Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forberedelse og strukturell evaluering av epitelcellemonolag i en fysiologisk størrelse mikrofluidisk kulturanordning

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

Den presenterte protokollen beskriver utvikling og bruk av en falloidinbasert filamentøs-aktinfargingsteknikk med konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) for å visualisere adherent cellelagstruktur i mikrofluidiske dynamiske kulturkanaler og tradisjonelle statiske kulturkamre med fast brønn. Denne tilnærmingen hjelper til med å evaluere cellelagskonfluens, monolagsdannelse og lagtykkelsesuniformitet.

Abstract

In vitro mikrofluidisk eksperimentering har stort potensial for å avsløre mange innsikter i de mikrofysiologiske fenomenene som forekommer ved tilstander som akutt lungesviktsyndrom (ARDS) og ventilatorindusert lungeskade (VILI). Imidlertid står studier i mikrofluidiske kanaler med dimensjoner fysiologisk relevante for de terminale bronkiolene i den menneskelige lungen for tiden overfor flere utfordringer, særlig på grunn av vanskeligheter med å etablere passende cellekulturforhold, inkludert mediestrømningshastigheter, innenfor et gitt kulturmiljø. Den presenterte protokollen beskriver en bildebasert tilnærming for å evaluere strukturen til NCI-H441 humane lungeepitelceller dyrket i en oksygengjennomtrengelig mikrofluidisk kanal med dimensjoner fysiologisk relevante for de terminale bronkiolene i den menneskelige lungen. Ved bruk av falloidinbasert filament-aktinfarging avsløres cytoskjelettstrukturene i cellene ved konfokal laserskanningsmikroskopi, noe som muliggjør visualisering av individuelle så vel som lagdelte celler. Etterfølgende kvantifisering bestemmer om cellekulturbetingelsene som anvendes, produserer ensartede monolag som er egnet for videre eksperimentering. Protokollen beskriver cellekultur og lagevalueringsmetoder i mikrofluidiske kanaler og tradisjonelle fastbrønnmiljøer. Dette inkluderer kanalkonstruksjon, cellekultur og nødvendige betingelser, fiksering, permeabilisering og farging, konfokal mikroskopisk avbildning, bildebehandling og dataanalyse.

Introduction

Akutt lungesviktsyndrom (ARDS) er en akutt tilstand som oppstår ved fornærmelse mot og forplantning av skade i lungeparenkymet, noe som resulterer i lungeødem i alveolene, utilstrekkelig gassutveksling og påfølgende hypoksemi1. Dette initierer en syklus av proinflammatorisk cytokinfrigivelse, nøytrofilrekruttering, toksisk mediatorfrigivelse og vevskader, som i seg selv medfører en ytterligere inflammatorisk respons2. I tillegg kan lungesurfaktant, som stabiliserer luftveiene og forhindrer skade forårsaket av repeterende rekruttering / derekruttering (R / D), bli inaktivert eller på annen måte gjort dysfunksjonell av de kjemiske prosessene som oppstår under ARDS, noe som resulterer i ytterligere stress og skade på det omkringliggende parenkymet3. Hvis tilstrekkelig skade opprettholdes, kan mekanisk ventilasjon være nødvendig for å sikre tilstrekkelig systemisk oksygenering4. Mekanisk ventilasjon medfører imidlertid egne utfordringer og traumer, inkludert muligheten for ventilatorindusert lungeskade (VILI), karakterisert som skade på lungeparenkymet forårsaket av mekaniske påkjenninger påført under overinflasjon (volutrauma) og/eller FoU i luft-væskegrensesnittet i væskeokkluderte luftveier (atelectrauma)5. Trykkgradienten som oppleves av epitelceller utsatt for et luft-væskegrensesnitt (som i en væskeokkludert bronkiol) i atelectrauma-modellen, kan resultere i en permeabilitetsopprinnelse obstruktiv respons (POOR), noe som fører til en POOR-get-POORer dydig syklus av skade 6,7,8.

In vitro-eksperimentering kan gi mikroskala innsikt i disse fenomenene, men nåværende studier i mikrofluidiske kanalmiljøer med fysiologisk relevante dimensjoner står overfor flere utfordringer9. For det første utgjør optimalisering av cellekulturforhold en betydelig barriere for oppføring for cellekulturforskning i mikrofluidiske miljøer, da det eksisterer et smalt skjæringspunkt der medieflytparametere, kulturvarighet og andre kulturforhold tillater optimal dannelse av cellelag. Dette inkluderer diffusjonsbegrensningene pålagt av den oksygengjennomtrengelige naturen til den mikrofluidiske kulturkanalkapslingen. Dette krever nøye vurdering av mediestrømningsparametere, da lave strømningshastigheter kan frata celler oksygen, spesielt de som er lengst fra innløpet; På den annen side kan høye strømningshastigheter skyve celler ut av kulturkanalen eller resultere i feil eller ujevn lagutvikling. Diffusjonsbegrensninger kan løses ved å bruke oksygenpermeable materialer som polydimetylsiloksan (PDMS) i et luft-væskegrensesnitt (ALI) kulturapparat; Imidlertid er mange konvensjonelle mikrofluidiske kulturkanaler, som for ECIS-systemet (Electric Cell Substrate Impedance Sensing), iboende oksygengjennomtrengelige, gitt arten av det produserte kabinettet10. Denne protokollen tar sikte på å gi en teknikk for å analysere cellelag dyrket i et oksygen-ugjennomtrengelig kabinett.

Ved sammenligning av levedyktigheten til kulturforhold er observasjoner av spesifikke lagegenskaper, for eksempel tilstedeværelsen av et monolag, overflatetopologi, konfluens og lagtykkelsesensartethet, nødvendig for å avgjøre om cellelaget produsert av et bestemt sett med kulturbetingelser oppfyller de ønskede spesifikasjonene og faktisk er relevante for eksperimentell design. En begrenset evaluering kan utføres ved metoder som ECIS, som benytter målinger av elektrisk potensial (spenning) skapt av motstand mot høyfrekvent vekselstrøm (AC) (impedans) pålagt av elektrisk isolerende membraner av celler dyrket på gullelektroder i strømningsmatrisen. Ved å modulere frekvensen av AC påført celler, kan spesifikke frekvensavhengige cellulære egenskaper til cellene og cellelagene som overflateadherensstyrke, tett kryssdannelse og celleproliferasjon eller sammenløp målrettes og undersøkes11. Imidlertid er disse indirekte formene for målinger noe vanskelig å tolke ved begynnelsen av et eksperiment, og kan ikke kvantifisere alle relevante aspekter av cellelaget. Bare å observere cellelaget under et fasekontrastmikroskop kan avsløre naturen til visse kvaliteter som konfluens; Imidlertid krever mange relevante egenskaper som tilstedeværelsen av et monolag og lagtykkelsesuniformitet en tredimensjonal (3D) evaluering som ikke er mulig med lysfelt, fasekontrast eller fluorescerende mikroskopisk avbildning12.

Målet med denne studien var å utvikle en filamentøs-aktinfargingsteknikk for å muliggjøre bildebasert verifisering av et monolag og evaluering av cellelagets ensartethet ved bruk av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM). Filamentalt aktin (F-aktin) ble ansett som et passende mål for fluoroforkonjugatet, delvis på grunn av måten F-aktin tett følger cellemembranen, noe som muliggjør en visuell tilnærming av hele cellevolumet13. En annen viktig fordel ved å målrette F-aktin er måten farging av F-aktin visuelt belyser cytoskjelettforstyrrelser eller endringer pålagt av spenninger og belastninger som oppleves av cellene. Kryssbindingsfiksering med metanolfritt formaldehyd ble brukt til å bevare morfologien til cellene og cellelaget, da dehydrerende fikseringsmidler som metanol har en tendens til å flate celler, grovt forvrenge cellelaget og endre dets egenskaper14,15.

For å bestemme evnen til lagevalueringsteknikken for å redusere disse utfordringene, ble celler dyrket i tradisjonelle åtte-brønnkulturkamre, så vel som i mikrofluidiske kanaler for å evaluere forskjellene, om noen, i cellelagene som ble produsert. For faste kulturbrønner ble det brukt åtte-brønnkammerede dekkglassenheter. For mikrofluidisk kultur ble strømningsarrayer (kanallengde 50 mm, bredde 5 mm, dybde 0,6 mm) optimalisert for å dyrke udødeliggjorte humane lungeepitelceller (NCI-H441) i et miljø med dimensjoner fysiologisk relevante for de terminale bronkiolene som er tilstede i respirasjonssonen til den menneskelige lungen16. Selv om denne protokollen ble utviklet med kulturmiljøet til ECIS-strømningsmatriser i tankene, kan den gjelde for ethvert oksygengjennomtrengelig dynamisk kulturmiljø for hvilket evaluering av dyrkede cellelagsegenskaper eller kulturbetingelser er nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NCI-H441 human epitelial lungecellelinje ble brukt i denne studien (se materialtabell).

1. Cellekultur i den mikrofluidiske kanalen

  1. Fremstill den mikrofluidiske kanalen og utfør forbehandlingen ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Få en enkeltkanals strømningsmatrise (se materialfortegnelse) og skill den øvre delen fra polykarbonatbunnplaten.
    2. Få et #1.5 rektangulært dekselglass (tykkelse 0.17 mm) med dimensjoner på 60 mm x 22 mm. Rengjør overflatene på dekselglasset i et ultralydbad og behandle den ene siden med en 0,1 mg / ml løsning av Poly-D-lysin ved romtemperatur i 5 minutter før tørking ved 60 ° C i 30 minutter.
    3. Fest et 0,13 mm tykt dobbeltsidig lim (se materialfortegnelse), laserskåret for å imøtekomme dimensjonene til toppen av strømningsarrayet og strømningskanalen (50 mm lengde, 5 mm bredde), til toppen av strømningsarrayet, og pass på å justere kanalutskjæringene nøyaktig17.
    4. Fest et 0,1 mm tykt mylaravstandsstykke (se materialfortegnelse), laserskåret for å imøtekomme dimensjonene til strømningsmatrisetoppen og strømningskanalen, til limstripen, og pass på å justere kanalutskjæringene nøyaktig.
    5. Gjenta trinn 1.1.3 og 1.1.4 til ønsket kanalhøyde er nådd (for eksempel for en kanalhøyde på 0,6 mm, bruk to avstandsstykker og tre selvklebende strimler).
    6. Fest et rektangulært dekselglass til den nederste limstrimmelen med den poly-D-lysinbehandlede siden vendt mot limet. Etter at monteringen er fullført, som angitt i figur 1, påfør fast og likt trykk på toppen og bunnen av konstruksjonen og hold i 1 min.
      MERK: Byggingen av kanalkabinettet, inkludert dekkglass, lim, avstandsstykker og flow array-topp, er nå fullført.
    7. Skyll kanalen med avionisert vann ved hjelp av en sprøyte, samtidig som du kontrollerer for lekkasjer.
    8. Steriliser kanalkabinettet i en ultrafiolett (UV) sterilisator i 30 min18.
    9. Bruk steril teknikk til å behandle kanalen med 2,0 μg/ml humant fibronektin (se materialtabellen) i fosfatbufret saltvann (PBS) og inkubere i minst 30 minutter ved 37 °C19.
  2. Utfør cellekultur i den mikrofluidiske kanalen ved å følge trinnene nedenfor.
    1. I en steril laminær strømningshette, bruk en mikropipette for å overføre en jevn suspensjon av NCI-H441-celler i RPMI 1640-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (se materialtabell) til frø to mikrofluidiske kanaler, hver med celler med en overflatetetthet på 150 000 celler / cm2.
      1. For kanaler på 50 mm x 5 mm x 0,6 mm, bruk 0,25 ml av en 2,5 x 106 celler/ml-fjæring for å fylle hver kanal, samt en del av portene. Kontroller at cellene har blitt fordelt jevnt i kanalene ved hjelp av et lysfeltmikroskop.
    2. Dyrk de to kanalene i henholdsvis 24 timer og 48 timer ved 37 °C med 5 % CO2 ved hjelp av en programmerbar sprøytepumpe (se materialfortegnelse), og trekker brukte medier ut fra kanalen og ferske medier inn i kanalen fra et sterilt mediereservoar festet til kanalinntaket som består av en åpen 20 ml sprøyte dekket med parafinfilm.
      1. Etter en venteperiode på 10 minutter etter cellesåing, introduser og pump ferske medier fra reservoaret gjennom kanalen med en variabel strømningshastighet som begynner ved 0,2 μL/min og trappes opp til 10 μL/min i 4 timer, og deretter opprettholdes den hastigheten20.
        MERK: Denne variable strømningshastigheten gir kulturbetingelser som tillater celler å (1) gravitasjonsmessig bosette seg til kulturoverflaten, (2) feste seg til kulturoverflaten og (3) danne et konfluent monolag.
  3. Utfør cellefiksering inne i mikrofluidiske kanaler ved bruk av formaldehydoppløsning.
    FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig og må håndteres i en egnet kjemisk avtrekkshette21.
    1. I en kjemisk avtrekksventilator, klargjør formaldehydløsninger ved å bruke 4% formaldehyd i PBS (metanolfri) (se materialtabell) for å lage to 4 ml porsjoner, fortynne den første til en konsentrasjon på 1% formaldehyd og den andre til 2% formaldehyd ved bruk av Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS; med Ca 2+ og Mg2+) som fortynningsmiddel. Overfør formaldehydoppløsninger til separate 5 ml sprøyter og etikett deretter. Trekk opp 20 ml DPBS i en separat 20 ml sprøyte.
    2. Fjern mikrofluidiske kanaler fra kulturapparatet og plasser dem i den kjemiske avtrekkshetten.
    3. Monter fikserings- og fargeapparatet.
      1. Fest et 10 cm segment av overføringsslange til sideporten på en treveis stoppekran via en mannlig Luer-lås til slangefesteadapter (se materialfortegnelse), og koble deretter stoppekranen til innløpsporten på strømningsarrayet.
      2. Deretter fester du et annet 10 cm segment av overføringsslange til utløpsporten på strømningsgruppen ved hjelp av samme type slangefesteadapter.
      3. Til slutt sikrer du de frie endene av begge overføringsrørene i en kjemisk og biohazard-passende avfallsbeholder, for eksempel et merket tomt 50 ml konisk sentrifugerør.
    4. Vri stoppekranen for å blokkere innløpsporten for strømningsmatrisen og skyll avfallsledningen med DPBS. Vri deretter stoppekranen for å blokkere avfallsledningen og vask cellene sakte med 2 ml DPBS. Gjenta spyletrinnet med den nye løsningen hver gang. En ny løsning (eller konsentrasjon av løsning) blir introdusert til kanalen.
    5. Skyv sakte 2 ml 1 % fikseringsoppløsning gjennom kanalen og la den virke i 5 min22.
    6. Skyv sakte 2 ml med 2 % fikseringsløsning gjennom kanalen og la den virke i 15 minutter.
    7. Vask celler ved sakte å introdusere 2 ml fersk DPBS til kanalen i tre separate forekomster (5 minutter hver).
    8. Fullfør trinn 1.3.3-1.3.7 for begge mikrofluidiske kanaler parallelt.
  4. Flekk, permeabilize, og legge monteringsmedier til cellene i den mikrofluidiske kanalen.
    1. Forbered 0,1% saponinoppløsning ved å tilsette 1 mg saponin (se materialfortegnelse) per ml DPBS for å produsere 4 ml oppløsning og forsiktig virvel for å blande23. Trekk opp 8 ml DPBS i en 20 ml sprøyte.
    2. Tilsett et F-aktinfargende falloidinreagens og et kjernefargende Hoechst-reagens (se materialfortegnelse) til 0,1% saponinoppløsningen, ved to dråper (0,1 ml) av hvert reagens per ml saponinløsning. Hold tilberedt beising/permeabiliserende oppløsning borte fra lys ved å dekke med aluminiumsfolie24.
    3. Skyll linjen med en liten mengde farge-/permeabiliseringsløsning (som beskrevet i trinn 1.3.4), før deretter 2 ml av oppløsningen til den mikrofluidiske kanalen og dekk kanalen med aluminiumsfolie før den får sitte i romtemperatur i 30 minutter.
    4. Skyll ut farge-/permeabiliseringsoppløsningen to ganger med 2 ml DPBS i 5 minutter per spyling.
    5. For bedre bildekvalitet, legg til et passende monteringsmedium (med en brytningsindeks som samsvarer tett med mikroskopets objektivolje og dekselglass, se Materialfortegnelse) i kanalen.
      1. Bruk en mikropipette til å introdusere en minimal mengde av et mykt antifadefestemiddel til hver port på den mikrofluidiske kanalen, slik at bunnflaten er helt dekket og at ingen bobler fanges innenfor ønsket avbildningsområde25. Forsegle endene av kanalen og verifisere cellelagets integritet ved å observere under et lysfeltmikroskop.
    6. Fullfør trinn 1.4.3-1.4.5 for begge mikrofluidiske kanaler parallelt.
      MERK: Bildeceller så snart som mulig etter farging for maksimal bildekvalitet. Hvis fotobleking oppstår eller langvarig lagring er ønsket, kan andre monteringsmedier med antifade eller prøvebevarende egenskaper brukes. Merk at hardherdende monteringsmedier vil forvrenge 3D-strukturen til cellene og, i forlengelsen, cellelaget; Av denne grunn er myke monteringsmedier å foretrekke26.
  5. Bildeceller i den mikrofluidiske kanalen ved å følge trinnene nedenfor.
    1. Juster innstillingene for konfokalmikroskopet (se materialfortegnelse), inkludert laserkraft, forsterkning, forskyvning og skanneparametere som skannehastighet, skanneområde, skanneformat, oppløsning og hulldiameter27.
    2. Test bildeplassering ved å ta referanseskanninger samt Z-stakker til ønskede bildeparametere og betingelser er oppfylt. Innringingsparametere ved sekvensielt høyere forstørrelsesmål til målet om 40x oljenedsenking er nådd og optimalisert28.
    3. Ved å bruke baseplaten for strømningsmatrisen som referanse, konstruerer du Z-stabler på fem steder, på den potensielle plasseringen av den første elektroden på innløpssiden, halvveis mellom midten og forrige plassering, senteret, halvveis mellom senteret og plasseringen av den siste elektroden (på utløpssiden), og ved den siste elektroden, som angitt i figur 2.
  6. Utfør bildebehandling og dataanalyse.
    1. Eksporter XZ og YZ tverrsnitt ved hjelp av konfokalmikroskopprogramvarepakken (se Materialfortegnelse).
    2. Ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare (se Materialfortegnelse) med kantdeteksjonsfunksjoner (terskelverdi 15,0), måler du det totale bildeområdet i piksler ved hjelp av tryllestavverktøyet utenfor bildet, og deretter området som ekskluderer det totale tverrsnittsarealet av cellelaget i piksler ved å bruke tryllestavverktøyet i den delen av bildet som er utvendig til cellelaget29.
    3. Ved hjelp av databehandlingsprogramvare (se Materialfortegnelse) trekker du bildepunktverdien for det ytre området fra verdien for det totale bildepunktet for areal for å finne bildepunktverdien for tverrsnittsområdet.
    4. Konverter bildepunktverdier for tverrsnittsareal til μm2-verdier ved å multiplisere bildepunktverdier med kvadratet av μm/pikselverdien, som angitt i mikroskopprogramvaren for det bestemte bildet (0,31 μm/piksel for Z-stakker tatt i 1024p-oppløsning uten zoom på et 40x olje-nedsenkingsobjektiv).
    5. Beregn midler og standardavvik for data og grafresultater.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av den mikrofluidiske kanalkonstruksjonen. Det øverste elementet er den øverste delen av strømningsmatrisen, tynne grå elementer er limstrimler, tynne blå elementer er mylar avstandsstykker, og det nederste elementet er det rektangulære dekselglasset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fem avbildningssteder langs det konsekvent lagproduserende området av den mikrofluidiske kulturkanalen. Bildebehandlingssteder er som følger: innløpsside, nær der den første elektroden ville være på den intakte strømningsmatrisen; halvveis mellom innløpssiden og sentrum av kanalen; sentrum av kanalen; halvveis mellom midten og utløpssiden, og utløpssiden, i nærheten av der den siste elektroden ville være på den intakte strømningsmatrisen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Cellekultur i det åtte-brønnkammerede dekkglasset

  1. Utfør forbehandling av det åtte-brønnkammerede dekselglasset.
    1. Få tak i et sterilt åtte-brønns kamret dekkglass produsert med et #1.5 dekkglass og celleadherensøkende overflatebehandling (figur 3, se materialtabell).
    2. Bruk steril teknikk, behandle overflaten av kulturbrønner med 2,0 μg / ml humant fibronektin i PBS og inkuber i minst 30 minutter ved 37 ° C19.
  2. Utfør cellekultur i kammerdekselglasset ved å følge trinnene nedenfor.
    1. I en steril laminær strømningshette, overfør 0,5 ml deler av løsninger av NCI-H441-celler jevnt suspendert i RPMI 1640-medium med 10% FBS ved volumetriske tettheter på 81 000, 162 000 og 324 000 celler / ml for å frø kulturbrønnene ved overflatetettheter på henholdsvis 45 000, 90 000 og 180 000 celler / cm2. Kontroller at cellene har blitt jevnt fordelt i brønnene ved hjelp av et brightfield-mikroskop.
    2. Dyrkningsceller i 24 timer, 48 timer og 96 timer ved 37 °C med 5 % CO2, erstatter medier daglig.
  3. Utfør formaldehydfiksering i det åtte-godt kammerede dekselglasset.
    FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig og må håndteres i en egnet kjemisk avtrekkshette21.
    1. I en kjemisk avtrekkshette fremstilles formaldehydløsninger ved å lage to porsjoner 4% formaldehyd i PBS (metanolfri), fortynne den første til en konsentrasjon på 1% formaldehyd og den andre til 2% formaldehyd ved bruk av Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS; med Ca 2+ og Mg2+) som fortynningsmiddel.
    2. Fjern det åtte-brønns kulturkammerglasset fra inkubatoren og legg det inn i den kjemiske avtrekkshetten.
    3. Vask cellene forsiktig med 0,5 ml DPBS ved hjelp av en mikropipette ved sakte å introdusere væske langs den øvre delen av hjørnet av hver brønn.
    4. Fjern eksisterende væske i hver brønn ved sakte å trekke den ut fra hjørnet av brønnene ved hjelp av en mikropipette. Bruk væskeintroduksjonsmetoden (trinn 2.3.3), innfør 0,5 ml 1% fiksativ løsning i hver brønn og la den sitte i 5 minutter22.
    5. Fjern eksisterende væske i hver brønn ved hjelp av væskeekstraksjonsmetoden nevnt i trinn 2.3.4. Ved hjelp av væskeintroduksjonsmetoden nevnt i trinn 2.3.3, introduser 0,5 ml 2% fiksativ løsning i hver brønn og la den sitte i 15 minutter.
    6. Ved hjelp av væskeintroduksjons- og ekstraksjonsmetodene (trinn 2.3.3 og 2.3.4), vask celler ved å introdusere og fjerne 0,5 ml fersk DPBS i hver brønn i tre separate tilfeller i 5 minutter hver.
  4. Utfør farging, permeabilisering og montering av medietilsetning i det åtte-brønnkammerede dekselglasset.
    1. Forbered 0,1% saponinoppløsning ved å tilsette 1 mg saponin per ml DPBS og forsiktig virvel for å blande23.
    2. Til 0,1% saponinoppløsning, tilsett to dråper (0,1 ml) hver av et F-aktinfargende falloidinreagens og et kjernefarging Hoechst-reagens per ml saponinløsning. Hold den forberedte løsningen borte fra lys ved å dekke med aluminiumsfolie24.
    3. Innfør 0,2 ml farge-/permeabiliseringsløsning til hver brønn og dekk kammerglasset med aluminiumsfolie før du lar det sitte i romtemperatur i 30 minutter.
    4. Skyll ut flekker/permeabiliserende oppløsning to ganger med 0,5 ml DPBS.
    5. For bedre bildekvalitet, legg til et passende monteringsmedium (med en brytningsindeks som samsvarer tett med mikroskopets objektivolje og dekkglass) i brønnene.
      1. Bruk en mikropipette til å introdusere en minimal mengde av et mykt antifadefestemiddel til hver brønn, slik at bunnflaten er helt dekket og at ingen bobler fanges i ønsket avbildningsområde25. Bekreft cellelagets integritet ved å observere under et lysfeltmikroskop.
        MERK: Bildeceller så snart som mulig etter farging for maksimal bildekvalitet. Hvis fotobleking oppstår eller langvarig lagring er ønsket, kan andre monteringsmedier med antifade eller prøvebevarende egenskaper brukes. Merk at hardherdende monteringsmedier vil forvrenge 3D-strukturen til cellene og i forlengelsen cellelaget, så myke monteringsmedier er å foretrekke26.
  5. Utfør avbildning i det åtte-brønnkammerede dekselglasset.
    1. Juster innstillingene for konfokalmikroskopet, inkludert laserkraft, forsterkning, offset og skanneparametere som skannehastighet, skanneområde, skanneformat, oppløsning og pinhole-diameter27.
    2. Test bildeplassering ved å ta referanseskanninger samt Z-stakker til ønskede bildeparametere og betingelser er oppfylt. Innringingsparametere ved sekvensielt høyere forstørrelsesmål til målet om 40x oljenedsenking er nådd og optimalisert28.
    3. Konstruer Z-stabler av tre tilfeldige steder i hver såingstetthet / kulturvarighet.
  6. Utfør bildebehandling og dataanalyse.
    1. Eksporter XZ og YZ tverrsnitt ved hjelp av konfokalmikroskop programvarepakken.
    2. Ved hjelp av et bildebehandlingsprogram med kantdeteksjonsfunksjoner (terskelverdi 15,0) måler du det totale bildeområdet i piksler ved hjelp av tryllestavverktøyet utenfor bildet, og deretter området som ekskluderer det totale tverrsnittsarealet av cellelaget i piksler ved å bruke tryllestavverktøyet i den delen av bildet som er utenfor cellelaget29.
    3. Bruk et databehandlingsprogram til å trekke bildepunktverdien for det ytre området fra verdien for det totale bildepunktområdet for å finne bildepunktverdien for tverrsnittsområdet.
    4. Konverter bildepunktverdier for tverrsnittsareal til μm2-verdier ved å multiplisere bildepunktverdier med kvadratet av μm/pikselverdien som angitt i mikroskopprogramvaren for det bestemte bildet (0,31 μm/piksel for Z-stakker tatt i 1024p-oppløsning uten zoom på et 40x olje-nedsenkingsobjektiv).
    5. Beregn gjennomsnitt og standardavvik og grafresultater.

Figure 3
Figur 3: Diagram over det åtte-brønnkammerede dekkglasset som ble brukt til fikset brønnkultur, farging og avbildningseksperiment som sammenlignet effekten av innledende cellesåtetthet og kulturvarighet på dannelsen av cellelag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterte metoden tillater visualisering av epitelcellelag dyrket i mikrofluidiske kulturkanaler og bruker en demonstrasjon i tradisjonelle fastbrønnscellekulturmiljøer som validering. Bilder som er anskaffet, vil eksistere på et spekter av kvalitet, signalintensitet og mobilmålspesifisitet. Vellykkede bilder vil demonstrere høy kontrast, noe som muliggjør bildeanalyse og kvantifisering av data for senere statistisk evaluering. Mislykkede bilder vil være svake, uklare, uskarpe eller på annen måte ubrukelige for subjektiv eller kvantitativ evaluering. Noen bilder kan være egnet for subjektiv lagkarakteristikkbestemmelse, samtidig som de ikke er av tilstrekkelig kvalitet for kvantitativ analyse. Dermed vil graden og omsorgen som protokollen følges, direkte påvirke egnetheten til et gitt bilde til å tjene som datakilde for statistisk analyse.

Figur 4 representerer vellykket bruk av teknikken i sammenheng med et mikrofluidisk dynamisk kulturmiljø og viser bildeopptak ved innløp og utløp av to mikrofluidiske enheter. Figur 4A, B gir eksempler på lag dyrket i 24 timer, og figur 4C, D presenterer eksempler på lag dyrket i 48 timer. Figur 5 illustrerer de tilknyttede dataene samlet inn fra det mikrofluidiske kanaleksperimentet, og inneholder tre prøver fra hver av de fem mikrofluidiske kanalavbildningsstedene angitt i figur 2 fra hver kulturvarighet. Feilfelt angir standardavvik.

Figur 6 viser et 2D-bilde av XY-planet i midten av den mikrofluidiske kanalen, og figur 7 viser en 3D-visning av samme sted med dybdefargekoding. Figur 8 representerer vellykket bildeoppkjøp i et tetthetsvarighetseksperiment som analyserer effekten av innledende cellesåingstetthet og kulturvarighet på NCI-H441-cellelagsdannelse i det åtte-brønnkammerede dekkglassmiljøet. Figur 8A-C indikerer kulturvarighet på henholdsvis 24 timer, 48 timer og 96 timer. Figur 8X-Z indikerer innledende cellesåingstettheter på henholdsvis 180 000, 90 000 og 45 000 celler/cm2. Figur 9 presenterer kvantitative data samlet inn fra det åtte-brønnkammerede dekkglasseksperimentet, inkludert prøver fra tre steder i hver tetthet-varighetsmatch-up. Feilfelt representerer standardavvik, og p-verditester ble utført for å bestemme statistisk signifikante forskjeller mellom tilsynelatende nære verdier.

Disse to representative eksperimentene i de dynamiske mikrofluidiske og statiske åttebrønnsmiljøene er distinkte eksempler på brukstilfeller som demonstrerer hvordan teknikken kan kontekstualisere eksperimentelle funn ved visuelt å bekrefte tilstedeværelsen eller fraværet av fysiologisk relevante monolag.

Figure 4
Figur 4: NCI-H441-cellelag dyrket i den mikrofluidiske kanalen i 24 og 48 timer, avbildet på innløpssiden og utløpssiden som vist i figur 2. (A) 24 timer, innløpsside. (B) 24 timer, utløpsside. (C) 48 timer, innløpsside. (D) 48 timer, utløpsside. Blått representerer kjernefargingen og grønt representerer fargingen av filamentøs aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Grafisk fremstilling av dataene samlet inn under 24-48 timers mikrofluidisk kanalavbildningseksperiment. Dette inkluderer seks tverrsnittsprøver fra hver av fem lokaliteter langs den aktuelle lengden på den mikrofluidiske kanalen (som vist i figur 2). Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: 2D-bilde tatt i XY-planet på et sentralt sted i den mikrofluidiske kanalen. Blått representerer kjernefargingen og grønt representerer fargingen av filamentøs aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: 3D-modell av samme plassering av mikrofluidiske kanaler som figur 6. Fargekodingen viser dybdedata. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: NCI-H441 cellelag dyrket i det åtte-brønnkammerede dekkglasset. I 24 timer (A), 48 timer (B) og 96 timer (C) ved innledende såtettheter på 180 000 (X), 90 000 (Y) og 45 000 (Z) celler/cm2. Blått representerer kjernefargingen og grønt representerer fargingen av filamentøs aktin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Grafisk fremstilling av dataene samlet inn under tetthetsvarigheten åtte-brønnkultureksperiment. Dette inkluderer seks tverrsnittsprøver fra hver tetthet-varighet match-up. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den presenterte protokollen beskriver kulturen, tverrbindingsfiksering, farging, permeabilisering og konfokal mikroskopisk visualisering av NCI-H441 humane lungeepitelceller i det dynamiske miljøet til en enkeltkanals mikrofluidisk strømningsmatrise, samt i det statiske miljøet til et tradisjonelt åtte-brønnkammeret dekkglass. Med en hvilken som helst mikrofluidisk cellekulturprotokoll er strømningsbetingelsene til cellekulturmediet av avgjørende betydning, da høyhastighetsstrømmen har potensial til å vaske bort cellene eller forstyrre den normale monteringen av cellemonolaget. I mellomtiden har lavhastighetsstrømmen potensialet til å "sulte" eller "kveles" (henholdsvis utilstrekkelig nærings- og oksygentilgjengelighet) cellelaget på grunn av diffusjonsbegrensningene pålagt av den mikrofluidiske kanalens ugjennomtrengelige natur, samt strømningsegenskapene30. Ved å begynne med en venteperiode på 10 minutter (hvor cellene forblir suspendert i det samme mediet som opprinnelig fylte kanalen), deretter avansere til en strømningshastighet på 0,2 μL/min, før den til slutt trappes opp til 10 μL/min i løpet av 4 timer, balanseres disse konkurrerende behovene for å fremme både celleadherens og overlevelse.

Et annet kritisk trinn i protokollen er riktig forberedelse av den mikrofluidiske kanalen, inkludert konstruksjon og forbehandling. Det må tas hensyn til at glassdekselet er riktig montert på kammerkonstruksjonen for å unngå lekkasje og potensiell forurensning. Riktig festing av dekselglasset er også nødvendig for å sikre at kanalhøyden er konsistent og nøyaktig gjengitt mellom påfølgende forsøk ved bruk av forskjellige konstruerte enheter. Mindre variasjon kan innføres ved toleransen i tykkelsen på limstrimlene som brukes, samt den relative kompressibiliteten. Minimering av variabilitet vil hjelpe med konsistensen av eksperimentelle resultater. Riktig forbehandling av den konstruerte kanalen er viktig for å sikre at cellene får feste seg til og initiere spredning på glassoverflaten. Ultralydrengjøring av glasset forbedrer Poly-D-lysinadherens, og fremmer adherens til fibronektin. Tilsetning av fibronektin, et glykoprotein naturlig syntetisert og utskilt av humane epitelceller, fremmer ytterligere adherens av NCI-H441-cellene til dekselglassoverflaten, noe som muliggjør normal cellemonolagsutvikling31.

Videre er en av de viktigste aspektene ved denne protokollen bildeplasseringen. Til tross for nøye kontrollert forberedelse, på grunn av det søyleformede volumet som er tilgjengelig i områdene av de to kanalåpningene, vil flere celler være til stede på dekkglassoverflaten i området rett under, så vel som ved siden av disse åpningene, selv når man overholder riktige cellekulturteknikker. Av denne grunn bør regioner nær åpningene ikke betraktes som en del av det "normale" dyrkede cellelaget, da det vil være betydelig flerlags / cellestabling som forekommer der. I stedet er det sentrale området av den mikrofluidiske kanalen et passende område å avbilde, da dette stedet er uforstyrret av feilen som skyldes kanalhøydevariasjon nær åpningene. Elektrodeplasseringene på strømningsmatrisen kan brukes til å veilede avbildningssteder, og som en tommelfingerregel bør alle skanninger som er ment å fange lag som virkelig er representative for de mikrofluidiske kanalforholdene, tas på analoge steder innenfor grensene til de to lengst fra hverandre elektrodene på strømningsmatrisen. I tillegg, i protokollen som er beskrevet, er 40x forstørrelsesmålet spesifisert for bruk; Dette kan imidlertid endres for å passe brukerens behov. 40x forstørrelse ble valgt som optimal forstørrelse på grunn av sin evne til å tilby høyoppløselig, høy forstørrelse avbildning samtidig beholde et tilstrekkelig antall celler til å tjene som en statistisk gyldig prøve.

En modifikasjon som kan gjøres til den mikrofluidiske kanalen inkluderer endring av kanalhøyden, noe som kan oppnås ved å variere antall avstandsstykker og lim som brukes til å konstruere den mikrofluidiske kanalen. Endring av kanalhøyden vil sannsynligvis nødvendiggjøre justering av strømningsparametrene for å sikre at skjærspenningen ikke fjerner celler under fôringen. Som sådan vil enhver variasjon i kanalhøyden påvirke den ideelle starthastigheten, oppstartshastigheten og den endelige hastigheten på medieflyten. Den beskrevne protokollen i denne artikkelen kan tjene som et middel som egnede strømningshastigheter kan utledes eksperimentelt, i forbindelse med indirekte metoder som ECIS. I tillegg kan strømningshastigheter endres for å passe behovene til forskjellige cellelinjer, noe som kan kreve tilpasning for å etablere optimale forhold. En annen modifikasjon som kan gjøres, med noen tillegg til trinnene i denne protokollen, er å utvide brukssaken til den beskrevne teknikken utover den relative sammenligningen av tverrsnittsarealet av cellelag. Ved passende kalibrering ved bruk av mikrosfærer eller mikroperler av kjente dimensjoner kan nøyaktige volumetriske, topologiske og absolutte tverrsnittsarealmålinger tas. Kalibrering ved hjelp av et referanseobjekt er nødvendig i dette tilfellet på grunn av konfokalmikroskopets begrensede Z-oppløsning og potensialet for over- eller undersampling i Z-dimensjonen på grunn av den manuelle kontrollen over Z-stack-trinnstørrelsen som konfokale skanningssystemer tilbyr32.

En begrensning ved denne protokollen er mangelen på ekte volumetrisk måling på grunn av mangelen på vertikale kalibreringstrinn. Kalibreringen nevnt ovenfor og verifikasjonsteknikken som benytter fluorescerende mikroperler av kjente dimensjoner kan brukes til naturtro skalering. I tillegg innebærer den nåværende protokollen bruk av forberedte, bruksklare flekker. Immunfluorescerende farging ved bruk av primære og sekundære antistoffer krever ofte en flerdagers protokoll som er mer involvert enn den denne artikkelen diskuterer. Imidlertid er det sannsynligvis mulig å bruke immunfluorescerende farging på denne måten, selv om det kan være nødvendig med noen eksperimenter for å optimalisere arbeidsflyten. Gitt de ekstra trinnene som er involvert i immunfluorescerende fargeprotokoller, må det utvises forsiktighet for å unngå skjæring av det dyrkede cellelaget under de mange vasketrinnene, da dette kan endre egenskapene til cellelaget som til slutt evalueres og derfor ugyldiggjøre eventuelle konklusjoner som vil følge. Videre utvikling av denne teknikken kan omfatte automatisering av bilde- og dataanalysene, inkludert deteksjon av interesseregion (ROI) og kvantifisering for bestemmelse av tverrsnittsareal. I tillegg kan utvidelse av denne teknikken til å inkludere forskjellige intra- og ekstracellulære målstrukturer (kanskje farging for mål som stramme kryssproteiner) utvide brukssaken for denne metoden til 3D-samlokalisering innen mikrofluidiske cellekulturenheter.

For å produsere de mest fysiologisk representative cellelagene, må lungeepitelceller dyrkes i mikrofluidiske kanaler med et luft-væskegrensesnitt (ALI) på kulturoverflaten, som vanligvis oppnås ved bruk av polydimetylsiloksan (PDMS), et fleksibelt materiale gjort permeabelt ved innføring av μm-skala porer. ALI-kulturforhold tillater dannelse av cellelag som ligner mest på de fysiologiske egenskapene til in vivo lungeepitel33. Selv om det er teknisk mulig, er bruk av ECIS i et ALI-kulturmiljø med en PDMS-kulturoverflate i et dynamisk mikrofluidisk miljø upraktisk og utilgjengelig for de fleste forskere, da det ikke finnes kommersielt tilgjengelige apparater for en så kompleks cellekultursamling34. En årsak til denne vanskeligheten kan være det paradoksale behovet for en permeabel kulturoverflate som fortsatt er i stand til å fungere som en fast elektrode for formålet med ECIS-målinger. Som sådan eksisterer det for tiden behov for en metode for visuelt å verifisere egenskapene og fysiologiske relevansen av cellelag dyrket i oksygengjennomtrengelige kulturmiljøer som de som er tilstede i ECIS-strømningsarrayer.

Denne metoden utvider den tradisjonelle metoden for å sikre riktig sammenløp ved hjelp av todimensjonal mikroskopi ved å tillate 3D-visualisering, noe som i stor grad utvider antall cellelagegenskaper som kan observeres, kvantifiseres og analyseres. I tillegg tillater dette en subjektiv bestemmelse av tilstedeværelsen av et monolag, lagensartethet og andre egenskaper som anses relevante for eksperimentelle formål. Denne protokollen er viktig fordi den tjener som et middel for visuell verifisering og evaluering av cellelag som produseres i mange oksygengjennomtrengelige miljøer, for eksempel i ECIS-eksperimenter som evaluerer barrierefunksjonsegenskaper til epitelceller utsatt for atelectrauma. Dette fungerer også som en metode som kan brukes i fremtidig arbeid for å avgjøre om et sett med dynamiske mikrofluidiske kulturbetingelser produserer cellelag som er relevante og hensiktsmessige for videre eksperimentering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner Alan Shepardson for å designe skjæremønsteret for 3M-limet og mylararket som brukes i mikrofluidisk kanalkonstruksjon og for testing av cellekulturmediestrømningshastigheten og sprøytepumpeprogrammeringen. Finansiering ble levert av NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801, og Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 185
Forberedelse og strukturell evaluering av epitelcellemonolag i en fysiologisk størrelse mikrofluidisk kulturanordning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. … More

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. E., Gaver III, D. P. Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device. J. Vis. Exp. (185), e64148, doi:10.3791/64148 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter