Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Entwicklung und den Einsatz einer Phalloidin-basierten filamentösen Aktin-Färbetechnik mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zur Visualisierung der adhärenten Zellschichtstruktur in mikrofluidischen dynamischen Kulturkanälen und traditionellen statischen Fix-Well-Kulturkammern. Dieser Ansatz hilft bei der Bewertung der Zellschichtkonfluenz, der Monolagenbildung und der Gleichmäßigkeit der Schichtdicke.

Abstract

In-vitro-mikrofluidische Experimente bergen ein großes Potenzial, viele Einblicke in die mikrophysiologischen Phänomene zu gewinnen, die bei Erkrankungen wie dem akuten Atemnotsyndrom (ARDS) und der beatmungsinduzierten Lungenschädigung (VILI) auftreten. Studien in mikrofluidischen Kanälen mit physiologisch relevanten Dimensionen für die terminalen Bronchiolen der menschlichen Lunge stehen jedoch derzeit vor mehreren Herausforderungen, insbesondere aufgrund von Schwierigkeiten bei der Festlegung geeigneter Zellkulturbedingungen, einschließlich Medienflussraten, innerhalb einer bestimmten Kulturumgebung. Das vorgestellte Protokoll beschreibt einen bildbasierten Ansatz zur Bewertung der Struktur von NCI-H441 humanen Lungenepithelzellen, die in einem sauerstoffundurchlässigen mikrofluidischen Kanal kultiviert wurden, dessen Dimensionen physiologisch relevant für die terminalen Bronchiolen der menschlichen Lunge sind. Mittels Phalloidin-basierter filamentöser Aktin-Färbung werden die zytoskelettalen Strukturen der Zellen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie aufgedeckt, was die Visualisierung sowohl einzelner als auch geschichteter Zellen ermöglicht. Die anschließende Quantifizierung bestimmt, ob die verwendeten Zellkulturbedingungen einheitliche Monoschichten erzeugen, die für weitere Experimente geeignet sind. Das Protokoll beschreibt Zellkultur- und Schichtbewertungsmethoden in mikrofluidischen Kanälen und traditionellen Fixed-Well-Umgebungen. Dazu gehören Kanalkonstruktion, Zellkultur und erforderliche Bedingungen, Fixierung, Permeabilisierung und Färbung, konfokale mikroskopische Bildgebung, Bildverarbeitung und Datenanalyse.

Introduction

Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine akute Erkrankung, die durch eine Verletzung des Lungenparenchyms verursacht wird und zu einem Lungenödem der Alveolen, einem unzureichenden Gasaustausch und einer anschließenden Hypoxämie führt1. Dadurch wird ein Zyklus aus entzündungsfördernder Zytokinfreisetzung, Rekrutierung neutrophiler Granulozyten, Freisetzung toxischer Mediatoren und Gewebeschädigung in Gang gesetzt, die wiederum eine weitere Entzündungsreaktion hervorruft2. Darüber hinaus kann pulmonales Surfactant, das die Atemwege stabilisiert und Schäden durch wiederholte Rekrutierung/Derekrutierung (F/E) verhindert, durch die während des ARDS ablaufenden chemischen Prozesse inaktiviert oder anderweitig funktionsgestört werden, was zu weiterer Belastung und Verletzung des umgebenden Parenchyms führt3. Wenn eine ausreichende Schädigung vorliegt, kann eine mechanische Beatmung erforderlich sein, um eine ausreichende systemische Sauerstoffversorgung zu gewährleisten4. Die mechanische Beatmung bringt jedoch ihre eigenen Herausforderungen und Traumata mit sich, einschließlich der Möglichkeit einer beatmungsinduzierten Lungenschädigung (VILI), die als Verletzung des Lungenparenchyms gekennzeichnet ist, die durch die mechanischen Belastungen verursacht wird, die während der Überblähung (Volutrauma) und/oder der F/E der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche im flüssigkeitsverschlossenen Atemweg (Atelectrauma) auftreten5. Der Druckgradient, den Epithelzellen, die einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (wie in einer flüssigkeitsverschlossenen Bronchiole) ausgesetzt sind, im Atelectrauma-Modell erfahren, kann zu einer durch Permeabilität verursachten obstruktiven Reaktion (POOR) führen, die zu einem POOR-get-POORer-positiven Verletzungszyklus führt 6,7,8.

In-vitro-Experimente können Einblicke in diese Phänomene im Mikromaßstab liefern, aber aktuelle Studien in mikrofluidischen Kanalumgebungen mit physiologisch relevanten Dimensionen stehen vor mehreren Herausforderungen9. Zum einen stellt die Optimierung der Zellkulturbedingungen eine erhebliche Eintrittsbarriere für die Zellkulturforschung in mikrofluidischen Umgebungen dar, da es eine enge Schnittstelle gibt, innerhalb derer Medienflussparameter, Kulturdauer und andere Kulturbedingungen eine optimale Zellschichtbildung ermöglichen. Dazu gehören auch die Diffusionsbeschränkungen, die sich aus der Sauerstoffundurchlässigkeit des mikrofluidischen Kulturkanalgehäuses ergeben. Dies erfordert eine sorgfältige Berücksichtigung der Strömungsparameter des Mediums, da niedrige Durchflussraten den Zellen Sauerstoff entziehen können, insbesondere denen, die am weitesten vom Einlass entfernt sind. Andererseits können hohe Flussraten Zellen aus dem Kulturkanal verdrängen oder zu einer unsachgemäßen oder ungleichmäßigen Schichtentwicklung führen. Diffusionsbeschränkungen können durch die Verwendung sauerstoffdurchlässiger Materialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS) in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI)-Kulturapparatur behoben werden. Viele herkömmliche mikrofluidische Kulturkanäle, wie z. B. die des ECIS-Systems (Electric Cell-Substrat Impedance Sensing), sind jedoch aufgrund der Beschaffenheit des hergestellten Gehäuses10 von Natur aus sauerstoffundurchlässig. Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Technik zur Analyse von Zellschichten bereitzustellen, die in einem sauerstoffundurchlässigen Gehäuse kultiviert wurden.

Beim Vergleich der Lebensfähigkeit von Kulturbedingungen sind Beobachtungen spezifischer Schichteigenschaften, wie z. B. das Vorhandensein einer Monoschicht, die Oberflächentopologie, die Konfluenz und die Gleichmäßigkeit der Schichtdicke, erforderlich, um festzustellen, ob die Zellschicht, die durch eine bestimmte Gruppe von Kulturbedingungen erzeugt wird, die gewünschten Spezifikationen erfüllt und tatsächlich für das Versuchsdesign relevant ist. Eine begrenzte Bewertung kann mit Methoden wie ECIS durchgeführt werden, bei denen Messungen des elektrischen Potentials (Spannung) verwendet werden, das durch den Widerstand gegen hochfrequenten Wechselstrom (AC) (Impedanz) erzeugt wird, der von elektrisch isolierenden Membranen von Zellen erzeugt wird, die auf Goldelektroden innerhalb des Durchflussarrays kultiviert wurden. Durch die Modulation der Frequenz des auf Zellen angelegten AC können spezifische frequenzabhängige zelluläre Eigenschaften der Zellen und Zellschichten, wie z. B. Oberflächenadhärenzstärke, Tight-Junction-Bildung und Zellproliferation oder -konfluenz, gezielt anvisiert und untersucht werden11. Diese indirekten Formen der Messung sind jedoch zu Beginn eines Experiments etwas schwierig zu interpretieren und quantifizieren möglicherweise nicht alle relevanten Aspekte der Zellschicht. Die einfache Beobachtung der Zellschicht unter einem Phasenkontrastmikroskop kann die Natur bestimmter Eigenschaften wie der Konfluenz aufdecken; Viele relevante Merkmale, wie z. B. das Vorhandensein einer Monoschicht und die Gleichmäßigkeit der Schichtdicke, erfordern jedoch eine dreidimensionale (3D) Auswertung, die mit Hellfeld-, Phasenkontrast- oder fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung nicht möglich ist12.

Das Ziel dieser Studie war es, eine filamentöse Aktin-Färbetechnik zu entwickeln, die eine bildgebende Verifizierung einer Monoschicht und die Bewertung der Zellschichtgleichmäßigkeit mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) ermöglicht. Filamentöses Aktin (F-Aktin) wurde als geeignetes Ziel für das Fluorophor-Konjugat angesehen, was zum Teil auf die Art und Weise zurückzuführen ist, wie F-Aktin eng der Zellmembran folgt und eine visuelle Annäherung an das gesamte Zellvolumen ermöglicht13. Ein weiterer wichtiger Vorteil des Targetings von F-Aktin ist die Art und Weise, wie die Färbung von F-Aktin Störungen oder Veränderungen des Zytoskeletts, die durch die Belastungen der Zellen verursacht werden, visuell aufklärt. Die Vernetzungsfixierung mit methanolfreiem Formaldehyd wurde verwendet, um die Morphologie der Zellen und der Zellschicht zu erhalten, da dehydrierende Fixiermittel wie Methanol dazu neigen, Zellen abzuflachen, die Zellschicht stark zu verzerren und ihre Eigenschaften zu verändern14,15.

Um zu bestimmen, ob die Schichtbewertungstechnik in der Lage ist, diese Herausforderungen zu mindern, wurden die Zellen in traditionellen Acht-Well-Kulturkammern sowie in mikrofluidischen Kanälen kultiviert, um die Unterschiede in den erzeugten Zellschichten zu bewerten. Für Fixkulturwellen wurden Deckglaseinheiten mit acht Wells verwendet. Für die mikrofluidische Kultur wurden Flow-Arrays (Kanallänge 50 mm, Breite 5 mm, Tiefe 0,6 mm) optimiert, um immortalisierte humane Lungenepithelzellen (NCI-H441) in einer Umgebung zu kultivieren, deren Abmessungen physiologisch relevant für die terminalen Bronchiolen in der Atemzone der menschlichen Lunge sind16. Obwohl dieses Protokoll unter Berücksichtigung der Kulturumgebung von ECIS-Flow-Arrays entwickelt wurde, kann es für jede sauerstoffundurchlässige dynamische Kulturumgebung gelten, für die eine Bewertung der Eigenschaften der kultivierten Zellschicht oder der Kulturbedingungen erforderlich ist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurde die humane epitheliale Lungenzelllinie NCI-H441 verwendet (siehe Materialtabelle).

1. Zellkultur im mikrofluidischen Kanal

  1. Stellen Sie den mikrofluidischen Kanal her und führen Sie die Vorbehandlung gemäß den folgenden Schritten durch.
    1. Besorgen Sie sich ein einkanaliges Durchfluss-Array (siehe Materialtabelle) und trennen Sie den oberen Teil von der Polycarbonat-Grundplatte.
    2. Besorgen Sie sich ein rechteckiges Deckglas #1.5 (Dicke 0.17 mm) mit Abmessungen von 60 mm x 22 mm. Reinigen Sie die Oberflächen des Deckglases in einem Ultraschallbad und behandeln Sie eine Seite 5 Minuten lang mit einer 0,1 mg/ml-Lösung Poly-D-Lysin bei Raumtemperatur, bevor Sie sie 30 Minuten lang bei 60 °C trocknen.
    3. Bringen Sie einen 0,13 mm dicken doppelseitigen Klebstoff (siehe Materialtabelle), der auf die Abmessungen der Oberseite des Strömungsarrays und des Strömungskanals (50 mm Länge, 5 mm Breite) zugeschnitten ist, auf die Oberseite des Strömungsarrays auf, wobei darauf zu achten ist, dass die Kanalausschnitte17 genau ausgerichtet sind.
    4. Befestigen Sie einen 0,1 mm dicken Mylar-Abstandshalter (siehe Materialtabelle), lasergeschnitten, um die Abmessungen der Oberseite des Flow-Arrays und des Flow-Kanals aufzunehmen, auf den Klebestreifen und achten Sie dabei auf eine exakte Ausrichtung der Kanalausschnitte.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.3 und 1.1.4, bis die gewünschte Kanalhöhe erreicht ist (z. B. bei einer Kanalhöhe von 0,6 mm zwei Abstandshalter und drei Klebestreifen verwenden).
    6. Befestigen Sie ein rechteckiges Deckglas auf dem untersten Klebestreifen mit der Poly-D-Lysin-behandelten Seite, die dem Klebstoff zugewandt ist. Üben Sie nach Abschluss der Montage, wie in Abbildung 1 gezeigt, festen und gleichmäßigen Druck auf die Ober- und Unterseite der Konstruktion aus und halten Sie sie 1 Minute lang.
      Anmerkungen: Die Konstruktion des Kanalgehäuses, einschließlich Deckglas, Klebstoffen, Abstandshaltern und Durchfluss-Array-Oberseite, ist jetzt abgeschlossen.
    7. Spülen Sie den Kanal mit einer Spritze mit deionisiertem Wasser aus und prüfen Sie gleichzeitig, ob er undicht ist.
    8. Sterilisieren Sie das Kanalgehäuse in einem UV-Sterilisator für 30 min18.
    9. Behandeln Sie den Kanal steril mit 2,0 μg/ml humanem Fibronektin (siehe Materialtabelle) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie ihn mindestens 30 min bei 37 °C19.
  2. Führen Sie die Zellkultur im mikrofluidischen Kanal durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. In einer sterilen Laminar-Flow-Haube wird eine gleichmäßige Suspension von NCI-H441-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) (siehe Materialtabelle) übertragen, um zwei mikrofluidische Kanäle mit jeweils Zellen mit einer Oberflächendichte von 150.000 Zellen/cmzu besiedeln2.
      1. Verwenden Sie für Kanäle mit den Maßen 50 mm x 5 mm x 0,6 mm 0,25 ml einer 2,5 x 10Suspension mit 6 Zellen/ml, um jeden Kanal sowie einen Teil der Anschlüsse zu füllen. Überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, ob die Zellen gleichmäßig innerhalb der Kanäle verteilt sind.
    2. Die beiden Kanäle werden 24 h bzw. 48 h lang bei 37 °C mit 5 % CO2 unter Verwendung einer programmierbaren Spritzenpumpe (siehe Materialtabelle) kultiviert, wobei verbrauchte Medien aus dem Kanal und frische Medien aus einem sterilen Medienreservoir entnommen werden, das am Kanaleinlass befestigt ist und aus einer aufgeschnittenen 20-ml-Spritze besteht, die aus einer mit Paraffinfolie bedeckten 20-ml-Spritze besteht.
      1. Nach einer Wartezeit von 10 Minuten nach der Aussaat der Zelle wird frisches Medium aus dem Reservoir mit einer variablen Durchflussrate, die bei 0,2 μl/min beginnt und auf 10 μl/min für 4 h ansteigt, durch den Kanal gepumpt, wobei diese Rate danach20 Stunden beibehalten wird.
        HINWEIS: Diese variable Flussrate bietet Kulturbedingungen, die es den Zellen ermöglichen, (1) sich gravitativ an der Kulturoberfläche abzusetzen, (2) an der Kulturoberfläche zu haften und (3) eine konfluente Monoschicht zu bilden.
  3. Führen Sie die Zellfixierung innerhalb der mikrofluidischen Kanäle mit Formaldehydlösung durch.
    VORSICHT: Formaldehyd ist giftig und muss in einem geeigneten chemischen Abzug21 gehandhabt werden.
    1. In einem chemischen Abzug werden Formaldehydlösungen hergestellt, indem 4 % Formaldehyd in PBS (methanolfrei) verwendet werden (siehe Materialtabelle), um zwei 4-ml-Portionen herzustellen, wobei die erste auf eine Konzentration von 1 % Formaldehyd und die zweite auf 2 % Formaldehyd verdünnt wird, wobei die phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco (DPBS; mit Ca 2+ und Mg2+) als Verdünnungsmittel verwendet wird. Übertragen Sie Formaldehydlösungen in separate 5-ml-Spritzen und etikettieren Sie sie entsprechend. 20 ml DPBS in eine separate 20-ml-Spritze aufziehen.
    2. Entfernen Sie mikrofluidische Kanäle aus dem Kulturapparat und legen Sie sie in den chemischen Abzug.
    3. Montieren Sie das Fixier- und Färbegerät.
      1. Befestigen Sie ein 10 cm langes Segment des Transferschlauchs über einen männlichen Luer-Lock-to-Schlauchtüllenadapter (siehe Materialtabelle) an der seitlichen Öffnung eines Dreiwege-Absperrhahns und verbinden Sie dann den Absperrhahn mit der Einlassöffnung des Durchflussarrays.
      2. Befestigen Sie als Nächstes ein weiteres 10-cm-Segment des Transferschlauchs mit demselben Schlauchtüllenadapter an der Auslassöffnung des Durchflussarrays.
      3. Befestigen Sie schließlich die freien Enden beider Transferröhrchen in einem für Chemikalien und biologische Gefahren geeigneten Abfallbehälter, z. B. einem beschrifteten leeren konischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    4. Drehen Sie den Absperrhahn, um die Einlassöffnung des Durchflussbereichs zu blockieren, und spülen Sie die Abflussleitung mit DPBS. Drehen Sie dann den Absperrhahn, um die Abfallleitung zu verstopfen, und waschen Sie die Zellen langsam mit 2 ml DPBS. Wiederholen Sie den Spülschritt jedes Mal mit der neuen Lösung. Eine neue Lösung (oder Konzentration der Lösung) wird in den Kanal eingeführt.
    5. Schieben Sie langsam 2 ml 1%ige Fixierlösung durch den Kanal und lassen Sie sie dann 5 Minuteneinwirken 22.
    6. Schieben Sie langsam 2 ml 2%ige Fixierlösung durch den Kanal und lassen Sie sie dann 15 Minuten einwirken.
    7. Waschen Sie die Zellen, indem Sie langsam 2 ml frisches DPBS in drei separaten Instanzen (jeweils 5 Minuten) in den Kanal einführen.
    8. Führen Sie die Schritte 1.3.3 bis 1.3.7 für beide mikrofluidischen Kanäle parallel aus.
  4. Färben, permeabilizieren und fügen Sie den Zellen im mikrofluidischen Kanal Einbettmedien hinzu.
    1. Bereiten Sie eine 0,1%ige Saponinlösung vor, indem Sie 1 mg Saponin (siehe Materialtabelle) pro ml DPBS hinzufügen, um 4 ml Lösung herzustellen, und vorsichtig wirbeln, um23 zu mischen. 8 ml DPBS in eine 20-ml-Spritze aufziehen.
    2. In der 0,1%igen Saponinlösung werden ein F-Aktin-färbendes Phalloidin-Reagenz und ein Zellkern-färbendes Hoechst-Reagenz (siehe Materialtabelle) in zwei Tropfen (0,1 ml) jedes Reagenzes pro ml Saponinlösung gegeben. Halten Sie die vorbereitete Färbe-/Permeabilisierungslösung lichtfern, indem Sie sie mit Alufolie24 abdecken.
    3. Spülen Sie die Linie mit einer kleinen Menge Färbe-/Permeabilisierungslösung (wie in Schritt 1.3.4 beschrieben), geben Sie dann 2 ml der Lösung in den mikrofluidischen Kanal und decken Sie den Kanal mit Aluminiumfolie ab, bevor Sie ihn 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen lassen.
    4. Spülen Sie die Färbe-/Permeabilierlösung zweimal mit 2 ml DPBS für 5 Minuten pro Spülung aus.
    5. Um eine bessere Bildqualität zu erzielen, fügen Sie ein geeignetes Einbettmedium (mit einem Brechungsindex, der eng mit dem Öl des Mikroskopobjektivs und dem Deckglas übereinstimmt, siehe Materialtabelle) in den Kanal ein.
      1. Führen Sie unter Verwendung einer Mikropipette eine minimale Menge eines weich fixierten Antifade-Eindeckmittels in jeden Anschluss des mikrofluidischen Kanals ein, wobei sichergestellt wird, dass die Bodenfläche vollständig bedeckt ist und keine Blasen im gewünschten Bildgebungsbereich25 eingeschlossen werden. Versiegeln Sie die Enden des Kanals und überprüfen Sie die Integrität der Zellschicht durch Beobachtung unter einem Hellfeldmikroskop.
    6. Führen Sie die Schritte 1.4.3 bis 1.4.5 für beide Mikrofluidikkanäle parallel aus.
      HINWEIS: Bildzellen so schnell wie möglich nach dem Färben ab, um maximale Bildqualität zu erzielen. Wenn Photobleichung auftritt oder eine Langzeitlagerung gewünscht wird, können andere Einbettmedien mit lichtbeständigen oder probenerhaltenden Eigenschaften verwendet werden. Beachten Sie, dass harthärtende Einbettmedien die 3D-Struktur der Zellen und damit auch die Zellschicht verzerren. Aus diesem Grund sind weich abbindende Eindeckmedien26 vorzuziehen.
  5. Bilden Sie Zellen im mikrofluidischen Kanal ab, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Passen Sie die Einstellungen des konfokalen Mikroskops (siehe Materialtabelle) an, einschließlich Laserleistung, Verstärkung, Offset und Scanparameter wie Scangeschwindigkeit, Scanbereich, Scanformat, Auflösung und Lochblendendurchmesser27.
    2. Testen Sie die Position der Bildgebung, indem Sie sowohl Referenzscans als auch Z-Stapel erstellen, bis die gewünschten Bildparameter und -bedingungen erfüllt sind. Einwahlparameter bei Objektiven mit sequentiell höherer Vergrößerung bis zum Erreichen des 40-fachen Ölimmersionsobjektivs28.
    3. Konstruieren Sie unter Verwendung der Flow-Array-Grundplatte als Referenz Z-Stapel an fünf Stellen, an der zukünftigen Position der ersten Elektrode auf der Einlassseite, auf halbem Weg zwischen der Mitte und der vorherigen Position, in der Mitte, auf halbem Weg zwischen der Mitte und der Position der letzten Elektrode (auf der Auslassseite) und an der letzten Elektrode, wie in Abbildung 2 dargestellt.
  6. Führen Sie Bildverarbeitung und Datenanalyse durch.
    1. Exportieren Sie XZ- und YZ-Querschnitte mit dem Softwarepaket für konfokale Mikroskope (siehe Materialtabelle).
    2. Messen Sie unter Verwendung einer Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle) mit Kantenerkennungsfunktionen (Schwellenwert 15,0) die gesamte Bildfläche in Pixeln mit dem Zauberstab-Werkzeug außerhalb des Bildes, dann den Bereich ohne die gesamte Querschnittsfläche der Zellenebene in Pixeln, indem Sie das Zauberstab-Werkzeug in dem Teil des Bildes außerhalb der Zellenschicht29 verwenden.
    3. Subtrahieren Sie mit einer Datenverarbeitungssoftware (siehe Materialtabelle) den Pixelwert der Außenfläche vom Pixelwert der Gesamtfläche, um den Pixelwert für die Querschnittsfläche zu ermitteln.
    4. Konvertieren Sie die Pixelwerte der Querschnittsfläche in μm2-Werte , indem Sie die Pixelwerte mit dem Quadrat des μm/Pixel-Werts multiplizieren, wie in der Mikroskopsoftware für das jeweilige Bild angegeben (0,31 μm/Pixel für Z-Stapel, die in 1024p-Auflösung ohne Zoom auf einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv aufgenommen wurden).
    5. Berechnen Sie Mittelwerte und Standardabweichungen von Daten und Diagrammergebnissen.

Figure 1
Abbildung 1: Explosionszeichnung der mikrofluidischen Kanalkonstruktion. Das obere Element ist der obere Teil des Flow-Arrays, dünne graue Elemente sind Klebestreifen, dünne blaue Elemente sind Mylar-Abstandshalter und das untere Element ist das rechteckige Deckglas. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Fünf Bildgebungspositionen entlang des konsistent schichtproduzierenden Bereichs des mikrofluidischen Kulturkanals. Die Bildgebungspositionen sind wie folgt: Einlassseite, in der Nähe der Stelle, an der sich die erste Elektrode auf dem intakten Durchflussarray befinden würde; auf halbem Weg zwischen der Lage auf der Einlassseite und der Mitte des Kanals; Mitte des Kanals; auf halbem Weg zwischen der Mitte und der auslassseitigen Position und der Auslassseite, in der Nähe der Stelle, an der sich die letzte Elektrode auf dem intakten Durchflussarray befinden würde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Zellkultur im Acht-Well-Deckglas

  1. Führen Sie eine Vorbehandlung des Deckglases mit acht Wells durch.
    1. Besorgen Sie sich ein steriles Deckglas mit acht Wells, das mit einem #1.5-Deckglas und einer Oberflächenbehandlung hergestellt wurde, die die Zellhaftung erhöht (Abbildung 3, siehe Materialtabelle).
    2. Die Oberfläche von Kulturvertiefungen wird steril mit 2,0 μg/ml humanem Fibronektin in PBS behandelt und mindestens 30 min bei 37 °C inkubiert19.
  2. Führen Sie die Zellkultur im gekammerten Deckglas durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. In einer sterilen Laminar-Flow-Haube werden 0,5-ml-Portionen von Lösungen von NCI-H441-Zellen übertragen, die gleichmäßig in RPMI 1640-Medium mit 10 % FBS bei Volumendichten von 81.000, 162.000 und 324.000 Zellen/ml suspendiert sind, um die Kulturvertiefungen mit Oberflächendichten von 45.000, 90.000 bzw. 180.000 Zellen/cm2 zu besiedeln. Überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, ob die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind.
    2. Kulturzellen für 24 h, 48 h und 96 h bei 37 °C mit 5 % CO2 und täglichem Austausch der Medien.
  3. Führen Sie die Formaldehydfixierung im Deckglas mit acht Kammern durch.
    VORSICHT: Formaldehyd ist giftig und muss in einem geeigneten chemischen Abzug21 gehandhabt werden.
    1. In einem chemischen Abzug werden Formaldehydlösungen hergestellt, indem zwei Portionen von 4 % Formaldehyd in PBS (methanolfrei) hergestellt werden, wobei die erste auf eine Konzentration von 1 % Formaldehyd und die andere auf 2 % Formaldehyd verdünnt wird, wobei die phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco (DPBS; mit Ca 2+ und Mg2+) als Verdünnungsmittel verwendet wird.
    2. Entfernen Sie das Deckglas der Acht-Well-Kulturkammer aus dem Inkubator und setzen Sie es in den Chemikalienabzug ein.
    3. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 0,5 ml DPBS mit einer Mikropipette, indem Sie langsam Flüssigkeit entlang des oberen Teils der Ecke jeder Vertiefung einführen.
    4. Entfernen Sie die vorhandene Flüssigkeit in jeder Vertiefung, indem Sie sie mit einer Mikropipette langsam aus der Ecke der Vertiefungen herausziehen. Unter Verwendung der Methode der Flüssigkeitseinführung (Schritt 2.3.3) werden 0,5 ml 1%ige Fixierlösung in jede Vertiefung gegeben und 5 min22 Minuten ruhen gelassen.
    5. Entfernen Sie die vorhandene Flüssigkeit in jeder Vertiefung mit der in Schritt 2.3.4 beschriebenen Methode zur Flüssigkeitsextraktion. Unter Anwendung der in Schritt 2.3.3 beschriebenen Methode zur Flüssigkeitseinführung werden 0,5 ml 2%ige Fixierlösung in jede Vertiefung gegeben und 15 Minuten ruhen gelassen.
    6. Unter Verwendung der Flüssigkeitszufuhr- und Extraktionsmethoden (Schritte 2.3.3 und 2.3.4) werden die Zellen durch Einbringen und Entfernen von 0,5 ml frischem DPBS in jeder Vertiefung in drei getrennten Instanzen für jeweils 5 min gewaschen.
  4. Führen Sie das Färben, Permeabilisieren und das Einbinden von Medien in das Deckglas mit acht Wells durch.
    1. Bereiten Sie eine 0,1%ige Saponinlösung vor, indem Sie 1 mg Saponin pro ml DPBS hinzufügen und vorsichtig wirbeln, um23 zu mischen.
    2. In die 0,1%ige Saponinlösung werden je zwei Tropfen (0,1 ml) eines F-Aktin-färbenden Phalloidin-Reagenzes und eines Nukleus-färbenden Hoechst-Reagenzes pro ml Saponinlösung gegeben. Halten Sie die vorbereitete Lösung lichtfern, indem Sie sie mit Alufolie24 abdecken.
    3. Geben Sie 0,2 ml Färbe-/Permeabilisierungslösung in jede Vertiefung und decken Sie das gekammerte Deckglas mit Aluminiumfolie ab, bevor Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen lassen.
    4. Färbe-/Permeabilisierungslösung zweimal mit 0,5 ml DPBS ausspülen.
    5. Um eine bessere Bildqualität zu erzielen, fügen Sie ein geeignetes Eindeckmedium (mit einem Brechungsindex, der dem Öl des Mikroskopobjektivs und dem Deckglas genau entspricht) in die Vertiefungen hinzu.
      1. Geben Sie mit einer Mikropipette eine minimale Menge eines weich abbindenden Eindeckmittels in jede Vertiefung, wobei darauf zu achten ist, dass die Bodenfläche vollständig bedeckt ist und keine Blasen im gewünschten Bildgebungsbereich25 eingeschlossen werden. Überprüfen Sie die Integrität der Zellschicht durch Beobachtung unter einem Hellfeldmikroskop.
        HINWEIS: Bildzellen so schnell wie möglich nach dem Färben ab, um maximale Bildqualität zu erzielen. Wenn Photobleichung auftritt oder eine Langzeitlagerung gewünscht wird, können andere Einbettmedien mit lichtbeständigen oder probenerhaltenden Eigenschaften verwendet werden. Es ist zu beachten, dass harthärtende Einbettmedien die 3D-Struktur der Zellen und damit auch der Zellschicht verzerren, so dass weich aushärtende Eindeckmedien vorzuziehen sind26.
  5. Führen Sie die Bildgebung im Deckglas mit acht Wells durch.
    1. Passen Sie die Einstellungen des konfokalen Mikroskops an, einschließlich Laserleistung, Verstärkung, Offset und Scanparameter wie Scangeschwindigkeit, Scanbereich, Scanformat, Auflösung und Lochblendendurchmesser27.
    2. Testen Sie die Position der Bildgebung, indem Sie sowohl Referenzscans als auch Z-Stapel erstellen, bis die gewünschten Bildparameter und -bedingungen erfüllt sind. Einwahlparameter bei Objektiven mit sequentiell höherer Vergrößerung bis zum Erreichen des 40-fachen Ölimmersionsobjektivs28.
    3. Konstruieren Sie Z-Stapel aus drei zufälligen Positionen in jeder Übereinstimmung zwischen Seedingdichte und Kulturdauer.
  6. Führen Sie Bildverarbeitung und Datenanalyse durch.
    1. Exportieren Sie XZ- und YZ-Querschnitte mit dem Softwarepaket für konfokale Mikroskope.
    2. Messen Sie unter Verwendung einer Bildverarbeitungssoftware mit Kantenerkennungsfunktionen (Schwellenwert 15,0) den gesamten Bildbereich in Pixeln mit dem Zauberstab-Werkzeug außerhalb des Bildes und dann den Bereich ohne die gesamte Querschnittsfläche der Zellenebene in Pixeln, indem Sie das Zauberstab-Werkzeug in dem Teil des Bildes außerhalb der Zellenebene29 verwenden.
    3. Subtrahieren Sie mit einer Datenverarbeitungssoftware den Pixelwert für den Außenbereich vom Pixelwert der Gesamtfläche, um den Pixelwert für die Querschnittsfläche zu ermitteln.
    4. Konvertieren Sie die Pixelwerte der Querschnittsfläche in μm2-Werte , indem Sie die Pixelwerte mit dem Quadrat des μm/Pixel-Werts multiplizieren, wie in der Mikroskopsoftware für das jeweilige Bild angegeben (0,31 μm/Pixel für Z-Stapel, die in 1024p-Auflösung ohne Zoom auf einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv aufgenommen wurden).
    5. Berechnen Sie Mittelwerte und Standardabweichungen und stellen Sie die Ergebnisse grafisch dar.

Figure 3
Abbildung 3: Diagramm des Deckglases mit acht Wells, das für das Fixed-Well-Kultur-, Färbe- und Bildgebungsexperiment verwendet wurde, um die Auswirkungen der anfänglichen Zellaussaatdichte und der Kulturdauer auf die Bildung von Zellschichten zu vergleichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die vorgestellte Methode ermöglicht die Visualisierung von Epithelzellschichten, die in mikrofluidischen Kulturkanälen kultiviert wurden, und nutzt eine Demonstration in traditionellen Fixed-Well-Zellkulturumgebungen als Validierung. Die aufgenommenen Bilder liegen in einem Spektrum von Qualität, Signalintensität und zellulärer Zielspezifität vor. Erfolgreiche Bilder weisen einen hohen Kontrast auf, der eine Bildanalyse und Quantifizierung der Daten für die anschließende statistische Auswertung ermöglicht. Erfolglose Bilder sind dunkel, unscharf, verschwommen oder anderweitig für die subjektive oder quantitative Bewertung unbrauchbar. Einige Bilder eignen sich möglicherweise für die subjektive Bestimmung von Schichtmerkmalen, sind aber dennoch von unzureichender Qualität für die quantitative Analyse. Daher wirkt sich der Grad und die Sorgfalt, mit der das Protokoll befolgt wird, direkt auf die Eignung eines bestimmten Bildes aus, als Datenquelle für statistische Analysen zu dienen.

Abbildung 4 stellt den erfolgreichen Einsatz der Technik im Kontext einer mikrofluidischen dynamischen Kulturumgebung dar und zeigt die Bildaufnahme am Ein- und Auslass von zwei mikrofluidischen Geräten. Abbildung 4A,B zeigt Beispiele für Schichten, die 24 h lang kultiviert wurden, und Abbildung 4C,D zeigt Beispiele für Schichten, die 48 h lang kultiviert wurden. Abbildung 5 veranschaulicht die zugehörigen Daten, die aus dem mikrofluidischen Kanalexperiment gesammelt wurden, wobei drei Proben von jeder der fünf in Abbildung 2 angegebenen mikrofluidischen Kanal-Bildgebungspositionen aus jeder Kulturdauer enthalten sind. Fehlerbalken stehen für Standardabweichungen.

Abbildung 6 zeigt ein 2D-Bild der XY-Ebene in der Mitte des mikrofluidischen Kanals, und Abbildung 7 zeigt eine 3D-Ansicht desselben Ortes mit Tiefenfarbcodierung. Abbildung 8 zeigt eine erfolgreiche Bildaufnahme im Rahmen eines Dichte-Dauer-Experiments, bei dem die Auswirkungen der anfänglichen Zellaussaatdichte und der Kulturdauer auf die Bildung der NCI-H441-Zellschicht in der Acht-Well-Deckglasumgebung analysiert wurden. Abbildung 8A-C zeigt eine Kulturdauer von 24 h, 48 h bzw. 96 h. Abbildung 8X-Z zeigt anfängliche Zellaussaatdichten von 180.000, 90.000 bzw. 45.000 Zellen/cm2. Abbildung 9 zeigt quantitative Daten, die aus dem Deckglasexperiment mit acht Bohrlöchern gesammelt wurden, einschließlich Proben von drei Standorten in jedem Dichte-Dauer-Match-up. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar, und es wurden p-Wert-Tests durchgeführt, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen scheinbar nahe beieinander liegenden Werten zu ermitteln.

Diese beiden repräsentativen Experimente in der dynamischen mikrofluidischen und statischen Acht-Well-Umgebung sind unterschiedliche Anwendungsbeispiele, die zeigen, wie die Technik experimentelle Ergebnisse kontextualisieren kann, indem sie das Vorhandensein oder Fehlen physiologisch relevanter Monoschichten visuell bestätigt.

Figure 4
Abbildung 4: NCI-H441-Zellschichten, die 24 und 48 h lang im mikrofluidischen Kanal kultiviert wurden, abgebildet an der Einlass- und Auslassseite, wie in Abbildung 2 dargestellt. (A) 24 h, Einlassseite. (B) 24 h, Auslassseite. (C) 48 h, Einlassseite. (D) 48 h, Auslassseite. Blau steht für die Färbung der Zellkerne und Grün für die Färbung von filamentösem Aktin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Grafische Darstellung der Daten, die während des 24-48 h mikrofluidischen Kanal-Imaging-Experiments gesammelt wurden. Dazu gehören sechs Querschnittsflächen von jedem der fünf Standorte entlang der relevanten Länge des mikrofluidischen Kanals (wie in Abbildung 2 dargestellt). Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: 2D-Bild, aufgenommen in der XY-Ebene an einer zentralen Stelle innerhalb des mikrofluidischen Kanals. Blau steht für die Färbung der Zellkerne und Grün für die Färbung von filamentösem Aktin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: 3D-Modell der gleichen mikrofluidischen Kanalposition wie Abbildung 6. Die Farbcodierung stellt Tiefendaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: NCI-H441-Zellschichten, die im Deckglas mit acht Wells kultiviert wurden. Für 24 h (A), 48 h (B) und 96 h (C) bei anfänglichen Aussaatdichten von 180.000 (X), 90.000 (Y) und 45.000 (Z) Zellen/cm2. Blau steht für die Färbung der Zellkerne und Grün für die Färbung von filamentösem Aktin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Grafische Darstellung der Daten, die während des Acht-Well-Kulturexperiments mit Dichtedauer gesammelt wurden. Dazu gehören sechs Querschnittsflächenproben aus jedem Dichte-Dauer-Abgleich. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Kultur, Vernetzungsfixierung, Färbung, Permeabilisierung und konfokale mikroskopische Visualisierung von NCI-H441 menschlichen Lungenepithelzellen in der dynamischen Umgebung eines einkanaligen mikrofluidischen Flussarrays sowie in der statischen Umgebung eines traditionellen Acht-Well-Deckglases. Bei jedem mikrofluidischen Zellkulturprotokoll sind die Fließbedingungen der Zellkulturmedien von größter Bedeutung, da die hohe Fließgeschwindigkeit das Potenzial hat, die Zellen wegzuspülen oder den normalen Aufbau der Zellmonoschicht zu stören. Währenddessen hat eine niedrige Strömungsgeschwindigkeit das Potenzial, die Zellschicht aufgrund der Diffusionsbeschränkungen, die durch die Undurchlässigkeit des mikrofluidischen Kanals sowie die Strömungseigenschaften auferlegt werden, "auszuhungern" oder zu "ersticken" (unzureichende Nährstoff- bzw. Sauerstoffverfügbarkeit)30. Beginnend mit einer Wartezeit von 10 Minuten (während der die Zellen in demselben Medium suspendiert bleiben, das den Kanal ursprünglich gefüllt hat), dann auf eine Flussrate von 0,2 μl/min vordringen, bevor sie schließlich im Laufe von 4 Stunden auf 10 μl/min hochgefahren werden, werden diese konkurrierenden Bedürfnisse ausgeglichen, um sowohl die Zelladhärenz als auch das Überleben zu fördern.

Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist die ordnungsgemäße Vorbereitung des mikrofluidischen Kanals, einschließlich des Aufbaus und der Vorbehandlung. Es muss darauf geachtet werden, dass das Deckglas ordnungsgemäß an der Kammerkonstruktion montiert ist, um Leckagen und mögliche Verunreinigungen zu vermeiden. Eine ordnungsgemäße Befestigung des Deckglases ist auch erforderlich, um sicherzustellen, dass die Kanalhöhe zwischen aufeinanderfolgenden Versuchen mit unterschiedlich konstruierten Einheiten konsistent und genau reproduziert wird. Geringfügige Abweichungen können durch die Toleranz in der Dicke der verwendeten Klebestreifen sowie die relative Kompressibilität verursacht werden. Die Minimierung jeglicher Variabilität trägt zur Konsistenz der experimentellen Ergebnisse bei. Die richtige Vorbehandlung des konstruierten Kanals ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Glasoberfläche haften und die Proliferation auf ihr initiieren können. Die Ultraschallreinigung des Glases verbessert die Poly-D-Lysin-Adhärenz und fördert die Adhärenz an Fibronektin. Die Zugabe von Fibronektin, einem Glykoprotein, das auf natürliche Weise von menschlichen Epithelzellen synthetisiert und sezerniert wird, fördert die Adhärenz der NCI-H441-Zellen an der Deckglasoberfläche weiter, was eine normale Entwicklung von Zellmonoschichten ermöglicht31.

Darüber hinaus ist einer der wichtigsten Aspekte dieses Protokolls der Ort der Bildgebung. Trotz sorgfältig kontrollierter Präparation sind aufgrund des säulenförmigen Volumens, das in den Bereichen der beiden Kanalöffnungen zur Verfügung steht, mehr Zellen auf der Deckglasoberfläche im Bereich direkt darunter sowie in der Nähe dieser Öffnungen vorhanden, selbst wenn geeignete Zellkulturtechniken eingehalten werden. Aus diesem Grund sollten Regionen in der Nähe der Öffnungen nicht als Teil der "normalen" kultivierten Zellschicht betrachtet werden, da dort eine signifikante Mehrschichtung/Zellstapelung stattfindet. Stattdessen ist der zentrale Bereich des mikrofluidischen Kanals ein geeigneter Bereich für die Abbildung, da dieser Ort nicht durch den Fehler gestört wird, der durch die Variation der Kanalhöhe in der Nähe der Öffnungen verursacht wird. Als Faustregel gilt, dass alle Scans, die dazu bestimmt sind, Schichten zu erfassen, die wirklich repräsentativ für die mikrofluidischen Kanalbedingungen sind, an analogen Stellen innerhalb der Grenzen der beiden am weitesten voneinander entfernten Elektroden auf dem Flussarray aufgenommen werden sollten. Darüber hinaus ist in dem beschriebenen Protokoll das Objektiv mit 40-facher Vergrößerung für die Verwendung spezifiziert; Dies kann jedoch an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden. Die 40-fache Vergrößerung wurde als optimale Vergrößerung gewählt, da sie eine hochauflösende Bildgebung mit hoher Vergrößerung bietet und gleichzeitig eine ausreichende Anzahl von Zellen beibehält, um als statistisch gültige Probe zu dienen.

Eine Modifikation, die am mikrofluidischen Kanal vorgenommen werden kann, umfasst die Änderung der Kanalhöhe, die durch Variation der Anzahl der Abstandshalter und Klebstoffe erreicht werden kann, die zum Aufbau des mikrofluidischen Kanals verwendet werden. Eine Änderung der Kanalhöhe erfordert wahrscheinlich eine Anpassung der Strömungsparameter, um sicherzustellen, dass die Scherspannung während der Zuführung keine Zellen entfernt. Daher wirkt sich jede Variation der Kanalhöhe auf die ideale Anfangsrate, die Hochlaufrate und die Endgeschwindigkeit des Medienflusses aus. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll kann als Mittel dienen, mit dem geeignete Durchflussraten in Verbindung mit indirekten Methoden wie ECIS experimentell abgeleitet werden können. Darüber hinaus können die Flussraten modifiziert werden, um den Bedürfnissen verschiedener Zelllinien gerecht zu werden, die möglicherweise angepasst werden müssen, um optimale Bedingungen zu schaffen. Eine weitere Modifikation, die mit einigen Ergänzungen zu den Schritten in diesem Protokoll vorgenommen werden kann, besteht darin, den Anwendungsfall der beschriebenen Technik über den relativen Vergleich der Querschnittsfläche von Zellschichten hinaus zu erweitern. Bei entsprechender Kalibrierung mit Mikrokugeln oder Mikrokügelchen bekannter Abmessungen können genaue volumetrische, topologische und absolute Querschnittsmessungen durchgeführt werden. Die Kalibrierung mit einem Referenzobjekt ist in diesem Fall aufgrund der begrenzten Z-Auflösung des konfokalen Mikroskops und der Möglichkeit einer Über- oder Unterabtastung in der Z-Dimension aufgrund der manuellen Steuerung der Z-Stapel-Schrittweite, die konfokale Scansysteme bieten, erforderlich32.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist das Fehlen einer echten volumetrischen Messung aufgrund des Fehlens vertikaler Kalibrierschritte. Die oben erwähnte Kalibrierung und die Verifizierungstechnik unter Verwendung fluoreszierender Mikrokügelchen bekannter Abmessungen können für eine naturgetreue Skalierung verwendet werden. Darüber hinaus beinhaltet das vorliegende Protokoll die Verwendung von vorgefertigten, gebrauchsfertigen Beizen. Die Immunfluoreszenzfärbung mit primären und sekundären Antikörpern erfordert oft ein mehrtägiges Protokoll, das aufwändiger ist als das, was in diesem Artikel besprochen wird. Es ist jedoch wahrscheinlich möglich, die Immunfluoreszenzfärbung auf diese Weise zu nutzen, obwohl einige Experimente erforderlich sein können, um den Arbeitsablauf zu optimieren. Angesichts der zusätzlichen Schritte, die mit Immunfluoreszenz-Färbeprotokollen verbunden sind, muss darauf geachtet werden, dass die kultivierte Zellschicht während der zahlreichen Waschschritte nicht geschert wird, da dies die Eigenschaften der letztendlich bewerteten Zellschicht verändern und somit alle daraus resultierenden Schlussfolgerungen ungültig machen kann. Weiterentwicklungen dieser Technik können die Automatisierung der Bild- und Datenanalyse umfassen, einschließlich der Erkennung und Quantifizierung von Region of Interest (ROI) für die Querschnittsflächenbestimmung. Darüber hinaus kann die Erweiterung dieser Technik auf verschiedene intra- und extrazelluläre Zielstrukturen (z. B. Färbung für Targets wie Tight-Junction-Proteine) den Anwendungsfall dieser Methode auf die 3D-Kolokalisierung in mikrofluidischen Zellkulturgeräten erweitern.

Um die physiologisch repräsentativsten Zellschichten zu erzeugen, müssen Lungenepithelzellen in mikrofluidischen Kanälen mit einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) an der Kulturoberfläche kultiviert werden, was typischerweise mit Polydimethylsiloxan (PDMS) erreicht wird, einem flexiblen Material, das durch die Einführung von Poren im μm-Bereich durchlässig wird. Die ALI-Kulturbedingungen ermöglichen die Bildung von Zellschichten, die den physiologischen Merkmalen des in vivo Lungenepithels am nächsten kommen33. Obwohl es technisch möglich ist, ist die Verwendung von ECIS in einer ALI-Kulturumgebung mit einer PDMS-Kulturoberfläche in einer dynamischen mikrofluidischen Umgebung unpraktisch und für die meisten Forscher unzugänglich, da es keine kommerziell erhältlichen Apparaturen für eine derart komplexe Zellkulturanordnung gibt34. Ein Grund für diese Schwierigkeit könnte die paradoxe Notwendigkeit einer durchlässigen Kulturoberfläche sein, die noch in der Lage ist, als Festelektrode für ECIS-Messungen zu fungieren. Daher besteht derzeit der Bedarf an einer Methode, um die Eigenschaften und die physiologische Relevanz von Zellschichten, die in sauerstoffundurchlässigen Kulturumgebungen, wie sie in ECIS-Flow-Arrays vorhanden sind, visuell zu überprüfen.

Diese Methode erweitert die traditionelle Methode zur Sicherstellung der richtigen Konfluenz mit Hilfe der zweidimensionalen Mikroskopie, indem sie eine 3D-Visualisierung ermöglicht, die die Anzahl der Zellschichtmerkmale, die beobachtet, quantifiziert und analysiert werden können, erheblich erweitert. Darüber hinaus ermöglicht dies eine subjektive Bestimmung des Vorhandenseins einer Monoschicht, der Gleichmäßigkeit der Schicht und anderer Eigenschaften, die für experimentelle Zwecke als relevant erachtet werden. Dieses Protokoll ist wichtig, da es als Mittel zur visuellen Verifizierung und Bewertung von Zellschichten dient, die in vielen sauerstoffundurchlässigen Umgebungen produziert werden, wie z. B. in ECIS-Experimenten zur Bewertung der Barrierefunktionseigenschaften von Epithelzellen, die Atelectrauma ausgesetzt sind. Dies dient auch als Methode, die in zukünftigen Arbeiten verwendet werden kann, um zu bestimmen, ob eine Reihe dynamischer mikrofluidischer Kulturbedingungen Zellschichten erzeugt, die für weitere Experimente relevant und geeignet sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren danken Alan Shepardson für die Entwicklung des Schnittmusters für den 3M-Klebstoff und die Mylar-Folie, die bei der Konstruktion von Mikrofluidikkanälen verwendet werden, sowie für die Prüfung der Durchflussrate des Zellkulturmediums und der Programmierung der Spritzenpumpe. Die Finanzierung erfolgte durch NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 und den Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Tags

Diesen Monat in JoVE Ausgabe 185
Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. … More

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. E., Gaver III, D. P. Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device. J. Vis. Exp. (185), e64148, doi:10.3791/64148 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter