Summary
Escherichia coli veroorzaakt sepsis bij pasgeborenen die de bacteriën rond het moment van geboorte binnenkrijgen. Het proces dat betrokken is bij het vermogen van E. coli om van het enterische kanaal naar de bloedbaan te reizen, is slecht begrepen. Dit in vitro model beoordeelt het vermogen van E. coli stammen om door de darmepitheelcellen te reizen.
Abstract
Pasgeborenen krijgen maternale E. coli-stammen binnen die hun darmkanaal koloniseren rond het moment van de bevalling. E. coli-stammen met het vermogen om over de darm te transloceren, dringen de bloedbaan van de pasgeborene binnen en veroorzaken levensbedreigende bacteriëmie. De hier gepresenteerde methodologie maakt gebruik van gepolariseerde intestinale epitheelcellen gekweekt op semipermeabele inserts om de transcytose van neonatale E. coli-bacteriëmie-isolaten in vitro te beoordelen. Deze methode maakt gebruik van de gevestigde T84 intestinale cellijn die het vermogen heeft om te groeien tot samenvloeiing en tight junctions en desmosomen te vormen. Na het bereiken van confluence ontwikkelen volwassen T84-monolagen transepitheliale weerstand (TEER), die kan worden gekwantificeerd met behulp van een voltmeter. De TEER-waarden zijn omgekeerd gecorreleerd met de paracellulaire permeabiliteit van extracellulaire componenten, waaronder bacteriën, in de intestinale monolaag. De transcellulaire passage van bacteriën (transcytose) daarentegen verandert niet noodzakelijkerwijs de TEER-metingen. In dit model wordt de bacteriële passage door de intestinale monolaag gekwantificeerd voor maximaal 6 uur na infectie en worden herhaalde metingen van TEER uitgevoerd om de paracellulaire permeabiliteit te controleren. Bovendien vergemakkelijkt deze methode het gebruik van technieken zoals immunostaining om de structurele veranderingen in tight junctions en andere cel-naar-cel adhesie-eiwitten tijdens bacteriële transcytose over het gepolariseerde epitheel te bestuderen. Het gebruik van dit model draagt bij aan de karakterisering van de mechanismen waarmee neonatale E. coli transcytose over het darmepitheel bacteriëmie produceert.
Introduction
Escherichia coli is de meest voorkomende oorzaak van sepsis met vroege aanvang bij pasgeborenen 1,2,3. Het sterftecijfer van neonatale E. coli-bacteriëmie kan 40% bereiken en meningitis is een mogelijke complicatie die gepaard gaat met ernstige neurologische ontwikkelingsstoornissen2. De inname van maternale E. coli-stammen door de pasgeborene kan neonatale bacteriëmie veroorzaken; dit proces is gerepliceerd in diermodellen 2,4. Eenmaal ingenomen, reizen pathogene bacteriën vanuit het neonatale darmlumen over de darmbarrière en komen in de bloedbaan terecht, waardoor bloedvergiftiging ontstaat. Neonatale invasieve E. coli-stammen die bacteriëmie produceren, variëren in hun vermogen om darmepitheelcellen binnen te dringen 1,5. Hun vermogen om het darmepitheel na een invasie te transcytose is echter niet volledig gekarakteriseerd.
Dit intestinale transcytosemodel is een nuttige in vitro methode om bacteriële passage over het darmepitheel na te bootsen. Het algemene doel van de methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, is om het vermogen van neonatale E. coli-isolaten te vergelijken met transcytose van het darmepitheel. Het hier beschreven model maakt gebruik van T84-cellen, die vereeuwigde menselijke intestinale adenocarcinoomcellen zijn 6,7. T84-cellen worden gekweekt tot samenvloeiing op een semipermeabel membraan met twee afzonderlijke compartimenten. De reden voor het gebruik van deze techniek is dat, zoals in vivo gebeurt, deze darmcellen polariseren en volwassen tight junctions ontwikkelen 6,8. De kant die in contact komt met het membraan wordt de basale kant. De andere kant van de cellen wordt de apicale kant, die lijkt op het darmlumen waar ingenomen pathogenen zich hechten en binnendringen. Het transwellmembraan is doorlaatbaar voor bacteriën, maar de gepolariseerde darmcellen vormen tight junctions, die bacteriële paracellulaire bewegingen aantasten9. Deze methode biedt dus het voordeel van een gecontroleerde in vitro omgeving met behulp van een menselijke cellijn om het proces van bacteriële transcytose te bestuderen, inclusief de transcellulaire route. Terwijl er andere methoden bestaan om de transcytose van bacteriën in het darmepitheel te onderzoeken, biedt de hier gepresenteerde transwell-methode meer gemak en toegankelijkheid. Alternatieve technieken, zoals die met behulp van ex vivo monsters die zijn opgezet in Ussing-kamersystemen, zijn beschikbaar. Ze gebruiken echter weefselspecimens die mogelijk niet gemakkelijk toegankelijk zijn, vooral als het onderzoek van plan is de menselijke fysiologie tebestuderen 10. Intestinale organoïden zijn een ander voorbeeld van een in vitro alternatief voor het bestuderen van gastheer-bacterie interacties11. Hoewel organoïde monolagen ook in het transwell-systeem kunnen worden gebruikt om bacteriële transcytose te bestuderen, vereisen ze de isolatie en groei van stamcellen en het gebruik van specifieke groeifactoren om differentiatie te induceren12. Het gebruik ervan is dus tijdrovender en gaat gepaard met hogere kosten in vergelijking met de transwell-methode die in dit manuscript wordt beschreven.
De beoordeling van bacteriële passage door het darmepitheel met behulp van dit in vitro transwell-systeem is met succes uitgevoerd voor verschillende pathogenen. Deze studies hebben het nut aangetoond van het transwell-systeem dat T84-cellen gebruikt om de transcytose van bacteriën over het gepolariseerde darmepitheel te karakteriseren 13,14,15. De toepassing van deze transwellmethode om het transcytosevermogen van bacteriëmieproducerende neonatale E. coli-stammen te vergelijken, is echter niet in detail beschreven. Dit manuscript biedt andere onderzoekers een standaard transwell-protocol dat betrouwbaar en gemakkelijk te gebruiken is en geen te dure middelen vereist.
Om het vermogen van neonatale invasieve E. coli-stammen om het darmepitheel te transcytose te vergelijken, kan de apicale kant van de intestinale epitheliale monolaag worden geïnfecteerd met een bekend aantal bacteriële cellen. Na incubatie kan het medium aan de basale kant van het epitheel worden verzameld en de bacteriën worden gekwantificeerd om de hoeveelheid bacteriële transcytose in de loop van de tijd te bepalen. In dit manuscript worden de gepresenteerde methoden gebruikt om het transcytosevermogen van neonatale E. coli klinische stammen te bestuderen die zijn hersteld van pasgeborenen die in het ziekenhuis zijn opgenomen met bacteriëmie. De inclusiecriteria voor de selectie van deze neonatale klinische isolaten voor transcytosestudies zijn eerder gepubliceerd 1,2,16. Wanneer deze methode wordt uitgevoerd met behulp van verschillende E. coli-stammen, kunnen hun transcytosecapaciteiten worden vergeleken. Door dit proces biedt het intestinale transcytosemodel waardevolle gegevens om de virulentiefactoren van E. coli te karakteriseren die bijdragen aan het meerstappenproces dat culmineert in de ontwikkeling van neonatale bacteriëmie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Voer alle manipulaties van de T84-cellen, bacteriën, platen en reagentia uit in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) veiligheidskast om besmetting te voorkomen. Gebruik aparte ruimtes en incubators voor al het werk met steriele T84-cellen, geïnfecteerde T84-cellen en E. coli. De klinische E. coli-isolaten die zijn getest met de hier beschreven methoden zijn verkregen volgens de richtlijnen van de Institutional Review Board in onze instelling 1,16.
1. Transcytose-inserts voorbereiden met T84-cellen (ongeveer 1-2 weken vóór het experiment)
- Kweek American Type Culture Collection (ATCC) T84-cellen in weefselkweekmedium (TCM + antibiotica) bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium: Ham's F-12 voedingsmengsel (1: 1, eindconcentratie: 50% elk), 5% foetaal runderserum en 1% (100 U / ml) penicilline / streptomycine dubbel antibioticummengsel. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5% CO2.
OPMERKING: Een variatie van deze mediumformulering zonder penicilline/streptomycine (TCM zonder antibiotica) wordt gebruikt voor de latere stappen (rubriek 2 en verder) in de procedure. Zorg ervoor dat voor elke stap de juiste formulering wordt gebruikt. - Werkend in een bioveiligheidskast (BSC), zaai de T84-cellen in polyethyleentereftalaatmembraancelkweektranswell-inserts met poriën van 3 μm gemaakt voor 24-wellplaten. Inclusief transwell insert replicaties voor elke gewenste experimentele conditie plus niet-geïnfecteerde controles om te controleren op mogelijke besmetting.
- In een 24-well plaat ontworpen om transwell inserts te houden, vult u het gewenste aantal verzamelputten met 1 ml TCM + antibiotica.
- Plaats in elke put een transwell-inzetstuk.
- Zaai deze inserts met 1 x 105 T84 cellen gesuspendeerd in 500 μL TCM + antibiotica. Kwantificeer het aantal cellen met behulp van een hemocytometer met trypan blauwe kleuring of een geautomatiseerde celteller17.
- Incubeer de transwellplaten met gezaaide inserts in dezelfde omstandigheden waarin de cellen werden gekweekt.
- Controleer met lichtmicroscopie of de monolagen confluent zijn geworden na het zaaien van de insert, ongeveer 48 uur na het zaaien.
- Meet en registreer elke 2 dagen na het zaaien de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) met behulp van een epitheliale volt / ohm-meter (EVOM) om de volwassenheid van de monolaag te beoordelen. Zodra de inserts een TEER van ten minste 1.000 Ω·cm2 bereiken, worden ze klaar geacht voor de test18.
OPMERKING: De inserts hebben meestal 7-10 dagen nodig om deze TEER na het zaaien te bereiken. De T84-cellen zullen 100% samenvloeiing vertonen onder lichtmicroscopie zodra deze weerstand is bereikt.- Bewaar de EVOM-sonde met de elektroden ondergedompeld in 0,15 M KCl wanneer deze niet in gebruik is.
- Voordat u de TEER meet, ontsmet u de elektrodesonde door deze gedurende 10-15 minuten onder te dompelen in 5 ml 70% ethanol in een conische buis van 50 ml. Verwijder de sonde, schud de overtollige ethanol af en laat deze gedurende 10 minuten aan de lucht drogen in de BSC. Houd de buis ethanol vast.
- Test de EVOM en sonde door de droge ontsmette sonde in een steriele put met 1 ml TCM + antibiotica te plaatsen met een steriele insert erin met 500 μL TCM + antibiotica. Zorg ervoor dat de EVOM-waarde <200 Ω is. Noteer deze lege waarde om deze te gebruiken in de latere weerstandsberekeningen die in stap 1.3.6 worden beschreven.
- Verwijder de sonde uit de tube TCM + antibiotica. Houd deze buis vast voor de opslag van de sonde gedurende het hele experiment.
- Laat de sonde voorzichtig in het eerste inzetstuk zakken met de lange elektrode in de opvangput en de korte elektrode in het inzetstuk. Laat de lange elektrode de bodem van de verzamelput raken, maar duw niet naar beneden omdat dit de epitheliale monolaag kan verstoren.
- Herhaal dit proces om de weerstand in Ohm (Ω) voor elke insert te meten en vast te leggen. Als u klaar bent, ontsmet u de sonde in de ethanol door deze nog eens 10-15 minuten onder te dompelen. Verplaats vervolgens de ontsmette sonde terug naar de KCl-oplossing voor opslag. Trek de in stap 1.3.3 verkregen blancoweerstand af van elke waarde die wordt verkregen uit elke insert die T84-cellen bevat. Vermenigvuldig de resulterende weerstand (Ω) voor elke wisselplaat met het oppervlak van de bodem van elke wisselplaat (cm2) om de uiteindelijke TEER-meting (Ω·cm2) te verkrijgen.
- Zodra de TEER ten minste 1.000 Ω·cm2 bereikt, is de epitheliale monolaag volwassen en klaar voor infectietests.
- Naarmate de TEER rijpt, voorzie de cellen elke 1-2 dagen van vers medium.
- Voeg in een nieuwe plaat met 24 putten 1 ml TCM + antibiotica toe aan één putje voor elke gezaaide insert die wordt bereid.
- Breng met behulp van een steriele tang de inserts voorzichtig over naar de nieuw aangevulde putten.
- Vervang de media in de inserts.
- Verwijder de oude media van de inzetstukken door de plaat te kantelen en gebruik een interne vacuümaspirator om de media voorzichtig te verwijderen met een pipetpunt langs de zijkant van het inzetstuk. De aspirator maakt de regulatie van low-level zuigkracht mogelijk om de verstoring van de cellen te voorkomen. Laat de pipetpunt de onderkant van de insert niet raken, omdat dit de zich ontwikkelende epitheliale monolaag zal verstoren.
- Voeg 500 μL TCM + antibiotica toe aan de bijsluiters. Visualiseer de monolaag met lichtmicroscopie om te controleren of deze intact blijft.
- Meet elke 1-2 dagen de TEER over elke insert zoals hierboven beschreven in de stappen 1.3.2-1.3.6.
2. Voorbereiding van de T84-cellen 1 dag voor het experiment met TCM zonder antibiotica
- Meet en noteer de TEER de dag voor het experiment.
- Vervang de TCM op dezelfde manier als tijdens de eerdere celvoorbereiding en -onderhoud. In plaats daarvan wordt echter TCM zonder antibiotica gebruikt ter voorbereiding op de infectie (1 ml in de plaatput en 500 μL in de insert).
3. E. coli-culturen (gestart 1 dag voor het experiment)
LET OP: Gebruik voorzorgsmaatregelen voor bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) bij het werken met pathogene klinische E. coli-stammen .
- Neem een gelabelde conische buis van 15 ml met 5 ml steriele lysogene bouillon (LB) en gebruik een steriele lus om de bouillon te enten met één kolonie van één bacteriestam (E. coli). Herhaal dit proces en maak één nachtkweekbuis voor elke te testen soort.
- Incubeer de nachtcultuur, met de doppen van de buizen losgemaakt, in een incubator shaker (250 rpm, 37 °C).
4. Bereiding van het E. coli-entmateriaal, epitheelcellen en materialen (op de ochtend van het experiment)
OPMERKING: Gebruik vanaf dit punt TCM zonder antibiotica die zijn opgewarmd tot 37 °C.
- Voeg 250 μL uit elke nachtelijke LB-cultuur toe aan 25 ml TCM zonder antibiotica in een conische buis van 50 ml (één per individuele stam). Houd de doppen van de buizen los. Plaats deze nieuwe kweekbuizen in de shaker op dezelfde stand (250 rpm, 37 °C) gedurende precies 2 uur. Voer de resterende substappen uit tijdens het wachten.
- Meet de TEER over elke insert, zoals beschreven in stap 1.3.2-1.3.6. Noteer deze als de TEERRs op tijdstip (t) = 0 uur.
- Verplaats de inzetstukken naar putten in een nieuwe plaat en verander de media met behulp van de techniek die wordt beschreven in stap 1.4.3. Vul deze keer echter de nieuwe verzamelputten met 500 μL TCM zonder antibiotica en vul de inserts met 400 μL TCM zonder antibiotica. Bewaar de inserts in de weefselkweekincubator tot het moment van infectie.
- Zet een voldoende aantal vierkante LB-agarplaten uit om op te warmen tot kamertemperatuur (RT) voor latere beplating en bacteriële kwantificering.
5. Inenting van de cellen (start van het experiment)
- Verwijder na precies 2 uur de ochtendbacterieculturen uit de shaker en centrifugeer ze gedurende 10 minuten (1.900 x g, 4 °C).
OPMERKING: Houd voor alle volgende stappen alle bacteriële suspensies op ijs om de groei te minimaliseren. - Resuspend de bacterie pellet in TCM zonder antibiotica. Gebruik een spectrofotometer om de optische dichtheid (OD) aan te passen aan 0,7-0,9 en verdun verder met TCM zonder antibiotica tot een concentratie van 1 x 106 kolonievormende eenheden (CFU) / ml (ongeveer 1:100 verdunning). Gebruik deze bacteriële suspensie om elke insert te infecteren met 1 x 105 CFU per 100 μL volume.
- Label de transwellplaat en infecteer elke insert met 100 μL van het OD-aangepaste entmateriaal (totaal 1 x 105 CFU per insert). De test is nu begonnen. Noteer de tijd en noteer deze als t = 0 uur.
- Plaats de entbacteriële suspensie om de CFU/ml te kwantificeren met behulp van de spoorverdunningsmethode, waarbij 10 μL aliquots op vierkante LB-agarplaten19 worden geplateerd.
6. Transcytose kwantificeren
- Vul elke 30 minuten na inenting nieuwe putten met 500 μL TCM zonder antibiotica. Breng de inserts over naar deze nieuwe putten met behulp van een andere set steriele tangen voor elke verschillende bacteriestam.
- Verzamel de media van de gebruikte verzamelput voor elk inzetstuk in afzonderlijke gelabelde buizen. Plaats deze buisjes op ijs. Breng de transwellplaten tussen de tijdstippen terug naar de incubator.
- Combineer voor elke insert de verzamelde media van t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h en t = 2 h, en vortex kort. Plaats de verzamelde media op LB-agarplaten met behulp van de trackverdunningsmethode om de hoeveelheid bacteriën te kwantificeren die in de eerste 2 uur van het experiment zijn getranscytoseerd.
OPMERKING: Door de bacteriën elke 30 minuten op te halen en op ijs te houden, zorgt u ervoor dat de bacteriegroei in de verzamelputten wordt geminimaliseerd en dat er metingen worden gedaan aan overwegend getranscytoseerde bacteriën. - Plaats de gelabelde trackverdunning LB agarplaten in de bacteriële incubator bij 37 °C zonder aanvullende CO2 en breng de T84 transwellplaat terug naar de weefselkweekincubator.
- Herhaal bij t = 4 uur stap 6,3 door de verzamelde media te combineren van t = 2,5 uur, t = 3 uur, t = 3,5 uur en t = 4 uur.
- Herhaal bij t = 6 uur stap 6,3 door de verzamelde media van t = 4,5 uur, t = 5 uur, t = 5,5 uur en t = 6 uur te combineren. Bovendien, bij t = 6 h, plaat de media uit de controleputten.
7. Einde van het experiment
- Meet en noteer de TEER aan het einde van het experiment, t = 6 uur. Gebruik de procedure die wordt beschreven in stap 1.3.2-1.3.6.
- Ontsmet de sonde door deze gedurende 10-15 minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Gooi de inserts weg of bewaar/verwerk ze desgewenst voor extra toepassingen. Laat de LB-agarplaten een nacht incuberen en desinfecteer en/of gooi alle andere gebruikte materialen veilig weg.
- Tel na nachtelijke incubatie de bacteriekolonies handmatig op de verdunnings-LB-platen om de hoeveelheid entmateriaal en de hoeveelheid E. coli-transcytose te bepalen. Zorg ervoor dat de controleplaten geen bacteriegroei vertonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1: T84 TEER in de loop van de tijd. Naarmate de T84-cellaag op het inzetstuk rijpt, neemt de elektrische weerstand van de monolaag toe. Bij een TEER van ten minste 1.000 Ω·cm2 is de cellaag voldoende ontwikkeld om het paracellulaire bacteriële transport te verminderen en de meting van voornamelijk transcellulaire bacteriële doorvoer mogelijk te maken. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tijdens de proliferatie van de steriele T84-cellen zoals beschreven in rubriek 1, stijgen de TEER's over de T84-monolagen voortdurend in de loop van de tijd en overschrijden ze ongeveer 1.000 Ω·cm2 na 7 dagen na het zaaien (zie figuur 1). Hoewel de epitheelcelpolarisatie en de rijping van de TEER robuuster zijn met T84-cellen dan met andere darmcellen, zoals Caco-2, kan enige probleemoplossing nog steeds nodig zijn6. De TEER van een wisselplaat mag tussen de metingen niet dramatisch afnemen. Een dergelijke afname van de TEER zou kunnen wijzen op een mechanische verstoring van de epitheliale monolaag. Men moet ervoor zorgen dat tijdens de mediumverandering de punt van de aspirator nooit de onderkant van de celkweekinzet raakt. Als dit type schade wordt vermoed, kan het door lichtmicroscopie worden gevisualiseerd als een afwezigheid van epitheelcellen in de buurt van de locatie van aspiratie. Naast schade door hantering kan een afname van de TEER wijzen op besmetting.
Figuur 2: Transcytose van neonatale E. coli-isolaten in de loop van de tijd. Na het infecteren van de T84-inserts worden neonatale E. coli klinische isolaten die met succes de verzamelput bereiken gekwantificeerd met behulp van de trackverdunningsmethode. Verschillende E. coli-stammen kunnen worden vergeleken in termen van hun vermogen om het darmepitheel te transcytose. De niet-pathogene E. coli DH5 alfa werd opgenomen als comparator. De plots tonen de gemiddelde CFU's en standaardfouten op elk tijdstip. De vergelijkingen van de gemiddelde transcytosewaarden werden uitgevoerd met one-tailed t-tests, die significante verschillen aantoonden tussen de neonatale E. coli-isolaten # 1 versus # 2 na 2 uur (* p < 0,05), 4 uur (** p < 0,04) en 6 uur (*** p < 0,04) na infectie. Daarentegen onderging de niet-pathogene E. coli-stam DH5 alpha minimale transcytose, zoals te zien is in de derde grafiek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De gekwantificeerde transcytose kan worden weergegeven zoals weergegeven in figuur 2. In dit voorbeeld werden de experimenten uitgevoerd met behulp van drie inserts, elk geïnfecteerd met twee verschillende neonatale invasieve E. coli-isolaten . Een niet-pathogene stam, DH5 alpha, werd ook getest voor vergelijking. Twee steriele controle-inzetstukken werden ook opgenomen (er wordt geen plot getoond omdat er geen bacteriën werden geïsoleerd). De gegevens van deze procedure zijn nuttig voor het beschrijven van het vermogen van een enkele E. coli-stam om het darmepitheel te transcytose. De gegevens kunnen ook een vergelijking van de transcytosecapaciteiten van verschillende stammen mogelijk maken (zie het discussiegedeelte voor verdere toepassingen).
Figuur 3: TEER vlak voor infectie en 6 uur na infectie. De TEER van de inserts neemt meestal toe na infectie met neonatale E. coli-bacteriekemieproducerende stammen2. De geïnfecteerde inserts vertonen een grotere toename van TEER dan de niet-geïnfecteerde controle-inserts. De TEER was significant groter in T84 monolagen na 6 uur infectie met neonatale E. coli stam #1 (*p < 0,01) en E. coli stam #2 (**p < 0,03), zoals berekend door t-tests. De TEER in de niet-geïnfecteerde controle T84 monolagen nam ook toe, maar het verschil tussen de pre-infectie en post-infectie waarden was niet statistisch significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 toont typische TEER-resultaten voor en na infectie met twee neonatale E. coli klinische isolaten met verschillende vermogens om intestinale epitheelcellen te transcyteren. De snelheid en de hoeveelheid transcytose variëren tussen stammen, zoals weergegeven in figuur 2, maar de TEER neemt aanzienlijk toe na infectie met beide pathogene stammen.
De resultaten kunnen worden gewijzigd in de aanwezigheid van verontreiniging in dit experiment. De gebruikte neonatale E. coli-stammen veroorzaakten niet voldoende schade aan de epitheliale monolaag om een afname van TEER te produceren, maar de bacteriën waren in staat om transcytose te veroorzaken. Het is aannemelijk dat een contaminant organisme, indien aanwezig, schade aan de darmcellen en een daaropvolgende afname van de TEER kan veroorzaken. De steriele controle-inzetstukken dienen om een dergelijke mogelijke besmetting te helpen identificeren. Het weefselkweekmedium dat bij deze procedure wordt gebruikt, bevat de fenolrode pH-indicator. Over het algemeen lijkt het medium helder roze wanneer het steriel is of geïnfecteerd met een klein entmateriaal. Bij aanzienlijke groei of vervuiling kan het medium troebel, geel of stinkend worden. Voorafgaand aan de infectie zien de media in alle T84-inserts er normaal gesproken helderroze uit.
Na nachtelijke incubatie is de laatste plaats om te controleren op besmetting op de LB-agarplaten. De controleplaten mogen geen groei vertonen. De platen gemaakt van de verzamelputten van met E. coli geïnfecteerde inserts moeten homogene, ronde, gele E. coli-kolonies bevatten. Om het risico op besmetting te minimaliseren, moet al het werk worden uitgevoerd in bioveiligheidskasten. Afzonderlijke kasten en incubators moeten worden gebruikt voor steriele weefselkweek, E. coli-geïnfecteerde weefselkweek en bacteriële manipulatie. De werkruimten moeten schoon worden gehouden en er moet overal een steriele techniek worden gebruikt.
Figuur 4: Schematische weergave van het transwellsysteem en relevante darmcelstructuren. (A) Sectieweergave van de transwell insert (blauw); de verticale lijnen aan de onderkant van de insert geven de doorlatende poriën aan. De gepolariseerde darmepitheelcellen vormen een monolaag aan de onderkant van de insert. Het weefselkweekmedium wordt weergegeven in roze, met een evom-sonde met twee tanden erin ondergedompeld. De sondedraden aan de andere kant zijn aangesloten op het EVOM-apparaat (niet afgebeeld). (B) Vereenvoudigd diagram van de tight junction componenten van intestinale epitheelcellen. De verticale pijlen vertegenwoordigen mogelijke routes van bacteriële passage van de apicale naar de basolaterale kant van de gepolariseerde intestinale epitheliale monolaag. Afkortingen: ZO = zona occludens proteins; JAM = junctionele adhesiemoleculen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Apicale groei van neonatale E. coli-isolaten in de loop van de tijd. Metingen van E. coli in supernatanten bovenliggende T84-cellen in transwell-inserts kunnen worden uitgevoerd als een optioneel, aanvullend eindpunt. De figuur toont aan dat de apicale groei van beide pathogene E. coli-stammen die werden getest op transcytose in de loop van de tijd niet significant verschilde. De foutbalken geven standaarddeviaties aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode is afgeleid van technieken die worden gebruikt in gastro-enterologie en infectieziekten20. In vitro modellen van de intestinale epitheliale barrière zijn gebruikt om de mechanismen op te helderen waarmee de luminale inhoud interageert met deze relevante component van aangeboren immuniteit 6,8. De gastheer-pathogeen interacties van invasieve neonatale E. coli zijn ook afzonderlijk gekarakteriseerd door genetische analyse, studies van antimicrobiële resistentie en immunologische technieken 1,5,16,21. Er is echter weinig bekend over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van E. coli neonatale isolaten om via de darm in de bloedbaan te komen3.
De transcytosetechniek die hierin wordt gedemonstreerd, maakt een meer gedetailleerde karakterisering mogelijk van de neonatale E. coli invasieve stammen die bloedvergiftiging produceren na enterale verwerving. Neonatale bacteriëmie is een meerstappenproces en transcytose is een van de relevante stappen. In vergelijking met invasiemodellen biedt deze transcytosemethode aanvullende informatie over de mechanismen die betrokken zijn bij de pathogenese van bacteriëmie. In sommige gevallen dringt pathogene E. coli de dunne darm binnen zonder de bloedbaan te bereiken, waardoor de infectie wordt beperkt tot het veroorzaken van gelokaliseerde ziekte22. Het vermogen van de bacteriën om eenvoudig het darmepitheel binnen te dringen, weerspiegelt dus mogelijk niet hun vermogen om volledig door de epitheliale barrière te gaan. Dit model kan worden gebruikt om het proces van bacteriële passage door het darmepitheel via de transcellulaire of paracellulaire routes te bestuderen, vooral als aanvullende technieken zoals elektronenmicroscopie worden opgenomen20. In vergelijking met in vivo diermodellen is dit in vitro model efficiënter en zorgt het voor een betere controle van verschillende potentiële variabelen. Bovendien draagt het bij aan dierenwelzijn door een alternatief te bieden voor in vivo experimenten.
Ondanks deze voordelen heeft dit experiment nog steeds zijn beperkingen. Ten eerste houdt deze test geen rekening met verschillen in bacteriegroei aan de apicale kant van het epitheel tijdens incubatie. Dergelijke groeiverschillen kunnen van invloed zijn op de hoeveelheid transcytose voor elke stam. Gebruikers kunnen ervoor kiezen om apicale groei te meten voor een uitgebreidere karakterisering van de resultaten die met dit model worden verkregen. Een voorbeeld van de apicale groei van de twee E. coli-isolaten die worden gebruikt voor de transcytose-experimenten in de methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, is weergegeven in aanvullende figuur 1. Bovendien, hoewel dit model de intestinale epitheliale monolaag redelijk recreëert, vertegenwoordigt het niet volledig alle componenten van de darmbarrière die de bloedbaan beschermt tegen ingenomen pathogenen. Niettemin kunnen sommige eigenschappen van het darmepitheel met dit model worden bestudeerd. T84-cellen scheiden bijvoorbeeld chloride af en produceren mucine23. Invasie door diarree-producerende E. coli is geassocieerd met verhoogde chloridesecretie in T84-cellen en een significante afname van TEER na 6 uur na infectie24. Het is mogelijk dat invasie door bacteriëmie-producerende E. coli-stammen ook de chloridesecretie in dit model verhoogt en dat een afname van TEER kan optreden na 6 uur infectie. Dit model kan worden aangepast voor studies naar de relatie tussen ionentransport en bacteriële invasie indien gewenst door andere onderzoekers. Mucin is een fysieke barrière die het epitheel beschermt tegen ziekteverwekkers. Infectie met andere E. coli-stammen vermindert de mucine-expressie met T84-cellen25. De rol van mucine in de pathogenese van neonatale E. coli transcytose over het darmepitheel kan ook met dit model worden bestudeerd. Een ander gebruik van dit model zou kunnen zijn om de cytotoxische effecten van bacteriële cyclomodulines en hun mogelijke rol in het proces van transcytose van neonatale E. coli-stammen te bestuderen. Bijvoorbeeld, cytotoxische necrotiserende factor-1 (CNF-1), die wordt geproduceerd door sommige pathogene E. coli-stammen, richt zich op Rho GTPases, die cruciaal zijn bij het reguleren van de tight junction-functie en apoptose van geïnfecteerde eukaryote cellen26. Dit transwell-model kan worden aangepast om de mechanismen waarmee deze cytotoxinen het darmepitheel beïnvloeden beter te begrijpen27. Bij het gebruik van dit model om de interactie van neonatale E. coli-stammen met het darmepitheel te bestuderen, is het belangrijk om te overwegen dat de T84-cellen die worden gebruikt om het darmepitheel te modelleren, afkomstig zijn van een longmetastase van colonadenocarcinoom bij een volwassene6. Terwijl studies in T84-cellen specifieke effecten op de darmdoorlaatbaarheid hebben gereproduceerd die zich hebben vertaald in vergelijkbare effecten in menselijke pasgeboren en neonatale dierlijke darmcellen28,29, kunnen het foetale en neonatale darmepitheel zich anders gedragen in de aanwezigheid van invasieve E. coli.
Er kan enige probleemoplossing nodig zijn om dit model en de kwaliteit van de gegevens die het biedt te optimaliseren. Het gebruik van steriele controle-inzetstukken wordt in detail besproken in de sectie representatieve resultaten. Andere niet-invasieve E. coli-stammen kunnen ook worden opgenomen als negatieve / minimale transcyctosecontroles. Bovendien kan een andere cellijn, zoals Caco-2, worden gebruikt om het vermogen van de neonatale E. coli-stammen om gepolariseerd darmepitheel te transcyteren te beoordelen. De invasie en transcytose van E. coli blijken groter te zijn voor T84-cellen in vergelijking met Caco-2-cellen30. Daarom moeten deze verschillen worden overwogen wanneer dit model wordt gebruikt om bacteriële transcytose te evalueren met deze en andere epitheelcellen die polariseren en tight junctions vormen. Het uitvoeren van TEER-metingen van elke afzonderlijke transwell-insert vereist enkele seconden en wanneer meerdere stammen worden getest, moet rekening worden gehouden met de extra operatortijd. Er worden nog steeds efficiëntere methoden ontwikkeld voor de bewaking van de TEER in transwellsystemen. Deze nieuwere apparaten maken het mogelijk om de TEER tegelijkertijd te bewaken in meerdere transwell-inserts en in realtime31. Onderzoekers die deze opties overwegen, zouden moeten beslissen of de bespaarde tijd mogelijk de hogere prijs van deze nieuwere apparaten zou kunnen compenseren in vergelijking met de metingen met één elektrode die hierin worden beschreven.
Ondanks enkele mogelijke uitdagingen, stelt deze test onderzoekers in staat om specifieke mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij de pathogenese van E. coli-bacteriëmie die verder gaat dan alleen de hoeveelheid transcytose. In combinatie met moleculaire microbiologische technieken kan dit proces worden gebruikt om de effecten van individuele genen op het vermogen van E. coli om het darmepitheel te transcytose te bepalen, zoals is geprobeerd in diermodellen32. Dit model kan ook worden gewijzigd door co-kweek van immuuncellen of de toevoeging van cytokines, groeifactoren en farmaceutische interventies om complexere immuun- en farmacodynamische reacties te simuleren33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Sarah Morrison-studiebeurs uitgegeven door de University of Missouri-Kansas City School of Medicine aan A.I.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, Å The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
