Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

Het gepresenteerde protocol beschrijft de ontwikkeling en het gebruik van een op falloidine gebaseerde filamenteuze actinekleuringstechniek met confocale laserscanmicroscopie (CLSM) om de aanhangende cellaagstructuur in microfluïdische dynamische cultuurkanalen en traditionele statische-cultuurkamers met vaste put te visualiseren. Deze benadering helpt bij het evalueren van cellaagconfluentie, monolaagvorming en uniformiteit van laagdikte.

Abstract

In vitro microfluïdische experimenten hebben een groot potentieel om veel inzichten te onthullen in de microfysiologische verschijnselen die optreden bij aandoeningen zoals acute respiratory distress syndrome (ARDS) en door beademingsapparatuur geïnduceerde longschade (VILI). Studies in microfluïdische kanalen met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen van de menselijke long worden momenteel echter geconfronteerd met verschillende uitdagingen, vooral als gevolg van problemen bij het vaststellen van geschikte celkweekomstandigheden, waaronder mediastroomsnelheden, binnen een bepaalde kweekomgeving. Het gepresenteerde protocol beschrijft een beeldgebaseerde benadering om de structuur van NCI-H441 menselijke longepitheelcellen gekweekt in een zuurstofondoordringbaar microfluïdisch kanaal te evalueren met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen van de menselijke long. Met behulp van falloidine-gebaseerde filamenteuze actinekleuring worden de cytoskeletale structuren van de cellen onthuld door confocale laserscanmicroscopie, waardoor zowel individuele als gelaagde cellen kunnen worden gevisualiseerd. De daaropvolgende kwantificering bepaalt of de toegepaste celkweekomstandigheden uniforme monolagen produceren die geschikt zijn voor verdere experimenten. Het protocol beschrijft celkweek- en laagevaluatiemethoden in microfluïdische kanalen en traditionele fixed-well-omgevingen. Dit omvat kanaalconstructie, celkweek en vereiste omstandigheden, fixatie, permeabilisatie en kleuring, confocale microscopische beeldvorming, beeldverwerking en gegevensanalyse.

Introduction

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is een acute aandoening die voortvloeit uit belediging en verspreiding van letsel in het longparenchym, resulterend in longoedeem van de longblaasjes, onvoldoende gasuitwisseling en daaropvolgende hypoxemie1. Dit initieert een cyclus van pro-inflammatoire cytokine-afgifte, neutrofiele rekrutering, toxische mediatorafgifte en weefselschade, die zelf een verdere ontstekingsreactie veroorzaakt2. Bovendien kan pulmonale oppervlakteactieve stof, die de luchtwegen stabiliseert en schade voorkomt die wordt veroorzaakt door repetitieve rekrutering / derekrutering (R / D), worden geïnactiveerd of anderszins disfunctioneel worden gemaakt door de chemische processen die optreden tijdens ARDS, wat resulteert in verdere stress en letsel aan het omliggende parenchym3. Als er voldoende schade wordt opgelopen, kan mechanische ventilatie nodig zijn om voldoende systemische oxygenatie te garanderen4. Mechanische beademing brengt echter zijn eigen uitdagingen en trauma's met zich mee, waaronder de mogelijkheid van door beademingsapparatuur geïnduceerd longletsel (VILI), gekarakteriseerd als letsel aan het longparenchym veroorzaakt door de mechanische spanningen die worden opgelegd tijdens overinflatie (volutrauma) en/of de R/D van de lucht-vloeistofinterface in de vloeistof-afgesloten luchtweg (atelectrauma)5. De drukgradiënt die wordt ervaren door epitheelcellen die worden blootgesteld aan een lucht-vloeistofinterface (zoals in een met vloeistof afgesloten bronchiol) in het atelectraumamodel kan resulteren in een permeabiliteitsgerelateerde obstructieve respons (POOR), wat leidt tot een POOR-get-POORer deugdzame cyclus van letsel 6,7,8.

In vitro experimenten kunnen op microschaal inzicht geven in deze verschijnselen, maar de huidige studies in microfluïdische kanaalomgevingen met fysiologisch relevante dimensies staan voor verschillende uitdagingen9. Ten eerste vormt het optimaliseren van celkweekomstandigheden een belangrijke barrière voor toegang tot celkweekonderzoek in microfluïdische omgevingen, omdat er een smalle kruising bestaat waarbinnen mediastroomparameters, kweekduur en andere kweekomstandigheden optimale cellaagvorming mogelijk maken. Dit omvat de diffusiebeperkingen die worden opgelegd door de zuurstofondoordringbare aard van de microfluïdische kweekkanaalbehuizing. Dit vereist een zorgvuldige afweging van mediastroomparameters, omdat lage stroomsnelheden cellen van zuurstof kunnen beroven, vooral die het verst van de inlaat verwijderd zijn; Aan de andere kant kunnen hoge stroomsnelheden cellen uit het kweekkanaal duwen of resulteren in onjuiste of ongelijke laagontwikkeling. Diffusiebeperkingen kunnen worden aangepakt door zuurstofdoorlatende materialen zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) te gebruiken in een lucht-vloeistofinterface (ALI) kweekapparaat; veel conventionele microfluïdische kweekkanalen, zoals die van het elektrische celsubstraatimpedantiedetectiesysteem (ECIS), zijn echter inherent zuurstofondoordringbaar, gezien de aard van de vervaardigde behuizing10. Dit protocol heeft tot doel een techniek te bieden voor het analyseren van cellagen gekweekt in een zuurstof-ondoordringbare behuizing.

Bij het vergelijken van de levensvatbaarheid van kweekomstandigheden zijn waarnemingen van specifieke laagkenmerken, zoals de aanwezigheid van een monolaag, oppervlaktetopologie, confluentie en uniformiteit van de laagdikte, noodzakelijk om te bepalen of de cellaag die door een bepaalde reeks kweekomstandigheden wordt geproduceerd, voldoet aan de gewenste specificaties en inderdaad relevant is voor het experimentele ontwerp. Een beperkte evaluatie kan worden uitgevoerd met methoden zoals ECIS, die gebruik maakt van metingen van elektrische potentiaal (spanning) gecreëerd door weerstand tegen hoogfrequente wisselstroom (AC) (impedantie) opgelegd door elektrisch isolerende membranen van cellen gekweekt op gouden elektroden binnen de stroomarray. Door de frequentie van AC toegepast op cellen te moduleren, kunnen specifieke frequentie-afhankelijke cellulaire eigenschappen van de cellen en cellagen zoals oppervlaktetrouwsterkte, tight-junction-vorming en celproliferatie of confluentie worden gericht en onderzocht11. Deze indirecte vormen van metingen zijn echter enigszins moeilijk te interpreteren aan het begin van een experiment en kwantificeren mogelijk niet alle relevante aspecten van de cellaag. Alleen al het observeren van de cellaag onder een fasecontrastmicroscoop kan de aard van bepaalde kwaliteiten zoals confluentie onthullen; veel relevante kenmerken, zoals de aanwezigheid van een monolaag en uniformiteit van de laagdikte, vereisen echter een driedimensionale (3D) evaluatie die niet mogelijk is met brightfield, fasecontrast of fluorescerende microscopische beeldvorming12.

Het doel van deze studie was om een filamenteuze actinekleuringstechniek te ontwikkelen om op beeldvorming gebaseerde verificatie van een monolaag en de evaluatie van cellaaguniformiteit met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM) mogelijk te maken. Filamenteuze actine (F-actine) werd beschouwd als een geschikt doelwit voor het fluorofoorconjugaat, deels vanwege de manier waarop F-actine het celmembraan strak volgt, waardoor een visuele benadering van het volledige celvolumemogelijk is 13. Een ander belangrijk voordeel van het richten op F-actine is de manier waarop kleuring van F-actine visueel cytoskeletale verstoringen of veranderingen opheldert die worden opgelegd door de spanningen en stammen die door de cellen worden ervaren. Crosslinking fixatie met methanolvrij formaldehyde werd gebruikt om de morfologie van de cellen en de cellaag te behouden, omdat uitdrogende fixatieven zoals methanol de neiging hebben om cellen af te vlakken, de cellaag ernstig te vervormen en de eigenschappen ervan te veranderen14,15.

Om het vermogen van de laagevaluatietechniek te bepalen om deze uitdagingen te verminderen, werden cellen gekweekt in traditionele kweekkamers met acht putten en in microfluïdische kanalen om de eventuele verschillen in de geproduceerde cellagen te evalueren. Voor vaste kweekputten werden acht putvormige afdekglasunits gebruikt. Voor microfluïdische cultuur werden flowarrays (kanaallengte 50 mm, breedte 5 mm, diepte 0,6 mm) geoptimaliseerd om vereeuwigde menselijke longepitheelcellen (NCI-H441) te kweken in een omgeving met afmetingen die fysiologisch relevant zijn voor de terminale bronchiolen die aanwezig zijn in de ademhalingszone van de menselijke long16. Hoewel dit protocol is ontwikkeld met de kweekomgeving van ECIS-flowarrays in gedachten, kan het van toepassing zijn op elke zuurstofondoordringbare dynamische cultuuromgeving waarvoor evaluatie van gekweekte cellaagkenmerken of kweekomstandigheden noodzakelijk is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De NCI-H441 humane epitheliale longcellijn werd gebruikt voor deze studie (zie tabel met materialen).

1. Celkweek in het microfluïdische kanaal

  1. Fabriceer het microfluïdische kanaal en voer de voorbehandeling uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Verkrijg een eenkanaals stroomarray (zie materiaaltabel) en scheid het bovenste gedeelte van de basisplaat van polycarbonaat.
    2. Verkrijg een #1.5 rechthoekig afdekglas (dikte 0,17 mm) met afmetingen van 60 mm x 22 mm. Reinig oppervlakken van het afdekglas in een ultrasoon bad en behandel één kant met een 0,1 mg / ml oplossing van Poly-D-Lysine bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten voordat u gedurende 30 minuten bij 60 ° C droogt.
    3. Bevestig een 0,13 mm dikke dubbelzijdige lijm (zie materiaaltabel), lasergesneden om tegemoet te komen aan de afmetingen van de bovenkant van de flowarray en het stroomkanaal (50 mm lengte, 5 mm breedte), op de bovenkant van de flowarray, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de kanaaluitsparingen nauwkeurig worden uitgelijnd17.
    4. Bevestig een 0,1 mm dikke mylar-afstandhouder (zie materiaaltabel), lasergesneden om tegemoet te komen aan de afmetingen van de bovenkant van de stroomarray en het stroomkanaal, op de plakstrip, waarbij de kanaaluitsparingen nauwkeurig worden uitgelijnd.
    5. Herhaal stap 1.1.3 en 1.1.4 totdat de gewenste kanaalhoogte is bereikt (gebruik bijvoorbeeld voor een kanaalhoogte van 0,6 mm twee afstandhouders en drie plakstrips).
    6. Breng een rechthoekig afdekglas aan op de onderste plakstrip met de met Poly-D-Lysine behandelde zijde naar de kleefstof gericht. Nadat de montage is voltooid, zoals aangegeven in figuur 1, oefent u stevige en gelijke druk uit op de boven- en onderkant van de constructie en houdt u deze gedurende 1 minuut vast.
      OPMERKING: De constructie van de kanaalbehuizing, inclusief afdekglas, lijmen, afstandhouders en flow array top, is nu voltooid.
    7. Spoel het kanaal met gedeïoniseerd water met behulp van een spuit en controleer tegelijkertijd op lekken.
    8. Steriliseer de kanaalbehuizing in een ultraviolette (UV) sterilisator gedurende 30 min18.
    9. Behandel het kanaal met behulp van een steriele techniek met 2,0 μg/ml humaan fibronectine (zie tabel met materialen) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C19.
  2. Voer celkweek uit in het microfluïdische kanaal volgens de onderstaande stappen.
    1. Gebruik in een steriele laminaire stromingskap een micropipette om een gelijkmatige suspensie van NCI-H441-cellen in RPMI 1640-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel) over te brengen om twee microfluïdische kanalen te zaaien, elk met cellen met een oppervlaktedichtheid van 150.000 cellen / cm2.
      1. Gebruik voor kanalen van 50 mm x 5 mm x 0,6 mm 0,25 ml van een 2,5 x 106 cellen/ml suspensie om elk kanaal te vullen, evenals een deel van de poorten. Controleer of de cellen gelijkmatig binnen de kanalen zijn verdeeld met behulp van een brightfield-microscoop.
    2. Kweek de twee kanalen gedurende respectievelijk 24 uur en 48 uur bij 37 °C met 5% CO2 met behulp van een programmeerbare spuitpomp (zie materiaaltabel), waarbij gebruikte media uit het kanaal en verse media uit het kanaal worden getrokken uit een steriel mediareservoir dat is bevestigd aan de kanaalinlaat bestaande uit een opengesneden spuit van 20 ml bedekt met paraffinefilm.
      1. Na een wachttijd van 10 minuten na het zaaien van de cel, brengt en pompt u verse media uit het reservoir door het kanaal met een variabel debiet dat begint bij 0,2 μl / min en gedurende 4 uur wordt opgevoerd tot 10 μl / min, waarna u met dat tempo20 handhaaft.
        OPMERKING: Deze variabele stroomsnelheid biedt kweekomstandigheden die cellen in staat stellen om (1) gravitationeel op het kweekoppervlak te bezinken, (2) zich aan het cultuuroppervlak te hechten en (3) een confluente monolaag te vormen.
  3. Voer celfixatie uit in de microfluïdische kanalen met behulp van formaldehyde-oplossing.
    LET OP: Formaldehyde is giftig en moet worden behandeld in een geschikte chemische zuurkast21.
    1. Bereid in een chemische zuurkast formaldehyde-oplossingen door 4% formaldehyde in PBS (methanolvrij) te gebruiken (zie materiaaltabel) om twee porties van 4 ml te maken, waarbij de eerste wordt verdund tot een concentratie van 1% formaldehyde en de tweede tot 2% formaldehyde met behulp van dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS; met Ca 2 + en Mg2 +) als verdunningsmiddel. Breng formaldehyde-oplossingen over in afzonderlijke spuiten van 5 ml en etiketteer dienovereenkomstig. Zuig 20 ml DPBS op in een afzonderlijke spuit van 20 ml.
    2. Verwijder microfluïdische kanalen uit het kweekapparaat en plaats ze in de chemische zuurkast.
    3. Monteer het bevestigings- en beitsapparaat.
      1. Bevestig een segment van 10 cm overdrachtsbuizen aan de zijpoort van een driewegstopkraan via een mannelijke Luer-vergrendeling aan de slanghaakadapter (zie materiaaltabel) en sluit vervolgens de stopkraan aan op de inlaatpoort van de stroomarray.
      2. Bevestig vervolgens nog een segment van 10 cm transferbuizen aan de uitlaatpoort van de stroomarray met behulp van hetzelfde type slanghaakadapter.
      3. Bevestig ten slotte de vrije uiteinden van beide overdrachtsbuizen in een chemische en biohazard-geschikte afvalcontainer, zoals een gelabelde lege conische centrifugebuis van 50 ml.
    4. Draai aan de stopkraan om de inlaatpoort van de stroomarray te blokkeren en spoel de afvalleiding met DPBS. Draai vervolgens aan de stopkraan om de afvallijn af te sluiten en was cellen langzaam met 2 ml DPBS. Herhaal de spoelstap met de nieuwe oplossing elke keer. Een nieuwe oplossing (of concentratie van oplossing) wordt in het kanaal geïntroduceerd.
    5. Duw langzaam 2 ml 1% fixatieve oplossing door het kanaal en laat dan 5 min22 zitten.
    6. Duw langzaam 2 ml 2% fixatieve oplossing door het kanaal en laat dan 15 minuten zitten.
    7. Was cellen door langzaam 2 ml verse DPBS in het kanaal te introduceren in drie afzonderlijke instanties (elk 5 minuten).
    8. Voer stap 1.3.3-1.3.7 voor beide microfluïdische kanalen parallel uit.
  4. Kleur, permeabiliseer en voeg bevestigingsmedia toe aan de cellen in het microfluïdische kanaal.
    1. Bereid 0,1% saponine-oplossing door 1 mg saponine (zie materiaaltabel) per ml DPBS toe te voegen om 4 ml oplossing te produceren en voorzichtig vortex om23 te mengen. Zuig 8 ml DPBS op in een spuit van 20 ml.
    2. Voeg een F-actinekleuringsfalloidinereagens en een nucleuskleurend Hoechst-reagens (zie materiaaltabel) toe aan de 0,1% saponine-oplossing, met twee druppels (0,1 ml) van elk reagens per ml saponine-oplossing. Houd voorbereide vlek- / permeabiliserende oplossing uit de buurt van licht door te bedekken met aluminiumfolie24.
    3. Spoel de lijn met een kleine hoeveelheid kleurings-/permeabiliserende oplossing (zoals beschreven in stap 1.3.4), breng vervolgens 2 ml van de oplossing aan in het microfluïdische kanaal en bedek het kanaal met aluminiumfolie voordat u het gedurende 30 minuten op kamertemperatuur laat zitten.
    4. Spoel de kleurings-/permeabiliserende oplossing tweemaal uit met 2 ml DPBS gedurende 5 minuten per spoeling.
    5. Voor een betere beeldkwaliteit voegt u een geschikt montagemedium (met een brekingsindex die nauw aansluit bij de olie en het dekglas van de microscoopobjectief, zie materiaaltabel) toe aan het kanaal.
      1. Breng met behulp van een micropipet een minimale hoeveelheid van een zacht ingestelde antifade-montage aan op elke poort van het microfluïdische kanaal, zodat het bodemoppervlak volledig bedekt is en er geen bellen worden opgesloten in het gewenste beeldvormingsgebied25. Sluit de uiteinden van het kanaal af en controleer de integriteit van de cellaag door te observeren onder een brightfield-microscoop.
    6. Voer stap 1.4.3-1.4.5 voor beide microfluïdische kanalen parallel uit.
      OPMERKING: Afbeeldingscellen zo snel mogelijk na het kleuren voor maximale beeldkwaliteit. Als fotobleaching optreedt of langdurige opslag gewenst is, kunnen andere montagemedia met antifade- of monsterconserverende eigenschappen worden gebruikt. Merk op dat hard uithardende montagemedia de 3D-structuur van de cellen en, bij uitbreiding, de cellaag zullen vervormen; Om deze reden hebben zacht uithardende montagemedia de voorkeur26.
  5. Afbeeldingscellen in het microfluïdische kanaal volgen de onderstaande stappen.
    1. Pas de instellingen van de confocale microscoop (zie materiaaltabel) aan, inclusief laservermogens-, versterkings-, offset- en scanparameters zoals scansnelheid, scangebied, scanindeling, resolutie en pinholediameter27.
    2. Test de beeldlocatie door referentiescans en Z-stacks te maken totdat aan de gewenste beeldparameters en -voorwaarden is voldaan. Inbelparameters bij sequentieel hogere vergrotingsdoelen totdat het 40x olie-onderdompelingsobjectief is bereikt en geoptimaliseerd28.
    3. Gebruik de basisplaat van de stroomarray als referentie en construeer Z-stacks op vijf locaties, op de potentiële locatie van de eerste elektrode aan de inlaatzijde, halverwege tussen het midden en de vorige locatie, het midden, halverwege tussen het midden en de locatie van de laatste elektrode (aan de uitlaatzijde) en bij de laatste elektrode, zoals aangegeven in figuur 2.
  6. Voer beeldverwerking en gegevensanalyse uit.
    1. Exporteer XZ- en YZ-doorsneden met behulp van het confocale microscoopsoftwarepakket (zie materiaaltabel).
    2. Meet met behulp van beeldverwerkingssoftware (zie materiaaltabel) met randdetectiemogelijkheden (drempelwaarde 15,0) het totale afbeeldingsgebied in pixels met het gereedschap Toverstaf buiten de afbeelding en vervolgens het gebied met uitzondering van de totale doorsnede van de cellaag in pixels met het gereedschap Toverstaf in het gedeelte van de afbeelding buiten de cellaag29.
    3. Trek met behulp van gegevensverwerkende software (zie Materiaaltabel) de pixelwaarde van het buitengebied af van de pixelwaarde van het totale gebied om de pixelwaarde van de dwarsdoorsnede te vinden.
    4. Converteer pixelwaarden voor dwarsdoorsneden naar μm2-waarden door pixelwaarden te vermenigvuldigen met het kwadraat van de μm/pixelwaarde, zoals aangegeven in de microscoopsoftware voor het specifieke beeld (0,31 μm/pixel voor Z-stacks genomen in 1024p-resolutie zonder zoom op een 40x olie-immersielens).
    5. Bereken gemiddelden en standaarddeviaties van gegevens en grafiekresultaten.

Figure 1
Figuur 1: Exploded-view schema van de microfluïdische kanaalconstructie. Het bovenste element is het bovenste gedeelte van de flow array, dunne grijze elementen zijn plakstrips, dunne blauwe elementen zijn mylar spacers en het onderste element is het rechthoekige afdekglas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Vijf beeldvormingslocaties langs het consistent laagproducerende gebied van het microfluïdische cultuurkanaal. Beeldvormingslocaties zijn als volgt: inlaatzijde, in de buurt van waar de eerste elektrode zich op de intacte stroomarray zou bevinden; halverwege tussen de inlaatlocatie en het midden van het kanaal; midden van het kanaal; halverwege tussen het midden en de locatie aan de uitlaatzijde en de uitlaatzijde, in de buurt van waar de laatste elektrode zich op de intacte stroomarray zou bevinden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Celkweek in het acht-well chambered coverglass

  1. Voer een voorbehandeling uit van het afdekglas met acht putkamers.
    1. Verkrijg een steriel acht-well chambered coverglass vervaardigd met een #1.5 coverglass en celhechtingsverhogende oppervlaktebehandeling (Figuur 3, zie Tabel met materialen).
    2. Behandel met behulp van steriele techniek het oppervlak van kweekputten met 2,0 μg / ml humaan fibronectine in PBS en incubeer gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C19.
  2. Voer celkweek uit in het kamervormig afdekglas volgens de onderstaande stappen.
    1. Breng in een steriele laminaire stroomkap 0,5 ml porties van oplossingen van NCI-H441-cellen gelijkmatig over in RPMI 1640-medium met 10% FBS bij volumetrische dichtheden van 81.000, 162.000 en 324.000 cellen / ml om de kweekputten te zaaien met oppervlaktedichtheden van respectievelijk 45.000, 90.000 en 180.000 cellen / cm2. Controleer of de cellen gelijkmatig zijn verdeeld in de putten met behulp van een brightfield-microscoop.
    2. Kweekcellen gedurende 24 uur, 48 uur en 96 uur bij 37 °C met 5% CO2, waarbij de media dagelijks worden vervangen.
  3. Voer formaldehydefixatie uit in het afdekglas met acht putkamers.
    LET OP: Formaldehyde is giftig en moet worden behandeld in een geschikte chemische zuurkast21.
    1. Bereid in een chemische zuurkast formaldehyde-oplossingen door twee porties van 4% formaldehyde in PBS (methanolvrij) te maken, waarbij de eerste wordt verdund tot een concentratie van 1% formaldehyde en de andere tot 2% formaldehyde met behulp van dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS; met Ca 2 + en Mg2 +) als verdunningsmiddel.
    2. Verwijder het afdekglas met acht kweekkamers uit de incubator en plaats het in de chemische zuurkast.
    3. Was cellen voorzichtig met 0,5 ml DPBS met behulp van een micropipette door langzaam vloeistof in te brengen langs het bovenste deel van de hoek van elke put.
    4. Verwijder bestaande vloeistof in elke put door deze langzaam uit de hoek van de putten te halen met behulp van een micropipette. Gebruik de vloeistofinbrengmethode (stap 2.3.3) en breng 0,5 ml 1% fixatieve oplossing in elke put en laat deze 5 minuten22 zitten.
    5. Verwijder de bestaande vloeistof in elke put met behulp van de vloeistofextractiemethode die wordt vermeld in stap 2.3.4. Gebruik de vloeistofinbrengmethode die wordt vermeld in stap 2.3.3, breng 0,5 ml 2% fixatieve oplossing in elke put en laat deze 15 minuten zitten.
    6. Was cellen met behulp van de vloeistofintroductie- en extractiemethoden (stappen 2.3.3 en 2.3.4) door 0,5 ml vers DPBS in elke put in te brengen en te verwijderen in drie afzonderlijke instanties gedurende elk 5 minuten.
  4. Voer beits-, permeabilisatie- en montagemedia-toevoeging uit in het afdekglas met acht putkamers.
    1. Bereid 0,1% saponine-oplossing door 1 mg saponine per ml DPBS toe te voegen en voorzichtig vortex om23 te mengen.
    2. Voeg aan de 0,1% saponine-oplossing twee druppels (0,1 ml) elk van een F-actinekleurend falloïdine-reagens en een kernkleurend Hoechst-reagens per ml saponine-oplossing toe. Houd de bereide oplossing uit de buurt van licht door af te dekken met aluminiumfolie24.
    3. Breng 0,2 ml beits- / permeabilisatieoplossing aan in elke put en bedek het kamervormige afdekglas met aluminiumfolie voordat u het 30 minuten op kamertemperatuur laat zitten.
    4. Spoel de vlek-/permeabiliserende oplossing tweemaal uit met 0,5 ml DPBS.
    5. Voor een betere beeldkwaliteit voegt u een geschikt montagemedium (met een brekingsindex die nauw aansluit bij de olie en het dekglas van de microscoop) toe aan de putten.
      1. Breng met behulp van een micropipet een minimale hoeveelheid van een zacht ingestelde antifade-montage aan in elke put, zodat het bodemoppervlak volledig bedekt is en er geen bubbels worden opgesloten in het gewenste beeldvormingsgebied25. Controleer de integriteit van de cellaag door te observeren onder een brightfield-microscoop.
        OPMERKING: Afbeeldingscellen zo snel mogelijk na het kleuren voor maximale beeldkwaliteit. Als fotobleaching optreedt of langdurige opslag gewenst is, kunnen andere montagemedia met antifade- of monsterconserverende eigenschappen worden gebruikt. Merk op dat hard uithardende montagemedia de 3D-structuur van de cellen en, bij uitbreiding, de cellaag zullen vervormen, dus zacht uithardende montagemedia hebben de voorkeur26.
  5. Voer beeldvorming uit in het acht-well chambered coverglass.
    1. Pas de confocale microscoopinstellingen aan, inclusief laservermogen, versterking, offset en scanparameters zoals scansnelheid, scangebied, scanformaat, resolutie en pinholediameter27.
    2. Test de beeldlocatie door referentiescans en Z-stacks te maken totdat aan de gewenste beeldparameters en -voorwaarden is voldaan. Inbelparameters bij sequentieel hogere vergrotingsdoelen totdat het 40x olie-onderdompelingsobjectief is bereikt en geoptimaliseerd28.
    3. Construeer Z-stacks van drie willekeurige locaties in elke match-up van zaaidichtheid / cultuurduur.
  6. Voer beeldverwerking en gegevensanalyse uit.
    1. Exporteer XZ- en YZ-doorsneden met behulp van het confocale microscoopsoftwarepakket.
    2. Meet met behulp van een beeldverwerkingssoftware met randdetectiemogelijkheden (drempelwaarde 15,0) het totale afbeeldingsgebied in pixels met het gereedschap Toverstaf buiten de afbeelding en vervolgens het gebied met uitzondering van de totale doorsnede van de cellaag in pixels met het gereedschap Toverstaf in het gedeelte van de afbeelding buiten de cellaag29.
    3. Trek met behulp van een gegevensverwerkende software de pixelwaarde van het buitengebied af van de pixelwaarde van de totale oppervlakte om de pixelwaarde van de dwarsdoorsnede te vinden.
    4. Converteer pixelwaarden voor dwarsdoorsnedes naar μm2-waarden door pixelwaarden te vermenigvuldigen met het kwadraat van de μm/pixelwaarde zoals aangegeven in de microscoopsoftware voor het specifieke beeld (0,31 μm/pixel voor Z-stacks genomen in 1024p-resolutie zonder zoom op een 40x olie-immersielens).
    5. Bereken gemiddelden en standaarddeviaties en grafiekresultaten.

Figure 3
Figuur 3: Diagram van het achtputvormige afdekglas dat wordt gebruikt voor het experiment, de kleuring en het beeldvormingsexperiment met vaste put, waarin de effecten van de initiële celzaaidichtheid en de kweekduur op de vorming van cellagen worden vergeleken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De gepresenteerde methode maakt de visualisatie mogelijk van epitheelcellagen gekweekt in microfluïdische cultuurkanalen en gebruikt een demonstratie in traditionele celkweekomgevingen met vaste put als validatie. De verkregen beelden bestaan op een spectrum van kwaliteit, signaalintensiteit en cellulaire doelspecificiteit. Succesvolle afbeeldingen zullen een hoog contrast vertonen, waardoor beeldanalyse en kwantificering van gegevens mogelijk is voor latere statistische evaluatie. Niet-succesvolle afbeeldingen zijn vaag, wazig, wazig of anderszins onbruikbaar voor subjectieve of kwantitatieve evaluatie. Sommige afbeeldingen kunnen geschikt zijn voor subjectieve laagkarakteristiekbepaling, terwijl ze nog steeds van onvoldoende kwaliteit zijn voor kwantitatieve analyse. De mate en zorg waarmee het protocol wordt gevolgd, zal dus rechtstreeks van invloed zijn op de geschiktheid van een bepaald beeld om te dienen als een gegevensbron voor statistische analyse.

Figuur 4 toont het succesvolle gebruik van de techniek in de context van een microfluïdische dynamische cultuuromgeving en toont beeldacquisitie bij de in- en uitlaat van twee microfluïdische apparaten. Figuur 4A,B geeft voorbeelden van lagen die gedurende 24 uur zijn gekweekt, en figuur 4C,D geeft voorbeelden van lagen die gedurende 48 uur zijn gekweekt. Figuur 5 illustreert de bijbehorende gegevens die zijn verzameld uit het microfluïdische kanaalexperiment, waarbij drie monsters zijn opgenomen van elk van de vijf microfluïdische kanaalbeeldvormingslocaties die in figuur 2 zijn aangegeven voor elke kweekduur. Foutbalken geven standaarddeviaties aan.

Figuur 6 toont een 2D-afbeelding van het XY-vlak in het midden van het microfluïdische kanaal en figuur 7 toont een 3D-weergave van dezelfde locatie met dieptekleurcodering. Figuur 8 toont succesvolle beeldacquisitie binnen een experiment met een dichtheidsduur dat de effecten van de initiële celzaaidichtheid en kweekduur op de vorming van NCI-H441-cellagen in de omgeving met acht kamers bedekt glas analyseert. Figuur 8A-C geeft cultuurduur aan van respectievelijk 24 uur, 48 uur en 96 uur. Figuur 8X-Z geeft initiële celzaaidichtheden aan van respectievelijk 180.000, 90.000 en 45.000 cellen/cm2. Figuur 9 toont kwantitatieve gegevens verzameld uit het acht-well chambered coverglass-experiment, inclusief monsters van drie locaties in elke match-up tussen dichtheid en duur. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties en p-waardetests werden uitgevoerd om statistisch significante verschillen tussen schijnbaar nauwe waarden te bepalen.

Deze twee representatieve experimenten binnen de dynamische microfluïdische en statische achtputomgevingen zijn verschillende use-case voorbeelden die aantonen hoe de techniek experimentele bevindingen kan contextualiseren door de aan- of afwezigheid van fysiologisch relevante monolagen visueel te bevestigen.

Figure 4
Figuur 4: NCI-H441-cellagen gekweekt in het microfluïdische kanaal gedurende 24 en 48 uur, afgebeeld op de locaties aan de inlaat- en uitlaatzijde zoals afgebeeld in figuur 2. (A) 24 uur, inlaatzijde. B) 24 uur, uitlaatzijde. C) 48 h, inlaatzijde. D) 48 uur, uitlaatzijde. Blauw vertegenwoordigt de kernkleuring en groen vertegenwoordigt de kleuring van filamenteuze actine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Grafische weergave van de gegevens verzameld tijdens het 24-48 h microfluïdische kanaal beeldvormingsexperiment. Dit omvat zes dwarsdoorsnedemonsters van elk van de vijf locaties langs de relevante lengte van het microfluïdische kanaal (zoals weergegeven in figuur 2). Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: 2D-opname genomen in het XY-vlak op een centrale locatie binnen het microfluïdische kanaal. Blauw vertegenwoordigt de kernkleuring en groen vertegenwoordigt de kleuring van filamenteuze actine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: 3D-model van dezelfde microfluïdische kanaallocatie als figuur 6. De kleurcodering geeft dieptegegevens weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: NCI-H441 cellagen gekweekt in het acht-well chambered coverglass. Gedurende 24 h (A), 48 h (B) en 96 h (C) bij initiële zaaidichtheden van 180.000 (X), 90.000 (Y) en 45.000 (Z) cellen/ cm 2. Blauw vertegenwoordigt de kernkleuring en groen vertegenwoordigt de kleuring van filamenteuze actine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Grafische weergave van de gegevens verzameld tijdens het dichtheidsduur achtputcultuurexperiment. Dit omvat zes cross-sectionele gebiedsmonsters van elke match-up tussen dichtheid en duur. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gepresenteerde protocol beschrijft de cultuur, crosslinking fixatie, kleuring, permeabilisatie en confocale microscopische visualisatie van NCI-H441 menselijke longepitheelcellen in de dynamische omgeving van een eenkanaals microfluïdische stroomarray, evenals in de statische omgeving van een traditioneel acht-goed gekamerd coverglas. Bij elk microfluïdisch celkweekprotocol zijn de stroomomstandigheden van de celkweekmedia van het grootste belang, omdat de snelle stroom het potentieel heeft om de cellen weg te spoelen of de normale assemblage van de celmonolaag te verstoren. Ondertussen heeft low-rate flow het potentieel om de cellaag te "verhongeren" of te "verstikken" (onvoldoende beschikbaarheid van voedingsstoffen en zuurstof, respectievelijk) als gevolg van de diffusiebeperkingen die worden opgelegd door de ondoordringbare aard van het microfluïdische kanaal en de stroomkarakteristieken30. Door te beginnen met een wachttijd van 10 minuten (waarin cellen in dezelfde media blijven hangen die oorspronkelijk het kanaal vulden), vervolgens door te gaan naar een stroomsnelheid van 0,2 μL / min, voordat ze uiteindelijk oplopen tot 10 μL / min in de loop van 4 uur, worden deze concurrerende behoeften in evenwicht gebracht om zowel de celtrouw als de overleving te bevorderen.

Een andere cruciale stap in het protocol is de juiste voorbereiding van het microfluïdische kanaal, inclusief constructie en voorbehandeling. Er moet voor worden gezorgd dat het afdekglas op de juiste manier op de kamerconstructie is gemonteerd om lekkage en mogelijke verontreiniging te voorkomen. Een goede bevestiging van het afdekglas is ook noodzakelijk om ervoor te zorgen dat de kanaalhoogte consistent en nauwkeurig wordt gereproduceerd tussen opeenvolgende proeven met verschillende geconstrueerde eenheden. Kleine variabiliteit kan worden geïntroduceerd door de tolerantie in dikte van de gebruikte plakstrips en de relatieve samendrukbaarheid. Het minimaliseren van eventuele variabiliteit zal helpen bij de consistentie van experimentele resultaten. Een goede voorbehandeling van het geconstrueerde kanaal is belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen zich kunnen hechten aan en proliferatie op het glasoppervlak kunnen initiëren. Ultrasone reiniging van het glas verbetert de hechting van Poly-D-Lysine en bevordert de hechting aan fibronectine. Het toevoegen van fibronectine, een glycoproteïne dat van nature wordt gesynthetiseerd en uitgescheiden door menselijke epitheelcellen, bevordert verder de hechting van de NCI-H441-cellen aan het oppervlak van het dekglas, waardoor een normale ontwikkeling van de celmonolaag mogelijk wordt31.

Verder is een van de belangrijkste aspecten van dit protocol de beeldvormingslocatie. Ondanks een zorgvuldig gecontroleerde voorbereiding, vanwege het kolomvormige volume dat beschikbaar is in de regio's van de twee kanaalopeningen, zullen er meer cellen aanwezig zijn op het afdekglasoppervlak in het gebied direct onder en naast deze openingen, zelfs wanneer de juiste celkweektechnieken worden gevolgd. Om deze reden moeten gebieden in de buurt van de openingen niet worden beschouwd als onderdeel van de "normale" gekweekte cellaag, omdat daar aanzienlijke meerlagige / celstapeling zal optreden. In plaats daarvan is het centrale gebied van het microfluïdische kanaal een geschikt gebied om in beeld te brengen, omdat deze locatie niet wordt gestoord door de fout die wordt opgelegd door kanaalhoogtevariatie in de buurt van de openingen. De elektrodelocaties op de stroomarray kunnen worden gebruikt om beeldvormingslocaties te begeleiden, en als vuistregel geldt dat alle scans die bedoeld zijn om lagen vast te leggen die echt representatief zijn voor de microfluïdische kanaalomstandigheden, moeten worden genomen op analoge locaties binnen de grenzen van de twee verste uit elkaar liggende elektroden op de stroomarray. Bovendien is in het beschreven protocol het 40x-vergrotingsobjectief opgegeven voor gebruik; Dit kan echter worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker. 40x vergroting werd gekozen als de optimale vergroting vanwege het vermogen om hoge resolutie, hoge vergroting beeldvorming te bieden met behoud van een voldoende aantal cellen om te dienen als een statistisch geldig monster.

Een wijziging die kan worden aangebracht in het microfluïdische kanaal omvat het wijzigen van de kanaalhoogte, die kan worden bereikt door het aantal afstandhouders en kleefstoffen te variëren die worden gebruikt om het microfluïdische kanaal te construeren. Verandering van de kanaalhoogte zal waarschijnlijk het aanpassen van de stroomparameters vereisen om ervoor te zorgen dat de schuifspanning geen cellen verwijdert tijdens het voeren. Als zodanig heeft elke variatie in kanaalhoogte invloed op de ideale beginsnelheid, snelheid van opvoeren en uiteindelijke snelheid van mediastroom. Het beschreven protocol in dit artikel kan dienen als een middel waarmee geschikte stroomsnelheden experimenteel kunnen worden afgeleid, in combinatie met indirecte methoden zoals ECIS. Bovendien kunnen stroomsnelheden worden aangepast aan de behoeften van verschillende cellijnen, die mogelijk moeten worden aangepast om optimale omstandigheden vast te stellen. Een andere wijziging die kan worden aangebracht, met enkele toevoegingen aan de stappen in dit protocol, is om de use-case van de beschreven techniek uit te breiden tot buiten de relatieve vergelijking van het dwarsdoorsnedegebied van cellagen. Met de juiste kalibratie met behulp van microsferen of microbeads van bekende afmetingen kunnen nauwkeurige volumetrische, topologische en absolute dwarsdoorsnedemetingen worden uitgevoerd. Kalibratie met behulp van een referentieobject is in dit geval noodzakelijk vanwege de beperkte Z-resolutie van de confocale microscoop en het potentieel voor over- of onderbemonstering in de Z-dimensie vanwege de handmatige controle over de Z-stack stapgrootte die confocale scansystemen bieden32.

Een beperking van dit protocol is het ontbreken van echte volumetrische metingen als gevolg van het ontbreken van verticale kalibratiestappen. De hierboven genoemde kalibratie en de verificatietechniek met behulp van fluorescerende microbeads van bekende afmetingen kunnen worden gebruikt voor levensechte schaling. Bovendien omvat het huidige protocol het gebruik van vooraf voorbereide, gebruiksklare vlekken. Immunofluorescente kleuring met behulp van primaire en secundaire antilichamen vereist vaak een meerdaags protocol dat meer betrokken is dan het protocol dat in dit artikel wordt besproken. Het is echter waarschijnlijk mogelijk om immunofluorescente kleuring op deze manier te gebruiken, hoewel enige experimenten nodig kunnen zijn om de workflow te optimaliseren. Gezien de extra stappen die betrokken zijn bij immunofluorescente kleuringsprotocollen, moet ervoor worden gezorgd dat de gekweekte cellaag tijdens de talrijke wasstappen niet wordt afgeschud, omdat dit de eigenschappen van de uiteindelijk geëvalueerde cellaag kan veranderen en daarom eventuele conclusies die zouden volgen ongeldig kan maken. Verdere ontwikkelingen van deze techniek kunnen automatisering van de beeld- en data-analyses omvatten, inclusief region-of-interest (ROI) detectie en kwantificering voor de cross-sectionele gebiedsbepaling. Bovendien kan het uitbreiden van deze techniek naar verschillende intra- en extracellulaire doelstructuren (misschien kleuring voor doelen zoals tight-junction-eiwitten) de use-case van deze methode verbreden naar 3D-colokalisatie in microfluïdische celcultuurapparaten.

Om de meest fysiologisch representatieve cellagen te produceren, moeten longepitheelcellen worden gekweekt in microfluïdische kanalen met een lucht-vloeistofinterface (ALI) aan het kweekoppervlak, wat meestal wordt bereikt met behulp van polydimethylsiloxaan (PDMS), een flexibel materiaal dat doorlaatbaar wordt gemaakt door de introductie van poriën op μm-schaal. ALI-kweekomstandigheden maken de vorming van cellagen mogelijk die het meest lijken op de fysiologische kenmerken van het in vivo longepitheel33. Hoewel het technisch mogelijk is, is het gebruik van ECIS in een ALI-kweekomgeving met een PDMS-cultuuroppervlak in een dynamische microfluïdische omgeving voor de meeste onderzoekers onpraktisch en ontoegankelijk, omdat er geen commercieel beschikbare apparaten zijn voor een dergelijke complexe celkweekassemblage34. Een reden voor deze moeilijkheid kan de paradoxale behoefte zijn aan een doorlatend cultuuroppervlak dat nog steeds in staat is om te fungeren als een vaste elektrode voor ECIS-metingen. Als zodanig bestaat er momenteel behoefte aan een methode om de kenmerken en fysiologische relevantie van cellagen die zijn gekweekt in zuurstofondoordringbare kweekomgevingen zoals die aanwezig zijn in ECIS-flowarrays, visueel te verifiëren.

Deze methode breidt de traditionele methode uit om een goede confluentie te garanderen met behulp van tweedimensionale microscopie door 3D-visualisatie mogelijk te maken, wat het aantal cellaagkenmerken dat kan worden waargenomen, gekwantificeerd en geanalyseerd, aanzienlijk verbreedt. Bovendien maakt dit een subjectieve bepaling mogelijk van de aanwezigheid van een monolaag, laaguniformiteit en andere eigenschappen die relevant worden geacht voor experimentele doeleinden. Dit protocol is belangrijk omdat het dient als een middel voor de visuele verificatie en evaluatie van cellagen die worden geproduceerd in veel zuurstofondoordringbare omgevingen, zoals in ECIS-experimenten die barrièrefunctie-eigenschappen evalueren van epitheelcellen die zijn blootgesteld aan atelectrauma. Dit dient ook als een methode die in toekomstig werk kan worden gebruikt om te bepalen of een reeks dynamische microfluïdische cultuuromstandigheden cellagen produceert die relevant en geschikt zijn voor verdere experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Alan Shepardson voor het ontwerpen van het snijpatroon voor de 3M-lijm en mylar-plaat die wordt gebruikt in de microfluïdische kanaalconstructie en voor het testen van de celkweekmediastroomsnelheid en spuitpompprogrammering. Financiering werd geleverd door NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 en de Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Tags

Deze maand in JoVE nummer 185
Voorbereiding en structurele evaluatie van epitheelcelmonolagen in een fysiologisch groot microfluïdisch kweekapparaat
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. … More

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. E., Gaver III, D. P. Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device. J. Vis. Exp. (185), e64148, doi:10.3791/64148 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter