Summary
Ce protocole décrit un modèle murin d’anévrisme de l’aorte abdominale induit par le phosphate de calcium (AAA) pour étudier les caractéristiques pathologiques et les mécanismes moléculaires des AAA.
Abstract
Un anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est une maladie cardiovasculaire potentiellement mortelle qui survient dans le monde entier et se caractérise par une dilatation irréversible de l’aorte abdominale. Actuellement, plusieurs modèles murins AAA induits chimiquement sont utilisés, chacun simulant un aspect différent de la pathogenèse de l’AAA. Le modèle AAA induit par le phosphate de calcium est un modèle rapide et rentable par rapport aux modèles AAA induits par l’angiotensine II et l’élastase. L’application de cristaux de CaPO4 à l’aorte de la souris entraîne une dégradation des fibres élastiques, une perte de cellules musculaires lisses, une inflammation et un dépôt de calcium associé à la dilatation aortique. Cet article présente un protocole standard pour le modèle AAA induit par CaPO4. Le protocole comprend la préparation du matériel, l’application chirurgicale du CaPO4 à l’adventice de l’aorte abdominale infrarénale, la récolte des aortes pour visualiser les anévrismes de l’aorte et les analyses histologiques chez la souris.
Introduction
Un anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) est une maladie cardiovasculaire mortelle caractérisée par une dilatation permanente de l’aorte abdominale, avec des taux de mortalité élevés une fois la rupture survenue. L’AAA est associé au vieillissement, au tabagisme, au sexe masculin, à l’hypertension et à l’hyperlipidémie1. Il a été démontré que plusieurs processus pathologiques contribuent à la formation d’AAA, notamment la protéolyse des fibres de la matrice extracellulaire, l’infiltration des cellules immunitaires et la perte des cellules musculaires lisses vasculaires. Actuellement, les mécanismes pathologiques de l’AAA restent insaisissables et il n’existe aucun médicament éprouvé pour le traitement de l’AAA1. La recherche sur l’AAA humain est limitée en raison de l’existence de peu d’échantillons aortiques humains; ainsi, plusieurs modèles AAA animaux induits par des modifications chimiques ont été établis et largement adoptés, y compris la perfusion sous-cutanée d’angiotensine II (AngII), l’incubation périvasculaire ou intraluminale d’élastase et l’application périvasculaire de phosphatede calcium 2. Un modèle murin couramment utilisé est l’application de phosphate de calcium (CaPO4) à l’adventice de l’aorte abdominale infrarénale, ce qui est rentable et ne nécessite pas de modification génétique.
L’application périaortique directe de CaCl2 sur l’artère carotide de lapins pour induire un changement anévrysmal a été initialement rapportée par Gertz et al.3 et a ensuite été appliquée aux aortes abdominales de souris. Le modèle a été développé par Yamanouchi et al. pour accélérer la dilatation aortique en utilisant des cristaux CaPO 4 chez la souris4. L’infiltration de CaPO4 dans les aortes de souris récapitule de nombreuses caractéristiques pathologiques observées chez les AAA humains, notamment l’infiltration profonde des macrophages, la dégradation de la matrice extracellulaire et le dépôt de calcium. Les facteurs de risque de l’AAA humain, tels que l’hyperlipidémie, augmentent également l’AAA induit par CaPO4 chez la souris5. Contrairement à l’AAA induit par la perfusion AngII chez les souris ApoE-/- ou LDLR-/-, l’AAA induit par CaPO 4 se produit dans la région aortique infrarénale, qui imite l’AAA humain. Actuellement, cette méthode a été largement appliquée pour évaluer la sensibilité au développement de l’AAA chez les souris génétiquement modifiées et évaluer les effets anti-AAA des médicaments 6,7.
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Protocol
Les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de Pékin et ont été approuvées par le Comité d’éthique biomédicale de l’Université de Pékin (LA2015142). Toutes les souris pour la chirurgie ont été anesthésiées avec de l’isoflurane (1,5%-2%), et l’anesthésie a été soigneusement surveillée pour éviter la douleur ou l’inconfort pour les souris.
1. Préparation
- Coupez des bandes de 0,3 cm de large de gants en caoutchouc sans poudre et de gaze.
- Achetez des souris mâles C57BL/6J âgées de 8 à 10 semaines. Hébergez les animaux dans un environnement climatisé avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
- Autoclavez la gaze, les cotons-tiges, les ciseaux et les forceps avant la chirurgie.
- Procurez-vous de la bétadine, de l’éthanol à 70 % et un lavage antiseptique des mains.
- Mettez un masque, une blouse et des gants stériles.
2. Intervention chirurgicale
- Donnez des comprimés de carprofène à croquer (dose de 5 mg/kg) à une souris C57BL/6J âgée de 8 à 10 semaines 2 à 4 h avant la chirurgie. Ensuite, placez la souris dans une chambre d’induction (206 mm x 210 mm x 140 mm) avec de l’isoflurane à un débit de 1,5% à 2%.
- Surveillez la souris pendant environ 5 minutes jusqu’à ce que la respiration soit visiblement ralentie. Assurez-vous que la souris n’a pas de réponse à la stimulation de la douleur avant la chirurgie.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux et fournissez un soutien thermique avec un coussin chauffant ou une couverture. Confirmez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement d’orteil toutes les 15 minutes pendant l’intervention chirurgicale.
- Rasez les poils abdominaux de la souris à l’aide d’une tondeuse électrique ou d’une crème dépilatoire. Écouvillonnez et essuyez la zone rasée avec de la bétadine, suivie d’éthanol à 70%, plusieurs fois dans un mouvement circulaire. Changez de gants pour maintenir la stérilité.
- Utilisez des ciseaux pour faire une incision de ~ 1,5 cm au bas de l’abdomen le long de la ligne médiane de l’abdomen.
- Utilisez un coton-tige stérile humidifié avec une solution saline normale pour retirer soigneusement l’intestin jusqu’à ce que l’aorte infrarénale soit visible.
- Disséquer le tissu conjonctif et la graisse de l’aorte infrarénale pour une section d’environ 0,5 cm. Remarquez les petits vaisseaux du côté dorsal et évitez de les déchirer. Il n’est pas nécessaire de séparer l’aorte abdominale de la veine principale abdominale.
- Emballez un morceau de la bande de gants en caoutchouc imbibée de solution saline sous l’aorte abdominale et la veine principale abdominale. Utilisez un coton-tige pour essuyer l’excès de liquide.
- Emballez un morceau de gaze imbibé de 0,5 M de CaCl2 sur l’adventice du système vasculaire abdominal infrarénal pendant 10 min. Pour le groupe des souris factices, remplacer le CaCl2 0,5 M par une solution saline normale.
- Retirez la gaze et emballez un autre morceau de gaze imbibé de solution de PBS pendant 5 minutes pour générer des cristaux de CaPO4 in situ dans l’adventice de l’aorte.
- Retirez délicatement la bande de gants en caoutchouc et la gaze. Réinitialisez le tractus intestinal de la souris.
- Suturer l’incision abdominale et la peau avec une suture 5-0.
- Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience. Fournir un logement de récupération de la douleur postopératoire et une analgésie, selon le comité local d’éthique animale.
- Hébergez la souris pendant encore 14 jours. Surveillez la souris de près après la chirurgie et observez-la au moins 1x chaque jour par la suite. Effectuez une nécropsie immédiatement si des souris meurent pendant cette période.
3. Récolte pour l’imagerie des aortes
- 14 jours après la chirurgie, sacrifiez les souris en utilisant du CO2.
- Coupez les cavités thoracique et abdominale de la souris ventralement et ouvrez l’oreillette droite.
- Perfuser les souris avec un tampon PBS à travers le ventricule gauche du cœur pour éliminer le sang dans l’aorte, puis perfuser avec 4% de paraformaldéhyde comme décrit précédemment8.
- Récoltez l’aorte sous le stéréoscope.
- Placer les aortes récoltées dans des tubes contenant 5 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h.
- Enlevez soigneusement le tissu adventice et la graisse sous le stéréoscope et épinglez l’aorte sur une plaque de cire noire avec des aiguilles d’insectes.
- Acquérir des images aortiques.
4. Evaluation de la dégradation des fibres élastiques
- Couper les tissus anévrismaux de l’aorte en cryosections en série (7 μm d’épaisseur).
- Analysez les fibres élastiques à l’aide d’un kit de coloration élastique commercial van Gieson (EVG) selon le protocole du fabricant.
- Classer la dégradation de l’élastine. Grade 1 : dégradation de <25 %; grade 2 : dégradation de 25 % à 50 %; grade 3 : dégradation de 50 % à 75 %; ou grade 4 : dégradation de >75 %.
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Representative Results
14 jours après l’application de CaPO4, les souris mâles C57BL/6J ont été euthanasiées et leurs aortes ont été récoltées et nettoyées. La morphologie des aortes a été imagée pour visualiser la formation d’AAA. Comme le montre la figure 1A-B, l’application de CaPO4 a entraîné une dilatation de l’aorte abdominale infrarénale. Histologiquement, CaPO4 a entraîné une dégradation spectaculaire des fibres élastiques, comme l’illustrent les cassures de l’élastine (Figure 1C).
Figure 1 : Les souris C57BL/6J mâles âgées de 8 semaines ont été traitées avec une solution saline (simulée) ou du CaPO4 récolté après 14 jours. (A) Images représentatives de l’aorte abdominale infrarénale sous stéréoscope. (B) Images morphologiques représentatives des aortes de souris; barre d’échelle = 1 mm. (C) Images représentatives de la coloration élastique de van Gieson des aortes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’application périaortique de CaPO4 est une approche robuste pour induire l’AAA chez la souris. Plusieurs études ont utilisé le modèle CaPO4 et ont systématiquement rapporté qu’il s’agit d’une méthode rapide et reproductible pour étudier l’AAA chez la souris 7,9. Ce modèle est considéré comme récapitulant une partie des caractéristiques de l’anévrisme de l’aorte humaine et fournissant des informations mécanistes sur la pathogenèse de l’AAA, y compris l’inflammation et la dégradation de la matrice extracellulaire.
Les facteurs de risque de l’AAA humain comprennent principalement le vieillissement, le sexe masculin, le tabagisme, l’hyperlipidémie, l’hypertension et l’athérosclérose10. Bien qu’elle n’ait pas été systématiquement étudiée, l’hyperlipidémie s’est également avérée prédisposer les souris à l’expansion de l’AAA lors de l’utilisation du modèle CaPO4 . Contrairement aux humains, le vieillissement joue un rôle mineur dans la formation d’AAA chez la souris CaPO4 modèle5. De grandes études épidémiologiques antérieures ont montré que le diabète est un facteur de risque négatif indépendant de l’AAAhumain 11. Alors que certaines données suggèrent que la metformine, un médicament contre le diabète, provoque cet effet, il est intéressant de noter que, dans le modèle CaPO4 , l’hyperglycémie inhibe la dilatation aortique par la suppression de l’activation des macrophages12.
Actuellement, plusieurs modèles murins AAA induits chimiquement ont été établis, y compris l’incubation d’élastase, l’incubation de CaPO4 et la perfusion sous-cutanée AngII2. En général, les modèles élastase et CaPO4 ont été réalisés chez des souris mâles mâles de type sauvage âgées de 8 à 10 semaines, et le modèle AngII a été réalisé chez des souris hyperlipidémies (telles que les souris ApoE-/- et LDLR-/-) ou des souris âgées de 5 à 6 mois pour induire AAA13. Les trois modèles phénocopient les principales caractéristiques pathologiques de l’AAA humain, y compris la dégradation des fibres élastiques et l’infiltration des cellules immunitaires. Par rapport aux deux autres modèles, l’application de CaPO 4 conduit à une expansion rapide et plus de 1,5 fois de l’aorte 7 jours après la chirurgie, associée à une dégradation spectaculaire de l’élastine et à un dépôt de calcium4. Le modèle CaPO4 induit une dilatation fusiforme au niveau de l’aorte abdominale infrarénale, qui imite la condition AAA humaine, tandis que la perfusion AngII induit à la fois un AAA suprarénal et un anévrisme de l’aorte thoracique. Compte tenu du coût de l’élastase, de l’AngII et de la mini-pompe osmotique, il est plus rentable d’effectuer le modèle CaPO4. Cependant, il est juste d’affirmer que le modèle CaPO4 ne peut pas induire des caractéristiques AAA telles que la formation de thrombus muraux et la rupture aortique, et le modèle est rapide et, par conséquent, moins adapté à la réalisation d’études d’intervention avec AAA existant. Le modèle CaPO4 est idéal pour travailler avec des souris génétiquement modifiées afin d’évaluer la sensibilité au développement de l’AAA.
Le mécanisme sous-jacent à la formation d’AAA induite par CaPO4 n’a pas encore été entièrement élucidé. Des études antérieures suggèrent que l’ion calcium peut se lier directement aux principaux composants structurels artériels, l’élastine et le collagène, facilitant la dégradation de la matrice extracellulaire et diminuant la stabilité de la paroi vasculaire14. Des cristaux de CaPO 4 ont également été identifiés pour déclencher une activation significative de l’inflammasome de la protéine 3 du récepteur de type NOD (NLRP3) et l’apoptosedes cellules musculaires lisses 4,15. En outre, les cristaux de microcalcification sont capables d’induire des cellules mononucléaires dans des cellules ostéoclastes et de favoriser la production de métalloprotéinase matricielle (MMP) et peuvent, à terme, entraîner une expansion aortique16.
Lors de l’exécution du modèle CaPO4 , plusieurs problèmes doivent être évités pour améliorer le taux de réussite. Il faut éviter de déchirer les vaisseaux sanguins de la branche dorsale, éviter l’ajout d’un excès de solution de CaCl2 dans la cavité abdominale et éviter un surdosage d’anesthésie. Les souris présentant des saignements sévères pendant la chirurgie ou une infection postopératoire doivent être exclues de l’expérience. Comme indiqué précédemment, lorsque le nombre d’observations est suffisant, les diamètres maximaux des aortes dans le modèle CaPO4 sont généralement normalement distribués, ce qui est différent du modèle AngII7. Par conséquent, nous recommandons une comparaison des diamètres maximaux des aortes au lieu de l’incidence AAA lors de l’utilisation du modèle CaPO4 .
Dans l’ensemble, le modèle AAA de souris induites par CaPO4 est une approche rapide et rentable pour explorer les mécanismes moléculaires et les stratégies thérapeutiques de l’AAA et pourrait être appliqué en parallèle avec les autres modèles pour imiter pleinement les caractéristiques de l’AAA humain.
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Acknowledgments
Cette recherche a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056 et 91529203) et le National Key R&D Program of China (2019YFA 0801600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CaCl2 | MECKLIN | C805225 | |
| NaCl | Biomed | SH5001-01 | |
| PBS | HARVEYBIO | MB5051 | |
| Small animal ventilator | RWD | H1550501-012 |
References
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