microfluídico y cubra el canal con papel de aluminio antes de dejarlo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    4. Enjuague la solución de tinción/permeabilización dos veces con 2 ml de DPBS durante 5 minutos por descarga.
    5. Para una mejor calidad de imagen, agregue un medio de montaje adecuado (con un índice de refracción que coincida estrechamente con el aceite del objetivo del microscopio y el vidrio de la cubierta, consulte la Tabla de materiales) en el canal.
      1. Con una micropipeta, introduzca una cantidad mínima de un montante antidecolorante de fijación suave en cada puerto del canal microfluídico, asegurándose de que la superficie inferior esté completamente cubierta y que no queden burbujas atrapadas dentro del área de imagen deseada25. Selle los extremos del canal y verifique la integridad de la capa celular observando bajo un microscopio de campo claro.
    6. Complete los pasos 1.4.3-1.4.5 para ambos canales microfluídicos en paralelo.
      NOTA: Celdas de imagen tan pronto como sea posible después de la tinción para obtener la máxima calidad de imagen. Si se produce fotoblanqueo o se desea un almacenamiento a largo plazo, se pueden utilizar otros medios de montaje con propiedades antidecoloración o de preservación de muestras. Tenga en cuenta que los medios de montaje de curado duro distorsionarán la estructura 3D de las celdas y, por extensión, la capa celular; Por esta razón, es preferible el soporte de montaje de ajuste suave26.
  5. Imágenes de células en el canal microfluídico siguiendo los pasos a continuación.
    1. Ajuste la configuración del microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales), incluidos los parámetros de potencia, ganancia, desplazamiento y escaneo del láser, como la velocidad de escaneo, el área de escaneo, el formato de escaneo, la resolución y el diámetro 27 del orificio27.
    2. Pruebe la ubicación de las imágenes tomando escaneos de referencia, así como pilas Z hasta que se hayan cumplido los parámetros y condiciones de imagen deseados. Parámetros de marcación en objetivos de aumento secuencialmente más altos hasta que se haya alcanzado el objetivo de inmersión en aceite 40x y optimizado28.
    3. Usando la placa base de la matriz de flujo como referencia, construya pilas Z en cinco ubicaciones, en la ubicación potencial del primer electrodo en el lado de entrada, a medio camino entre el centro y la ubicación anterior, el centro, a medio camino entre el centro y la ubicación del último electrodo (en el lado de salida), y en el último electrodo, como se indica en la Figura 2.
  6. Realizar procesamiento de imágenes y análisis de datos.
    1. Exporte secciones transversales XZ e YZ utilizando el paquete de software de microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales).
    2. Utilizando un software de procesamiento de imágenes (consulte Tabla de materiales) con capacidades de detección de bordes (valor de umbral 15.0), mida el área total de la imagen en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica fuera de la imagen, luego el área excluyendo el área de sección transversal total de la capa de celda en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica en la parte de la imagen exterior a la capa de celda29.
    3. Utilizando software de procesamiento de datos (consulte la Tabla de materiales), reste el valor del píxel del área exterior del valor del píxel del área total para encontrar el valor del píxel del área de la sección transversal.
    4. Convierta los valores de píxeles de área de sección transversal a valores de μm2 multiplicando los valores de píxeles por el cuadrado del valor de μm/píxel, como se indica en el software del microscopio para la imagen en particular (0,31 μm/píxel para pilas Z tomadas en resolución 1024p sin zoom en una lente de inmersión en aceite de 40x).
    5. Calcular medias y desviaciones estándar de los datos y graficar los resultados.

Figure 1
Figura 1: Esquema de vista explotada de la construcción del canal microfluídico. El elemento superior es la parte superior de la matriz de flujo, los elementos grises delgados son tiras adhesivas, los elementos azules delgados son espaciadores mylar y el elemento inferior es el vidrio de cubierta rectangular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cinco ubicaciones de imágenes a lo largo de la región productora de capas consistentes del canal de cultivo microfluídico. Las ubicaciones de las imágenes son las siguientes: lado de entrada, cerca de donde estaría el primer electrodo en la matriz de flujo intacta; a medio camino entre la ubicación del lado de entrada y el centro del canal; centro del canal; A medio camino entre el centro y la ubicación del lado de salida, y el lado de salida, cerca de donde estaría el último electrodo en la matriz de flujo intacta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cultivo celular en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos

  1. Realice el tratamiento previo de la cubierta de vidrio de ocho pocillos.
    1. Obtenga un vidrio de cubierta estéril de ocho pocillos fabricado con un vidrio de cubierta # 1.5 y un tratamiento superficial que aumenta la adherencia celular (Figura 3, consulte la Tabla de materiales).
    2. Utilizando una técnica estéril, tratar la superficie de los pocillos de cultivo con 2,0 μg/ml de fibronectina humana en PBS e incubar durante al menos 30 min a 37 °C19.
  2. Realice el cultivo celular en el vidrio de cubierta con cámara siguiendo los pasos a continuación.
    1. En una campana de flujo laminar estéril, transfiera porciones de 0.5 ml de soluciones de células NCI-H441 suspendidas uniformemente en medio RPMI 1640 con 10% de FBS a densidades volumétricas de 81,000, 162,000 y 324,000 células / ml para sembrar los pocillos de cultivo a densidades superficiales de 45,000, 90,000 y 180,000 células / cm2, respectivamente. Verifique que las células se hayan distribuido uniformemente dentro de los pocillos usando un microscopio de campo claro.
    2. Cultivar células durante 24 h, 48 h y 96 h a 37 °C con 5% deCO2, sustituyendo diariamente los medios.
  3. Realice la fijación de formaldehído en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos.
    PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y debe manipularse en una campana extractora química apropiada21.
    1. En una campana extractora química, prepare soluciones de formaldehído haciendo dos porciones de formaldehído al 4% en PBS (sin metanol), diluyendo la primera a una concentración de formaldehído al 1% y la otra a formaldehído al 2% utilizando solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS; con Ca 2+ y Mg2+) como diluyente.
    2. Retire el vidrio de cubierta con cámara de cultivo de ocho pocillos de la incubadora y colóquelo en la campana extractora de humos químicos.
    3. Lave suavemente las células con 0,5 ml de DPBS usando una micropipeta introduciendo lentamente líquido a lo largo de la parte superior de la esquina de cada pocillo.
    4. Retire el líquido existente en cada pocillo extrayéndolo lentamente de la esquina de los pocillos con una micropipeta. Utilizando el método de introducción líquida (paso 2.3.3), introducir 0,5 ml de solución fijadora al 1% en cada pocillo y dejar reposar durante 5 min22.
    5. Eliminar el líquido existente en cada pocillo utilizando el método de extracción de líquidos mencionado en el paso 2.3.4. Utilizando el método de introducción de líquidos mencionado en el paso 2.3.3, introducir 0,5 ml de solución fijadora al 2% en cada pocillo y dejar reposar durante 15 minutos.
    6. Utilizando los métodos de introducción y extracción de líquidos (pasos 2.3.3 y 2.3.4), lave las celdas introduciendo y eliminando 0,5 ml de DPBS fresco en cada pocillo en tres instancias separadas durante 5 minutos cada una.
  4. Realice la tinción, permeabilización y adición de medios de montaje en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos.
    1. Prepare una solución de saponina al 0,1% agregando 1 mg de saponina por ml de DPBS y mezcle suavemente23.
    2. A la solución de saponina al 0,1%, agregue dos gotas (0,1 ml) de cada una de un reactivo faloidina con tinción de actina F y un reactivo Hoechst para teñir el núcleo por ml de solución de saponina. Mantenga la solución preparada alejada de la luz cubriendo con papel de aluminio24.
    3. Introduzca 0,2 ml de solución de tinción/permeabilización en cada pocillo y cubra el vidrio de cubierta con papel de aluminio antes de dejarlo reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
    4. Enjuague la solución de tinción/permeabilización dos veces con 0,5 ml de DPBS.
    5. Para una mejor calidad de imagen, agregue un medio de montaje adecuado (con un índice de refracción que coincida estrechamente con el aceite objetivo del microscopio y el vidrio de la cubierta) en los pozos.
      1. Usando una micropipeta, introduzca una cantidad mínima de un montante antidecolorante de fijación suave en cada pocillo, asegurándose de que la superficie inferior esté completamente cubierta y que no queden burbujas atrapadas dentro del área de imagen deseada25. Verifique la integridad de la capa celular observando bajo un microscopio de campo claro.
        NOTA: Celdas de imagen tan pronto como sea posible después de la tinción para obtener la máxima calidad de imagen. Si se produce fotoblanqueo o se desea un almacenamiento a largo plazo, se pueden utilizar otros medios de montaje con propiedades antidecoloración o de preservación de muestras. Tenga en cuenta que los medios de montaje de curado duro distorsionarán la estructura 3D de las celdas y, por extensión, la capa de celda, por lo que es preferible un medio de montaje de fraguado suave26.
  5. Realice imágenes en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos.
    1. Ajuste la configuración del microscopio confocal, incluidos los parámetros de potencia, ganancia, desplazamiento y escaneo del láser, como la velocidad de escaneo, el área de escaneo, el formato de escaneo, la resolución y el diámetro27 del orificio del láser.
    2. Pruebe la ubicación de las imágenes tomando escaneos de referencia, así como pilas Z hasta que se hayan cumplido los parámetros y condiciones de imagen deseados. Parámetros de marcación en objetivos de aumento secuencialmente más altos hasta que se haya alcanzado el objetivo de inmersión en aceite 40x y optimizado28.
    3. Construye pilas Z de tres ubicaciones aleatorias en cada coincidencia entre densidad de siembra y duración de cultivo.
  6. Realizar procesamiento de imágenes y análisis de datos.
    1. Exporte secciones transversales XZ e YZ utilizando el paquete de software de microscopio confocal.
    2. Utilizando un software de procesamiento de imágenes con capacidades de detección de bordes (valor de umbral 15.0), mida el área total de la imagen en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica fuera de la imagen, luego el área excluyendo el área de sección transversal total de la capa de celda en píxeles utilizando la herramienta Varita mágica en la parte de la imagen exterior a la capa de celda29.
    3. Con un software de procesamiento de datos, reste el valor del píxel del área exterior del valor del píxel del área total para encontrar el valor del píxel del área transversal.
    4. Convierta los valores de píxeles del área de la sección transversal a valores de μm2 multiplicando los valores de píxeles por el cuadrado del valor de μm/píxel como se indica en el software del microscopio para la imagen en particular (0,31 μm/píxel para pilas Z tomadas en resolución 1024p sin zoom en una lente de inmersión en aceite de 40x).
    5. Calcular medias y desviaciones estándar y graficar resultados.

Figure 3
Figura 3: Diagrama del vidrio de cubierta de ocho pocillos utilizado para el experimento de cultivo, tinción e imagen de pozo fijo que compara los efectos de la densidad inicial de siembra celular y la duración del cultivo en la formación de capas celulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

El método presentado permite la visualización de capas celulares epiteliales cultivadas en canales de cultivo microfluídico y utiliza una demostración en entornos tradicionales de cultivo celular de pozo fijo como validación. Las imágenes adquiridas existirán en un espectro de calidad, intensidad de señal y especificidad de objetivo celular. Las imágenes exitosas demostrarán un alto contraste, lo que permitirá el análisis de imágenes y la cuantificación de datos para su posterior evaluación estadística. Las imágenes fallidas serán tenues, borrosas, borrosas o inutilizables para la evaluación subjetiva o cuantitativa. Algunas imágenes pueden ser adecuadas para la determinación subjetiva de las características de la capa, sin dejar de ser de calidad insuficiente para el análisis cuantitativo. Por lo tanto, el grado y el cuidado con el que se sigue el protocolo afectarán directamente la idoneidad de una imagen determinada para servir como fuente de datos para el análisis estadístico.

La Figura 4 representa el uso exitoso de la técnica en el contexto de un entorno de cultivo dinámico microfluídico y muestra la adquisición de imágenes en la entrada y salida de dos dispositivos microfluídicos. La Figura 4A,B proporciona ejemplos de capas cultivadas durante 24 h, y la Figura 4C,D presenta ejemplos de capas cultivadas durante 48 h. La Figura 5 ilustra los datos asociados recopilados del experimento del canal microfluídico, incorporando tres muestras de cada una de las cinco ubicaciones de imágenes del canal microfluídico indicadas en la Figura 2 de cada duración del cultivo. Las barras de error significan desviaciones estándar.

La Figura 6 muestra una imagen 2D del plano XY en el centro del canal microfluídico, y la Figura 7 muestra una vista 3D de la misma ubicación con codificación de colores de profundidad. La Figura 8 representa la adquisición exitosa de imágenes dentro de un experimento de densidad-duración que analiza los efectos de la densidad inicial de siembra celular y la duración del cultivo en la formación de la capa celular NCI-H441 en el entorno de cubierta de ocho pocillos con cámara. La Figura 8A-C indica duraciones de cultivo de 24 h, 48 h y 96 h, respectivamente. La Figura 8X-Z indica densidades iniciales de siembra celular de 180.000, 90.000 y 45.000 células/cm2, respectivamente. La Figura 9 presenta datos cuantitativos recopilados del experimento de vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos, incluidas muestras de tres ubicaciones en cada coincidencia densidad-duración. Las barras de error representan desviaciones estándar y se realizaron pruebas de valor p para determinar diferencias estadísticamente significativas entre valores aparentemente cercanos.

Estos dos experimentos representativos dentro de los entornos dinámicos microfluídicos y estáticos de ocho pozos son ejemplos de casos de uso distintos que demuestran cómo la técnica puede contextualizar los hallazgos experimentales al confirmar visualmente la presencia o ausencia de monocapas fisiológicamente relevantes.

Figure 4
Figura 4: Capas celulares NCI-H441 cultivadas en el canal microfluídico durante 24 y 48 h, fotografiadas en las ubicaciones del lado de entrada y del lado de salida como se muestra en la Figura 2. (A) 24 h, lado de entrada. (B) 24 h, lado de salida. (C) 48 h, lado de entrada. (D) 48 h, lado de salida. El azul representa la tinción de los núcleos y el verde representa la tinción de la actina filamentosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Representación gráfica de los datos recogidos durante el experimento de imágenes de canales microfluídicos de 24-48 h. Esto incluye seis muestras de área de sección transversal de cada una de las cinco ubicaciones a lo largo de la longitud relevante del canal microfluídico (como se muestra en la Figura 2). Las barras de error representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Imagen 2D tomada en el plano XY en una ubicación central dentro del canal microfluídico. El azul representa la tinción de los núcleos y el verde representa la tinción de la actina filamentosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Modelo 3D de la misma ubicación del canal microfluídico que la Figura 6. El código de colores representa datos de profundidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Capas celulares NCI-H441 cultivadas en el vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos. Durante 24 h (A), 48 h (B) y 96 h (C) a densidades iniciales de siembra de 180.000 (X), 90.000 (Y) y 45.000 (Z) células/cm2. El azul representa la tinción de los núcleos y el verde representa la tinción de la actina filamentosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Representación gráfica de los datos recopilados durante el experimento de cultivo de ocho pocillos de densidad-duración. Esto incluye seis muestras de área de sección transversal de cada coincidencia densidad-duración. Las barras de error representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo presentado describe el cultivo, la fijación de reticulación, la tinción, la permeabilización y la visualización microscópica confocal de células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 en el entorno dinámico de una matriz de flujo microfluídico de un solo canal, así como en el entorno estático de un vidrio de cubierta tradicional de ocho pocillos. Con cualquier protocolo de cultivo celular microfluídico, las condiciones de flujo de los medios de cultivo celular son de suma importancia, ya que el flujo de alta velocidad tiene el potencial de lavar las células o interferir con el ensamblaje normal de la monocapa celular. Mientras tanto, el flujo de baja velocidad tiene el potencial de "matar de hambre" o "sofocar" (disponibilidad insuficiente de nutrientes y oxígeno, respectivamente) la capa celular debido a las limitaciones de difusión impuestas por la naturaleza impermeable del canal microfluídico, así como las características de flujo30. Al comenzar con un período de espera de 10 minutos (durante el cual las células permanecen suspendidas en el mismo medio que originalmente llenó el canal), luego avanzar a un caudal de 0.2 μL / min, antes de finalmente aumentar hasta 10 μL / min en el transcurso de 4 h, estas necesidades competitivas se equilibran para promover tanto la adherencia como la supervivencia celular.

Otro paso crítico en el protocolo es la preparación adecuada del canal microfluídico, incluida la construcción y el tratamiento previo. Se debe tener cuidado para asegurarse de que el vidrio de cubierta esté montado correctamente en la construcción de la cámara para evitar fugas y posibles contaminaciones. La fijación adecuada del vidrio de cubierta también es necesaria para garantizar que la altura del canal sea consistente y se reproduzca con precisión entre ensayos sucesivos utilizando diferentes unidades construidas. La variabilidad menor puede ser introducida por la tolerancia en el espesor de las tiras adhesivas utilizadas, así como la compresibilidad relativa. Minimizar cualquier variabilidad ayudará con la consistencia de los resultados experimentales. El pretratamiento adecuado del canal construido es importante para garantizar que las células puedan adherirse e iniciar la proliferación en la superficie del vidrio. La limpieza ultrasónica del vidrio mejora la adherencia a la poli-D-lisina, promoviendo la adherencia a la fibronectina. La adición de fibronectina, una glicoproteína sintetizada naturalmente y secretada por las células epiteliales humanas, promueve aún más la adhesión de las células NCI-H441 a la superficie del vidrio de cobertura, lo que permite el desarrollo normal de la monocapa celular31.

Además, uno de los aspectos más importantes de este protocolo es la ubicación de las imágenes. A pesar de la preparación cuidadosamente controlada, debido al volumen columnar disponible en las regiones de las dos aberturas del canal, habrá más células presentes en la superficie del vidrio de cubierta en el área directamente debajo y adyacente a estas aberturas, incluso cuando se adhieren a las técnicas adecuadas de cultivo celular. Por esta razón, las regiones cercanas a las aberturas no deben considerarse como parte de la capa celular cultivada "normal", ya que habrá una importante acumulación de múltiples capas / apilamiento de células allí. En cambio, la región central del canal microfluídico es un área apropiada para obtener imágenes, ya que esta ubicación no se ve perturbada por el error impuesto por la variación de la altura del canal cerca de las aberturas. Las ubicaciones de los electrodos en la matriz de flujo se pueden usar para guiar las ubicaciones de imágenes y, como regla general, todas las exploraciones destinadas a capturar capas verdaderamente representativas de las condiciones del canal microfluídico deben tomarse en ubicaciones análogas dentro de los límites de los dos electrodos más separados en la matriz de flujo. Además, en el protocolo descrito, se especifica el objetivo de aumento de 40x para su uso; sin embargo, esto puede modificarse para adaptarse a las necesidades del usuario. Se eligió un aumento de 40x como el aumento óptimo debido a su capacidad para ofrecer imágenes de alta resolución y gran aumento, al tiempo que conserva un número suficiente de células para servir como una muestra estadísticamente válida.

Una modificación que se puede hacer al canal microfluídico incluye alterar la altura del canal, lo que se puede lograr variando el número de espaciadores y adhesivos utilizados para construir el canal microfluídico. La alteración de la altura del canal probablemente requerirá ajustar los parámetros de flujo para garantizar que el esfuerzo cortante no elimine las células durante la alimentación. Como tal, cualquier variación en la altura del canal afectará la tasa inicial ideal, la tasa de aceleración y la tasa final del flujo de medios. El protocolo descrito en este artículo puede servir como medio para obtener caudales adecuados experimentalmente, junto con métodos indirectos como ECIS. Además, los caudales pueden modificarse para adaptarse a las necesidades de diferentes líneas celulares, lo que puede requerir adaptación para establecer condiciones óptimas. Otra modificación que se puede hacer, con algunas adiciones a los pasos de este protocolo, es ampliar el caso de uso de la técnica descrita más allá de la comparación relativa del área de la sección transversal de las capas celulares. Con la calibración adecuada utilizando microesferas o microperlas de dimensiones conocidas, se pueden tomar mediciones precisas del área volumétrica, topológica y transversal absoluta. La calibración con un objeto de referencia es necesaria en este caso debido a la limitada resolución Z del microscopio confocal y al potencial de sobremuestreo o insuficiente en la dimensión Z debido al control manual sobre el tamaño de paso de la pila Z que ofrecen los sistemas de escaneo confocal32.

Una limitación de este protocolo es la falta de una verdadera medición volumétrica debido a la falta de pasos de calibración vertical. La calibración mencionada anteriormente y la técnica de verificación que utiliza microperlas fluorescentes de dimensiones conocidas pueden utilizarse para una escala realista. Además, el presente protocolo implica el uso de tinciones preparadas previamente y listas para usar. La tinción inmunofluorescente con anticuerpos primarios y secundarios a menudo requiere un protocolo de varios días que es más complicado que el que se discute en este artículo. Sin embargo, es probable que sea posible utilizar la tinción inmunofluorescente de esta manera, aunque puede ser necesaria cierta experimentación para optimizar el flujo de trabajo. Dados los pasos adicionales involucrados en los protocolos de tinción inmunofluorescente, se debe tener cuidado para evitar el cizallamiento de la capa celular cultivada durante los numerosos pasos de lavado, ya que esto puede alterar las propiedades de la capa celular finalmente evaluada y, por lo tanto, invalidar cualquier conclusión que seguiría. Otros desarrollos de esta técnica pueden incluir la automatización de los análisis de imágenes y datos, incluida la detección y cuantificación de la región de interés (ROI) para la determinación del área transversal. Además, la expansión de esta técnica para incluir diferentes estructuras diana intra y extracelulares (tal vez la tinción para objetivos como las proteínas de unión estrecha) puede ampliar el caso de uso de este método a la colocalización 3D dentro de dispositivos de cultivo celular microfluídico.

Para producir las capas celulares más representativas fisiológicamente, las células epiteliales pulmonares deben cultivarse en canales microfluídicos con una interfaz aire-líquido (ALI) en la superficie de cultivo, lo que generalmente se logra utilizando polidimetilsiloxano (PDMS), un material flexible permeable mediante la introducción de poros de escala μm. Las condiciones de cultivo de ALI permiten la formación de capas celulares que se asemejan más a las características fisiológicas del epitelio pulmonar in vivo 33. Aunque técnicamente posible, el uso de ECIS en un entorno de cultivo ALI con una superficie de cultivo PDMS en un entorno microfluídico dinámico es poco práctico e inaccesible para la mayoría de los investigadores, ya que no hay aparatos disponibles comercialmente para un conjunto de cultivo celular tan complejo34. Una razón para esta dificultad puede ser la necesidad paradójica de una superficie de cultivo permeable que todavía sea capaz de actuar como un electrodo sólido para el propósito de las mediciones ECIS. Como tal, actualmente existe la necesidad de un método para verificar visualmente las características y la relevancia fisiológica de las capas celulares cultivadas en entornos de cultivo impermeables al oxígeno, como los presentes en las matrices de flujo ECIS.

Este método amplía el método tradicional de garantizar la confluencia adecuada utilizando microscopía bidimensional al permitir la visualización 3D, lo que amplía en gran medida el número de características de la capa celular que se pueden observar, cuantificar y analizar. Además, esto permite una determinación subjetiva de la presencia de una monocapa, la uniformidad de la capa y otras propiedades consideradas relevantes para fines experimentales. Este protocolo es importante porque sirve como un medio para la verificación visual y la evaluación de las capas celulares que se producen en muchos entornos impermeables al oxígeno, como en los experimentos ECIS que evalúan las propiedades de la función de barrera de las células epiteliales expuestas al atelectrauma. Esto también sirve como un método que se puede utilizar en trabajos futuros para determinar si un conjunto de condiciones dinámicas de cultivo microfluídico produce capas celulares que son relevantes y apropiadas para una mayor experimentación.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores reconocen a Alan Shepardson por diseñar el patrón de corte para el adhesivo 3M y la lámina de mylar utilizados en la construcción del canal microfluídico y por probar la velocidad de flujo de medios de cultivo celular y la programación de la bomba de jeringa. Los fondos fueron proporcionados por NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 y Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
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pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

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Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico
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Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. E., Gaver III, D. P. Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device. J. Vis. Exp. (185), e64148, doi:10.3791/64148 (2022).

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