Summary
本プロトコルは、マイクロ流体チャンバーにおけるニューロンミトコンドリアの播種および染色を記載する。これらのチャンバー内の流体圧力勾配により、軸索のミトコンドリアを選択的に処理して、細胞体コンパートメントに影響を与えることなく、薬理学的課題に応じてその特性を分析することができます。
Abstract
ミトコンドリアは、ニューロンにおけるATP(アデノシン三リン酸)の主要な供給者です。ミトコンドリア機能障害は、多くの神経変性疾患において一般的な表現型である。いくつかの軸索の精巧な構造と極端な長さを考えると、軸索のミトコンドリアが細胞体のミトコンドリアと比較して異なる環境を経験する可能性があることは驚くべきことではありません。興味深いことに、軸索ミトコンドリアの機能不全はしばしば細胞体への影響に先行する。in vitroで軸索ミトコンドリア機能障害をモデル化するために、マイクロ流体デバイスは、体細胞ミトコンドリアに影響を与えることなく軸索ミトコンドリアの治療を可能にする。これらのチャンバー内の流体圧力勾配は、勾配に対する分子の拡散を防ぎ、軸索内の局所的な薬理学的課題に応じたミトコンドリア特性の分析を可能にします。現在のプロトコルでは、マイクロ流体デバイスにおける解離した海馬ニューロンの播種、膜電位感受性色素による染色、ミトコンドリア毒素による処理、およびその後の顕微鏡分析について説明しています。軸索生物学を研究するこの汎用性の高い方法は、多くの薬理学的摂動および画像読み出しに適用でき、いくつかのニューロンサブタイプに適しています。
Introduction
ミトコンドリアは、ニューロンにおけるATP(アデノシン三リン酸)の主要な供給者です。神経細胞の健康はミトコンドリア機能と密接に関連しているため、これらの細胞小器官の機能不全の調節がパーキンソン病を含むさまざまな神経変性疾患の発症に関連していることは驚くべきことではありません1。さらに、ミトコンドリア中毒は、動物のパーキンソン病症状をモデル化するために首尾よく使用されています2。動物モデルとヒト疾患の両方で、ニューロンの終焉は遠位部3,4から始まり、軸索ミトコンドリアが侮辱を受けやすい可能性があることを示唆しています。しかし、軸索におけるミトコンドリアの生物学は、細胞体突起の同時障害なしに軸索ミトコンドリアの標的治療および分析に関連する困難のためによく理解されていない。
解離ニューロンのin vitroでの培養技術における最近の進歩により、マイクロ流体デバイスを介して軸索と細胞体の流体分離が可能になりました5。図1Aに示すように、これらのデバイスは4つのアクセスウェル(a/hとc/i)を備え、2つのチャネルが各ペア(dとf)を接続します。大きなチャンネルは、長さ450μmの一連のマイクロチャンネル(e)によって互いに接続されています。2つのチャンバー間の充填レベルの意図的な違いにより、流体圧力勾配が発生し(図1B)、流体レベルが低いチャネルから反対側への小分子の拡散を防ぎます(図1C、トリパンブルー染料で示されています)。
私たちは最近、マイクロ流体デバイスを使用して、損傷したミトコンドリアの選択的除去である軸索マイトファジーの局所翻訳要件を研究しました6。本プロトコールでは、ミトコンドリア複合体III阻害剤Antimycin A 6,7を用いた軸索の選択的処置を通じて局所ミトコンドリア損傷を誘導するための異なるステップが提示される。
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Protocol
すべての動物実験は、オーバーバイエルン州の関連するガイドラインと規制に従って実施されました。初代ニューロンは、前述の標準的な方法に従って、両性のE16.5 C57BL/6野生型マウス胚から調製した6。
1. マイクロ流体デバイスの組み立て
- 1枚の6ウェルガラス底組織培養プレートに、最終濃度20 μg/mLのポリ-D-リジンと3.4 μg/mLのラミニンをPBS(リン酸緩衝生理食塩水)でコーティングします( 材料の表を参照)。
- コーティングされたプレートを室温で暗所で一晩インキュベートします。
注:コーティングは37°Cで1〜2時間行うこともできます。コーティングの選択は、使用する細胞の種類によって異なります。 - コーティング後、6ウェルプレートを滅菌フードに持ち込み、滅菌ddH 2 Oで2回洗浄します。
注意: 塩の結晶はシールの形成を妨げるため、PBSなどの塩含有バッファーで洗浄しないでください。 - プレートを傾斜した状態で3〜5分間乾燥させます。真空吸引またはピペッティングによって余分な水分を取り除きます。
- マイクロ流体チャンバーを80%エタノールに浸します。
注:マイクロ流体チャンバーは、市販の情報源から入手しました( 材料表を参照)。 - マイクロ流体チャンバーを傾斜した位置で3〜5分間乾燥させます。真空、吸引、またはピペッティングによって余分なエタノールを除去します。
- 完全に乾いたら、マイクロ流体チャンバーをウェルの中央に置きます。
注意: シールの形成は、プレートとシリコーンデバイス間の界面から空気を排除したときの反射特性の変化として観察できます。プレートとマイクロ流体チャンバーの両方は、良好なシールを作成するために、組み立て前に完全に乾燥している必要があります。ただし、細胞への適切な接着を確保するために、乾燥時間を可能な限り最小限に抑える必要があります。したがって、ウェルとチャンバーは、残りの液滴がないか目視検査する必要があります。液滴が見えない場合は、すぐにチャンバーを組み立てます。 - マイクロ流体チャンバーの境界と中央のマイクロ溝セクションを軽くたたいて、ガラス板に適切に取り付けます。
2.ニューロンの播種と維持
- チャンバーごとに必要な数の解離した海馬ニューロンを1.5 mLの反応チューブに集めます。
注:本研究では、イメージングベースのアプリケーションのために、デバイスごとに1.5 x 105 ニューロンを播種しました。 - ニューロンを1000 x g で室温で4分間遠心分離します。
- 上清をピペットで廃棄し、ペレットを8 μLのB27-神経基礎培地に再懸濁します( 材料の表を参照)。
- 細胞溶液をマイクロ流体チャンバーのチャネル入口にピペットで入れます(図1Aのb)。
- プレートの裏側をタップして、チャネルを通る流れを支援します。
注意: タッピングは、シールが壊れる心配なしに非常に強力に行うことができます。 - チャネルの出口に残っている細胞懸濁液(図1Aのg)をピペットで吸引して、チャネル外の細胞数を減少させる。
- マイクロ流体チャンバーを細胞とともに37°Cおよび5%CO2で15〜20分間インキュベートします。
- 上部の軸索ウェルに50 μLのB27-神経基底培地(図1Aのc)を満たします。
- プレートの裏側をタップして、チャネルを通る流れを支援します。
- ソーマ側のウェル(図1Aのaとh)にそれぞれ150 μLのB27-神経基底培地を満たし、上部に張力バブルを作成します。気泡の体積は約20μLである。
注:張力バブルを作成することは、流体の分離を達成するために必要ではありませんが、ソーマ側のより大きな体積を明確に視覚化します。 - 軸索側の両方のウェル(図1Aのcとi)にそれぞれ100 μLのB27-神経基底培地を充填します。
注:微小溝を介した軸索の成長を促進するために、体細胞側のウェルには軸索側のウェルよりも多くの媒体が含まれていることをお勧めします。しかし、軸索は体積差がなくても偶然に微小溝を通って成長します。 - マイクロ流体チャンバーを37°Cおよび5%CO2 で7〜8日間インキュベートします。
注:軸索房への軸索の成長は、通常、in vitro(DIV)5 の日から 観察できます。より成熟した培養が必要な場合は、より長い培養時間が可能です。 - 2〜3日ごとに、上部2つのウェル(a と c)から培地を取り除き、張力バブルが形成されるまで新しいB27-Neurobasal培地と交換することにより、ニューロンに供給します。
3. ミトコンドリア膜電位感受性色素による染色
- DIV 7-8で、軸索が微小溝を通って成長し、光学顕微鏡の下の軸索コンパートメントに伸びていることを評価します。
注:希望する年齢に応じて、さまざまなDIVステージも可能です。 - すべてのウェルからB27-Neurobasal培地を除去し、軸索チャネルと体細胞チャネル(aおよびc)の両方の上部ウェルに約100μLのイメージング培地を加えて、事前に温めたイメージング培地(37°C)で2回の洗浄を行います。培地を下のウェル(hおよびi)に流します。
- 下のウェルから培地を取り出し、上のウェルに残っている培地を取り出し、新しい培地で繰り返し、洗浄の最後にウェルを空のままにします。
注:チャネル(d および f)の毛細管力が高いため、ニューロンの乾燥を防ぐために除去すべきではないチャネル内に残りの洗浄媒体があります。ここでは、フェノールレッドを含まない任意のイメージング媒体、例えばHibernate E( 材料の表を参照)を使用できます。顕微鏡にCO2 供給が設定されていない場合は、イメージング媒体が炭酸塩/CO2 の代替緩衝システム(HEPESなど)を使用していることを確認してください8。
- 下のウェルから培地を取り出し、上のウェルに残っている培地を取り出し、新しい培地で繰り返し、洗浄の最後にウェルを空のままにします。
- イメージング媒体中で1 mMテトラメチルローダミンエチルエステル(TMRE、赤色、 材料表参照)ストックを5 nMに希釈する。
注意: 毒性を避けるために、最終希釈で1%DMSOを超えないようにしてください。 - 100 μLの5 nM TMRE希釈液を体細胞上部ウェルと軸索上部ウェル(a および c)の両方に添加し、すべてのウェルで等容量になるまで培地を体細胞コンパートメントと軸索コンパートメントの両方に流します。TMRE含有培地を充填します。
- ニューロンを制御された環境チャンバー(37°Cおよび5%CO2)に25分間戻します。
- 前述のように、予め加温した画像媒体(37°C)で2回の洗浄を行う(ステップ3.2)。最後の洗浄で、各ウェルに100 μLを充填し、体細胞ウェル上に培地の張力気泡を作ります(a および c)。
4. 生細胞イメージング
注:示されている静止画は、40x NA 1.25液浸対物レンズを使用して、スピニングディスク共焦点顕微鏡で取得されました( 材料表を参照)。赤チャンネルでは200msの露光時間と10%のレーザー出力、明視野では500msの露光時間を選択しました。ただし、通常の共焦点顕微鏡または広視野倒立顕微鏡を使用してTMRE強度を調べることもできます。
- 倒立顕微鏡で細胞を画像化します。
- 顕微鏡にステージインキュベーターが装備されていることを確認して、実験全体を通してニューロン培養を37°Cに維持します。
- 体細胞コンパートメントの関心領域を選択し、それを微小溝を通って軸索コンパートメントにたどります。画像化された微小溝が体細胞コンパートメントと軸索コンパートメントの溝と一致することを確認してください(ベースラインと治療後の比較を容易にするため)。
- 赤色蛍光シグナルについては、561 nmの励起と625 nmの発光を使用して蛍光画像をキャプチャします。
- 画像を取得します。
- ミトコンドリアの脱分極を誘発するには、イメージング媒体中の20 μMアンチマイシンA( 材料の表を参照)を軸索コンパートメントに追加します。体細胞腔と軸索房の間の体積差を確実にするために、体細胞側に張力気泡が存在することを確認します(体積>110μLに等しい)。
- チャネル(f)内の培地を除く、軸索側(i)の下部ウェルからすべての画像化媒体を除去する。160 μLの20 μMアンチマイシンAを上部の軸索ウェル(c)に加え、両方の軸索ウェルに等しい容量になるまでチャネルを流します。軸索ウェルの容量は、ウェルあたり約80μLです。
注意: 適切な流体圧力を確保するために、軸索ウェルの体積が体細胞ウェルよりも小さいことを確認してください。少なくとも10 μL(ウェル容量の10%)の差が推奨されますが、それ以上の違いも可能です。
- チャネル(f)内の培地を除く、軸索側(i)の下部ウェルからすべての画像化媒体を除去する。160 μLの20 μMアンチマイシンAを上部の軸索ウェル(c)に加え、両方の軸索ウェルに等しい容量になるまでチャネルを流します。軸索ウェルの容量は、ウェルあたり約80μLです。
- 制御された環境チャンバー(37°C)でニューロンを20〜30分間インキュベートします。
- 上記のようにイメージングを繰り返します(ステップ4.3〜4.5)。ベースライン取得時と同じ位置が画像化されている(マイクログルーブで簡単に識別できる)ことを確認してください。
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Representative Results
初代海馬ニューロンをマイクロ流体デバイスで7〜8日間増殖させた後、ミトコンドリアを両方のチャネルで膜感受性色素(TMRE)で25分間染色しました。図2Aに示すように、これは微小溝の両側のミトコンドリアの均質な染色をもたらしたが、それでも微小溝の中央への染色を平衡化するには不十分であった。抗マイシンAを軸索側に添加すると、ソームミトコンドリアはTMREシグナルを保持し(図2Bおよびビデオ1)、TMRE蛍光は軸索ミトコンドリアから失われました(図2Cおよびビデオ1)。ビデオは、完全に統合されたデジタル広視野顕微鏡を使用してキャプチャされました(材料表を参照)。
図1:マイクロ流体デバイスは、軸索の流体単離を可能にする 。 (A)本研究で用いたマイクロ流体デバイスの概略図。シリコンディスク(直径21mm)は、6ウェルプレートに簡単に収まります。a)体細胞側の井戸、b)体細胞側のチャネルの入り口、c)軸索側の井戸、d)体細胞側のチャネル、e)微小溝、f)軸索側のチャネル、g)体細胞側のチャネルの出口、h)体細胞側の井戸、i)軸索側の井戸。(B)さまざまな流体レベルがマイクロチャネル全体に流体圧力勾配をどのように作成するかを詳述する概略図。(C)チャンバーの片側にトリパンブルーを添加することによる流体分離のデモンストレーション。流体圧力勾配のために、青色染料はマイクロチャネル間で平衡化しないことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:軸索の選択的処理は軸索を脱分極させるが、細胞体ミトコンドリアは脱分極しない。 (A)マイクロ流体デバイスにおけるTMRE染色の有効性の概要を示す代表的な顕微鏡写真。スケールバー= 100μm。 (B-C)代表的な顕微鏡写真は、軸索コンパートメントに20μMアンチマイシンA(AA)を添加する前後の細胞体と軸索コンパートメントの同じ領域を示しています。スケールバー= 20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:軸索および細胞体のミトコンドリアに対する抗マイシンA治療の効果。 アンチマイシンAを添加した場合のTMRE蛍光の喪失のライブセルイメージング。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本プロトコルは、軸索ミトコンドリアを別々に治療するためにマイクロ流体デバイス内で解離した海馬ニューロンを播種および培養する方法を記載する。膜感受性色素TMREと複合体III阻害剤Antimycin A(以前に実証された7)を用いたこのアプローチの有用性はここで実証されていますが、この方法は、局所的な顕微鏡ベースの読み出しを可能にする他のミトコンドリア色素またはミトコンドリア機能の遺伝的にコードされたセンサーに容易に適応できます9。初代皮質ニューロン10 や人工多能性幹細胞(ipSC)由来の運動ニューロン11など、他の種類の神経細胞もマイクロ流体チャンバーで増殖できるため、このプラットフォームは、目的の神経細胞タイプの神経変性におけるミトコンドリア機能を研究するための汎用性の高いツールになります。マイクロ流体デバイスの組み立ては、効率的なシールを達成するために不可欠であり、経験豊富な研究者が組み立てを行うのを見ることで最も簡単に説明できます。ここで説明する下流の標識および処理手順は例示的であることを意図しており、流体圧力勾配を維持しながら、それぞれのラボで現在確立されているプロトコルに適合するように調整できます。
ここで説明するシード技術は、組み立てられたデバイスの推奨される洗浄をスキップし、代わりに解離したニューロンをドライチャンバーに直接シードするため、公開されているプロトコルやメーカーの説明とは異なります(セクション2)。これにより、チャネル内のニューロンの密度が増加し(e)、マイクロチャネルから遠く離れたウェルへのニューロンの広がりが制限されるため、必要なニューロンの数が減少することが観察されています。乾式播種は、プレートの底部を軽くたたくことによって支援されますが(ステップ2.5)、これは、デバイスを組み立てるときに前に加えられた力に応じて必要な場合と不要な場合があります。
ただし、この手順には特定の制限があります。組み立て中に加えられる力の違いにより、シールの気密性には多少のばらつきがあり、微小溝を通る成長が制限される可能性があります。また、水分が残っているとシールの形成が妨げられ、軸索の成長やデバイスの下の細胞の移動さえも可能になる可能性があります。どちらの問題も染色前に簡単に発見できるため、欠陥のあるチャンバーを実験から除外できます。
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Disclosures
著者は競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、ドイツ研究財団(HA 7728/2-1およびEXC2145プロジェクトID 390857198)およびマックスプランク協会の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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