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Bioengineering

शारीरिक रूप से आकार के माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर डिवाइस में एपिथेलियल सेल मोनोलेयर की तैयारी और संरचनात्मक मूल्यांकन

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

प्रस्तुत प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक डायनामिक-कल्चर चैनलों और पारंपरिक फिक्स्ड-वेल स्टैटिक-कल्चर चैंबरों में अनुयायी सेल परत संरचना की कल्पना करने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) के साथ एक फैलोइडिन-आधारित फिलामेंटस-एक्टिन स्टेनिंग तकनीक के विकास और उपयोग का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण सेल परत कंफ्लुएंसी, मोनोलेयर गठन और परत-मोटाई एकरूपता का मूल्यांकन करने में सहायता करता है।

Abstract

इन विट्रो माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोग में तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) और वेंटिलेटर-प्रेरित फेफड़ों की चोट (वीआईएलआई) जैसी स्थितियों में होने वाली माइक्रोफिजियोलॉजिकल घटनाओं में कई अंतर्दृष्टि प्रकट करने की बड़ी क्षमता है। हालांकि, मानव फेफड़े के टर्मिनल ब्रोंकिओल्स के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक आयामों के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में अध्ययन वर्तमान में कई चुनौतियों का सामना करते हैं, विशेष रूप से किसी दिए गए संस्कृति वातावरण के भीतर मीडिया प्रवाह दर सहित उचित सेल संस्कृति स्थितियों को स्थापित करने में कठिनाइयों के कारण। प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव फेफड़ों के टर्मिनल ब्रोंकिओल्स के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक आयामों के साथ ऑक्सीजन-अभेद्य माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में संवर्धित एनसीआई-एच 441 मानव फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं की संरचना का मूल्यांकन करने के लिए एक छवि-आधारित दृष्टिकोण का वर्णन करता है। फैलोइडिन-आधारित फिलामेंटस-एक्टिन धुंधला होने का उपयोग करके, कोशिकाओं की साइटोस्केलेटल संरचनाओं को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रकट किया जाता है, जिससे व्यक्तिगत और साथ ही स्तरित कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। बाद में परिमाणीकरण यह निर्धारित करता है कि नियोजित की जा रही सेल कल्चर स्थितियां आगे के प्रयोग के लिए उपयुक्त समान मोनोलेयर का उत्पादन कर रही हैं या नहीं। प्रोटोकॉल माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों और पारंपरिक निश्चित-वेल वातावरण में सेल संस्कृति और परत मूल्यांकन विधियों का वर्णन करता है। इसमें चैनल निर्माण, सेल कल्चर और अपेक्षित स्थितियां, निर्धारण, परमेबिलाइजेशन और धुंधलापन, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग, इमेज प्रोसेसिंग और डेटा विश्लेषण शामिल हैं।

Introduction

तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एआरडीएस) फेफड़ों के पैरेन्काइमा में चोट के अपमान और प्रसार से उत्पन्न एक तीव्र स्थिति है, जिसके परिणामस्वरूप एल्वियोली की फुफ्फुसीय एडिमा, अपर्याप्त गैस विनिमय और बाद में हाइपोक्सिमिया1 होता है। यह प्रो-भड़काऊ साइटोकिन रिलीज, न्यूट्रोफिल भर्ती, विषाक्त मध्यस्थ रिलीज, और ऊतक क्षति का एक चक्र शुरू करता है, जो स्वयं एक औरभड़काऊ प्रतिक्रिया 2 का कारण बनता है। इसके अतिरिक्त, फुफ्फुसीय सर्फेक्टेंट, जो वायुमार्ग को स्थिर करता है और दोहराए जाने वाले भर्ती / डीरिक्रूटमेंट (आर / डी) के कारण होने वाले नुकसान को रोकता है, एआरडीएस के दौरान होने वाली रासायनिक प्रक्रियाओं द्वारा निष्क्रिय या अन्यथा बेकार हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आसपास के पैरेन्काइमा3 को और तनाव और चोट लग सकती है। यदि पर्याप्त क्षति बनी रहती है, तो पर्याप्त प्रणालीगतऑक्सीजन सुनिश्चित करने के लिए यांत्रिक वेंटिलेशन आवश्यक हो सकता है। हालांकि, यांत्रिक वेंटिलेशन अपनी चुनौतियों और आघातों को लागू करता है, जिसमें वेंटिलेटर-प्रेरित फेफड़ों की चोट (वीआईएलआई) की संभावना शामिल है, जो ओवरइन्फ्लेशन (वोल्यूट्रॉमा) के दौरान लगाए गए यांत्रिक तनाव के कारण फेफड़ों के पैरेन्काइमा में चोट के रूप में विशेषता है और / या द्रव-अवरुद्ध वायुमार्ग (एटेलेक्ट्रॉमा) में वायु-तरल इंटरफ़ेस के आर / डी।. एटेलेक्ट्रॉमा मॉडल में वायु-तरल इंटरफ़ेस (जैसे द्रव-ऑक्लुडेड ब्रोन्किओल में) के संपर्क में आने वाली उपकला कोशिकाओं द्वारा अनुभव किए गए दबाव ढाल के परिणामस्वरूप पारगम्यता-उत्पन्न अवरोधक प्रतिक्रिया (पीयूएआर) हो सकती है, जिससे चोट का एक खराब-गेट-पीयूईआर पुण्य चक्र 6,7,8 हो सकता है।

इन विट्रो प्रयोग इन घटनाओं में सूक्ष्म पैमाने पर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक आयामों के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनल वातावरण में वर्तमान अध्ययनकई चुनौतियों का सामना करते हैं। एक के लिए, सेल कल्चर स्थितियों का अनुकूलन माइक्रोफ्लुइडिक वातावरण में सेल कल्चर अनुसंधान के लिए प्रवेश के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा है, क्योंकि एक संकीर्ण चौराहे मौजूद है जिसके भीतर मीडिया प्रवाह पैरामीटर, संस्कृति अवधि और अन्य संस्कृति स्थितियां इष्टतम सेल परत गठन की अनुमति देती हैं। इसमें माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर चैनल बाड़े की ऑक्सीजन-अभेद्य प्रकृति द्वारा लगाई गई प्रसार सीमाएं शामिल हैं। इसके लिए मीडिया प्रवाह मापदंडों पर सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि कम प्रवाह दर कोशिकाओं को ऑक्सीजन से वंचित कर सकती है, विशेष रूप से इनलेट से सबसे दूर; दूसरी ओर, उच्च प्रवाह दर कोशिकाओं को संस्कृति चैनल से बाहर धकेल सकती है या इसके परिणामस्वरूप अनुचित या असमान परत विकास हो सकता है। प्रसार सीमाओं को वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) संस्कृति तंत्र में पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) जैसे ऑक्सीजन-पारगम्य सामग्रियों का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है; हालांकि, कई पारंपरिक माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर चैनल, जैसे कि इलेक्ट्रिक सेल-सब्सट्रेट प्रतिबाधा संवेदन (ईसीआईएस) प्रणाली, निर्मित बाड़ेकी प्रकृति को देखते हुए स्वाभाविक रूप से ऑक्सीजन-अभेद्य हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ऑक्सीजन-अभेद्य बाड़े में सुसंस्कृत सेल परतों का विश्लेषण करने के लिए एक तकनीक प्रदान करना है।

संस्कृति स्थितियों की व्यवहार्यता की तुलना करते समय, विशिष्ट परत विशेषताओं के अवलोकन, जैसे कि एक मोनोलेयर की उपस्थिति, सतह टोपोलॉजी, कंफ्लुएंसी और परत-मोटाई एकरूपता, यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं कि संस्कृति स्थितियों के एक विशेष सेट द्वारा उत्पादित सेल परत वांछित विनिर्देशों को पूरा करती है और वास्तव में प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए प्रासंगिक है। ईसीआईएस जैसे तरीकों द्वारा एक सीमित मूल्यांकन किया जा सकता है, जो प्रवाह सरणी के भीतर सोने के इलेक्ट्रोड पर संवर्धित कोशिकाओं के विद्युत-इन्सुलेट झिल्ली द्वारा लगाए गए उच्च आवृत्ति वैकल्पिक धारा (एसी) (प्रतिबाधा) के प्रतिरोध द्वारा बनाई गई विद्युत क्षमता (वोल्टेज) के माप का उपयोग करता है। कोशिकाओं पर लागू एसी की आवृत्ति को संशोधित करके, कोशिकाओं और सेल परतों के विशिष्ट आवृत्ति-निर्भर सेलुलर गुणों जैसे सतह पालन शक्ति, तंग-जंक्शन गठन, और सेल प्रसार या कंफ्लुएंसी को लक्षित किया जा सकता हैऔर जांच की जा सकती है। हालांकि, माप के इन अप्रत्यक्ष रूपों को एक प्रयोग की शुरुआत में व्याख्या करना कुछ मुश्किल है, और सेल परत के सभी प्रासंगिक पहलुओं को निर्धारित नहीं कर सकता है। बस एक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत सेल परत का अवलोकन करने से कुछ गुणों की प्रकृति का पता चल सकता है जैसे कि कंफ्लुएंसी; हालांकि, कई प्रासंगिक विशेषताओं जैसे कि एक मोनोलेयर और परत-मोटाई एकरूपता की उपस्थिति के लिए तीन-आयामी (3 डी) मूल्यांकन की आवश्यकता होती है जो ब्राइटफील्ड, फेज-कंट्रास्ट या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग12 के साथ संभव नहीं है।

इस अध्ययन का उद्देश्य एक मोनोलेयर के इमेजिंग-आधारित सत्यापन और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग करके सेल परत एकरूपता के मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए एक फिलामेंटस-एक्टिन स्टेनिंग तकनीक विकसित करना था। फिलामेंटस-एक्टिन (एफ-एक्टिन) को फ्लोरोफोरे संयुग्म के लिए एक उपयुक्त लक्ष्य माना जाता था, जिस तरह से एफ-एक्टिन कोशिका झिल्ली का कसकर अनुसरण करता है, जिससे पूरे सेल वॉल्यूम13 के दृश्य अनुमान की अनुमति मिलती है। एफ-एक्टिन को लक्षित करने का एक और महत्वपूर्ण लाभ यह है कि जिस तरह से एफ-एक्टिन का धुंधलापन कोशिकाओं द्वारा अनुभव किए गए तनाव और उपभेदों द्वारा लगाए गए साइटोस्केलेटल व्यवधान या परिवर्तनों को स्पष्ट करता है। मेथनॉल-मुक्त फॉर्मलाडेहाइड के साथ क्रॉसलिंकिंग निर्धारण का उपयोग कोशिकाओं और कोशिका परत की आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए किया गया था, क्योंकि मेथनॉल जैसे निर्जलीकरण फिक्सेटिव कोशिकाओं को समतल करते हैं, कोशिका परत को विकृत करते हैं औरइसके गुणों को बदलते हैं।

इन चुनौतियों को कम करने के लिए परत मूल्यांकन तकनीक की क्षमता निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को पारंपरिक आठ-अच्छी संस्कृति कक्षों के साथ-साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में सुसंस्कृत किया गया था ताकि उत्पादित सेल परतों में अंतर, यदि कोई हो, का मूल्यांकन किया जा सके। निश्चित संस्कृति कुओं के लिए, आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास इकाइयों का उपयोग किया गया था। माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर के लिए, प्रवाह सरणियों (चैनल लंबाई 50 मिमी, चौड़ाई 5 मिमी, गहराई 0.6 मिमी) को मानव फेफड़ों के श्वसन क्षेत्र में मौजूद टर्मिनल ब्रोंकियोल्स के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक आयामों वाले वातावरण में अमरमानव फेफड़ों के उपकला (एनसीआई-एच 441) कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए अनुकूलित किया गया था। जबकि यह प्रोटोकॉल ईसीआईएस प्रवाह सरणियों के संस्कृति वातावरण को ध्यान में रखते हुए विकसित किया गया था, यह किसी भी ऑक्सीजन-अभेद्य गतिशील-संस्कृति वातावरण पर लागू हो सकता है जिसके लिए सुसंस्कृत सेल परत विशेषताओं या संस्कृति स्थितियों का मूल्यांकन आवश्यक है।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए एनसीआई-एच 441 मानव उपकला फेफड़े की कोशिका लाइन का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में सेल कल्चर

  1. माइक्रोफ्लुइडिक चैनल बनाएं और नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पूर्व-उपचार करें।
    1. एक एकल-चैनल प्रवाह सरणी प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें) और पॉली कार्बोनेट बेस प्लेट से ऊपरी भाग को अलग करें।
    2. 60 मिमी x 22 मिमी के आयामों के साथ # 1.5 आयताकार कवरग्लास (मोटाई 0.17 मिमी) प्राप्त करें। एक अल्ट्रासोनिक स्नान में कवरग्लास की सतहों को साफ करें और 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सूखने से पहले 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पॉली-डी-लाइसिन के 0.1 मिलीग्राम / एमएल समाधान के साथ एक तरफ का इलाज करें।
    3. प्रवाह सरणी शीर्ष और प्रवाह चैनल (50 मिमी लंबाई, 5 मिमी चौड़ाई) के आयामों को समायोजित करने के लिए 0.13 मिमी मोटी डबल-पक्षीय चिपकने वाली ( सामग्री की तालिका देखें), प्रवाह सरणी शीर्ष पर लेजर-कट चिपकाएं, चैनल कट-आउट17 को सटीक रूप से संरेखित करने का ध्यान रखें।
    4. 0.1 मिमी मोटी माइलर स्पेसर (सामग्री की तालिका देखें), प्रवाह सरणी शीर्ष और प्रवाह चैनल के आयामों को समायोजित करने के लिए लेजर-कट को चिपकने वाली पट्टी पर चिपकाएं, चैनल कट-आउट को सटीक रूप से संरेखित करने का ध्यान रखें।
    5. चरण 1.1.3 और 1.1.4 को तब तक दोहराएं जब तक कि वांछित चैनल ऊंचाई प्राप्त न हो जाए (उदाहरण के लिए, 0.6 मिमी की चैनल ऊंचाई के लिए, दो स्पेसर और तीन चिपकने वाली स्ट्रिप्स का उपयोग करें)।
    6. पॉली-डी-लाइसिन-उपचारित पक्ष के साथ सबसे नीचे चिपकने वाली पट्टी पर एक आयताकार कवरग्लास चिपकाएं। असेंबली पूरी होने के बाद, जैसा कि चित्र 1 में दर्शाया गया है, निर्माण के शीर्ष और निचले हिस्से पर दृढ़ और समान दबाव लागू करें और 1 मिनट तक पकड़ें।
      नोट: चैनल बाड़े का निर्माण, जिसमें कवरग्लास, चिपकने वाला, स्पेसर और फ्लो सरणी टॉप शामिल हैं, अब पूरा हो गया है।
    7. एक सिरिंज का उपयोग करके चैनल को डी-आयनीकृत पानी से धोएं, साथ ही रिसाव की जांच करें।
    8. 30 मिनट18 के लिए एक पराबैंगनी (यूवी) स्टरलाइज़र में चैनल बाड़े को स्टरलाइज़ करें।
    9. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 2.0 μg / mL मानव फाइब्रोनेक्टिन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ चैनल का इलाज करें और 37 डिग्री सेल्सियस19 पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में सेल कल्चर करें।
    1. एक बाँझ लामिनर प्रवाह हुड में, आरपीएमआई 1640 माध्यम में एनसीआई-एच 441 कोशिकाओं के समान निलंबन को स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें, जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (सामग्री की तालिका देखें) के साथ दो माइक्रोफ्लुइडिक चैनल ों को बीज करने के लिए, जिनमें से प्रत्येक की सतह घनत्व 150,000 कोशिकाओं / सेमी2 की सतह घनत्व पर कोशिकाएं हैं।
      1. 50 मिमी x 5 मिमी x 0.6 मिमी चैनलों के लिए, प्रत्येक चैनल को भरने के लिए 2.5 x 106 सेल / एमएल निलंबन के 0.25 एमएल का उपयोग करें, साथ ही पोर्ट के एक हिस्से का भी। सत्यापित करें कि कोशिकाओं को ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चैनलों के भीतर समान रूप से वितरित किया गया है।
    2. प्रोग्राम करने योग्य सिरिंज पंप का उपयोग करके 5% सीओ2 के साथ क्रमशः 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे और 48 घंटे के लिए दो चैनलों को कल्चर करें ( सामग्री की तालिका देखें), चैनल इनलेट से जुड़े बाँझ मीडिया जलाशय से चैनल में खर्च किए गए मीडिया और ताजा मीडिया को खींचना जिसमें पैराफिन फिल्म से ढका हुआ 20 एमएल सिरिंज शामिल है।
      1. सेल सीडिंग के बाद 10 मिनट की प्रतीक्षा अवधि के बाद, चैनल के माध्यम से जलाशय से ताजा मीडिया को पेश करें और पंप करें, 0.2 μL / min से शुरू होने वाले परिवर्तनीय प्रवाह दर पर और 4 घंटे के लिए 10 μL / min तक बढ़ाएं, उसके बाद20 के बाद उस दर पर बनाए रखें।
        नोट: यह चर प्रवाह दर संस्कृति की स्थिति प्रदान करती है जो कोशिकाओं को (1) गुरुत्वाकर्षण रूप से संस्कृति की सतह पर बसने की अनुमति देती है, (2) संस्कृति की सतह का पालन करती है, और (3) एक कंफ्लुएंट मोनोलेयर बनाती है।
  3. फॉर्मलाडेहाइड समाधान का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के अंदर सेल निर्धारण करें।
    सावधानी: फॉर्मलाडेहाइड विषाक्त है और इसे उचित रासायनिक फ्यूम हुड21 में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    1. एक रासायनिक फ्यूम हुड में, पीबीएस (मेथनॉल-मुक्त) में 4% फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करके फॉर्मलाडेहाइड समाधान तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें) दो 4 एमएल भागों को बनाने के लिए, पहले को 1% फॉर्मलाडेहाइड की एकाग्रता तक पतला करें और दूसरे से 2% फॉर्मलाडेहाइड को डलबेकको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस; सीए 2 + और एमजी2 + के साथ) का उपयोग करके डिल्यूनेट के रूप में उपयोग करें। फॉर्मलाडेहाइड समाधान को 5 एमएल सिरिंज को अलग करने और तदनुसार लेबल करने के लिए स्थानांतरित करें। डीपीबीएस के 20 एमएल को एक अलग 20 एमएल सिरिंज में खींचें।
    2. संस्कृति तंत्र से माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को हटा दें और उन्हें रासायनिक फ्यूम हुड में रखें।
    3. निर्धारण और धुंधला उपकरण को इकट्ठा करें।
      1. पुरुष ल्यूर लॉक के माध्यम से तीन-तरफा स्टॉपकॉक के साइड पोर्ट पर ट्रांसफर ट्यूबिंग के 10 सेमी सेगमेंट को नली बार्ब एडाप्टर (सामग्री की तालिका देखें) में संलग्न करें, फिर स्टॉपकॉक को प्रवाह सरणी के इनलेट पोर्ट से कनेक्ट करें।
      2. इसके बाद, उसी प्रकार के नली बार्ब एडाप्टर का उपयोग करके प्रवाह सरणी के आउटलेट पोर्ट में ट्रांसफर ट्यूबिंग के एक और 10 सेमी सेगमेंट को संलग्न करें।
      3. अंत में, एक रासायनिक और बायोहैजार्ड-उपयुक्त अपशिष्ट कंटेनर में दोनों स्थानांतरण ट्यूबों के मुक्त सिरों को सुरक्षित करें, जैसे कि एक लेबल खाली 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब।
    4. प्रवाह सरणी इनलेट पोर्ट को अवरुद्ध करने के लिए स्टॉपकॉक को चालू करें और डीपीबीएस के साथ अपशिष्ट रेखा को फ्लश करें। फिर, अपशिष्ट रेखा को अवरुद्ध करने के लिए स्टॉपकॉक को चालू करें और धीरे-धीरे 2 एमएल डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं। हर बार नए समाधान का उपयोग करके फ्लशिंग चरण को दोहराएं। चैनल में एक नया समाधान (या समाधान की एकाग्रता) पेश किया जाता है।
    5. चैनल के माध्यम से धीरे-धीरे 1% फिक्सेटिव घोल के 2 एमएल को धक्का दें और फिर 5 मिनट22 के लिए बैठने दें।
    6. चैनल के माध्यम से धीरे-धीरे 2% फिक्सेटिव घोल के 2 एमएल को धक्का दें और फिर 15 मिनट के लिए बैठने दें।
    7. तीन अलग-अलग उदाहरणों (5 मिनट प्रत्येक) में चैनल पर धीरे-धीरे 2 एमएल ताजा डीपीबीएस पेश करके कोशिकाओं को धोएं।
    8. समानांतर में दोनों माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के लिए चरण 1.3.3-1.3.7 को पूरा करें।
  4. माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में कोशिकाओं पर दाग लगाएं, परमेबिलाइज करें, और बढ़ते मीडिया को जोड़ें।
    1. 4 मिलीलीटर घोल का उत्पादन करने के लिए डीपीबीएस के प्रति एमएल में 1 मिलीग्राम सैपोनिन ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़कर 0.1% सैपोनिन समाधान तैयार करें और23 को मिलाने के लिए धीरे से भंवर करें। डीपीबीएस के 8 एमएल को 20 एमएल सिरिंज में खींचें।
    2. सैपोनिन घोल के प्रति एमएल प्रत्येक अभिकर्मक की दो बूंदों (0.1 एमएल) पर, 0.1% सैपोनिन समाधान में एक एफ-एक्टिन-स्टेनिंग फैलोइडिन अभिकर्मक और एक न्यूक्लियस-स्टेनिंग होकस्ट अभिकर्मक (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी24 के साथ कवर करके तैयार धुंधला / परमेबिलाइजिंग समाधान को प्रकाश से दूर रखें।
    3. परमेबिलाइजिंग समाधान (जैसा कि चरण 1.3.4 में वर्णित है) की एक छोटी मात्रा के साथ लाइन को फ्लश करें, फिर माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में 2 एमएल समाधान पेश करें और चैनल को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति देने से पहले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
    4. 5 मिनट प्रति फ्लश के लिए 2 मिलीलीटर डीपीबीएस के साथ दो बार धुंधला/परमेबिलाइजिंग घोल को बाहर निकालें।
    5. बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए, चैनल में एक उपयुक्त माउंटिंग मीडिया जोड़ें (माइक्रोस्कोप उद्देश्य तेल और कवर ग्लास से निकटता से मेल खाने वाले अपवर्तन के सूचकांक के साथ, सामग्री की तालिका देखें)।
      1. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के प्रत्येक पोर्ट पर एक नरम-सेट एंटीफैड माउंटेंट की न्यूनतम मात्रा पेश करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नीचे की सतह पूरी तरह से कवर की गई है और वांछित इमेजिंग क्षेत्र25 के भीतर कोई बुलबुले नहीं फंसे हैं। चैनल के सिरों को सील करें और एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन करके सेल परत अखंडता को सत्यापित करें।
    6. समानांतर में दोनों माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के लिए चरण 1.4.3-1.4.5 को पूरा करें।
      नोट: अधिकतम छवि गुणवत्ता के लिए धुंधला होने के बाद जितनी जल्दी हो सके छवि कक्ष। यदि फोटोब्लीचिंग होती है या दीर्घकालिक भंडारण वांछित है, तो एंटीफैड या नमूना-संरक्षण गुणों वाले अन्य माउंटिंग मीडिया का उपयोग किया जा सकता है। ध्यान दें कि हार्ड-इलाज माउंटिंग मीडिया कोशिकाओं की 3 डी संरचना और, विस्तार से, सेल परत को विकृत कर देगा; इस कारण से, सॉफ्ट-सेटिंग माउंटिंग मीडिया बेहतर है26.
  5. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में छवि कोशिकाएं।
    1. कॉनफोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) सेटिंग्स को समायोजित करें, जिसमें लेजर पावर, गेन, ऑफसेट और स्कैन पैरामीटर जैसे स्कैन गति, स्कैन क्षेत्र, स्कैन प्रारूप, रिज़ॉल्यूशन और पिनहोल व्यास27 शामिल हैं।
    2. वांछित छवि मापदंडों और शर्तों को पूरा करने तक संदर्भ स्कैन के साथ-साथ जेड-स्टैक्स लेकर इमेजिंग स्थान का परीक्षण करें। 40x तेल-विसर्जन उद्देश्य तक पहुंचने औरअनुकूलित होने तक क्रमिक रूप से उच्च-आवर्धन उद्देश्यों पर डायल-इन पैरामीटर।
    3. एक संदर्भ के रूप में प्रवाह सरणी बेस प्लेट का उपयोग करते हुए, पांच स्थानों पर जेड-स्टैक का निर्माण करें, इनलेट साइड पर पहले इलेक्ट्रोड के स्थान पर, केंद्र और पिछले स्थान के बीच आधे रास्ते पर, केंद्र, केंद्र और अंतिम इलेक्ट्रोड के स्थान के बीच आधे रास्ते (आउटलेट साइड पर), और अंतिम इलेक्ट्रोड पर, जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है।
  6. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण करें।
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके एक्सजेड और वाईजेड क्रॉस-सेक्शन निर्यात करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    2. एज-डिटेक्शन क्षमताओं (थ्रेशोल्डिंग मान 15.0) के साथ एक छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, छवि के बाहर मैजिक वैंड टूल का उपयोग करके पिक्सेल में कुल छवि क्षेत्र को मापें, फिर सेल परत29 के बाहर छवि के बाहर के हिस्से में मैजिक वैंड टूल का उपयोग करके पिक्सेल में सेल परत के कुल क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र को छोड़कर क्षेत्र।
    3. डेटा-प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र पिक्सेल मान खोजने के लिए कुल क्षेत्र पिक्सेल मान से बाहरी क्षेत्र पिक्सेल मान घटाएं।
    4. क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र पिक्सेल मानों कोμm/ pixel मान के वर्ग से गुणा करके μm2 मानों में कनवर्ट करें, जैसा कि विशेष छवि के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर में दर्शाया गया है (40x तेल-विसर्जन लेंस पर ज़ूम के बिना 1024p रिज़ॉल्यूशन में लिए गए Z-स्टैक्स के लिए 0.31 μm/pixel)।
    5. डेटा और ग्राफ परिणामों के साधनों और मानक विचलन की गणना करें।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोफ्लुइडिक चैनल निर्माण का विस्फोट-दृश्य योजनाबद्ध। शीर्ष तत्व प्रवाह सरणी का शीर्ष भाग है, पतले भूरे तत्व चिपकने वाली स्ट्रिप्स हैं, पतले नीले तत्व मायलर स्पेसर हैं, और निचला तत्व आयताकार कवरग्लास है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर चैनल के लगातार परत-उत्पादक क्षेत्र के साथ पांच इमेजिंग स्थान। इमेजिंग स्थान निम्नानुसार हैं: इनलेट-साइड, पास जहां पहला इलेक्ट्रोड बरकरार प्रवाह सरणी पर होगा; इनलेट-साइड स्थान और चैनल के केंद्र के बीच आधे रास्ते में; चैनल का केंद्र; केंद्र और आउटलेट-साइड स्थान के बीच आधे रास्ते में, और आउटलेट-साइड, जहां अंतिम इलेक्ट्रोड बरकरार प्रवाह सरणी पर होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास में सेल कल्चर।

  1. आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास का पूर्व-उपचार करें।
    1. # 1.5 कवरग्लास और सेल पालन-बढ़ती सतह उपचार के साथ निर्मित एक बाँझ आठ-अच्छी तरह से चैंबर ्ड कवरग्लास प्राप्त करें (चित्रा 3, सामग्री की तालिका देखें)।
    2. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, पीबीएस में 2.0 μg / mL मानव फाइब्रोनेक्टिन के साथ कल्चर कुओं की सतह का इलाज करें और 37 °C19 पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए चैंबर ्ड कवरग्लास में सेल कल्चर करें।
    1. एक बाँझ लामिनर प्रवाह हुड में, एनसीआई-एच 441 कोशिकाओं के घोल ों के 0.5 मिलीलीटर भागों को आरपीएमआई 1640 माध्यम में समान रूप से निलंबित कर दिया जाता है, जिसमें 10% एफबीएस 81,000, 162,000 और 324,000 कोशिकाओं / एमएल की वॉल्यूमेट्रिक घनत्व पर क्रमशः 45,000, 90,000 और 180,000 कोशिकाओं / सत्यापित करें कि कोशिकाओं को एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कुओं के भीतर समान रूप से वितरित किया गया है।
    2. 24 घंटे, 48 घंटे और 96 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ कल्चर सेल, दैनिक मीडिया की जगह।
  3. आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास में फॉर्मलाडेहाइड निर्धारण करें।
    सावधानी: फॉर्मलाडेहाइड विषाक्त है और इसे उचित रासायनिक फ्यूम हुड21 में नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    1. एक रासायनिक फ्यूम हुड में, पीबीएस (मेथनॉल-मुक्त) में 4% फॉर्मलाडेहाइड के दो भाग बनाकर फॉर्मलाडेहाइड समाधान तैयार करें, पहले को 1% फॉर्मलाडेहाइड की एकाग्रता तक पतला करें और दूसरे को डलबेकको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस; सीए 2 + और एमजी 2+ के साथ) का उपयोग करके2% फॉर्मलाडेहाइड तक पतला करें।
    2. इनक्यूबेटर से आठ-अच्छी तरह से कल्चर चैंबर वाले कवरग्लास को हटा दें और इसे रासायनिक फ्यूम हुड में रखें।
    3. प्रत्येक कुएं के कोने के ऊपरी हिस्से के साथ धीरे-धीरे तरल पेश करके माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 0.5 एमएल डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं।
    4. माइक्रोपिपेट का उपयोग करके कुओं के कोने से धीरे-धीरे निकालकर प्रत्येक कुएं में मौजूदा तरल को हटा दें। तरल-परिचय विधि (चरण 2.3.3) का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में 1% फिक्सेटिव घोल के 0.5 एमएल पेश करें और इसे 5 मिनट22 तक बैठने दें।
    5. चरण 2.3.4 में उल्लिखित तरल-निष्कर्षण विधि का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में मौजूदा तरल को हटा दें। चरण 2.3.3 में उल्लिखित तरल-परिचय विधि का उपयोग करते हुए, प्रत्येक कुएं में 2% फिक्सेटिव घोल के 0.5 एमएल पेश करें और इसे 15 मिनट तक बैठने दें।
    6. तरल परिचय और निष्कर्षण विधियों (चरण 2.3.3 और 2.3.4) का उपयोग करके, प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन अलग-अलग उदाहरणों में प्रत्येक कुएं में 0.5 मिलीलीटर ताजा डीपीबीएस पेश करके और हटाकर कोशिकाओं को धोएं।
  4. आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास में धुंधलापन, परमेबिलाइजेशन और बढ़ते मीडिया जोड़ का प्रदर्शन करें।
    1. डीपीबीएस के प्रति एमएल 1 मिलीग्राम सैपोनिन जोड़कर 0.1% सैपोनिन घोल तैयार करें और23 को मिलाने के लिए धीरे से भंवर करें।
    2. 0.1% सैपोनिन समाधान में, एफ-एक्टिन-स्टेनिंग फैलोइडिन अभिकर्मक और सैपोनिन समाधान के प्रति एमएल में एक नाभिक-धुंधला होचस्ट अभिकर्मक की दो बूंदें (0.1 एमएल) जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी24 के साथ कवर करके तैयार घोल को प्रकाश से दूर रखें।
    3. प्रत्येक कुएं में 0.2 एमएल धुंधला / परमेबिलाइजिंग घोल पेश करें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति देने से पहले एल्यूमीनियम पन्नी के साथ चैंबर कवर ग्लास को कवर करें।
    4. 0.5 एमएल डीपीबीएस के साथ दो बार धुंधला/परमेबिलाइजिंग घोल को बाहर निकालें।
    5. बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए, कुओं में एक उपयुक्त माउंटिंग मीडिया (माइक्रोस्कोप उद्देश्य तेल और कवर ग्लास से निकटता से मेल खाने वाले अपवर्तन के सूचकांक के साथ) जोड़ें।
      1. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं में एक नरम-सेट एंटीफैड माउंटेंट की न्यूनतम मात्रा पेश करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि नीचे की सतह पूरी तरह से कवर की गई है और वांछित इमेजिंग क्षेत्र25 के भीतर कोई बुलबुले नहीं फंसे हैं। एक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन करके सेल परत अखंडता को सत्यापित करें।
        नोट: अधिकतम छवि गुणवत्ता के लिए धुंधला होने के बाद जितनी जल्दी हो सके छवि कक्ष। यदि फोटोब्लीचिंग होती है या दीर्घकालिक भंडारण वांछित है, तो एंटीफैड या नमूना-संरक्षण गुणों वाले अन्य माउंटिंग मीडिया का उपयोग किया जा सकता है। ध्यान दें कि हार्ड-इलाज िंग माउंटिंग मीडिया कोशिकाओं की 3 डी संरचना को विकृत कर देगा और, विस्तार से, सेल परत, इसलिए सॉफ्ट-सेटिंग माउंटिंग मीडियाबेहतर है।
  5. आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास में इमेजिंग करें।
    1. कॉनफोकल माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को समायोजित करें, जिसमें लेजर पावर, गेन, ऑफसेट और स्कैन पैरामीटर जैसे स्कैन गति, स्कैन क्षेत्र, स्कैन प्रारूप, रिज़ॉल्यूशन और पिनहोल व्यास27 शामिल हैं।
    2. वांछित छवि मापदंडों और शर्तों को पूरा करने तक संदर्भ स्कैन के साथ-साथ जेड-स्टैक्स लेकर इमेजिंग स्थान का परीक्षण करें। 40x तेल-विसर्जन उद्देश्य तक पहुंचने औरअनुकूलित होने तक क्रमिक रूप से उच्च-आवर्धन उद्देश्यों पर डायल-इन पैरामीटर।
    3. प्रत्येक सीडिंग घनत्व/संस्कृति अवधि मिलान में तीन यादृच्छिक स्थानों के जेड-ढेर का निर्माण करें।
  6. छवि प्रसंस्करण और डेटा विश्लेषण करें।
    1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके एक्सजेड और वाईजेड क्रॉस सेक्शन निर्यात करें।
    2. एज-डिटेक्शन क्षमताओं (थ्रेशोल्डिंग मान 15.0) के साथ एक छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, छवि के बाहर मैजिक वैंड टूल का उपयोग करके पिक्सेल में कुल छवि क्षेत्र को मापें, फिर सेल परत29 के बाहर छवि के बाहर के हिस्से में मैजिक वैंड टूल का उपयोग करके पिक्सेल में सेल परत के कुल क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र को छोड़कर क्षेत्र।
    3. डेटा-प्रोसेसिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र पिक्सेल मान खोजने के लिए कुल क्षेत्र पिक्सेल मान से बाहरी क्षेत्र पिक्सेल मान घटाएँ.
    4. क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र पिक्सेल मानों को μm/pixel मान के वर्ग से गुणा करके μm/pixel मान में कनवर्ट करें जैसा कि विशेष छवि के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर में दर्शाया गया है (40x तेल-विसर्जन लेंस पर कोई ज़ूम न होने के साथ 1024p रिज़ॉल्यूशन में लिए गए Z-स्टैक्स के लिए 0.31μm/ pixel)।
    5. साधनों और मानक विचलन और ग्राफ परिणामों की गणना करें।

Figure 3
चित्रा 3: सेल परतों के निर्माण पर प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व और संस्कृति अवधि के प्रभावों की तुलना करते हुए निश्चित-वेल कल्चर, धुंधला और इमेजिंग प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास का आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

प्रस्तुत विधि माइक्रोफ्लुइडिक कल्चर चैनलों में सुसंस्कृत उपकला कोशिका परतों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है और सत्यापन के रूप में पारंपरिक फिक्स्ड-वेल सेल कल्चर वातावरण में एक प्रदर्शन का उपयोग करती है। प्राप्त छवियां गुणवत्ता, सिग्नल तीव्रता और सेलुलर लक्ष्य विशिष्टता के स्पेक्ट्रम पर मौजूद होंगी। सफल छवियां उच्च विरोधाभास प्रदर्शित करेंगी, जिससे छवि विश्लेषण और बाद के सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए डेटा का परिमाणीकरण हो सकेगा। असफल छवियां मंद, धुंधली, धुंधली या अन्यथा व्यक्तिपरक या मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुपयोगी होंगी। कुछ छवियां व्यक्तिपरक परत विशेषता निर्धारण के लिए उपयुक्त हो सकती हैं, जबकि मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अभी भी अपर्याप्त गुणवत्ता की हैं। इस प्रकार, प्रोटोकॉल का पालन करने की डिग्री और देखभाल सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा स्रोत के रूप में सेवा करने के लिए किसी दिए गए छवि की उपयुक्तता को सीधे प्रभावित करेगी।

चित्रा 4 एक माइक्रोफ्लुइडिक गतिशील-संस्कृति वातावरण के संदर्भ में तकनीक के सफल उपयोग का प्रतिनिधित्व करता है और दो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के इनलेट और आउटलेट पर छवि अधिग्रहण दिखाता है। चित्रा 4A, B 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत परतों के उदाहरण प्रदान करता है, और चित्रा 4C, D 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत परतों के उदाहरण प्रस्तुत करता है। चित्रा 5 माइक्रोफ्लुइडिक चैनल प्रयोग से एकत्र किए गए संबंधित डेटा को दर्शाता है, जिसमें प्रत्येक संस्कृति अवधि से चित्रा 2 में इंगित पांच माइक्रोफ्लुइडिक चैनल इमेजिंग स्थानों में से प्रत्येक से तीन नमूने शामिल हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को दर्शाती हैं.

चित्रा 6 माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के केंद्र में एक्सवाई विमान की 2 डी छवि को दर्शाता है, और चित्रा 7 गहराई रंग-कोडिंग के साथ उसी स्थान के 3 डी दृश्य को दर्शाता है। चित्रा 8 एक घनत्व-अवधि प्रयोग के भीतर सफल छवि अधिग्रहण का प्रतिनिधित्व करता है जो आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास वातावरण में एनसीआई-एच 441 सेल परत गठन पर प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व और संस्कृति अवधि के प्रभावों का विश्लेषण करता है। चित्र 8A-C क्रमशः 24 घंटे, 48 घंटे और 96 घंटे की संस्कृति अवधि को इंगित करता है। चित्र 8X-Z क्रमशः 180,000, 90,000 और 45,000 कोशिकाओं/सेमी2 की प्रारंभिक सेल सीडिंग घनत्व को इंगित करता है। चित्रा 9 आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास प्रयोग से एकत्र किए गए मात्रात्मक डेटा को प्रस्तुत करता है, जिसमें प्रत्येक घनत्व-अवधि मैच-अप में तीन स्थानों से नमूने शामिल हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं और स्पष्ट रूप से करीबी मूल्यों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर निर्धारित करने के लिए पी-वैल्यू परीक्षण किए गए थे।

गतिशील माइक्रोफ्लुइडिक और स्थैतिक आठ-वेल वातावरण के भीतर ये दो प्रतिनिधि प्रयोग अलग-अलग उपयोग-मामले उदाहरण हैं जो प्रदर्शित करते हैं कि तकनीक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मोनोलेयर की उपस्थिति या अनुपस्थिति की नेत्रहीन पुष्टि करके प्रयोगात्मक निष्कर्षों को कैसे प्रासंगिक बना सकती है।

Figure 4
चित्रा 4: एनसीआई-एच 441 सेल परतों को 24 और 48 घंटे के लिए माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में संवर्धित किया जाता है, जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है। (ए) 24 घंटे, इनलेट-साइड। (बी) 24 घंटे, आउटलेट-साइड। (सी) 48 घंटे, इनलेट-साइड। (डी) 48 घंटे, आउटलेट-साइड। नीला नाभिक धुंधला होने का प्रतिनिधित्व करता है और हरा फिलामेंटस-एक्टिन के धुंधलापन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: 24-48 एच माइक्रोफ्लुइडिक चैनल इमेजिंग प्रयोग के दौरान एकत्र किए गए डेटा का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। इसमें माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की प्रासंगिक लंबाई के साथ पांच स्थानों में से प्रत्येक से छह क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र नमूने शामिल हैं (जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है)। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के भीतर एक केंद्रीय स्थान पर एक्सवाई विमान में ली गई 2 डी छवि। नीला नाभिक धुंधला होने का प्रतिनिधित्व करता है और हरा फिलामेंटस-एक्टिन के धुंधलापन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: चित्रा 6 के समान माइक्रोफ्लुइडिक चैनल स्थान का 3 डी मॉडल। रंग-कोडिंग गहराई डेटा को दर्शाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: एनसीआई-एच 441 सेल परतों को आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास में संवर्धित किया गया। 24 घंटे (ए), 48 एच (बी), और 96 एच (सी) के लिए 180,000 (एक्स), 90,000 (वाई), और 45,000 (जेड) कोशिकाओं / सेमी2 के प्रारंभिक सीडिंग घनत्व पर। नीला नाभिक धुंधला होने का प्रतिनिधित्व करता है और हरा फिलामेंटस-एक्टिन के धुंधलापन का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: घनत्व-अवधि आठ-अच्छी तरह से संस्कृति प्रयोग के दौरान एकत्र किए गए डेटा का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। इसमें प्रत्येक घनत्व-अवधि मैच-अप से छह क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र नमूने शामिल हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक एकल-चैनल माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह सरणी के गतिशील वातावरण में एनसीआई-एच 441 मानव फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं की संस्कृति, क्रॉसलिंकिंग निर्धारण, धुंधलापन, परमेबिलाइजेशन और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक विज़ुअलाइज़ेशन का वर्णन करता है, साथ ही साथ पारंपरिक आठ-अच्छी तरह से चैंबर वाले कवरग्लास के स्थिर वातावरण में भी। किसी भी माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर प्रोटोकॉल के साथ, सेल कल्चर मीडिया की प्रवाह की स्थिति सर्वोपरि महत्व की है, क्योंकि उच्च दर प्रवाह में कोशिकाओं को धोने या सेल मोनोलेयर की सामान्य असेंबली में हस्तक्षेप करने की क्षमता है। इस बीच, कम दर वाले प्रवाह में माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की अभेद्य प्रकृति के साथ-साथप्रवाह विशेषताओं द्वारा लगाए गए प्रसार सीमाओं के कारण सेल परत को "भूखा" या "घुटन" (क्रमशः अपर्याप्त पोषक तत्व और ऑक्सीजन उपलब्धता) की क्षमता होती है। 10 मिनट की प्रतीक्षा अवधि के साथ शुरुआत करके (जिसके दौरान कोशिकाएं उसी मीडिया में निलंबित रहती हैं जो मूल रूप से चैनल को भरती हैं), फिर 0.2 μL / min की प्रवाह दर तक आगे बढ़कर, अंत में 4 घंटे के दौरान 10 μL / min तक बढ़ने से पहले, इन प्रतिस्पर्धी जरूरतों को सेल पालन और अस्तित्व दोनों को बढ़ावा देने के लिए संतुलित किया जाता है।

प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की उचित तैयारी है, जिसमें निर्माण और पूर्व-उपचार शामिल हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि रिसाव और संभावित संदूषण से बचने के लिए कक्ष निर्माण में कवरग्लास ठीक से लगाया गया है। कवरग्लास का उचित लगाव यह सुनिश्चित करने के लिए भी आवश्यक है कि चैनल की ऊंचाई विभिन्न निर्मित इकाइयों का उपयोग करके लगातार परीक्षणों के बीच सुसंगत और सटीक रूप से पुन: पेश की जाती है। उपयोग की जाने वाली चिपकने वाली स्ट्रिप्स की मोटाई में सहनशीलता के साथ-साथ सापेक्ष संपीड़ितता द्वारा मामूली परिवर्तनशीलता पेश की जा सकती है। किसी भी परिवर्तनशीलता को कम करने से प्रयोगात्मक परिणामों की स्थिरता में मदद मिलेगी। निर्मित चैनल का उचित पूर्व-उपचार यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को कांच की सतह पर प्रसार का पालन करने और शुरू करने की अनुमति है। ग्लास की अल्ट्रासोनिक सफाई पॉली-डी-लाइसिन पालन में सुधार करती है, फाइब्रोनेक्टिन के पालन को बढ़ावा देती है। फाइब्रोनेक्टिन को जोड़ना, एक ग्लाइकोप्रोटीन जो स्वाभाविक रूप से मानव उपकला कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित और स्रावित होता है, आगे कवरग्लास सतह पर एनसीआई-एच 441 कोशिकाओं के पालन को बढ़ावा देता है, जिससे सामान्य सेल मोनोलेयरविकास की अनुमति मिलती है।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक इमेजिंग स्थान है। सावधानीपूर्वक नियंत्रित तैयारी के बावजूद, दो चैनल खोलने के क्षेत्रों में उपलब्ध स्तंभ की मात्रा के कारण, उचित सेल कल्चर तकनीकों का पालन करते समय भी इन उद्घाटनों के नीचे और साथ ही आसन्न क्षेत्र में कवरग्लास सतह पर अधिक कोशिकाएं मौजूद होंगी। इस कारण से, उद्घाटन के पास के क्षेत्रों को "सामान्य" सुसंस्कृत सेल परत के हिस्से के रूप में नहीं माना जाना चाहिए, क्योंकि वहां महत्वपूर्ण मल्टीलेयरिंग / सेल-स्टैकिंग होगी। इसके बजाय, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का मध्य क्षेत्र छवि बनाने के लिए एक उपयुक्त क्षेत्र है, क्योंकि यह स्थान उद्घाटन के पास चैनल ऊंचाई भिन्नता द्वारा लगाई गई त्रुटि से अबाधित है। प्रवाह सरणी पर इलेक्ट्रोड स्थानों का उपयोग इमेजिंग स्थानों को निर्देशित करने के लिए किया जा सकता है, और अंगूठे के एक नियम के रूप में, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल स्थितियों के वास्तव में प्रतिनिधि परतों को पकड़ने के उद्देश्य से सभी स्कैन को प्रवाह सरणी पर दो सबसे दूर इलेक्ट्रोड की सीमा के भीतर अनुरूप स्थानों पर लिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, वर्णित प्रोटोकॉल में, 40x आवर्धन उद्देश्य उपयोग के लिए निर्दिष्ट है; हालाँकि, इसे उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। 40x आवर्धन को इष्टतम आवर्धन के रूप में चुना गया था क्योंकि उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उच्च-आवर्धन इमेजिंग की पेशकश करने की इसकी क्षमता के कारण अभी भी सांख्यिकीय रूप से मान्य नमूने के रूप में सेवा करने के लिए पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को बनाए रखा गया था।

माइक्रोफ्लुइडिक चैनल में किए जा सकने वाले एक संशोधन में चैनल की ऊंचाई को बदलना शामिल है, जिसे माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले स्पेसर और चिपकने वाले पदार्थों की संख्या को बदलकर प्राप्त किया जा सकता है। चैनल की ऊंचाई में परिवर्तन से प्रवाह मापदंडों को समायोजित करने की आवश्यकता होगी ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कतरनी तनाव भोजन के दौरान कोशिकाओं को नहीं हटाता है। जैसे, चैनल की ऊंचाई में कोई भी भिन्नता आदर्श प्रारंभिक दर, रैंप-अप की दर और मीडिया प्रवाह की अंतिम दर को प्रभावित करेगी। इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल एक साधन के रूप में काम कर सकता है जिसके द्वारा ईसीआईएस जैसे अप्रत्यक्ष तरीकों के साथ संयोजन में उपयुक्त प्रवाह दर प्रयोगात्मक रूप से प्राप्त की जा सकती है। इसके अतिरिक्त, प्रवाह दरों को विभिन्न सेल लाइनों की आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है, जिन्हें इष्टतम परिस्थितियों को स्थापित करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एक और संशोधन जो इस प्रोटोकॉल में चरणों में कुछ परिवर्धन के साथ किया जा सकता है, सेल परतों के पार-अनुभागीय क्षेत्र की सापेक्ष तुलना से परे वर्णित तकनीक के उपयोग-मामले का विस्तार करना है। ज्ञात आयामों के माइक्रोसेफर्स या माइक्रोबीड्स का उपयोग करके उचित अंशांकन के साथ, सटीक वॉल्यूमेट्रिक, टोपोलॉजिक और पूर्ण क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र माप लिया जा सकता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के सीमित जेड-रिज़ॉल्यूशन और जेड-स्टैक स्टेप आकार पर मैनुअल नियंत्रण के कारण जेड-आयाम में ओवर-या अंडर-सैंपलिंग की क्षमता के कारण इस उदाहरण में एक संदर्भ वस्तु का उपयोग करके अंशांकन आवश्यक है, जो कॉन्फोकल स्कैनिंग सिस्टम32 प्रदान करते हैं।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा ऊर्ध्वाधर अंशांकन चरणों की कमी के कारण सच्चे वॉल्यूमेट्रिक माप की कमी है। ऊपर उल्लिखित अंशांकन और ज्ञात आयामों के फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स का उपयोग करने वाली सत्यापन तकनीक का उपयोग सच्चे-से-जीवन स्केलिंग के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वर्तमान प्रोटोकॉल में पहले से तैयार, उपयोग के लिए तैयार दाग का उपयोग शामिल है। प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग को अक्सर एक बहु-दिवसीय प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जो इस लेख की चर्चा से अधिक शामिल है। हालांकि, इस तरह से इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग का उपयोग करना संभव है, हालांकि वर्कफ़्लो को अनुकूलित करने के लिए कुछ प्रयोग आवश्यक हो सकते हैं। इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग प्रोटोकॉल में शामिल अतिरिक्त चरणों को देखते हुए, कई धोने के चरणों के दौरान सुसंस्कृत सेल परत के कतरन से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि यह अंततः मूल्यांकन किए गए सेल परत के गुणों को बदल सकता है और इसलिए किसी भी निष्कर्ष को अमान्य कर सकता है। इस तकनीक के आगे के विकास में छवि और डेटा विश्लेषण का स्वचालन शामिल हो सकता है, जिसमें क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र निर्धारण के लिए क्षेत्र-रुचि (आरओआई) का पता लगाना और परिमाणीकरण शामिल है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न इंट्रा-और एक्स्ट्रा-सेलुलर लक्ष्य संरचनाओं (शायद टाइट-जंक्शन प्रोटीन जैसे लक्ष्यों के लिए धुंधला) को शामिल करने के लिए इस तकनीक का विस्तार करने से माइक्रोफ्लुइडिक सेल कल्चर उपकरणों के भीतर 3 डी सह-स्थानीयकरण के लिए इस विधि के उपयोग-मामले को व्यापक बनाया जा सकता है।

सबसे शारीरिक रूप से प्रतिनिधि सेल परतों का उत्पादन करने के लिए, फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं को संस्कृति की सतह पर एक वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) के साथ माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, जिसे आमतौर पर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके पूरा किया जाता है, एक लचीली सामग्री जो μm-स्केल छिद्रों की शुरूआत से पारगम्य होती है। एएलआई संस्कृति की स्थिति सेल परतों के गठन की अनुमति देती है जो विवो फेफड़ों के उपकला33 की शारीरिक विशेषताओं से सबसे अधिक मिलती-जुलती हैं। जबकि तकनीकी रूप से संभव है, एक गतिशील माइक्रोफ्लुइडिक वातावरण में पीडीएमएस संस्कृति की सतह के साथ एक एएलआई संस्कृति वातावरण में ईसीआईएस का उपयोग करना अधिकांश शोधकर्ताओं के लिए अव्यावहारिक और दुर्गम है, क्योंकि इस तरह के जटिल सेल कल्चर असेंबली34 के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण नहीं हैं। इस कठिनाई का एक कारण एक पारगम्य संस्कृति सतह की विरोधाभासी आवश्यकता हो सकती है जो अभी भी ईसीआईएस माप के उद्देश्य के लिए एक ठोस इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य करने में सक्षम है। जैसे, वर्तमान में ऑक्सीजन-अभेद्य संस्कृति वातावरण में संवर्धित सेल परतों की विशेषताओं और शारीरिक प्रासंगिकता को नेत्रहीन रूप से सत्यापित करने के लिए एक विधि की आवश्यकता मौजूद है जैसे कि ईसीआईएस प्रवाह सरणियों में मौजूद।

यह विधि 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देकर दो-आयामी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उचित संयोजन सुनिश्चित करने की पारंपरिक विधि पर विस्तार करती है, जो सेल परत विशेषताओं की संख्या को बहुत व्यापक बनाती है जिन्हें देखा, परिमाणित और विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह एक मोनोलेयर, परत एकरूपता और प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए प्रासंगिक समझे जाने वाले अन्य गुणों की उपस्थिति के व्यक्तिपरक निर्धारण की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह कई ऑक्सीजन-अभेद्य वातावरण में उत्पादित होने वाली सेल परतों के दृश्य सत्यापन और मूल्यांकन के लिए एक साधन के रूप में कार्य करता है, जैसे कि ईसीआईएस प्रयोगों में एटेलेक्ट्रॉमा के संपर्क में आने वाली उपकला कोशिकाओं के बाधा कार्य गुणों का मूल्यांकन करना। यह एक विधि के रूप में भी कार्य करता है जिसका उपयोग भविष्य के काम में यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि गतिशील माइक्रोफ्लुइडिक संस्कृति स्थितियों का एक सेट सेल परतों का उत्पादन करता है जो आगे के प्रयोग के लिए प्रासंगिक और उपयुक्त हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक ों ने माइक्रोफ्लुइडिक चैनल निर्माण में उपयोग किए जाने वाले 3 एम चिपकने वाले और मायलर शीट के लिए काटने के पैटर्न को डिजाइन करने और सेल कल्चर मीडिया प्रवाह दर और सिरिंज पंप प्रोग्रामिंग का परीक्षण करने के लिए एलन शेपर्डसन को स्वीकार किया। फंडिंग एनआईएच आर 01 HL0142702, एनएसएफ सीबीईटी 1706801 और न्यूकॉम्ब-तुलाने कॉलेज डीन ग्रांट द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
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