Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Beredning och strukturell utvärdering av epitelcellmonolager i en fysiologiskt dimensionerad mikrofluidisk odlingsanordning

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

Det presenterade protokollet beskriver utvecklingen och användningen av en falloidinbaserad filamentös aktinfärgningsteknik med konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) för att visualisera vidhäftande cellskiktstruktur i mikrofluidiska dynamiska odlingskanaler och traditionella statiska odlingskammare med fasta brunnar. Detta tillvägagångssätt hjälper till att utvärdera cellskiktets sammanflöde, monolagerbildning och skikttjocklekens enhetlighet.

Abstract

In vitro mikrofluidiska experiment har stor potential att avslöja många insikter i de mikrofysiologiska fenomen som förekommer vid tillstånd som akut respiratorisk nödsyndrom (ARDS) och ventilatorinducerad lungskada (VILI). Studier i mikrofluidiska kanaler med dimensioner fysiologiskt relevanta för de terminala bronkiolerna i den mänskliga lungan står dock för närvarande inför flera utmaningar, särskilt på grund av svårigheter att fastställa lämpliga cellodlingsförhållanden, inklusive medieflödeshastigheter, inom en given odlingsmiljö. Det presenterade protokollet beskriver ett bildbaserat tillvägagångssätt för att utvärdera strukturen hos NCI-H441 humana lungepitelceller odlade i en syreogenomtränglig mikrofluidisk kanal med dimensioner fysiologiskt relevanta för de terminala bronkiolerna i den mänskliga lungan. Med hjälp av falloidinbaserad filamentös aktinfärgning avslöjas cellernas cytoskeletala strukturer genom konfokal laserskanningsmikroskopi, vilket möjliggör visualisering av såväl enskilda som skiktade celler. Efterföljande kvantifiering avgör om de cellodlingsförhållanden som används producerar enhetliga monolager som är lämpliga för vidare experiment. Protokollet beskriver cellodling och lagerutvärderingsmetoder i mikrofluidiska kanaler och traditionella fasta brunnsmiljöer. Detta inkluderar kanalkonstruktion, cellodling och nödvändiga förhållanden, fixering, permeabilisering och färgning, konfokalmikroskopisk avbildning, bildbehandling och dataanalys.

Introduction

Akut respiratorisk nödsyndrom (ARDS) är ett akut tillstånd som härrör från förolämpning mot och spridning av skada i lungparenkymet, vilket resulterar i lungödem i alveolerna, otillräckligt gasutbyte och efterföljande hypoxemi1. Detta initierar en cykel av proinflammatorisk cytokinfrisättning, neutrofilrekrytering, toxisk mediatorfrisättning och vävnadsskada, vilket i sig medför ett ytterligare inflammatoriskt svar2. Dessutom kan lungsurfaktant, som stabiliserar luftvägarna och förhindrar skador orsakade av repetitiv rekrytering / derekrytering (R / D), inaktiveras eller på annat sätt göras dysfunktionell av de kemiska processer som inträffar under ARDS, vilket resulterar i ytterligare stress och skada på det omgivande parenkymet3. Om tillräcklig skada uppstår kan mekanisk ventilation vara nödvändig för att säkerställa tillräcklig systemisk syresättning4. Mekanisk ventilation medför emellertid sina egna utmaningar och trauman, inklusive risken för ventilatorinducerad lungskada (VILI), kännetecknad som skada på lungparenkymet orsakad av de mekaniska påfrestningar som åläggs under överinflation (volutrauma) och / eller R/D för luft-vätskegränssnittet i den vätskeockluderade luftvägen (atelectrauma)5. Tryckgradienten som upplevs av epitelceller exponerade för ett luft-vätskegränssnitt (som i en vätskeockluderad bronkiol) i atelectrauma-modellen kan resultera i ett permeabilitets-ursprungligt obstruktivt svar (POOR), vilket leder till en POOR-get-POORer dygdig skadecykel 6,7,8.

In vitro-experiment kan ge insikter i mikroskala om dessa fenomen, men aktuella studier i mikrofluidiska kanalmiljöer med fysiologiskt relevanta dimensioner står inför flera utmaningar9. För det första utgör optimering av cellodlingsförhållanden ett betydande hinder för inträde för cellodlingsforskning i mikrofluidiska miljöer, eftersom det finns en smal skärningspunkt inom vilken medieflödesparametrar, odlingsvaraktighet och andra odlingsförhållanden möjliggör optimal cellskiktbildning. Detta inkluderar diffusionsbegränsningarna som orsakas av den syreogenomträngliga naturen hos den mikrofluidiska kulturkanalhöljet. Detta kräver noggrant övervägande av medieflödesparametrar, eftersom låga flödeshastigheter kan beröva celler syre, särskilt de längst bort från inloppet; Å andra sidan kan höga flödeshastigheter driva celler ut ur odlingskanalen eller resultera i felaktig eller ojämn lagerutveckling. Diffusionsbegränsningar kan åtgärdas genom användning av syregenomsläppliga material såsom polydimetylsiloxan (PDMS) i en ALI-odlingsapparat (luft-vätskegränssnitt). Många konventionella mikrofluidiska odlingskanaler, såsom de i ECIS-systemet (Electric Cell-Substrate Impedance Impedance Sensing), är emellertid till sin natur syreogenomträngliga med tanke på den tillverkade inneslutningens natur10. Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en teknik för att analysera cellskikt odlade i en syreogenomtränglig inneslutning.

Vid jämförelse av odlingsförhållandenas livskraft är observationer av specifika skiktegenskaper, såsom närvaron av ett monolager, yttopologi, sammanflöde och skikttjocklekens enhetlighet, nödvändiga för att bestämma om cellskiktet som produceras av en viss uppsättning odlingsförhållanden uppfyller de önskade specifikationerna och verkligen är relevanta för den experimentella designen. En begränsad utvärdering kan utföras med metoder som ECIS, som använder mätningar av elektrisk potential (spänning) skapad av motstånd mot högfrekvent växelström (AC) (impedans) som införs av elektriskt isolerande membran av celler odlade på guldelektroder inom flödesmatrisen. Genom att modulera frekvensen av AC som appliceras på celler kan specifika frekvensberoende cellulära egenskaper hos cellerna och cellskikten, såsom ytvidhäftningsstyrka, täthetsbildning och cellproliferation eller sammanflöde riktas och undersökas11. Dessa indirekta former av mätningar är emellertid något svåra att tolka vid början av ett experiment och kanske inte kvantifierar alla relevanta aspekter av cellskiktet. Att helt enkelt observera cellskiktet under ett faskontrastmikroskop kan avslöja arten av vissa egenskaper, såsom sammanflöde; Många relevanta egenskaper, såsom närvaron av ett monolager och skikttjocklekens enhetlighet, kräver dock en tredimensionell (3D) utvärdering som inte är möjlig med ljusfält, faskontrast eller fluorescerande mikroskopisk avbildning12.

Syftet med denna studie var att utveckla en filamentös aktinfärgningsteknik för att möjliggöra bildbaserad verifiering av ett monolager och utvärdering av cellskiktets enhetlighet med hjälp av konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM). Filamentöst aktin (F-aktin) ansågs vara ett lämpligt mål för fluoroforkonjugatet, delvis på grund av det sätt som F-aktin tätt följer cellmembranet, vilket möjliggör en visuell approximation av hela cellvolymen13. En annan viktig fördel med att rikta F-aktin är det sätt på vilket färgning av F-aktin visuellt belyser cytoskeletala störningar eller förändringar som orsakas av de spänningar och stammar som cellerna upplever. Tvärbindningsfixering med metanolfri formaldehyd användes för att bevara cellernas morfologi och cellskiktet, eftersom dehydratiserande fixeringsmedel såsom metanol tenderar att platta celler, grovt snedvrida cellskiktet och förändra dess egenskaper14,15.

För att bestämma lagerutvärderingsteknikens förmåga att mildra dessa utmaningar odlades celler i traditionella åtta brunnsodlingskammare såväl som i mikrofluidiska kanaler för att utvärdera skillnaderna, om några, i cellskikten som producerades. För fasta kulturbrunnar användes åtta brunnskammare täckglasenheter. För mikrofluidisk odling optimerades flödesmatriser (kanallängd 50 mm, bredd 5 mm, djup 0,6 mm) för att odla odödliga humana lungepitelceller (NCI-H441) i en miljö med dimensioner fysiologiskt relevanta för de terminala bronkiolerna närvarande i andningszonen i den mänskliga lungan16. Även om detta protokoll utvecklades med odlingsmiljön för ECIS-flödesmatriser i åtanke, kan det tillämpas på alla syreogenomträngliga dynamiska odlingsmiljöer för vilka utvärdering av odlade cellskiktegenskaper eller odlingsförhållanden är nödvändig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NCI-H441 human epitelial lungcellinje användes för den aktuella studien (se materialtabell).

1. Cellodling i mikrofluidisk kanal

  1. Tillverka den mikrofluidiska kanalen och utför förbehandlingen enligt stegen nedan.
    1. Skaffa en enkanals flödesmatris (se materialtabell) och separera den övre delen från polykarbonatbasplattan.
    2. Skaffa ett #1,5 rektangulärt täckglas (tjocklek 0,17 mm) med måtten 60 mm x 22 mm. Rengör täckglasets ytor i ett ultraljudsbad och behandla ena sidan med en 0,1 mg / ml lösning av poly-D-lysin vid rumstemperatur i 5 minuter innan torkning vid 60 ° C i 30 min.
    3. Fäst ett 0,13 mm tjockt dubbelhäftande lim (se Materialförteckning), laserskuren för att passa måtten på flödesmatrisens topp och flödeskanalen (50 mm längd, 5 mm bredd), på flödesmatrisens topp, var noga med att exakt rikta in kanalutskärningarna17.
    4. Fäst en 0,1 mm tjock mylardistans (se Materialtabell), laserskuren för att passa måtten på flödesmatrisens topp och flödeskanalen, på den självhäftande remsan, var noga med att exakt rikta in kanalutskärningarna.
    5. Upprepa steg 1.1.3 och 1.1.4 tills önskad kanalhöjd har uppnåtts (använd till exempel två distanser och tre självhäftande remsor för en kanalhöjd på 0,6 mm).
    6. Fäst ett rektangulärt täckglas på den nedersta självhäftande remsan med den Poly-D-lysinbehandlade sidan vänd mot häftämnet. När monteringen är klar, enligt figur 1, applicera ett fast och lika tryck på toppen och botten av konstruktionen och håll den i 1 min.
      OBS: Konstruktionen av kanalhöljet, inklusive täckglas, lim, distanser och flödesmatristopp, är nu klar.
    7. Skölj kanalen med avjoniserat vatten med en spruta samtidigt som du kontrollerar om det finns läckor.
    8. Sterilisera kanalhöljet i en ultraviolett (UV) sterilisator i 30 min18.
    9. Behandla kanalen med 2,0 μg/ml humant fibronektin (se materialtabell) med steril teknik i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera i minst 30 minuter vid 37 °C19.
  2. Utför cellodling i mikrofluidikkanalen enligt stegen nedan.
    1. I en steril laminär flödeshuv, använd en mikropipett för att överföra en jämn suspension av NCI-H441-celler i RPMI 1640-medium med 10% fetalt bovint serum (FBS) (se materialförteckning) för att fröa två mikrofluidiska kanaler, var och en med celler med en ytdensitet på 150 000 celler / cm2.
      1. För 50 mm x 5 mm x 0,6 mm kanaler, använd 0,25 ml av en 2,5 x 106 celler / ml suspension för att fylla varje kanal, liksom en del av portarna. Kontrollera att cellerna har fördelats jämnt inom kanalerna med hjälp av ett ljusfältmikroskop.
    2. Odla de två kanalerna under 24 respektive 48 timmar vid 37 °C med 5 %CO2 med hjälp av en programmerbar sprutpump (se materialförteckning), dra ut förbrukade medier från kanalen och färska medier till kanalen från en steril mediebehållare fäst vid kanalinloppet bestående av en 20 ml uppskuren spruta täckt med paraffinfilm.
      1. Efter en väntetid på 10 minuter efter cellsådd förs nya medier in från behållaren genom kanalen med en variabel flödeshastighet som börjar vid 0,2 μl/min och ökar till 10 μl/min i 4 timmar, med bibehållen hastighet därefter20.
        OBS: Denna variabla flödeshastighet ger odlingsförhållanden som gör att celler (1) gravitationellt kan sedimentera till odlingsytan, (2) fästa vid odlingsytan och (3) bilda ett konfluent monolager.
  3. Utför cellfixering inuti mikrofluidiska kanaler med formaldehydlösning.
    VARNING: Formaldehyd är giftigt och måste hanteras i en lämplig kemisk dragskåp21.
    1. I en kemisk dragskåp, förbered formaldehydlösningar genom att använda 4% formaldehyd i PBS (metanolfri) (se materialförteckning) för att skapa två 4 ml portioner, späd den första till en koncentration av 1% formaldehyd och den andra till 2% formaldehyd med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS; med Ca 2+ och Mg2+) som utspädningsmedel. Överför formaldehydlösningar till separata 5 ml sprutor och märk därefter. Dra upp 20 ml DPBS i en separat 20 ml spruta.
    2. Ta bort mikrofluidiska kanaler från odlingsapparaten och placera dem i den kemiska dragskåpet.
    3. Montera fixerings- och färgningsapparaten.
      1. Fäst ett 10 cm segment av överföringsslangar på sidoporten på en trevägs stoppkran via ett hanlås till slangtaggadaptern (se Materialtabell) och anslut sedan kranen till flödesmatrisens inloppsport.
      2. Fäst sedan ytterligare ett segment av överföringsslangen på utloppsporten på flödesmatrisen med samma typ av slangbarbadapter.
      3. Slutligen säkra de fria ändarna på båda överföringsrören i en kemisk och biologisk risk-lämplig avfallsbehållare, såsom ett märkt tomt 50 ml koniskt centrifugrör.
    4. Vrid stoppkranen för att blockera flödesmatrisens inloppsport och spola avfallsledningen med DPBS. Vrid sedan stoppkranen för att blockera avfallsledningen och tvätta långsamt cellerna med 2 ml DPBS. Upprepa spolningssteget med den nya lösningen varje gång. En ny lösning (eller koncentration av lösning) införs i kanalen.
    5. Tryck långsamt 2 ml 1% fixativ lösning genom kanalen och låt sedan sitta i 5 min22.
    6. Tryck långsamt 2 ml 2% fixativ lösning genom kanalen och låt sedan sitta i 15 minuter.
    7. Tvätta cellerna genom att långsamt införa 2 ml färsk DPBS till kanalen i tre separata fall (5 min vardera).
    8. Slutför steg 1.3.3-1.3.7 för båda mikrofluidkanalerna parallellt.
  4. Färga, permeabilisera och tillsätt monteringsmedia till cellerna i mikrofluidkanalen.
    1. Bered 0,1% saponinlösning genom att tillsätta 1 mg saponin (se materialtabell) per ml DPBS för att producera 4 ml lösning och försiktigt virvel för att blanda23. Dra upp 8 ml DPBS i en 20 ml spruta.
    2. Tillsätt ett F-aktinfärgande falloidinreagens och ett Hoechst-reagens med kärnfärgning (se materialtabell) till 0,1 % saponinlösning vid två droppar (0,1 ml) av varje reagens per ml saponinlösning. Håll beredd färgnings-/permeabiliseringslösning borta från ljus genom att täcka med aluminiumfolie24.
    3. Spola ledningen med en liten mängd färgnings-/permeabiliseringslösning (enligt beskrivningen i steg 1.3.4), för sedan in 2 ml av lösningen i mikrofluidkanalen och täck kanalen med aluminiumfolie innan du låter den sitta i rumstemperatur i 30 minuter.
    4. Spola ut färgnings-/permeabiliseringslösningen två gånger med 2 ml DPBS i 5 minuter per spolning.
    5. För bättre bildkvalitet, lägg till ett lämpligt monteringsmedium (med ett brytningsindex som nära matchar mikroskopobjektivoljan och täckglaset, se Materialförteckning) i kanalen.
      1. Använd en mikropipett och för in en minimal mängd av ett mjukt inställt antifade-monteringsmedel till varje port i mikrofluidkanalen, vilket säkerställer att bottenytan är helt täckt och inga bubblor fångas inom önskat bildområde25. Försegla kanalens ändar och verifiera cellskiktets integritet genom att observera under ett ljusfältmikroskop.
    6. Slutför steg 1.4.3-1.4.5 för båda mikrofluidkanalerna parallellt.
      Bildceller så snart som möjligt efter färgning för maximal bildkvalitet. Om fotoblekning sker eller långvarig lagring önskas kan andra monteringsmedier med antifade eller provbevarande egenskaper användas. Observera att hårdhärdande monteringsmedier kommer att snedvrida cellernas 3D-struktur och i förlängningen cellskiktet; Av denna anledning är mjuka monteringsmedier att föredra26.
  5. Bildceller i mikrofluidikkanalen enligt stegen nedan.
    1. Justera inställningarna för konfokalmikroskopet (se Materialtabell), inklusive lasereffekt, förstärkning, förskjutning och skanningsparametrar som skanningshastighet, skanningsområde, skanningsformat, upplösning och håldiameter27.
    2. Testa bildplatsen genom att ta referensskanningar såväl som Z-staplar tills önskade bildparametrar och villkor har uppfyllts. Uppringningsparametrar vid sekventiellt högre förstoringsmål tills målet på 40x nedsänkning i olja har uppnåtts och optimerats28.
    3. Med hjälp av basplattan för flödesmatrisen som referens konstruerar du Z-staplar på fem platser, på den avsedda platsen för den första elektroden på inloppssidan, halvvägs mellan centrum och föregående plats, centrum, halvvägs mellan mitten och platsen för den sista elektroden (på utloppssidan) och vid den sista elektroden, som visas i figur 2.
  6. Utföra bildbehandling och dataanalys.
    1. Exportera XZ- och YZ-tvärsnitt med hjälp av programvarupaketet för konfokalmikroskop (se Materialförteckning).
    2. Använd ett bildbehandlingsprogram (se Materialförteckning) med kantdetekteringsfunktioner (tröskelvärde 15,0) och mät den totala bildytan i pixlar med hjälp av trollstavsverktyget utanför bilden, och sedan området exklusive cellskiktets totala tvärsnittsarea i pixlar med hjälp av trollstavsverktyget i den del av bilden som ligger utanför celllagret29.
    3. Använd databehandlingsprogram (se Materialförteckning) och subtrahera pixelvärdet för det yttre området från pixelvärdet för den totala arean för att hitta pixelvärdet för tvärsnittsarean.
    4. Konvertera pixelvärden för tvärsnittsarea till μm2-värden genom att multiplicera pixelvärden med kvadraten på μm/pixelvärdet, vilket indikeras i mikroskopprogramvaran för den specifika bilden (0,31 μm/pixel för Z-staplar tagna i 1024p-upplösning utan zoom på ett 40x olje-nedsänkningsobjektiv).
    5. Beräkna medelvärden och standardavvikelser för data och grafresultat.

Figure 1
Figur 1: Sprängskiss av den mikrofluidiska kanalkonstruktionen. Det övre elementet är den övre delen av flödesmatrisen, tunna grå element är självhäftande remsor, tunna blå element är mylardistanser och bottenelementet är det rektangulära täckglaset. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Fem avbildningsplatser längs den konsekvent lagerproducerande regionen av den mikrofluidiska kulturkanalen. Bildplatserna är följande: inloppssidan, nära där den första elektroden skulle vara på den intakta flödesmatrisen; halvvägs mellan inloppssidan och kanalens mitt; mitten av kanalen; halvvägs mellan mitten och utloppssidans placering och utloppssidan, nära där den sista elektroden skulle vara på den intakta flödesmatrisen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Cellodling i det åtta brunnar stora kammartäckglaset

  1. Utför förbehandling av det åtta brunnskammare täckglaset.
    1. Skaffa ett sterilt åtta-brunnskammar täckglas tillverkat med en # 1.5 täckglas och cellvidhäftningsökande ytbehandling (figur 3, se materialtabell).
    2. Behandla odlingsbrunnarnas yta med steril teknik med 2,0 μg/ml humant fibronektin i PBS och inkubera i minst 30 minuter vid 37 °C19.
  2. Utför cellodling i kammade täckglas enligt stegen nedan.
    1. I en steril laminär flödeshuv, överför 0,5 ml delar av lösningar av NCI-H441-celler jämnt suspenderade i RPMI 1640-medium med 10% FBS vid volymetriska densiteter på 81 000, 162 000 och 324 000 celler / ml för att fröa odlingsbrunnarna vid ytdensiteter på 45 000, 90 000 respektive 180 000 celler / cm2. Kontrollera att cellerna har fördelats jämnt i brunnarna med hjälp av ett ljusfältmikroskop.
    2. Odlingsceller i 24 timmar, 48 timmar och 96 timmar vid 37 °C med 5%CO2, som ersätter media dagligen.
  3. Utför formaldehydfixering i det åtta brunnar kammade täckglaset.
    VARNING: Formaldehyd är giftigt och måste hanteras i en lämplig kemisk dragskåp21.
    1. Förbered formaldehydlösningar i en kemisk dragskåp genom att göra två delar av 4% formaldehyd i PBS (metanolfri), späd den första till en koncentration av 1% formaldehyd och den andra till 2% formaldehyd med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS; med Ca 2+ och Mg2+) som utspädningsmedel.
    2. Ta bort det åtta brunnar kulturkammade täckglaset från inkubatorn och placera det i den kemiska rökkåpan.
    3. Tvätta försiktigt celler med 0,5 ml DPBS med en mikropipett genom att långsamt införa vätska längs den övre delen av hörnet av varje brunn.
    4. Ta bort befintlig vätska i varje brunn genom att långsamt extrahera den från brunnarnas hörn med hjälp av en mikropipett. Använd vätskeintroduktionsmetoden (steg 2.3.3), inför 0,5 ml 1% fixativ lösning i varje brunn och låt den sitta i 5 min22.
    5. Avlägsna befintlig vätska i varje brunn med den vätskeextraktionsmetod som nämns i steg 2.3.4. Använd den vätskeintroduktionsmetod som nämns i steg 2.3.3, för in 0,5 ml 2% fixeringslösning i varje brunn och låt den sitta i 15 minuter.
    6. Använd vätskeintroduktions- och extraktionsmetoderna (steg 2.3.3 och 2.3.4), tvätta cellerna genom att införa och avlägsna 0,5 ml färsk DPBS i varje brunn i tre separata fall i 5 minuter vardera.
  4. Utför färgning, permeabilisering och tillsats av monteringsmedia i det åtta brunnar stora täckglaset.
    1. Förbered 0,1% saponinlösning genom att tillsätta 1 mg saponin per ml DPBS och försiktigt virvel för att blanda23.
    2. Till 0,1% saponinlösning tillsätt två droppar (0,1 ml) vardera av ett F-aktinfärgande falloidinreagens och ett kärnfärgande Hoechst-reagens per ml saponinlösning. Håll den beredda lösningen borta från ljus genom att täcka med aluminiumfolie24.
    3. För in 0,2 ml färgnings-/permeabiliseringslösning i varje brunn och täck det kammade täckglaset med aluminiumfolie innan du låter det sitta i rumstemperatur i 30 minuter.
    4. Spola ut färgnings-/permeabiliseringslösningen två gånger med 0,5 ml DPBS.
    5. För bättre bildkvalitet, lägg till ett lämpligt monteringsmedium (med ett brytningsindex som nära matchar mikroskopobjektivoljan och täckglaset) i brunnarna.
      1. Använd en mikropipett och för in en minimal mängd av ett mjukt inställt antifade-monteringsmedel i varje brunn, vilket säkerställer att bottenytan är helt täckt och inga bubblor fångas inom önskat bildområde25. Verifiera cellskiktets integritet genom att observera under ett ljusfältmikroskop.
        Bildceller så snart som möjligt efter färgning för maximal bildkvalitet. Om fotoblekning sker eller långvarig lagring önskas kan andra monteringsmedier med antifade eller provbevarande egenskaper användas. Observera att hårdhärdande monteringsmedier förvränger cellernas 3D-struktur och i förlängningen cellskiktet, så mjukhärdande monteringsmedier är att föredra26.
  5. Utför avbildning i det åtta brunnar stora kammartäckglaset.
    1. Justera inställningarna för konfokalmikroskop, inklusive lasereffekt, förstärkning, förskjutning och skanningsparametrar som skanningshastighet, skanningsområde, skanningsformat, upplösning och håldiameter27.
    2. Testa bildplatsen genom att ta referensskanningar såväl som Z-staplar tills önskade bildparametrar och villkor har uppfyllts. Uppringningsparametrar vid sekventiellt högre förstoringsmål tills målet på 40x nedsänkning i olja har uppnåtts och optimerats28.
    3. Konstruera Z-staplar med tre slumpmässiga platser i varje matchning av seedningsdensitet/kulturvaraktighet.
  6. Utföra bildbehandling och dataanalys.
    1. Exportera XZ- och YZ-tvärsnitt med hjälp av programvarupaketet för konfokalmikroskop.
    2. Använd ett bildbehandlingsprogram med kantdetekteringsfunktioner (tröskelvärde 15,0) och mät den totala bildytan i pixlar med hjälp av trollstavsverktyget utanför bilden och sedan området exklusive cellskiktets totala tvärsnittsarea i pixlar med hjälp av trollstavsverktyget i den del av bilden som ligger utanför celllagret29.
    3. Med hjälp av ett databehandlingsprogram subtraherar du pixelvärdet för det yttre området från pixelvärdet för den totala arean för att hitta pixelvärdet för tvärsnittsarean.
    4. Konvertera pixelvärden för tvärsnittsarea till μm2-värden genom att multiplicera pixelvärden med kvadraten på μm/pixelvärdet som anges i mikroskopprogrammet för den specifika bilden (0,31 μm/pixel för Z-staplar tagna i 1024p-upplösning utan zoom på ett 40x olje-nedsänkningsobjektiv).
    5. Beräkna medelvärden och standardavvikelser och grafresultat.

Figure 3
Figur 3: Diagram över det åtta-brunnskammare täckglas som används för den fasta brunnskulturen, färgning och avbildningsexperiment som jämför effekterna av initial cellsådddensitet och odlingstid på bildandet av cellskikt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterade metoden möjliggör visualisering av epitelcellskikt odlade i mikrofluidiska odlingskanaler och använder en demonstration i traditionella cellodlingsmiljöer med fast brunn som validering. Bilder som förvärvas kommer att finnas på ett spektrum av kvalitet, signalintensitet och cellulär målspecificitet. Framgångsrika bilder kommer att visa hög kontrast, vilket möjliggör bildanalys och kvantifiering av data för efterföljande statistisk utvärdering. Misslyckade bilder blir svaga, suddiga, suddiga eller på annat sätt oanvändbara för subjektiv eller kvantitativ utvärdering. Vissa bilder kan vara lämpliga för subjektiv lagerkarakteristik samtidigt som de är av otillräcklig kvalitet för kvantitativ analys. Således kommer graden och omsorgen som protokollet följs direkt att påverka lämpligheten för en given bild att fungera som en datakälla för statistisk analys.

Figur 4 representerar framgångsrik användning av tekniken i samband med en mikrofluidisk dynamisk kulturmiljö och visar bildförvärv vid inlopp och utlopp av två mikrofluidiska enheter. Figur 4A,B ger exempel på lager odlade i 24 timmar, och figur 4C,D visar exempel på lager odlade i 48 timmar. Figur 5 illustrerar tillhörande data som samlats in från mikrofluidkanalexperimentet, med tre prover från var och en av de fem mikrofluidiska kanalavbildningsplatserna som anges i figur 2 från varje odlingslängd. Felstaplar anger standardavvikelser.

Figur 6 visar en 2D-bild av XY-planet i mitten av den mikrofluidiska kanalen och figur 7 visar en 3D-vy av samma plats med djupfärgkodning. Figur 8 representerar framgångsrik bildförvärv inom ett densitets-varaktighetsexperiment som analyserar effekterna av initial cellsådddensitet och odlingsvaraktighet på NCI-H441-cellskiktbildning i den åtta brunnskammare täckglasmiljön. Figur 8A-C visar kulturens varaktighet på 24 timmar, 48 timmar respektive 96 timmar. Figur 8X-Z indikerar initiala cellsådddensiteter på 180 000, 90 000 respektive 45 000 celler / cm2. Figur 9 presenterar kvantitativa data som samlats in från det åtta brunnskammare täckglasexperimentet, inklusive prover från tre platser i varje densitet-varaktighet matchning. Felstaplar representerar standardavvikelser och p-värdestester utfördes för att bestämma statistiskt signifikanta skillnader mellan till synes nära värden.

Dessa två representativa experiment inom de dynamiska mikrofluidiska och statiska åttabrunnsmiljöerna är distinkta användningsfallsexempel som visar hur tekniken kan kontextualisera experimentella fynd genom att visuellt bekräfta närvaron eller frånvaron av fysiologiskt relevanta monolager.

Figure 4
Figur 4: NCI-H441-cellskikt odlade i mikrofluidkanalen i 24 och 48 timmar, avbildade på inloppssidan och utloppssidan enligt figur 2. A) 24 timmar, inloppssidan. b) 24 timmar, utloppssidan. C) 48 timmar, inloppssidan. d) 48 timmar, utloppssidan. Blått representerar kärnfärgningen och grönt representerar färgningen av filamentöst aktin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Grafisk representation av data som samlats in under 24-48 timmars mikrofluidisk kanalavbildningsexperiment. Detta omfattar sex tvärsnittsareaprover från var och en av fem platser längs den relevanta längden på mikrofluidkanalen (såsom visas i figur 2). Felstaplar representerar standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: 2D-bild tagen i XY-planet på en central plats i mikrofluidikkanalen. Blått representerar kärnfärgningen och grönt representerar färgningen av filamentöst aktin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: 3D-modell av samma mikrofluidiska kanalplats som figur 6. Färgkodningen visar djupdata. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: NCI-H441-cellskikt odlade i det åtta brunnar stora täckglaset. För 24 h (A), 48 h (B) och 96 h (C) vid initiala sådddensiteter på 180 000 (X), 90 000 (Y) och 45 000 (Z) celler/cm2. Blått representerar kärnfärgningen och grönt representerar färgningen av filamentöst aktin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Grafisk representation av de data som samlats in under åttabrunnsodlingsexperimentet med densitetsvaraktighet. Detta inkluderar sex tvärsnittsareaprover från varje matchning av densitet-varaktighet. Felstaplar representerar standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det presenterade protokollet beskriver odling, tvärbindningsfixering, färgning, permeabilisering och konfokalmikroskopisk visualisering av NCI-H441 humana lungepitelceller i den dynamiska miljön av en enkanals mikrofluidisk flödesmatris, såväl som i den statiska miljön i ett traditionellt åtta-brunnskammar täckglas. Med alla mikrofluidiska cellodlingsprotokoll är flödesförhållandena för cellodlingsmediet av största vikt, eftersom höghastighetsflödet har potential att tvätta bort cellerna eller störa den normala sammansättningen av cellmonoskiktet. Samtidigt har låghastighetsflöde potential att "svälta" eller "kväva" (otillräcklig närings- respektive syretillgänglighet) cellskiktet på grund av diffusionsbegränsningarna som orsakas av den ogenomträngliga naturen hos den mikrofluidiska kanalen samt flödesegenskaperna30. Genom att börja med en väntetid på 10 minuter (under vilken cellerna förblir suspenderade i samma media som ursprungligen fyllde kanalen), sedan avancera till en flödeshastighet på 0,2 μl/min, innan de slutligen ökar till 10 μl/min under loppet av 4 timmar, balanseras dessa konkurrerande behov för att främja både cellföljsamhet och överlevnad.

Ett annat kritiskt steg i protokollet är korrekt förberedelse av mikrofluidikkanalen, inklusive konstruktion och förbehandling. Försiktighet måste iakttas för att säkerställa att täckglaset är korrekt monterat på kammarkonstruktionen för att undvika läckage och potentiell kontaminering. Korrekt fastsättning av täckglaset är också nödvändigt för att säkerställa att kanalhöjden är konsekvent och korrekt återges mellan på varandra följande försök med användning av olika konstruerade enheter. Mindre variationer kan införas genom toleransen i tjocklek på de självhäftande remsor som används samt den relativa kompressibiliteten. Att minimera eventuella variationer hjälper till med konsistensen av experimentella resultat. Korrekt förbehandling av den konstruerade kanalen är viktig för att säkerställa att cellerna får fästa vid och initiera spridning på glasytan. Ultraljud rengöring av glaset förbättrar Poly-D-lysin vidhäftning, främja vidhäftning till fibronektin. Tillsats av fibronektin, ett glykoprotein som naturligt syntetiseras och utsöndras av humana epitelceller, främjar ytterligare vidhäftningen av NCI-H441-cellerna till täckglasytan, vilket möjliggör normal cellmonolagerutveckling31.

Vidare är en av de viktigaste aspekterna av detta protokoll avbildningsplatsen. Trots noggrant kontrollerad förberedelse, på grund av den kolonnvolym som finns tillgänglig i regionerna i de två kanalöppningarna, kommer fler celler att finnas på täckglasytan i området direkt under och intill dessa öppningar, även när man följer lämpliga cellodlingstekniker. Av denna anledning bör regioner nära öppningarna inte betraktas som en del av det "normala" odlade cellskiktet, eftersom det kommer att finnas betydande flerskiktning / cellstapling som förekommer där. Istället är den centrala regionen av den mikrofluidiska kanalen ett lämpligt område att avbilda, eftersom denna plats inte störs av felet som orsakas av kanalhöjdsvariation nära öppningarna. Elektrodplatserna på flödesmatrisen kan användas för att styra avbildningsplatser, och som en tumregel bör alla skanningar avsedda att fånga lager som verkligen är representativa för mikrofluidiska kanalförhållanden tas på analoga platser inom gränserna för de två elektroderna längst bort på flödesmatrisen. Dessutom, i det beskrivna protokollet, anges 40x förstoringsmålet för användning; Detta kan dock ändras för att passa användarens behov. 40x förstoring valdes som den optimala förstoringen på grund av dess förmåga att erbjuda högupplöst avbildning med hög förstoring samtidigt som det behåller ett tillräckligt antal celler för att fungera som ett statistiskt giltigt prov.

En modifiering som kan göras på den mikrofluidiska kanalen inkluderar att ändra kanalhöjden, vilket kan uppnås genom att variera antalet distanser och lim som används för att konstruera den mikrofluidiska kanalen. Ändring av kanalhöjden kommer sannolikt att kräva justering av flödesparametrarna för att säkerställa att skjuvspänningen inte tar bort celler under matningen. Därför kommer alla variationer i kanalhöjd att påverka den ideala initialhastigheten, upprampningshastigheten och den slutliga hastigheten för medieflödet. Det beskrivna protokollet i denna artikel kan tjäna som ett medel genom vilket lämpliga flödeshastigheter kan härledas experimentellt, i kombination med indirekta metoder som ECIS. Dessutom kan flödeshastigheterna modifieras för att passa behoven hos olika cellinjer, vilket kan kräva anpassning för att fastställa optimala förhållanden. En annan modifiering som kan göras, med några tillägg till stegen i detta protokoll, är att utöka användningsfallet för den beskrivna tekniken bortom den relativa jämförelsen av tvärsnittsarean för cellskikt. Med lämplig kalibrering med hjälp av mikrosfärer eller mikrokulor av kända dimensioner kan noggranna volymetriska, topologiska och absoluta tvärsnittsareamätningar göras. Kalibrering med ett referensobjekt är nödvändigt i detta fall på grund av konfokalmikroskopets begränsade Z-upplösning och potentialen för över- eller undersampling i Z-dimensionen på grund av den manuella kontrollen över Z-stackstegstorleken som konfokala skanningssystem erbjuder32.

En begränsning med detta protokoll är bristen på sann volymetrisk mätning på grund av bristen på vertikala kalibreringssteg. Den kalibrering som nämns ovan och verifieringstekniken med fluorescerande mikrokulor av kända dimensioner kan användas för verklighetstrogen skalning. Dessutom innebär detta protokoll användning av förberedda, färdiga fläckar. Immunofluorescerande färgning med primära och sekundära antikroppar kräver ofta ett flerdagarsprotokoll som är mer involverat än det som denna artikel diskuterar. Det är dock troligt att det är möjligt att använda immunofluorescerande färgning på detta sätt, även om vissa experiment kan vara nödvändiga för att optimera arbetsflödet. Med tanke på de ytterligare steg som är involverade i immunofluorescerande färgningsprotokoll måste försiktighet vidtas för att undvika skjuvning av det odlade cellskiktet under de många tvättstegen, eftersom detta kan förändra egenskaperna hos det cellskikt som slutligen utvärderas och därför ogiltigförklara alla slutsatser som skulle följa. Ytterligare utveckling av denna teknik kan innefatta automatisering av bild- och dataanalyser, inklusive detektering av intresseregion (ROI) och kvantifiering för bestämning av tvärsnittsarea. Dessutom kan utvidgning av denna teknik till att omfatta olika intra- och extracellulära målstrukturer (kanske färgning för mål som tight-junction-proteiner) bredda användningsfallet för denna metod till 3D-samlokalisering inom mikrofluidiska cellodlingsanordningar.

För att producera de mest fysiologiskt representativa cellskikten måste lungepitelceller odlas i mikrofluidiska kanaler med ett luft-vätskegränssnitt (ALI) vid odlingsytan, vilket typiskt åstadkoms med användning av polydimetylsiloxan (PDMS), ett flexibelt material som görs permeabelt genom införandet av porer i μm-skala. ALI-odlingsförhållanden möjliggör bildandet av cellskikt som mest liknar de fysiologiska egenskaperna hos in vivo lungepitel33. Även om det är tekniskt möjligt är det opraktiskt och otillgängligt för de flesta forskare att använda ECIS i en ALI-odlingsmiljö med en PDMS-odlingsyta i en dynamisk mikrofluidisk miljö, eftersom det inte finns några kommersiellt tillgängliga apparater för en sådan komplex cellodlingsenhet34. En orsak till denna svårighet kan vara det paradoxala behovet av en permeabel odlingsyta som fortfarande kan fungera som en fast elektrod för ECIS-mätningar. Som sådan finns det för närvarande ett behov av en metod för att visuellt verifiera egenskaperna och fysiologisk relevans av cellskikt odlade i syreogenomträngliga odlingsmiljöer som de som finns i ECIS-flödesmatriser.

Denna metod expanderar på den traditionella metoden för att säkerställa korrekt sammanflöde med hjälp av tvådimensionell mikroskopi genom att möjliggöra 3D-visualisering, vilket kraftigt breddar antalet cellskiktsegenskaper som kan observeras, kvantifieras och analyseras. Dessutom tillåter detta en subjektiv bestämning av närvaron av ett monolager, skiktets enhetlighet och andra egenskaper som anses relevanta för experimentella ändamål. Detta protokoll är viktigt eftersom det fungerar som ett medel för visuell verifiering och utvärdering av cellskikt som produceras i många syreogenomträngliga miljöer, såsom i ECIS-experiment som utvärderar barriärfunktionsegenskaper hos epitelceller utsatta för atelectrauma. Detta fungerar också som en metod som kan användas i framtida arbete för att avgöra om en uppsättning dynamiska mikrofluidiska odlingsförhållanden producerar cellskikt som är relevanta och lämpliga för vidare experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna erkänner Alan Shepardson för att utforma skärmönstret för 3M-lim och mylarark som används i mikrofluidisk kanalkonstruktion och för att testa cellkulturens medieflödeshastighet och sprutpumpprogrammering. Finansiering tillhandahölls av NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 och Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 185
Beredning och strukturell utvärdering av epitelcellmonolager i en fysiologiskt dimensionerad mikrofluidisk odlingsanordning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. … More

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. E., Gaver III, D. P. Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device. J. Vis. Exp. (185), e64148, doi:10.3791/64148 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter