Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הכנה והערכה מבנית של חד-שכבות תאי אפיתל במכשיר תרבית מיקרופלואידית בגודל פיזיולוגי

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

הפרוטוקול המוצג מתאר את הפיתוח והשימוש בטכניקת צביעת אקטין נימה מבוססת פלואידין עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) כדי להמחיש את מבנה שכבת התא הדבק בתעלות תרבית דינמיות מיקרופלואידיות ובתאי תרבית סטטיים קבועים מסורתיים. גישה זו מסייעת בהערכת מפגש שכבות התא, היווצרות חד-שכבתית ואחידות בעובי השכבה.

Abstract

ניסויים מיקרופלואידים במבחנה טומנים בחובם פוטנציאל רב לחשוף תובנות רבות על תופעות מיקרופיזיולוגיות המתרחשות במצבים כגון תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ופגיעה ריאתית הנגרמת על ידי הנשמה (VILI). עם זאת, מחקרים בתעלות מיקרופלואידיות בעלות ממדים רלוונטיים פיזיולוגית לסימפונות הסופניים של הריאה האנושית עומדים כיום בפני מספר אתגרים, במיוחד בשל קשיים בקביעת תנאי תרבית תאים מתאימים, כולל קצב זרימת מדיה, בסביבת תרבית נתונה. הפרוטוקול המוצג מתאר גישה מבוססת תמונה להערכת המבנה של תאי אפיתל ריאה אנושיים NCI-H441 בתרבית בתעלה מיקרופלואידית אטומה לחמצן עם ממדים רלוונטיים פיזיולוגית לסימפונות הסופניים של הריאה האנושית. באמצעות צביעת אקטין נימה מבוססת פלואדין, מבני השלד הציטו-שלד של התאים נחשפים על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, המאפשר הדמיה של תאים בודדים כמו גם שכבות. כימות לאחר מכן קובע אם תנאי תרבית התאים המופעלים מייצרים מונושכבות אחידות המתאימות לניסויים נוספים. הפרוטוקול מתאר תרביות תאים ושיטות הערכת שכבות בתעלות מיקרופלואידיות ובסביבות מסורתיות של באר קבועה. זה כולל בניית תעלות, תרבית תאים ותנאים נדרשים, קיבוע, חלחול וצביעה, הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית, עיבוד תמונה וניתוח נתונים.

Introduction

תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) היא מצב חריף הנובע מעלבון והתפשטות של פגיעה בפרנכימת הריאות, וכתוצאה מכך בצקת ריאות של הנאדיות, חילופי גזים לקויים, והיפוקסמיה, לאחר מכן היפוקסמיה1. זה מתחיל מחזור של שחרור ציטוקינים פרו-דלקתיים, גיוס נויטרופילים, שחרור מתווך רעיל ונזק לרקמות, אשר עצמו גורר תגובה דלקתית נוספת2. בנוסף, פעילי שטח ריאתיים, אשר מייצבים את דרכי הנשימה ומונעים נזק הנגרם על ידי גיוס/גיוס חוזר (R/D), עלול להיות מושבת או להפוך לבלתי מתפקד בדרך אחרת על ידי תהליכים כימיים המתרחשים במהלך ARDS, וכתוצאה מכך מתח נוסף ופגיעה בפרנכימה3 שמסביב. אם נגרם נזק מספיק, ייתכן שיהיה צורך באוורור מכני כדי להבטיח חמצון מערכתי נאות4. עם זאת, אוורור מכני מטיל אתגרים וטראומות משלו, כולל האפשרות של פגיעה ריאתית כתוצאה מהנשמה (VILI), המאופיינת כפגיעה בפרנכימת הריאה הנגרמת על ידי לחצים מכניים המופעלים במהלך ניפוח יתר (וולוטראומה) ו / או R/D של ממשק אוויר-נוזל בנתיב האוויר החסום בנוזל (atelectrauma)5. שיפוע הלחץ שחווים תאי אפיתל החשופים לממשק אוויר-נוזל (כמו בסימפונות חבויים בנוזל) במודל האטלקטטראומה יכול לגרום לתגובה חסימתית שמקורה בחדירות (POOR), מה שמוביל למעגל מוסרי של פציעה 6,7,8.

ניסויים במבחנה יכולים לספק תובנות בקנה מידה מיקרוני על תופעות אלה, אך מחקרים עכשוויים בסביבות תעלות מיקרופלואידיות עם ממדים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עומדים בפני מספר אתגרים9. ראשית, אופטימיזציה של תנאי תרביות תאים מהווה חסם כניסה משמעותי למחקר תרביות תאים בסביבות מיקרופלואידיות, שכן קיים צומת צר שבתוכו פרמטרים של זרימת מדיה, משך תרבית ותנאי תרבית אחרים מאפשרים היווצרות אופטימלית של שכבת התא. זה כולל את מגבלות הדיפוזיה המוטלות על ידי הטבע הבלתי חדיר לחמצן של מארז תעלת התרבית המיקרופלואידית. זה מחייב התחשבות זהירה בפרמטרים של זרימת מדיה, שכן קצבי זרימה נמוכים יכולים למנוע מהתאים חמצן, במיוחד אלה הרחוקים ביותר מהמפרצון; מצד שני, קצבי זרימה גבוהים יכולים לדחוף תאים אל מחוץ לתעלת התרבית או לגרום להתפתחות שכבה לא תקינה או לא אחידה. ניתן לטפל במגבלות הדיפוזיה על ידי שימוש בחומרים חדירים לחמצן כגון פולידימתילסילוקסאן (PDMS) במנגנון תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI); עם זאת, תעלות תרבית מיקרופלואידיות קונבנציונליות רבות, כגון אלה של מערכת חישת עכבת המצע החשמלי של התא (ECIS), הן מטבען אטומות לחמצן, בהתחשב בטבעו של המארז המיוצר10. פרוטוקול זה נועד לספק טכניקה לניתוח שכבות תאים בתרבית במארז אטום לחמצן.

כאשר משווים את הכדאיות של תנאי תרבית, יש צורך בתצפיות של מאפייני שכבה ספציפיים, כגון נוכחות של חד-שכבתיות, טופולוגיית פני שטח, מפגש ואחידות בעובי שכבה, כדי לקבוע אם שכבת התא המיוצרת על ידי קבוצה מסוימת של תנאי תרבית עומדת במפרט הרצוי ואכן רלוונטית לתכנון הניסוי. הערכה מוגבלת יכולה להתבצע בשיטות כגון ECIS, המשתמשת במדידות של פוטנציאל חשמלי (מתח) שנוצר על ידי התנגדות לזרם חילופין בתדר גבוה (AC) (עכבה) המוטלת על ידי ממברנות מבודדות חשמלית של תאים בתרבית על אלקטרודות זהב בתוך מערך הזרימה. על ידי אפנון התדר של AC המופעל על תאים, תכונות תאיות תלויות תדר ספציפיות של התאים ושכבות התא כגון חוזק היצמדות פני השטח, היווצרות צומת הדוק, והתפשטות תאים או מפגש תאים עשויות להיות ממוקדות ונבדקות11. עם זאת, צורות עקיפות אלה של מדידות הן קצת קשה לפרש בתחילת הניסוי, ולא יכול לכמת את כל ההיבטים הרלוונטיים של שכבת התא. התבוננות פשוטה בשכבת התא תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עשויה לחשוף את טבען של תכונות מסוימות כגון מפגש; עם זאת, מאפיינים רלוונטיים רבים כגון נוכחות חד-שכבתית ואחידות בעובי השכבה דורשים הערכה תלת-ממדית (תלת-ממדית) שאינה אפשרית עם הדמיה מיקרוסקופית של שדה בהיר, ניגודיות פאזה או פלואורסצנטית12.

מטרת מחקר זה הייתה לפתח טכניקת צביעת אקטין נימה שתאפשר אימות מבוסס הדמיה של שכבה חד-שכבתית והערכת אחידות שכבת התא באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). Filamentous-actin (F-actin) נחשב למטרה מתאימה לצמידות פלואורופור, בין השאר בשל האופן שבו F-actin עוקב בחוזקה אחר קרום התא, מה שמאפשר קירוב חזותי של נפח התא כולו13. יתרון חשוב נוסף של מיקוד F-actin הוא האופן שבו צביעה של F-actin מבהירה חזותית הפרעות בשלד או שינויים המוטלים על ידי לחצים וזנים שחווים התאים. קיבוע צולב עם פורמלדהיד נטול מתנול שימש לשימור המורפולוגיה של התאים ושכבת התא, שכן קיבועים מייבשים כגון מתנול נוטים לשטח תאים, לעוות באופן גס את שכבת התא ולשנות את תכונותיה14,15.

כדי לקבוע את יכולתה של טכניקת הערכת השכבות למתן אתגרים אלה, תאים גודלו בתרבית בתאי תרבית מסורתיים של שמונה בארות, כמו גם בתעלות מיקרופלואידיות כדי להעריך את ההבדלים, אם בכלל, בשכבות התא שנוצרו. עבור בארות תרבות קבועות, יחידות כיסוי שמונה בארות שימש יחידות כיסוי קימור. עבור תרבית מיקרופלואידית, מערכי זרימה (אורך תעלה 50 מ"מ, רוחב 5 מ"מ, עומק 0.6 מ"מ) הותאמו לתאי אפיתל ריאה אנושיים מונצחים (NCI-H441) בסביבה עם ממדים רלוונטיים פיזיולוגית לסימפונות הסופניים הנמצאים באזור הנשימה של הריאה האנושית16. בעוד פרוטוקול זה פותח תוך התחשבות בסביבת התרבית של מערכי זרימת ECIS, הוא עשוי לחול על כל סביבה דינמית-תרבית אטומה לחמצן שעבורה נדרשת הערכה של מאפייני שכבת התא בתרבית או תנאי תרבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

קו תאי הריאה האפיתל האנושי NCI-H441 שימש במחקר הנוכחי (ראה טבלת חומרים).

1. תרבית תאים בתעלה המיקרופלואידית

  1. לייצר את התעלה המיקרופלואידית ולבצע את הטיפול המקדים לפי השלבים הבאים.
    1. קבל מערך זרימה חד-ערוצי (ראה טבלת חומרים) והפרד את החלק העליון מלוח בסיס הפוליקרבונט.
    2. השג זכוכית כיסוי מלבנית #1.5 (עובי 0.17 מ"מ) בממדים של 60 מ"מ x 22 מ"מ. נקו את המשטחים של זכוכית הכיסוי באמבטיה על-קולית וטפלו בצד אחד בתמיסת פולי-די-ליזין במינון 0.1 מ"ג/מ"ל בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות לפני ייבוש ב-60°C למשך 30 דקות.
    3. הצמידו דבק דו-צדדי בעובי 0.13 מ"מ (ראו טבלת חומרים), בחיתוך לייזר כדי להתאים למידות ראש מערך הזרימה ותעלת הזרימה (50 מ"מ אורך, 5 מ"מ רוחב), לראש מערך הזרימה, תוך הקפדה על יישור מדויק של מגזרות התעלה17.
    4. הצמידו ספייסר מיילרי בעובי 0.1 מ"מ (ראו טבלת חומרים), בחיתוך לייזר כדי להתאים למידות ראש מערך הזרימה ותעלת הזרימה, לרצועת ההדבקה, תוך הקפדה על יישור מדויק של חתכי התעלה.
    5. חזור על שלבים 1.1.3 ו- 1.1.4 עד להשגת גובה הערוץ הרצוי (לדוגמה, עבור גובה ערוץ של 0.6 מ"מ, השתמש בשני ספייסרים ובשלוש רצועות דבק).
    6. הצמידו זכוכית כיסוי מלבנית לרצועת הדבק התחתונה ביותר, כאשר הצד המטופל בפולי-D-ליזין פונה אל הדבק. לאחר השלמת ההרכבה, כפי שמצוין באיור 1, הפעילו לחץ יציב ושווה על החלק העליון והתחתון של המבנה והחזיקו למשך דקה אחת.
      הערה: בניית מארז התעלה, כולל זכוכית כיסוי, דבקים, ספייסרים וראש מערך זרימה, הושלמה כעת.
    7. שטפו את התעלה במים דה-מיוננים באמצעות מזרק, ובדקו במקביל אם יש נזילות.
    8. יש לעקר את מארז התעלה במעקר אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות18.
    9. באמצעות טכניקה סטרילית, יש לטפל בתעלה עם פיברונקטין אנושי של 2.0 מיקרוגרם/מ"ל (ראה טבלת חומרים) במי מלח חוצצים פוספט (PBS) ולדגור במשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37°C19.
  2. בצע תרבית תאים בתעלה המיקרופלואידית לפי השלבים הבאים.
    1. במכסה מנוע סטרילי של זרימה למינרית, השתמש במיקרופיפטה כדי להעביר תרחיף אחיד של תאי NCI-H441 בתווך RPMI 1640 עם סרום בקר עוברי 10% (FBS) (ראה טבלת חומרים) כדי לזרוע שתי תעלות מיקרופלואידיות, כל אחת עם תאים בצפיפות פני השטח של 150,000 תאים לסמ"ק2.
      1. עבור ערוצים של 50 מ"מ x 5 מ"מ x 0.6 מ"מ, השתמש ב- 0.25 מ"ל של מתלה של 2.5 x 106 תאים/מ"ל כדי למלא כל ערוץ, וכן בחלק מהיציאות. ודא שהתאים התפזרו באופן שווה בתוך הערוצים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
    2. תרבית את שני הערוצים במשך 24 שעות ו-48 שעות בהתאמה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 באמצעות משאבת מזרק ניתנת לתכנות (ראה טבלת חומרים), תוך שאיבת מדיה משומשת מהתעלה ומדיה טרייה לתוך התעלה ממאגר מדיה סטרילי המחובר לכניסת התעלה המורכב ממזרק חתוך בנפח 20 מ"ל מכוסה בסרט פרפין.
      1. לאחר תקופת המתנה של 10 דקות לאחר זריעת תאים, יש להכניס ולשאוב מדיה טרייה מהמאגר דרך התעלה בקצב זרימה משתנה המתחיל ב-0.2 מיקרוליטר/דקה ועד 10 מיקרוליטר/דקה למשך 4 שעות, תוך שמירה על קצב זה לאחרמכן 20.
        הערה: קצב זרימה משתנה זה מספק תנאי תרבית המאפשרים לתאים (1) לשקוע בכבידה על פני השטח של התרבית, (2) להיצמד לפני השטח של התרבית, ו-(3) ליצור חד-שכבה מתמזגת.
  3. בצע קיבוע תאים בתוך התעלות המיקרופלואידיות באמצעות תמיסת פורמלדהיד.
    אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל ויש לטפל בו במנדף כימי מתאים21.
    1. במנדף כימי, הכינו תמיסות פורמלדהיד באמצעות 4% פורמלדהיד ב-PBS (ללא מתנול) (ראו טבלת חומרים) ליצירת שתי מנות של 4 מ"ל, דילול הראשון לריכוז של 1% פורמלדהיד והשני ל-2% פורמלדהיד באמצעות מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS; עם Ca 2+ ו-Mg2+) כמדלל. העבירו את תמיסות הפורמלדהיד למזרקים נפרדים בנפח 5 מ"ל ותוויתו בהתאם. צייר 20 מ"ל של DPBS לתוך מזרק נפרד 20 מ"ל.
    2. הסר תעלות מיקרופלואידיות ממנגנון התרבית והכנס אותן למכסה האדים הכימי.
    3. להרכיב את מנגנון הקיבוע והצביעה.
      1. חבר קטע של 10 ס"מ של צינורות העברה ליציאה הצדדית של סטופקוק תלת-כיווני באמצעות מנעול Luer זכר למתאם מוט צינור (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן חבר את הסטופקוק ליציאת הכניסה של מערך הזרימה.
      2. לאחר מכן, חבר קטע נוסף של 10 ס"מ של צינורות העברה ליציאת היציאה של מערך הזרימה באמצעות אותו סוג של מתאם צינור.
      3. לבסוף, אבטח את הקצוות החופשיים של שני צינורות ההעברה במיכל פסולת כימי ומתאים לסיכונים ביולוגיים, כגון צינור צנטריפוגה חרוטי ריק של 50 מ"ל.
    4. סובב את הסטופרקוק כדי לחסום את יציאת הכניסה של מערך הזרימה ושטוף את קו הפסולת עם DPBS. לאחר מכן, סובב את הסטופרקוק כדי לחסום את קו הפסולת ולשטוף לאט תאים עם 2 מ"ל של DPBS. חזור על שלב ההדחה באמצעות הפתרון החדש בכל פעם. פתרון חדש (או ריכוז של תמיסה) מוצג לערוץ.
    5. לדחוף באיטיות 2 מ"ל של 1% פתרון קיבוע דרך הערוץ ולאחר מכן לאפשר לשבת במשך 5 דקות22.
    6. לדחוף באיטיות 2 מ"ל של 2% פתרון קיבוע דרך הערוץ ולאחר מכן לאפשר לשבת במשך 15 דקות.
    7. שטפו תאים על ידי החדרה איטית של 2 מ"ל של DPBS טריים לתעלה בשלושה מופעים נפרדים (5 דקות כל אחד).
    8. בצע את השלבים 1.3.3-1.3.7 עבור שני התעלות המיקרופלואידיות במקביל.
  4. צבעו, חדרו והוסיפו אמצעי הרכבה לתאים בתעלה המיקרופלואידית.
    1. הכינו תמיסת סאפונין 0.1% על ידי הוספת 1 מ"ג סאפונין (ראו טבלת חומרים) לכל מ"ל DPBS כדי לייצר 4 מ"ל תמיסה וערבול עדין לערבוב23. צייר 8 מ"ל של DPBS לתוך מזרק 20 מ"ל.
    2. הוסף מגיב פאלואדין מכתים F-actin וריאגנט Hoechst מכתים גרעין (ראה טבלת חומרים) לתמיסת 0.1% saponin, בשתי טיפות (0.1 מ"ל) של כל מגיב לכל מ"ל של תמיסת סאפונין. יש להרחיק תמיסת צביעה/חלחול מוכנה מאור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום24.
    3. שטפו את הקו בכמות קטנה של תמיסת צביעה/חלחול (כמתואר בשלב 1.3.4), לאחר מכן הכניסו 2 מ"ל של התמיסה לתעלה המיקרופלואידית וכסו את התעלה ברדיד אלומיניום לפני שתאפשרו לה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    4. יש לשטוף את תמיסת הצביעה/החדירה פעמיים עם 2 מ"ל DPBS למשך 5 דקות לכל סומק.
    5. לקבלת איכות תמונה טובה יותר, הוסיפו לערוץ אמצעי הרכבה מתאים (עם אינדקס שבירה התואם באופן הדוק את השמן האובייקטיבי של המיקרוסקופ ואת זכוכית הכיסוי, ראו טבלת חומרים).
      1. באמצעות מיקרופיפטה, הכנס כמות מינימלית של מתקן אנטי-דהייה רך לכל יציאה של התעלה המיקרופלואידית, וודא שהמשטח התחתון מכוסה לחלוטין ולא נלכדות בועות באזור ההדמיה הרצוי25. אטמו את קצות התעלה וודאו את שלמות שכבת התא על ידי התבוננות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
    6. בצע את השלבים 1.4.3-1.4.5 עבור שני התעלות המיקרופלואידיות במקביל.
      הערה: תאי תמונה בהקדם האפשרי לאחר צביעה לקבלת איכות תמונה מרבית. אם מתרחשת הלבנה או אם יש צורך באחסון לטווח ארוך, ניתן להשתמש באמצעי הרכבה אחרים עם תכונות למניעת עמעום או שימור דגימה. שים לב כי מדיה הרכבה קשה ריפוי יהיה מעוות את המבנה התלת-ממדי של התאים, ובהרחבה, את שכבת התא; מסיבה זו, עדיפה מדיית הרכבה רכה26.
  5. תאי תמונה בתעלה המיקרופלואידית לפי השלבים הבאים.
    1. התאם את הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי (ראה טבלת חומרים), כולל עוצמת לייזר, רווח, הסטה ופרמטרים של סריקה כגון מהירות סריקה, אזור סריקה, תבנית סריקה, רזולוציה וקוטר חור סיכה27.
    2. בדוק את מיקום ההדמיה על ידי ביצוע סריקות ייחוס וכן ערימות Z עד לעמידה בפרמטרים ובתנאים הרצויים של התמונה. פרמטרי חיוג ביעדי הגדלה גבוהים יותר ברצף עד להשגת יעד טבילת שמן פי 40 ואופטימיזציה28.
    3. באמצעות לוח הבסיס של מערך הזרימה כנקודת ייחוס, בנו ערימות Z בחמישה מקומות, במיקום העתידי של האלקטרודה הראשונה בצד הכניסה, באמצע הדרך בין המרכז למיקום הקודם, במרכז, באמצע הדרך בין המרכז למיקום של האלקטרודה האחרונה (בצד היציאה), ובאלקטרודה האחרונה, כפי שניתן לראות באיור 2.
  6. ביצוע עיבוד תמונה וניתוח נתונים.
    1. יצא חתכי XZ ו-YZ באמצעות חבילת התוכנה למיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים).
    2. בעזרת תוכנה לעיבוד תמונה (ראו טבלת חומרים) עם יכולות זיהוי קצוות (ערך סף 15.0), מדדו את שטח התמונה הכולל בפיקסלים בעזרת הכלי מטה הקסם מחוץ לתמונה, ולאחר מכן את האזור שאינו כולל שטח חתך הרוחב הכולל של שכבת התא בפיקסלים בעזרת הכלי מטה הקסם בחלק החיצוני של התמונה לשכבת התא29.
    3. בעזרת תוכנה לעיבוד נתונים (ראה טבלת חומרים), הפחת את ערך הפיקסל של האזור החיצוני מערך הפיקסלים הכולל של השטח כדי למצוא את ערך הפיקסלים של אזור חתך הרוחב.
    4. המרת ערכי פיקסלים של אזור חתך רוחב לערכי μm2 על-ידי הכפלת ערכי פיקסלים בריבוע ערך μm/pixel, כפי שמצוין בתוכנת המיקרוסקופ של התמונה המסוימת (0.31 μm/pixel עבור ערימות Z שצולמו ברזולוציה של 1024p ללא זום בעדשת טבילת שמן של 40x).
    5. חישוב אמצעים וסטיות תקן של נתונים ותוצאות גרפים.

Figure 1
איור 1: סכמת תצוגה מפוצצת של מבנה התעלה המיקרופלואידית. האלמנט העליון הוא החלק העליון של מערך הזרימה, אלמנטים אפורים דקים הם רצועות דבק, אלמנטים כחולים דקים הם ספייסרים מיילריים, והאלמנט התחתון הוא זכוכית הכיסוי המלבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: חמישה מיקומי הדמיה לאורך האזור המייצר שכבות באופן עקבי של ערוץ התרבית המיקרופלואידית. מיקומי ההדמיה הם כדלקמן: צד כניסה, קרוב למקום שבו תהיה האלקטרודה הראשונה על מערך הזרימה השלם; באמצע הדרך בין מיקום צד הכניסה למרכז הערוץ; מרכז הערוץ; באמצע הדרך בין המרכז למיקום בצד היציאה, ובצד היציאה, קרוב למקום שבו תהיה האלקטרודה האחרונה על מערך הזרימה השלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. תרבית תאים בזכוכית הכיסוי בעלת שמונה התאים

  1. בצע טיפול מקדים של זכוכית כיסוי שמונה תאים היטב.
    1. השג זכוכית כיסוי סטרילית בעלת שמונה תאים המיוצרת עם זכוכית כיסוי #1.5 וטיפול פני שטח המגדיל את היצמדות התאים (איור 3, ראה טבלת חומרים).
    2. באמצעות טכניקה סטרילית, לטפל בפני השטח של בארות תרבית עם 2.0 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין אנושי PBS לדגור לפחות 30 דקות ב 37 ° C19.
  2. בצע תרבית תאים בזכוכית הכיסוי התאית לפי השלבים הבאים.
    1. במכסה מנוע סטרילי של זרימה למינרית, העבר 0.5 מ"ל חלקים של תמיסות של תאי NCI-H441 המרחפים באופן שווה בתווך RPMI 1640 עם 10% FBS בצפיפות נפחית של 81,000, 162,000 ו- 324,000 תאים / מ"ל כדי לזרוע את בארות התרבית בצפיפות פני השטח של 45,000, 90,000 ו- 180,000 תאים לסמ"ק2, בהתאמה. ודא שהתאים התפזרו באופן שווה בתוך הבארות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
    2. תאי תרבית במשך 24 שעות, 48 שעות ו-96 שעות ב-37°C עם 5% CO2, המחליפים מדיה מדי יום.
  3. בצע קיבוע פורמלדהיד בזכוכית הכיסוי בעלת שמונה התאים היטב.
    אזהרה: פורמלדהיד הוא רעיל ויש לטפל בו במנדף כימי מתאים21.
    1. במנדף כימי, הכינו תמיסות פורמלדהיד על ידי הכנת שתי מנות של 4% פורמלדהיד ב-PBS (ללא מתנול), דילול הראשונה לריכוז של 1% פורמלדהיד והשנייה ל-2% פורמלדהיד באמצעות מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS; עם Ca 2+ ו-Mg2+) כמדלל.
    2. הסר את זכוכית הכיסוי בעלת שמונה הבארות מהאינקובטור והכנס אותה למכסה האדים הכימי.
    3. בעדינות לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של DPBS באמצעות micropipette על ידי החדרת נוזל לאט לאורך החלק העליון של הפינה של כל באר.
    4. הסר נוזל קיים בכל באר על ידי חילוץ איטי מפינת הבארות באמצעות מיקרופיפטה. באמצעות שיטת החדרת נוזלים (שלב 2.3.3), להכניס 0.5 מ"ל של 1% פתרון קיבוע לתוך כל באר ולאפשר לו לשבת במשך 5 דקות22.
    5. הסר נוזלים קיימים בכל באר באמצעות שיטת מיצוי הנוזלים המוזכרת בשלב 2.3.4. באמצעות שיטת החדרת הנוזלים המוזכרת בשלב 2.3.3, הכניסו 0.5 מ"ל של 2% תמיסה מקובעת לכל באר ואפשרו לה לשבת במשך 15 דקות.
    6. באמצעות שיטות החדרה ומיצוי נוזלים (שלבים 2.3.3 ו- 2.3.4), לשטוף תאים על ידי החדרה והסרה של 0.5 מ"ל של DPBS טרי בכל באר בשלושה מופעים נפרדים במשך 5 דקות כל אחד.
  4. בצע צביעה, חדירה וחיבור מדיה להרכבה בזכוכית הכיסוי בעלת שמונה התאים היטב.
    1. הכינו תמיסת סאפונין 0.1% על ידי הוספת 1 מ"ג סאפונין לכל מ"ל DPBS וערבבו בעדינות לערבוב23.
    2. לתמיסת 0.1% סאפונין יש להוסיף שתי טיפות (0.1 מ"ל) כל אחת של מגיב פאלואדין מכתים F-actin ומגיב Hoechst מכתים גרעין לכל מ"ל של תמיסת סאפונין. יש להרחיק את התמיסה המוכנה מאור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום24.
    3. הכניסו 0.2 מ"ל של תמיסת צביעה/חדירה לכל באר וכסו את הזכוכית המקורה ברדיד אלומיניום לפני שתאפשרו לה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    4. יש לשטוף את תמיסת הצביעה/חלחול פעמיים עם 0.5 מ"ל DPBS.
    5. לקבלת איכות תמונה טובה יותר, הוסף אמצעי הרכבה מתאים (עם אינדקס שבירה התואם באופן הדוק את שמן המטרה של המיקרוסקופ וזכוכית כיסוי) לתוך הבארות.
      1. באמצעות מיקרופיפטה, הכנס כמות מינימלית של מתקן אנטי-דהייה רך לכל באר, וודא שהמשטח התחתון מכוסה לחלוטין ולא נלכדות בועות באזור ההדמיה הרצוי25. ודא את שלמות שכבת התא על-ידי התבוננות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
        הערה: תאי תמונה בהקדם האפשרי לאחר צביעה לקבלת איכות תמונה מרבית. אם מתרחשת הלבנה או אם יש צורך באחסון לטווח ארוך, ניתן להשתמש באמצעי הרכבה אחרים עם תכונות למניעת עמעום או שימור דגימה. שים לב שמדיית הרכבה קשיחה תעוות את המבנה התלת-ממדי של התאים, ובהרחבה, את שכבת התא, ולכן עדיפה מדיית הרכבה רכה26.
  5. בצע הדמיה בזכוכית כיסוי בעלת שמונה תאים.
    1. התאם את הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי, כולל עוצמת לייזר, רווח, הסטה ופרמטרים של סריקה כגון מהירות סריקה, אזור סריקה, תבנית סריקה, רזולוציה וקוטר חור סיכה27.
    2. בדוק את מיקום ההדמיה על ידי ביצוע סריקות ייחוס וכן ערימות Z עד לעמידה בפרמטרים ובתנאים הרצויים של התמונה. פרמטרי חיוג ביעדי הגדלה גבוהים יותר ברצף עד להשגת יעד טבילת שמן פי 40 ואופטימיזציה28.
    3. בנה ערימות Z של שלושה מיקומים אקראיים בכל התאמת צפיפות זריעה/משך תרבית.
  6. ביצוע עיבוד תמונה וניתוח נתונים.
    1. ייצא חתכי XZ ו- YZ באמצעות חבילת התוכנה למיקרוסקופ קונפוקלי.
    2. בעזרת תוכנה לעיבוד תמונה עם יכולות זיהוי קצוות (ערך סף 15.0), מדדו את שטח התמונה הכולל בפיקסלים בעזרת הכלי מטה הקסם מחוץ לתמונה, ולאחר מכן את האזור שאינו כולל שטח חתך הרוחב הכולל של שכבת התא בפיקסלים בעזרת הכלי מטה הקסם בחלק החיצוני של התמונה לשכבת התא29.
    3. באמצעות תוכנה לעיבוד נתונים, הפחת את ערך הפיקסל של האזור החיצוני מערך הפיקסל הכולל של השטח כדי למצוא את ערך הפיקסלים של אזור חתך הרוחב.
    4. המר ערכי פיקסלים של שטח חתך רוחב לערכי μm2 על-ידי הכפלת ערכי פיקסלים בריבוע ערך μm/pixel כפי שמצוין בתוכנת המיקרוסקופ של התמונה המסוימת (0.31 μm/pixel עבור ערימות Z שצולמו ברזולוציית 1024p ללא זום בעדשת טבילת שמן של 40x).
    5. חישוב אמצעים וסטיות תקן ותוצאות גרף.

Figure 3
איור 3: דיאגרמה של זכוכית כיסוי בעלת שמונה בארות ששימשה לניסוי התרבית, הצביעה וההדמיה של באר קבועה, המשווה את ההשפעות של צפיפות זריעת התאים הראשונית ומשך התרבית על היווצרות שכבות התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה המוצגת מאפשרת הדמיה של שכבות תאי אפיתל בתרבית בתעלות תרבית מיקרופלואידיות ומשתמשת בהדגמה בסביבות מסורתיות של תרביות תאים קבועות כאימות. תמונות שיתקבלו יתקיימו בספקטרום של איכות, עוצמת אות וספציפיות מטרה סלולרית. תמונות מוצלחות יפגינו ניגודיות גבוהה, מה שיאפשר ניתוח תמונה וכימות נתונים להערכה סטטיסטית לאחר מכן. תמונות לא מוצלחות יהיו עמומות, מטושטשות, מטושטשות או בלתי שמישות בדרך אחרת לצורך הערכה סובייקטיבית או כמותית. תמונות מסוימות עשויות להתאים לקביעה סובייקטיבית של מאפייני שכבות ועדיין להיות באיכות לא מספקת לניתוח כמותי. לפיכך, המידה והזהירות שבה עוקבים אחר הפרוטוקול ישפיעו ישירות על התאמתה של תמונה נתונה לשמש מקור נתונים לניתוח סטטיסטי.

איור 4 מייצג את השימוש המוצלח בטכניקה בהקשר של סביבת תרבית דינמית מיקרופלואידית, ומראה רכישת תמונה בכניסה וביציאה של שני התקנים מיקרופלואידים. איור 4A,B מספק דוגמאות לשכבות שגודלו בתרבית במשך 24 שעות, ואיור 4C,D מציג דוגמאות לשכבות שגודלו בתרבית במשך 48 שעות. איור 5 ממחיש את הנתונים הקשורים שנאספו מניסוי התעלה המיקרופלואידית, ומשלב שלוש דגימות מכל אחד מחמשת מיקומי הדימות של התעלות המיקרופלואידיות שצוינו באיור 2 מכל משך תרבית. קווי שגיאה מציינים סטיות תקן.

איור 6 מתאר תמונה דו-ממדית של מישור XY במרכז התעלה המיקרופלואידית, ואיור 7 מתאר תצוגה תלת-ממדית של אותו מיקום עם קידוד צבע עומק. איור 8 מייצג רכישת תמונה מוצלחת במסגרת ניסוי משך צפיפות המנתח את ההשפעות של צפיפות הזריעה הראשונית של התאים ומשך התרבית על היווצרות שכבת התא NCI-H441 בסביבת זכוכית כיסוי בעלת שמונה בארות. איור 8A-C מציין משכי תרבית של 24 שעות, 48 שעות ו-96 שעות, בהתאמה. איור 8X-Z מציין צפיפות ראשונית של זריעת תאים של 180,000, 90,000 ו-45,000 תאים לסמ"ק2, בהתאמה. איור 9 מציג נתונים כמותיים שנאספו מניסוי זכוכית כיסוי בעלת שמונה בארות, כולל דגימות משלושה מקומות בכל התאמת משך צפיפות. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן ובדיקות ערך p בוצעו כדי לקבוע הבדלים מובהקים סטטיסטית בין ערכים קרובים לכאורה.

שני ניסויים מייצגים אלה בסביבות המיקרופלואידיות הדינמיות והסטטיות של שמונה בארות הם דוגמאות מקרה שימוש נפרדות המדגימות כיצד הטכניקה עשויה להקשר ממצאים ניסיוניים על ידי אישור חזותי של נוכחות או היעדר חד-שכבות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

Figure 4
איור 4: שכבות תאים מסוג NCI-H441 שגודלו בתרבית בתעלה המיקרופלואידית במשך 24 ו-48 שעות, וצולמו במיקומים בצד הכניסה ובצד היציאה כפי שמתואר באיור 2. (A) 24 שעות, צד כניסה. (ב) 24 שעות, צד יציאה. (ג) 48 שעות, צד כניסה. (ד) 48 שעות, צד יציאה. כחול מייצג את צביעת הגרעינים וירוק מייצג את צביעת אקטין נימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ייצוג גרפי של הנתונים שנאספו במהלך ניסוי דימות ערוץ מיקרופלואידי של 24-48 שעות. זה כולל שש דגימות שטח חתך מכל אחד מחמישה מיקומים לאורך הרלוונטי של התעלה המיקרופלואידית (כפי שמתואר באיור 2). קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תמונה דו-ממדית שצולמה במישור XY במיקום מרכזי בתוך התעלה המיקרופלואידית. כחול מייצג את צביעת הגרעינים וירוק מייצג את צביעת אקטין נימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: מודל תלת-ממדי של אותו מיקום של תעלה מיקרופלואידית כמו איור 6. קידוד הצבע מתאר נתוני עומק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: שכבות תאים מסוג NCI-H441 שגודלו בתרבית בזכוכית כיסוי בעלת שמונה תאים. במשך 24 שעות (A), 48 שעות (B) ו-96 שעות (C) בצפיפויות זריעה התחלתיות של 180,000 (X), 90,000 (Y) ו-45,000 (Z) תאים לסמ"ק2. כחול מייצג את צביעת הגרעינים וירוק מייצג את צביעת אקטין נימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: ייצוג גרפי של הנתונים שנאספו במהלך ניסוי התרבית של שמונה בארות בצפיפות. זה כולל שש דגימות שטח חתך מכל התאמת משך צפיפות. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג מתאר את התרבית, קיבוע הצלבה, צביעה, חלחול והדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית של תאי אפיתל ריאה אנושיים NCI-H441 בסביבה הדינמית של מערך זרימה מיקרופלואידית חד-ערוצית, כמו גם בסביבה הסטטית של זכוכית כיסוי מסורתית בעלת שמונה תאים. עם כל פרוטוקול תרבית תאים מיקרופלואידית, תנאי הזרימה של מדיית תרבית התא הם בעלי חשיבות עליונה, שכן לזרימה בקצב גבוה יש פוטנציאל לשטוף את התאים או להפריע להרכבה הרגילה של חד-שכבת התא. בינתיים, לזרימה בקצב נמוך יש פוטנציאל "להרעיב" או "לחנוק" (זמינות בלתי מספקת של חומרי מזון וחמצן, בהתאמה) את שכבת התא בשל מגבלות הדיפוזיה המוטלות על ידי האופי הבלתי חדיר של התעלה המיקרופלואידית כמו גם מאפייני הזרימה30. על ידי התחלה עם תקופת המתנה של 10 דקות (שבמהלכה התאים נשארים תלויים באותה מדיה שמילאה את הערוץ במקור), ואז מתקדמים לקצב זרימה של 0.2 מיקרוליטר לדקה, ולבסוף עולים ל -10 מיקרוליטר לדקה במהלך 4 שעות, צרכים מתחרים אלה מאוזנים כדי לקדם הן היצמדות לתאים והן הישרדות.

שלב קריטי נוסף בפרוטוקול הוא הכנה נכונה של התעלה המיקרופלואידית, כולל בנייה וטיפול מקדים. יש להקפיד על כך שזכוכית הכיסוי תותקן כראוי למבנה התא כדי למנוע דליפה וזיהום פוטנציאלי. חיבור נכון של זכוכית הכיסוי נחוץ גם כדי להבטיח שגובה הערוץ יהיה עקבי ומשוכפל במדויק בין ניסויים עוקבים באמצעות יחידות בנויות שונות. שונות מינורית עשויה להיווצר על ידי הסיבולת בעובי רצועות הדבק המשמשות וכן על ידי הדחיסות היחסית. מזעור כל שונות יעזור עם עקביות של תוצאות הניסוי. טיפול מקדים נכון בתעלה הבנויה חשוב כדי להבטיח שהתאים יורשו להיצמד וליזום התרבות על משטח הזכוכית. ניקוי אולטראסוני של הזכוכית משפר את ההיצמדות לפולי-די-ליזין, ומקדם היצמדות לפיברונקטין (fibronectin). הוספת פיברונקטין (fibronectin), גליקופרוטאין המסונתז ומופרש באופן טבעי על ידי תאי אפיתל אנושיים, מקדמת עוד יותר את ההיצמדות של תאי NCI-H441 למשטח הכיסוי, ומאפשרת התפתחות חד-שכבתית תקינה של תאים31.

יתר על כן, אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרוטוקול זה הוא מיקום ההדמיה. למרות הכנה מבוקרת בקפידה, בשל נפח העמודים הזמין באזורים של שני פתחי התעלה, תאים רבים יותר יהיו נוכחים על משטח זכוכית הכיסוי באזור ישירות מתחת ובסמוך לפתחים אלה, גם כאשר דבקים בטכניקות תרבית תאים נכונות. מסיבה זו, אין להתייחס לאזורים הסמוכים לפתחים כחלק משכבת התא התרבית "הרגילה", שכן תתרחש שם רב-שכבתיות / הערמת תאים משמעותית. במקום זאת, האזור המרכזי של התעלה המיקרופלואידית הוא אזור מתאים לתמונה, מכיוון שמיקום זה אינו מופרע על ידי השגיאה המוטלת על ידי שינוי גובה התעלה ליד הפתחים. ניתן להשתמש במיקומי האלקטרודות במערך הזרימה כדי להנחות מיקומי הדמיה, וככלל אצבע, כל הסריקות שנועדו ללכוד שכבות המייצגות באמת את תנאי התעלה המיקרופלואידית צריכות להילקח במיקומים מקבילים בתוך גבולות שתי האלקטרודות המרוחקות ביותר זו מזו במערך הזרימה. בנוסף, בפרוטוקול המתואר, מטרת ההגדלה פי 40 מוגדרת לשימוש; עם זאת, זה עשוי להשתנות כדי להתאים לצרכים של המשתמש. הגדלה פי 40 נבחרה כהגדלה האופטימלית בשל יכולתה להציע הדמיה ברזולוציה גבוהה ובהגדלה גבוהה תוך שמירה על מספר מספיק של תאים שישמשו כמדגם תקף סטטיסטית.

שינוי אחד שניתן לבצע בתעלה המיקרופלואידית כולל שינוי גובה התעלה, אשר ניתן להשיג על ידי שינוי מספר הספייסרים והדבקים המשמשים לבניית התעלה המיקרופלואידית. שינוי גובה הערוץ יחייב ככל הנראה התאמת פרמטרי הזרימה כדי להבטיח שלחץ הגזירה לא יסיר תאים במהלך ההזנה. לפיכך, כל שינוי בגובה הערוץ ישפיע על הקצב הראשוני האידיאלי, קצב העלייה והקצב הסופי של זרימת המדיה. הפרוטוקול המתואר במאמר זה עשוי לשמש כאמצעי שבאמצעותו ניתן להפיק קצבי זרימה מתאימים באופן ניסיוני, בשילוב עם שיטות עקיפות כגון ECIS. בנוסף, קצבי הזרימה עשויים להשתנות כך שיתאימו לצרכים של קווי תאים שונים, אשר עשויים לדרוש התאמה כדי לקבוע תנאים אופטימליים. שינוי נוסף שניתן לעשות, עם כמה תוספות לשלבים בפרוטוקול זה, הוא להרחיב את מקרה השימוש של הטכניקה המתוארת מעבר להשוואה היחסית של שטח החתך של שכבות התא. עם כיול מתאים באמצעות מיקרוספרות או מיקרו-חרוזים בממדים ידועים, ניתן לבצע מדידות שטח מדויקות של נפח נפחי, טופולוגי ומוחלט. כיול באמצעות אובייקט ייחוס נחוץ במקרה זה בשל רזולוציית Z המוגבלת של המיקרוסקופ הקונפוקלי והפוטנציאל לדגימת יתר או תת-דגימה בממד Z עקב הבקרה הידנית על גודל צעד Z-stack שמערכות סריקה קונפוקלית מציעות32.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא היעדר מדידה נפחית אמיתית בשל היעדר שלבי כיול אנכיים. הכיול שהוזכר לעיל וטכניקת האימות המשתמשת במיקרו-כדוריות פלואורסצנטיות בממדים ידועים עשויים לשמש לקנה מידה נאמן למציאות. בנוסף, הפרוטוקול הנוכחי כולל שימוש בכתמים מוכנים מראש לשימוש. צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים דורשת לעתים קרובות פרוטוקול רב-יומי מעורב יותר מזה שמאמר זה דן בו. עם זאת, סביר להניח שניתן להשתמש בכתמים אימונופלואורסצנטיים באופן זה, אם כי ייתכן שיהיה צורך בניסויים מסוימים כדי לייעל את זרימת העבודה. בהתחשב בצעדים הנוספים הכרוכים בפרוטוקולי צביעה אימונופלואורסצנטיים, יש להקפיד להימנע מגזירה של שכבת התא בתרבית במהלך שלבי השטיפה הרבים, מכיוון שהדבר עלול לשנות את תכונות שכבת התא המוערכת בסופו של דבר ולכן לפסול כל מסקנות שיבואו בעקבותיה. פיתוחים נוספים של טכניקה זו עשויים לכלול אוטומציה של ניתוח התמונה והנתונים, כולל זיהוי אזור עניין (ROI) וכימות לקביעת שטח חתך. בנוסף, הרחבת טכניקה זו כך שתכלול מבני מטרה תוך-תאיים וחוץ-תאיים שונים (אולי צביעה עבור מטרות כגון חלבונים בעלי צומת הדוק) עשויה להרחיב את מקרה השימוש של שיטה זו לקולוקליזציה תלת-ממדית בתוך התקני תרבית תאים מיקרופלואידים.

כדי לייצר את שכבות התאים המייצגות ביותר מבחינה פיזיולוגית, תאי אפיתל ריאה חייבים להיות בתרבית בתעלות מיקרופלואידיות עם ממשק אוויר-נוזל (ALI) על פני התרבית, אשר נעשה בדרך כלל באמצעות polydimethylsiloxane (PDMS), חומר גמיש שנעשה חדיר על ידי החדרת נקבוביות בקנה מידה של מיקרומטר. תנאי תרבית ALI מאפשרים היווצרות שכבות תאים הדומות ביותר לתכונות הפיזיולוגיות של אפיתל הריאה in vivo 33. בעוד שמבחינה טכנית זה אפשרי, השימוש ב-ECIS בסביבת תרבית ALI עם משטח תרבית PDMS בסביבה מיקרופלואידית דינמית אינו מעשי ואינו נגיש לרוב החוקרים, מכיוון שאין מנגנונים זמינים מסחרית להרכבה כה מורכבת של תרביות תאים34. אחת הסיבות לקושי זה עשויה להיות הצורך הפרדוקסלי במשטח תרבית חדיר שעדיין מסוגל לשמש כאלקטרודה מוצקה לצורך מדידות ECIS. לפיכך, קיים כיום צורך בשיטה לאימות חזותי של המאפיינים והרלוונטיות הפיזיולוגית של שכבות תאים בתרבית בסביבות תרבית אטומות לחמצן, כגון אלה הקיימות במערכי זרימה ECIS.

שיטה זו מרחיבה את השיטה המסורתית של הבטחת מפגש תקין באמצעות מיקרוסקופיה דו-ממדית בכך שהיא מאפשרת הדמיה תלת-ממדית, המרחיבה מאוד את מספר מאפייני שכבת התא שניתן לצפות, לכמת ולנתח. בנוסף, הדבר מאפשר קביעה סובייקטיבית של נוכחות חד-שכבתית, אחידות שכבות ותכונות אחרות הנחשבות רלוונטיות למטרות ניסוי. פרוטוקול זה חשוב מכיוון שהוא משמש כאמצעי לאימות חזותי והערכה של שכבות תאים המיוצרות בסביבות אטומות חמצן רבות, כגון בניסויי ECIS המעריכים תכונות תפקוד מחסום של תאי אפיתל שנחשפו לאטלקטוטראומה. שיטה זו משמשת גם כשיטה שניתן להשתמש בה בעבודה עתידית כדי לקבוע אם קבוצה של תנאי תרבית מיקרופלואידית דינמיים מייצרת שכבות תאים רלוונטיות ומתאימות לניסויים נוספים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים מודים לאלן שפרדסון על תכנון תבנית החיתוך עבור דבק 3M ויריעת מיילר המשמשת לבניית תעלות מיקרופלואידיות ועל בדיקת קצב זרימת המדיה של תרבית התא ותכנות משאבת המזרק. המימון סופק על ידי NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801, ומענק הדיקן של מכללת ניוקומב-טוליין.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 185
הכנה והערכה מבנית של חד-שכבות תאי אפיתל במכשיר תרבית מיקרופלואידית בגודל פיזיולוגי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. … More

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. E., Gaver III, D. P. Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device. J. Vis. Exp. (185), e64148, doi:10.3791/64148 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter