Vurdering af intestinal transcytose af neonatal Escherichia coli bakteriæmiisolater

Summary

Escherichia coli forårsager sepsis hos nyfødte, der indtager bakterierne omkring fødselstidspunktet. Processen involveret i E. coli’s evne til at rejse fra den enteriske kanal til blodbanen er dårligt forstået. Denne in vitro-model vurderer E. coli-stammers evne til at rejse gennem tarmepitelcellerne.

Abstract

Nyfødte indtager moderens E. coli-stammer , der koloniserer deres tarmkanal omkring leveringstidspunktet. E. coli-stammer med evnen til at translokere over tarmen invaderer den nyfødtes blodbanen og forårsager livstruende bakteriæmi. Metoden, der præsenteres her, anvender polariserede intestinale epitelceller dyrket på semipermeable indsatser til at vurdere transcytose af neonatal E . coli-bakteriæmiisolater in vitro. Denne metode bruger den etablerede T84 tarmcellelinje, der har evnen til at vokse til sammenløb og danne tætte kryds og desmosomer. Efter at have nået sammenløb udvikler modne T84-monolag transepitelresistens (TEER), som kan kvantificeres ved hjælp af et voltmeter. TEER-værdierne er omvendt korreleret med den paracellulære permeabilitet af ekstracellulære komponenter, herunder bakterier, på tværs af tarmmonolaget. Den transcellulære passage af bakterier (transcytose) ændrer derimod ikke nødvendigvis TEER-målingerne. I denne model kvantificeres bakteriel passage over tarmens monolag i op til 6 timer efter infektion, og der foretages gentagne målinger af TEER for at overvåge den paracellulære permeabilitet. Derudover letter denne metode brugen af teknikker såsom immunfarvning til at studere de strukturelle ændringer i tætte kryds og andre celle-til-celle-adhæsionsproteiner under bakteriel transcytose over det polariserede epitel. Anvendelsen af denne model bidrager til karakteriseringen af de mekanismer, hvormed neonatal E. coli transcytose over tarmepitelet for at producere bakteriæmi.

Introduction

Escherichia coli er den mest almindelige årsag til tidlig sepsis hos nyfødte ^1,2,3. Dødeligheden af neonatal E. coli bakteriæmi kan nå 40%, og meningitis er en mulig komplikation, der er forbundet med alvorlige neurodevelopmental handicap². Indtagelse af moderens E. coli-stammer af den nyfødte kan producere neonatal bakteriæmi; Denne proces er blevet gentaget i dyremodel ^2,4. Når de er indtaget, rejser patogene bakterier fra det neonatale tarmlumen over tarmbarrieren og kommer ind i blodbanen og forårsager septikæmi. Neonatal invasive E. coli-stammer, der producerer bakteriæmi, varierer i deres evne til at invadere intestinale epitelceller ^1,5. Imidlertid er deres evne til at transcytose tarmepitelet efter invasion ikke blevet fuldstændigt karakteriseret.

Denne intestinale transcytosemodel er en nyttig in vitro-metode til at efterligne bakteriel passage over tarmepitelet. Det overordnede mål med de metoder, der præsenteres i dette manuskript, er at sammenligne neonatal E. coli-isolaters evne til at transcytose tarmepitelet. Modellen beskrevet her bruger T84-celler, som er udødeliggjorte humane tarmadenocarcinomceller ^6,7. T84-celler dyrkes til sammenløb på en semipermeabel membran med to separate rum. Begrundelsen for at bruge denne teknik er, at disse tarmceller, som det sker in vivo, polariserer og udvikler modne tætte kryds ^6,8. Den side, der er i kontakt med membranen, bliver basalsiden. Den modsatte side af cellerne bliver den apikale side, der ligner tarmlumenet, hvor indtagne patogener klæber og invaderer. Transwell-membranen er gennemtrængelig for bakterier, men de polariserede tarmceller danner tætte kryds, hvilket forringer bakteriel paracellulær bevægelse⁹. Således giver denne metode fordelen ved et kontrolleret in vitro-miljø, der anvender en human cellelinje til at studere processen med bakteriel transcytose, herunder den transcellulære rute. Mens der findes andre metoder til at undersøge transcytose af bakterier over tarmepitelet, giver transwell-metoden, der præsenteres her, større lethed og tilgængelighed. Der findes alternative teknikker, f.eks. ved hjælp af ex vivo-prøver, der er opstillet i Ussing-kammersystemer. De bruger dog vævsprøver, der muligvis ikke er let tilgængelige, især hvis forskningen har til hensigt at studere menneskelig fysiologi¹⁰. Intestinale organoider repræsenterer et andet eksempel på et in vitro-alternativ til undersøgelse af værtsbakterieinteraktioner¹¹. Mens organoide monolag også kan bruges i transwellsystemet til at studere bakteriel transcytose, kræver de isolering og vækst af stamceller og anvendelse af specifikke vækstfaktorer til at inducere differentiering¹². Således er deres anvendelse mere tidskrævende og forbundet med større omkostninger sammenlignet med transwell-metoden beskrevet i dette manuskript.

Vurderingen af bakteriel passage over tarmepitelet ved hjælp af dette in vitro transwell-system er blevet udført med succes for forskellige patogener. Disse undersøgelser har vist nytten af transwell-systemet ved hjælp af T84-celler til at karakterisere transcytose af bakterier over det polariserede tarmepitel^13,14,15. Imidlertid er anvendelsen af denne transwell-metode til sammenligning af transcytoseevnen hos bakteriæmiproducerende neonatal E. coli-stammer ikke beskrevet detaljeret. Dette manuskript giver andre forskere en standard transwell-protokol, der er pålidelig og nem at bruge og ikke kræver ressourcer, der er for dyre.

For at sammenligne neonatal invasive E. coli-stammers evne til at transcytose tarmepitelet, kan den apikale side af tarmepitelmonolaget inficeres med et kendt antal bakterieceller. Efter inkubation kan mediet på epithelets basale side opsamles, og bakterierne kvantificeres for at bestemme mængden af bakteriel transcytose over tid. I dette manuskript anvendes de præsenterede metoder til at studere transcytoseevnen hos neonatal E. coli kliniske stammer, der er genoprettet fra nyfødte indlagt med bakteriæmi. Inklusionskriterierne for udvælgelsen af disse neonatale kliniske isolater til transcytosestudier er tidligere blevet offentliggjort ^1,2,16. Når denne metode udføres ved anvendelse af forskellige E. coli-stammer, kan deres transcytoseevner sammenlignes. Gennem denne proces giver tarmtranscytosemodellen værdifulde data til at karakterisere virulensfaktorerne for E. coli, der bidrager til multistep-processen, der kulminerer i udviklingen af neonatal bakteriæmi.

Protocol

BEMÆRK: Udfør alle manipulationer af T84-celler, bakterier, plader og reagenser i et sikkerhedsskab til biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) for at undgå kontaminering. Brug separate områder og inkubatorer til alt arbejde, der involverer sterile T84-celler, inficerede T84-celler og E. coli. De kliniske E. coli-isolater, der blev testet med de metoder, der er beskrevet her, blev opnået efter retningslinjerne fra Institutional Review Board på vores institution <sup class=…

Representative Results

Figur 1: T84 TEER over tid. Efterhånden som T84-cellelaget modnes på indsatsen, øges monolagets elektriske modstand. Ved en TEER på mindst 1.000 Ω·cm2 er cellelaget tilstrækkeligt udviklet til at mindske den paracellulære bakterietransport og muliggøre måling af primært transcellulær bakterietransit. Fejlbjælkerne angiver sta…

Discussion

Denne metode er afledt af teknikker, der anvendes i gastroenterologi og infektionssygdomme²⁰. In vitro-modeller af tarmepitelbarrieren er blevet brugt til at belyse de mekanismer, hvormed luminalindholdet interagerer med denne relevante komponent af medfødt immunitet ^6,8. Værtspatogeninteraktionerne mellem invasiv neonatal E. coli er også blevet karakteriseret separat gennem genetisk analyse, undersøgelser af antimikr…

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL sterile conical tubes	MidSci	C15B
2 mL microcentrifuge tubes	Avant	AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes	Falcon	352070
Aspirator	Corning	4930
Biosafety Cabinets	Labconco	30441010028343	Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Disposable inoculation loops	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter	World Precision Instruments	EVOM
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11765-047
Hemacytometer	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubator shaker	New Brunswick	Innova 4080
Incubators	Thermo Scientific	51030284	Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth	Difco	244610
Lysogeny broth agar	IBI Scientific	IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope	Nikon
Spectrophotometer	Unico	1100RS
T84 Intestinal Cells	American Tissue Culture Collection	CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format	Falcon	353096
Tissue culture plate, 24 wells	Falcon	353504
Trypan blue stain	Fisher Scientific	T10282