Summary
Her præsenterer vi en protokol til at isolere kerner fra hjernen i den kortlivede hvirveldyrmodel Nothobranchius furzeri til downstream-applikationer såsom enkeltkerne-RNA-sekventering eller enkeltkerneassay til transposase-tilgængeligt kromatin med sekventering (ATAC-seq).
Abstract
At studere hjernens aldring ved enkeltcelleopløsning i hvirveldyrsystemer er fortsat udfordrende på grund af omkostninger, tid og tekniske begrænsninger. Her demonstrerer vi en protokol til at generere enkeltkernede RNA-sekventeringsbiblioteker (snRNA-seq) fra hjernen hos det naturligt kortlivede hvirveldyr afrikansk turkis killifish Nothobranchius furzeri. Den afrikanske turkise killifish har en levetid på 4-6 måneder og kan opbevares på en omkostningseffektiv måde, hvilket reducerer omkostnings- og tidsbarrierer for at studere hvirveldyrs hjerne aldring. Imidlertid er der behov for skræddersyede protokoller for at isolere kerner af tilstrækkelig kvalitet til nedstrøms enkeltcelleforsøg fra hjernen hos unge og gamle fisk. Her demonstrerer vi en empirisk optimeret protokol til isolering af kerner af høj kvalitet fra hjernen hos voksne afrikanske turkis killifish, et kritisk skridt i dannelsen af enkeltkerner af høj kvalitet omiske biblioteker. Desuden viser vi, at trinene til at reducere forurenende baggrunds-RNA er vigtige for klart at skelne celletyper. Sammenfattende viser denne protokol muligheden for at studere hjernens aldring i ikke-traditionelle hvirveldyrmodelorganismer.
Introduction
At forstå mekanismerne for hvirveldyrs hjerne aldring er afgørende for at løse aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme som Alzheimers og demens1. Den afrikanske turkis killifish (Nothobranchus furzeri) er det kortest levede hvirveldyr, der kan opdrættes i fangenskab, og på grund af dets korte levetid og aldersrelaterede kognitive svækkelse er det en fremragende hjerne aldringsmodel 2,3,4,5. For nylig har fremkomsten af enkeltcellede "omics" -teknologier, såsom enkeltkerner RNA-seq (snRNA-seq) og enkeltkerneassay til transposase-tilgængeligt kromatin med sekventering (snATAC-seq), gjort det muligt for forskere at forhøre den aldrende hjerne med en hidtil uset opløsning 6,7,8. Disse metoder er afhængige af kerneisolering, da genopretningen af hjerneceller såsom neuroner ofte er for udfordrende til at isolere 6,7,8,9,10. Imidlertid er de fleste offentliggjorte kerneisoleringsprotokoller optimeret til pattedyrmodelorganismer 11,12,13,14,15. Da der således i øjeblikket er et udækket behov for at isolere hjernekerner i killifish som en kommende ny modelorganisme inden for aldringsforskning2, er målet med denne protokol at etablere en metode til isolering af kerner af høj kvalitet fra frosset hjernedræbervæv.
Her etableres en strømlinet og robust arbejdsgang, der bruger almindeligt tilgængelige materialer til at isolere kerner af høj kvalitet fra killifish-hjerner. Denne protokol blev ændret fra en 10x Genomics-protokol for musehjerner for at imødekomme hjerner med lavere myelinindhold i afrikansk turkis killifish, skrøbeligheden af frosset væv og behovet for at reducere indholdet af omgivende affald til sekventeringsrelaterede applikationer16. Faktisk fører tidligere optimerede protokoller for pattedyrs hjernevæv17,18 til dårlig kernekvalitet (dvs. overlysis) og / eller højt affaldsindhold, når de anvendes på frosne killifish-hjerner, hvilket gør dem uegnede til brug med snRNA-seq i henhold til anbefalinger for enkeltkerner RNA-seq ved hjælp af mikrofluidik (supplerende figur 1).
Ud over kerneisolering demonstrerer vi, hvordan man vurderer kernekvalitet og udbytte ved mikroskopi og flowcytometri. Denne artikel indeholder eksempler på både optimale og suboptimale resultater og diskuterer fejlfinding. Denne protokol blev designet og optimeret til frosne killifish hjerner, men kan også bruges uden større ændringer på frisk dissekerede killifish prøver. Killifish hjernekerner isoleret ved hjælp af denne metode er optimeret til brug i enkeltkerne RNA-seq (snRNA-seq) som en downstream-applikation, men bør også være egnet til brug i snATAC-seq og bulk ATAC-seq.
Protocol
Dyrepleje og dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med University of Southern California IACUC under godkendte protokoller #21215. For ethvert arbejde, der bruger denne protokol, er det nødvendigt at indhente godkendelse fra institutionens IACUC, inden der påbegyndes forskningsarbejde på hvirveldyr.
BEMÆRK: En komplet gennemgang af protokollen startende fra flashfrosset hjernevæv (startende fra trin 3) skal tage ~ 2,5 timer for seks prøver (figur 1).
1. Disseker killifish hjerner
- Aflivning af killifish humant ved hjælp af en opløsning af 1,5 g / l methanosulfonat / tricain (MS-222) i systemvandet.
- Brug en skarp saks til hurtigt at halshugge killifish, efter at al krops- og gællebevægelse er ophørt.
- Disseker det afhuggede hoved på en ren petriskål som tidligere beskrevet19.
- Placer skålen under et dissekerende mikroskop (ved hjælp af et 8x-35x forstørrelsesområde). Drej hovedet således, at branchiostegalstrålerne er i fokus
- Brug saks til at skære gennem tandprotesen, således at branchiostegalstrålerne og kraniet afsløres.
- Brug tang til at holde greniostegalstrålerne nede på hver side af kraniet. Brug et andet par tang til at fjerne eventuelle resterende vævsfragmenter fra kraniet. Den V-formede optiske chiasme, der forbinder hjernen og øjnene, skal blive synlig.
- Klip den optiske chiasm ved hjælp af en saks for at løsne begge øjne fra hjernen. Brug tang til forsigtigt at frigøre kraniet.
- Vend kraniet om og brug tang til at skrabe musklen fra kraniets dorsale side.
- Brug et par tang til at holde kraniet på plads og et andet par tang til forsigtigt at fjerne kraniets knogler og afsløre hjernen.
- Hjernen fremstår hvid og blød. Når det er synligt, er det ikke nødvendigt at fjerne alle kraniale knogler. Fjern hjernen med ren tang ved forsigtigt at løfte og skrabe.
- Flash fryser hjernen ved at placere den i et mikrocentrifugerør opbevaret på tøris.
BEMÆRK: Det frosne hjernevæv kan opbevares ved -80 °C, indtil alle prøver, der skal behandles sammen, er indsamlet for at begrænse batcheffekter ved behandling til biblioteksgenerering. Mens prøver opbevaret ved -80 ° C ikke kan opbevares på ubestemt tid, er denne protokol blevet udført med succes på killifish-hjerner, der er opbevaret i op til 12 måneder uden noget bemærkelsesværdigt fald i kvaliteten.
2. Forbered friske buffere
- Klargør kernevaskbuffer (2% bovin serumalbumin [BSA] i 1x PBS, fosfatbufferet saltvand pH 7,4 og 0,2 U / μL RNasehæmmer) og opbevar på is. Forbered 250 ml kernevaskbuffer til op til otte prøver. Til 250 ml skal du bruge 50 ml 10% BSA-stamopløsning, 25 ml af en 10x PBS-stamopløsning, 1,25 ml af 40 U/μL RNase-hæmmerstammen og derefter bringe volumen til 250 ml med RNAse-fri ddH2O.
- Klargør kernelysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0,01875% v/v NP-40 og0,2 U/μL RNasehæmmer) og opbevar på is. Forbered 10 ml kernelysisbuffer til op til otte prøver. Til 10 ml anvendes 100 μL 1 M Tris-HCl pH 7,4 stamopløsning, 20 μL 5 M NaCl-stamopløsning, 30 μL 1 M MgCl2-stamopløsning , 18,75 μL af en 10% NP-40-stamopløsning, 50 μL af 40 U/μL RNase-hæmmerstammen og bringes derefter til 10 ml med RNAse-fri ddH2O.
3. Isoler kerner
- Hvis du bruger frosne prøver, tøs dem op på is i 10 min. Hvis du bruger nyligt dissekerede hjerner, skal du fortsætte direkte til trin 3.2
BEMÆRK: Selvom denne protokol kan fungere på enkelthjerner, vil mindre prøver fra unge fisk (5-6 uger gamle) have et dårligere udbytte. Der kan altid opnås tilstrækkeligt udbytte ved at behandle to hjerner som én prøve, uanset fiskens alder og køn (tabel 1). Denne protokol har med succes isoleret kerner af høj kvalitet fra fisk i alderen 5-26 uger, herunder dyr fra både GRZ- og ZMZ1001-stammer. Der forventes ingen problemer med at anvende denne protokol på andre stammer. - Dounce hjernen i 1 ml iskold kerne lysis buffer i en 2 ml Dounce homogenisator. Hold homogenisatoren på is, og undgå at generere bobler, mens prøven lyser. Dounce med en omtrentlig hastighed på 0,5 s / downstroke og 0,5 s / opslag med en 180 ° twist pr. Cyklus. Dounce ved hjælp af den løse pistil i 15 slag, eller indtil væv / lysisbufferblandingen ser homogen ud, hvis der er behov for yderligere slag.
BEMÆRK: Dounce homogenisatorer skal vaskes, skylles med destilleret vand og steriliseres med standard tørre autoklave steriliseringscyklusser mellem anvendelser.- Dounce ved hjælp af den stramme pistle i 30 slag med små pauser, 30 s til 1 min, hvert 10. slag. Dounce med en omtrentlig hastighed på 0,5 s / downstroke og 0,5 s / opslag med en 180 ° twist pr. Cyklus. Lad prøven hvile på is i Dounce homogenisatoren i 2 min.
BEMÆRK: Denne inkubationstid sikrer tilstrækkelig lyse, men bør forkortes, hvis der observeres nuklear overlyse.
- Dounce ved hjælp af den stramme pistle i 30 slag med små pauser, 30 s til 1 min, hvert 10. slag. Dounce med en omtrentlig hastighed på 0,5 s / downstroke og 0,5 s / opslag med en 180 ° twist pr. Cyklus. Lad prøven hvile på is i Dounce homogenisatoren i 2 min.
- Stammen gennem et 70 μm cellefilter i et 15 ml konisk rør forbelagt i 5% BSA.
- Der tilsættes 4 ml kernevaskbuffer til prøven ved at pipettere vaskebufferen over 70 μm cellefilteret fra trin 3.3 og blandes forsigtigt ved inversion fem gange.
BEMÆRK: Dette giver mulighed for genopretning af kerner, der kan være fanget på filteret og forbedrer udbyttet. - Centrifuge ved hjælp af en svingende spandrotor ved 500 x g, 4 °C, i 10 min. Kassér supernatanten ved forsigtigt at hælde i en beholder til flydende affald. Prøven sættes i opretstående stilling, og den resterende vaskebuffer fjernes med en P1000-pipette.
BEMÆRK: Kernepillen vil sandsynligvis være synlig, når man starter fra to hjerner i en prøve. Men ved behandling af enkelthjerner fra unge dyr (5-6 uger gamle) forventes et lavere udbytte, og pellets kan ikke altid være synlige. I dette tilfælde skal supernatanten fjernes forsigtigt, mens pelletens position i bunden af røret antages. - Umiddelbart resuspenderes kernerne i 1 ml kernevaskbuffer med en bred boring P1000 pipettespids.
- Prøven bringes til 5 ml ved at tilsætte 4 ml kernevaskbuffer og bland forsigtigt ved inversion fem gange. Centrifuge ved hjælp af en svingende spandrotor ved 500 x g, 4 °C, i 10 minutter, og kassér supernatanten.
- Resuspender kernerne i 1 ml kernevaskbuffer med en bred borepipettespids og overføres til et flowcytometrirør (FACS).
- Der tilsættes 300 μL opløsning til fjernelse af affald (materialetabel) og blandes grundigt ved pipettering med en bred borespids, indtil blandingen er homogen.
- Overlejr forsigtigt 1 ml kernevaskbuffer oven på kerneopløsningen, der er fremstillet i trin 3.9, ved hjælp af en P1000-pipette og hold røret i en lille vinkel (supplerende figur 2). Affaldsfjernelsesopløsningsfraktionen og kernevaskbufferfraktionen skal danne en klar grænseflade, hvis den er lagdelt korrekt.
- Centrifuge i en svingende spandrotor ved 3000 x g, 4 °C, i 10 min. Kassér de to øverste faser helt ved hjælp af en P1000-pipette.
BEMÆRK: Det klare FACS-rør tillader visualisering af de tre forskellige faser efter centrifugering (top, interfase, bund). For at lette maksimal fjernelse af affald anbefales det at være mere aggressiv end konservativ ved at fjerne de to øverste faser (dvs. fjernelse af en lille del af den nederste fase foretrækkes frem for at overføre nogen af de øverste faser; Supplerende figur 2). Derudover kan interfaselaget være for tyndt til at visualisere. I dette tilfælde skal du fjerne det øverste (tilsyneladende) lag, som indeholder interfaselaget. Det bundlag, der bevares, skal indeholde ~ 1 ml samlet volumen. - Overfør bundlaget til et 15 ml konisk rør forbelagt med 5% BSA.
- I det koniske rør bringes volumenet til 15 ml med kernevaskbuffer og inverteres tre gange for at blande.
- Centrifuge i en svingende spandrotor ved 1000 x g, 4 °C, i 10 min. Fjern supernatanten forsigtigt.
- Der resuspenderes straks 150 μL kernevaskbuffer ved hjælp af en bred borepipettespids.
- Skift til en standardborepipettespids, der er indstillet til ~300 μL. Optag hele prøven, og fastgør derefter et 40 μm filter på spidsen til enden af pipettespidsen, og pas på ikke at udvise prøven.
BEMÆRK: On-tip-filtre er nødvendige for at opnå mindre volumener, som er nødvendige for at opretholde tilstrækkelig kernekoncentration til downstream-applikationer. For eksempel anbefales en minimumskoncentration på >300 kerner / μL til snRNA-seq ved hjælp af mikrofluidik, selvom det optimale interval er 700-1200 kerner / μL18. Højere koncentrationer af kerner kan også let fortyndes, hvis det er nødvendigt. - Prøven filtreres ved kraftigt at udvise prøven gennem filteret til et lavt DNA-bindende 1,5 ml mikrocentrifugerør. Det endelige elueringsvolumen skal være 120-150 μL.
BEMÆRK: Noget skumning kan skyldes filtrering. Dette ser ikke ud til at påvirke kernekvaliteten.
4. Vurder kernekvaliteten ved mikroskopi
- I et separat mikrocentrifugerør blandes 10 μL af den filtrerede prøve med 10 μL trypanblå opløsning med forsigtig pipettering. Prøver kræver ingen forlænget inkubationstid og er klar til visualisering umiddelbart efter blanding med trypanblå opløsning.
- Deponer 10 μL af de farvede kerner i et kammer i et tællekammerglas.
BEMÆRK: Alternativt kan du aflejre 10 μL af den farvede kerneprøve på et hæmocytometer eller mikroskopiglas og dække med en dækslip. - Vurder kernekvaliteten ved lysmikroskopi.
BEMÆRK: Lavere forstørrelser bør kun bruges til at zoome ind på kerner, da kernefejl kun vil være visuelt synlige ved højere forstørrelser (dvs. 60x eller højere). Dette trin kan gøres hurtigt for at vurdere succesen med kerneforberedelse og kræver ikke sekundær analyse ud over visuel inspektion. Intakte kerner af høj kvalitet vil have en skarpt defineret kant20 (figur 2A). Kerner af dårlig kvalitet vil have forstyrret nukleare membraner, pletvis trypanblå farvning nær kernemembranen, der indikerer potentiel nukleinsyrelækage og / eller tegn på blebbing20 (figur 2B). Sunde kerner forventes at være 10-15 μm i diameter.
5. Kvantificer singletkerner, snavs og multipletandel ved flowcytometri
BEMÆRK: Den specifikke terminologi og grænseflade for flowcytometersoftwaren kan variere afhængigt af maskinens mærke, men disse trin skal let tilpasses andre systemer, hvis det kræves.
- I et FACS-rør resuspenderes 10 μL af den filtrerede kerneprøve i 90 μL af den buffer, der anbefales til flowcytometri til en 1:10 fortynding. Til dette formål anvendes 0,22 μm filtreret steriliseret PBS, pH 7,2, med 2 mM EDTA og 0,5% BSA i denne undersøgelse.
BEMÆRK: Selvom denne fortynding vil fungere for de fleste kernepræparater, kan en lavere fortynding (f.eks. 1: 5) være nødvendig for at prøve nok kerner til kvalitetsvurdering i tilfælde af en prøve med lavere udbytte (dvs. < 30 kerner / μL i den fortyndede prøve). - Pletter prøverne med propidiumiodid (PI) i en slutkoncentration på 1 μg/ml. Der kræves ingen inkubationstid, og kerner kan analyseres med det samme.
BEMÆRK: Alternativt farves prøverne med en endelig koncentration på 0,1 μg/ml DAPI. Bemærk, at DAPI skal læses på en anden fluorescenskanal end PI (Vioblue-A V1-A-kanal; excitation ved 405 nm, emission ved 450/50 nm). - Analyser prøverne på et flowcytometer som følger:
- Konfigurere et arbejdsområde:
- Har flowcytometeret i anskaffelsestilstand. Klik på Filer, og vælg derefter Nyt arbejdsområde i rullemenuen. Under fanen Eksperiment i venstre panel skal du indtaste projektnavnet og eksempel-id'et i deres respektive felter.
- I øverste venstre værktøjslinje skal du klikke på knappen Nyt analysevindue (scatter plot-ikon). Klik på feltet med tre plots (Plot 4t) i pop op-menuen. Tre plots vises på skærmen. Klik på knappen Analysetilstand øverst til venstre på værktøjslinjen øverst til venstre (et ikon), så den er grå og ikke orange.
- Opret analyseplots:
- Ændre akserne for de tre plots som følger, ordnet som henholdsvis X-akse og Y-akse:
Plot 1: X-akse: FSC-A, Y-akse: SSC-A
Plot 2: X-akse: HDR-T, Y-akse: SSC-A
Plot 3: X-akse: PerCP-Vio700-A B3-A, Y-akse: SSC-A - Skift akserne ved at klikke på akseetiketten og vælge den ønskede kanal i rullemenuen.
- Indstil plottene til at være tæthedsfarvekodet ved at klikke på det firkantede grå "i" -ikon, der vises ved siden af øverste højre hjørne af hvert plot. Vinduet Egenskaber åbnes med et panel med knapper til venstre. I vinduet Egenskaber skal du klikke på Scatterplot-ikonet (andet fra toppen til venstre for panelet). Klik på OK.
BEMÆRK: PerCP-Vio700-A B3-A fluorescenskanalen svarer til en excitation ved 488 nm og emission i området 650-730 nm.
- Ændre akserne for de tre plots som følger, ordnet som henholdsvis X-akse og Y-akse:
- Konfigurer instrumentindstillinger:
- Klik på fanen Kanaler i venstre panel. En liste over alle kanaler vises med tre felter til højre. Indstil B3, FSC-A og SSC-A til Hlog ved at klikke på pil ned på deres respektive første felter til højre og vælge Hlog i rullemenuen. Indstil spændingen for SSC til 640 V, FSC til 300 V og B3 til 480 V ved at indtaste disse tal i deres respektive midterste felter til højre og trykke på Enter-tasten . Bemærk, at den tredje boks til højre er en skifte, der kan bruges skiftevis til at skrive.
- Under udløseroverskriften skal du indstille FSC-udløseren til 4 og SSC- og B3-udløseren til 0 ved at klikke på pil ned, vælge dem i rullemenuen til venstre, indtaste nummeret i feltet til højre og derefter trykke på Enter-tasten . Bemærk, at der er en vippeboks til højre, der kan bruges alternativt til at skrive.
BEMÆRK: PMT-spændinger skal optimeres for hver enkelt flowcytometrimaskine, men udløseren for kerner skal være lavere end det, der typisk bruges til celler. Desuden skal akseskalaen indstilles til h-log.
- Skriv 100 μL i tekstfeltet Eksempelvolumen og 50 μL i tekstfeltet Optag lydstyrke i venstre side af flowsoftwarevinduet. Kontroller, at parameteren Mix Sample er indstillet til Mix Gentle for at undgå lysering af kerner på dette trin. Tryk på trekanten i en cirkel (ikonet Afspil ) i nederste højre hjørne for at starte flowet.
- Kontroller flowkvaliteten:
- Brug sidespredningsområde (SSC-A) versus HDR-T til at kontrollere, om der er luftbobler eller klumper i prøven. Sørg for, at dette plot er et glat kontinuum af punkter. Luftbobler eller klumper vil resultere i tomme områder i SSC-A versus HDR-T-plottet.
- Kontroller sidespredningsplottet (SSC-A) versus fremadgående spredning (FSC-A) for at kontrollere, at de anvendte spændinger er korrekte for prøven.
BEMÆRK: I modsætning til celler vil kerner ikke helt løse sig fra snavs i et sidespredning vs. fremadgående spredningsplot. Der skal dog være en klynge af begivenheder med høj densitet mod midten af plottet svarende til kerner (varmere farvet) med en lavere tæthed af begivenheder (køligere farvet) i baggrunden svarende til snavs.
- Analyser kerneantal og kvalitet:
- Dobbeltklik på plottet SSC-A vs. PerCp-Vio-700A for at få en forstørret visning. Klik på knappen øverst til venstre værktøjslinje med vinkelrette linjer (kvadrant) for at vælge en kvadrantport. Klik derefter et vilkårligt sted i SSC-A vs. PerCp-Vio-700A-plottet , og kvadranterne vises inde i plottet.
- Klik et vilkårligt sted på kvadrantens skillelinjer, og skub markøren for at ændre kvadrantplaceringen. Placer kvadranterne således, at den øverste venstre kvadrant indeholder populationen yderst til venstre (affald), og den øverste højre kvadrant indeholder flere dråbeformede klynger (kerner) (se figur 3 for portopsætning og eksempler på flowresultater for typiske resultater med preps, herunder eller ikke inklusive et trin til fjernelse af snavs).
- Affald versus kerner tæller:
- Klik på det firkantede grå "i" -ikon i øverste højre hjørne af plottet for at åbne vinduet Egenskaber . Klik på fanen Regionsfunktioner ; Lister over plotregioner og funktioner vises.
- Under listen Regioner skal du markere et grønt flueben ud for det øverste element, der angiver, at hele plottet er valgt. Under listen Funktioner skal du klikke på Tæl/μL for at sætte et grønt flueben. Klik på OK, og der vises en optælling/μL-metrik i hver kvadrant.
- Hvis du vil have vist rå optællinger og procenter, skal du vælge Tæl og %-T under fanen Områdefunktioner , hvis det ønskes. Tællingerne/μL i øverste venstre og højre kvadrant svarer til henholdsvis vragrester og kerneudbytte.
- Singlet tæller:
- Den venstre mest dråbeformede klynge i den nederste del af den øverste højre kvadrant repræsenterer singlets. Tegn en polygonal port omkring denne population ved at klikke på polygonknappen (Polygon) øverst til venstre værktøjslinje.
- Klik på en enkelt gang, skub musen for at begynde at tegne, og klik igen for at afslutte et lineært segment af porten og begynde det næste. Dobbeltklik for at afslutte porten. Klik på portens kant, og skub musen for at flytte porten.
- Klik på portens hjørner for at ændre figuren. Tællinger/μL af den lukkede befolkning (singlets) vises. Dette er koncentrationen af kerneforberedelsen med den indledende fortynding.
BEMÆRK: Det fremadrettede spredningsområde versus højde 1: 1 lineære forhold, der almindeligvis bruges til at bestemme singlethastighed, når der flyder celler, gælder ikke for kerner og kan ignoreres.
- Ved hjælp af koncentrationen af de fortyndede kerner prep og fortyndingsfaktoren skal du tilbageberegne koncentrationen af den oprindelige forberedelse (f.eks. for en 1:10 fortynding multipliceres den observerede koncentration med 10). Koncentrationer fra >300 kerner/μL er egnede til snRNA-seq.
- Konfigurere et arbejdsområde:
Representative Results
Killifish brain nuclei isolationsprotokollen beskrevet her er optimeret specifikt til killifish og er opsummeret i figur 1. Ud over kerneekstraktion beskriver protokollen forskellige metoder til vurdering af kvaliteten og mængden af isolerede kerner. Figur 2 viser eksempler på både sunde (figur 2A) og usunde (figur 2B) kerner vurderet ved lysmikroskopi. Sunde kerner, der er egnede til downstream-analyse (figur 2A), er til stede som singletkerner med intakte membraner. Som vist i figur 2B er den mest almindelige fejltilstand i denne protokol (og andre kerneisoleringsprotokoller) dannelsen af overlyserede kerner, der er kendetegnet ved beskadigede nukleare membraner. Dette fører ofte til, at kerner klumper sig sammen og kan bidrage til baggrundssignaler i nedstrøms applikationer på grund af lækage af nukleinsyrer fra de bristede kerner. Hvis der observeres overdreven klumpning, anbefaler vi at være blidere under dounce-trinene og / eller reducere inkubationstiderne i lysisbufferen.
Denne protokol bruger flowcytometri til at kvantificere antallet af isolerede kerner og bestemme den relative andel af multipletkerner i en prøve. Derudover kan flowcytometri bruges til at vurdere det relative indhold af forurenende affald, ofte bristede kernefragmenter og andet cellulært affald, der kan påvirke nedstrøms assays i kerneprøven skadeligt. Repræsentative flowdata fremgår af figur 3. En kerneisoleringsprocedure af høj kvalitet vil producere: 1) en lille affaldsfraktion og 2) en høj fraktion af singlet versus multipletkerner (> 80% af kernefraktionen). Brugen af PI-farvning, som pletter nukleinsyrer, gør det muligt at adskille singletkerner fra snavs og multipletkerner. Figur 3A er et eksempel på en prep, der er forurenet med affald, mens figur 3B er et eksempel på et eksperiment af høj kvalitet.
Figur 1: Killifish hjernekerne isolation arbejdsgang. Eksperimentel arbejdsgang for kerneisolering fra frosne eller friske killifish-hjerner. Når de er isoleret og vurderet, kan kerner bruges til forskellige downstream "omics" analyser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vurdering af kernekvalitet ved mikroskopi. Kerner blev blandet 1:1 i en opløsning af 0,4% Trypan Blue og visualiseret på et Echo Revolve-mikroskop ved brightfield-billeddannelse ved 60x. (A) Et eksempel på en kerne af høj kvalitet. Kernen er til stede som en singlet, og kernemembranen er intakt. (B) Et eksempel på kerner af dårlig kvalitet. Kernemembranerne er beskadiget, og kerner klumper sig sammen i en dublet, sandsynligvis på grund af lækage af klæbrigt DNA, som kan ses lække fra toppen af den øverste kerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af kerner og renhedsvurdering ved flowcytometri. Kerneprøver blev farvet med en 1:100 fortynding af PI og kørt på et flowcytometer. Kerner er til stede i singlet- og multipletformer i den øverste højre kvadrant af (A, B) med singlets som den laveste sky af begivenheder efterfulgt af dubletter, trillinger osv. I stigende rækkefølge. Vragrester er præget af begivenhederne i de to kvadranter længst til venstre. (A) Et eksempel på en kerneforberedelse af lav kvalitet, hvor trinnet til fjernelse af affald blev udeladt, og snavs udgør >40% af begivenhederne. (B) Et eksempel på en kerneprøve af høj kvalitet med det medfølgende trin til fjernelse af affald. I dette eksempel udgør affald <10% af alle hændelser, der registreres af flowcytometeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Prøvetype (2 hjerner) | Gennemsnitligt udbytte (4 uafhængige preps) |
| 5-ugers mandlige hjerner | 3,59 ± 1,76 x 105 |
| 10-ugers mandlige hjerner | 6,41 ± 1,33 x 105 |
| 15-ugers mandlige hjerner | 14,59 ± 2,05 x 105 |
| 5-ugers kvindelige hjerner | 2,54 ± 0,75 x 105 |
| 10-ugers kvindelige hjerner | 4,66 ± 1,29 x 105 |
| 15-ugers kvindelige hjerner | 7,95 ± 3,51 x 105 |
Tabel 1: Gennemsnitligt forventet udbytte fra to hjerner af afrikansk turkis killifish på tværs af køn og alder. Gennemsnitlige udbytter udtrykt som 105 kerner ± standardafvigelse for gennemsnittet over fire uafhængige kernepræparater i hver kategori.
Supplerende figur 1: Sammenligning af kerneisoleringskvalitet ved hjælp af standardprotokoller og vores optimerede protokol om frosne killifish-hjerner. (A) Kvalitetsvurdering af kerner ved mikroskopi. Kerner blev blandet 1:1 i en opløsning af 0,4% Trypan Blue og visualiseret på et mikroskop ved brightfield-billeddannelse ved 60x. (B) Kvantificering af kerner og snavsbelastning ved flowcytometri. Kerneprøver blev farvet med en 1:100 fortynding af PI og kørt på et flowcytometer. (C) Resumé af kvalitetsvurderingsmålinger ved mikroskopi og flowcytometri med de forskellige benchmarkede protokoller. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Skematisk gengivelse af trinene til fjernelse af affald. (A) Ordning for fjernelse af affald lagdeling af præcentrifugering. (B) Ordning for fjernelse af supernatant efter centrifugering. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, kan bruges til reproducerbart at generere kerner af høj kvalitet fra killifish-hjerner. Denne protokol skulle være specielt designet til killifish-hjernen, da typiske pattedyrbaserede hjernekerneisoleringsprotokoller anvendt på killifish-hjerner konsekvent resulterede i dårlig kernekvalitet i vores hænder. Vi formoder, at dette skyldes det lavere relative myelinindhold i killifish-hjernen sammenlignet med deres pattedyrs modstykker, som ville lyse og klumpe sig sammen som reaktion på de barske forhold, der kræves for pattedyrs hjernecellelysis. Denne protokol er et fremskridt inden for aldring og killifish-felterne, da det letter udforskningen af hjernens aldring på enkeltcelleniveau i en omkostnings- og tidseffektiv model af hvirveldyrs hjerneældning.
Denne protokol er robust over for friske eller frosne prøver, selvom man skal overveje downstream-applikationerne, når man bruger frisk eller frosset væv. Frosset væv er ofte praktisk, da det kan indsamles og opbevares i flere måneder, mens prøver indsamles. Sådanne prøver kan sikkert anvendes til applikationer såsom snRNA-seq. Imidlertid kan fryseprøver forstyrre den nukleare struktur og dermed evnen til nøjagtigt at måle kromatinlandskabet ved ATAC-seq21. Til downstream-applikationer såsom bulk ATAC-seq eller snATAC-seq anbefales det således at bruge frisk dissekerede hjerner i stedet for frosne hjerner. Derudover, fordi alle trin efter hjernehomogenisering kan udføres parallelt, er denne protokol egnet til at køre flere prøver inden for en rimelig tidsramme, hvilket begrænser RNA-nedbrydning forårsaget af langvarig inkubation på is.
Desuden er det bydende nødvendigt at forberede buffere friske (inden for få timer) efter udførelse af kerneekstraktion. Vi fandt ud af, at vaskemidler såvel som BSA skal tilsættes buffere umiddelbart inden protokollen påbegyndes. Buffere, der kun indeholder salte (PBS, NaCl osv.), kan fremstilles som koncentrater, filtreres steriliseres (0,22 μm) og opbevares på ubestemt tid ved stuetemperatur. BSA-stamopløsninger kan fremstilles, steriliseres og opbevares ved 4 °C inden for få dage efter kerneekstraktionen (hvis de er fremstillet af et pulver), men bør altid tilsættes til de buffere, der anvendes i denne protokol, umiddelbart før protokollen iværksættes. Vi anbefaler dog at forberede BSA-løsninger på protokollens dag. Hvis du bruger præfabrikerede BSA-opløsninger fra en tredjepart, anbefales det at bruge friske, uåbnede flasker. Brug af frisk BSA fører generelt til lavere snavsindhold i kerneforberedelser.
Uanset om friske eller frosne prøver anvendes som input, er det vigtigt at vurdere kernekvaliteten efter kerneisolering. Selvom denne protokol er specielt designet til at undgå overlysis, er dette den mest almindelige årsag til tab af kernekvalitet. Overlysis kan skyldes for meget tid brugt i lysisbufferen, alt for hård håndtering af kernerne, såsom overdreven pipettering med en standardborepipettespids eller en for lang tid brugt mellem kerneisolering og nedstrøms applikationer (>1 time). Overlyserede kerner vil ofte have beskadiget nukleare periferier, som lækker DNA og forårsager klumpning (figur 2B). Dette vil føre til et øget antal multipletter og bidrage med baggrundsnukleinsyrer, der vil interferere med downstream-applikationer, især snRNA-seq. Begge kvaliteter kan vurderes ved mikroskopi efter kerneisolering. Hvis der observeres overdreven nuklear klumpning, anbefaler vi at forsøge at forkorte lysistrininkubationen for at reducere risikoen for overlysis. Som en alternativ metode til at øge kernesingler kan fluorescensassisteret cellesortering (FACS) bruges til at berige for singler nedstrøms for denne protokol. Vi bemærker dog, at når man arbejder med allerede skrøbelige kerner fra frosset væv, kan forskydningsspændingen, der opstår under sortering, føre til øget nuklear brud og dermed øget omgivende RNA / DNA. Derudover bemærker vi, at den tid, der kræves for at køre en FACS-udbyttesortering for kerner, når de behandler flere prøver, vil kræve, at alle kerneprøver forbliver på is i timevis, mens andre prøver sorteres. Således kan øgede ventetider ved behandling af flere prøver parallelt med FACS-tilgangen sandsynligvis også føre til generelt reduceret kernekvalitet og øge risikoen for RNA-nedbrydning. Hvis FACS ønskes for reduceret dublethastighed, anbefaler vi således, at affaldsindholdet kontrolleres igen efter udbyttesorteringen, og at mulig reduceret RNA-kvalitet tages i betragtning for enkeltcellede RNA-seq-applikationer som en potentiel advarsel.
Et nøjagtigt skøn over kernetal og singlet-andel er afgørende for næsten alle downstream "omics" -applikationer og er af største betydning. På grund af evnen til let at gate og tælle kerner efter størrelse er flowcytometri den mest nøjagtige metode til at tælle kerner, som vi har vurderet. Alternativt kan man kvantificere kerner ved hjælp af celletællere som Invitrogens grevinde 2 FL Automated Cell Counter eller DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. For at bemærke, har Invitrogens grevinde 2 FL Automated Cell Counter, og i langt mindre grad DeNovix, en tendens til at overvurdere kernetællinger ved at tælle snavs som kerner, hvilket betyder, at manuel størrelse gating kan være påkrævet. Desuden giver flowcytometeret en mulighed for let at vurdere kernernes renhed. Man kan skelne den relative andel af singlet versus multipletkerner på en kvantitativ måde, der er vanskelig ved mikroskopi. Dette er afgørende for snRNA-seq og snATAC-seq, da disse protokoller vil lide under et overskud af multipletprøver, som skal udelukkes fra downstream-analyser. Ud over multipletter kan den relative andel af "snavs" (fragmenterede kerner, cellulære affald) kvantificeres ved flowcytometri og skal være relativt lav, da dette materiale ofte indeholder forurenende nukleinsyrer, der kan bidrage med et baggrundssignal og korrupte enkeltkerne "omics" -data.
Som med tidligere beskrevne kerneisoleringsprotokoller må proportionerne af celletyper i det oprindelige væv ikke rekapituleres trofast i kerneforberedelsen19 og bør derfor fortolkes med forsigtighed. For at bemærke, som alle teleosts, har afrikansk turkis killifish nukleerede erytrocytter, som også forventes at være repræsenteret i kerneforberedelsen. Disse kerner kan identificeres i snRNA-seq og snATAC-seq datasæt ved den højere ekspression / tilgængelighed af hæmoglobingener og kan udelukkes beregningsmæssigt, hvis det ønskes.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Nogle paneler blev genereret med BioRender.com. Dette arbejde i vores laboratorium blev støttet af NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant til B.T., et tilskud fra Simons Foundation som en del af Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, et pilotstipendium fra Navigage Foundation og en Hanson-Thorell Family-pris til B.A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
- Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P.
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. 17 (3), 12757 (2018).
- McKay, A., et al. An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning. bioRxiv. , (2021).
- Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).
- Vanhunsel, S., et al. The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation. NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22 (2021).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Ziffra, R. S., et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development. Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).
- Grindberg, R. V., et al.
- Kalish, B. T., et al. Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments. (162), e61542 (2020).
- Saunders, A., et al. Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain. Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).
- Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k (2021).
- Martin, C., et al. Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2. protocols.io. , (2020).
- Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing (2022).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression- (2022).
- Rocks, D., et al. Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain. Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).
