Summary
Escherichia coli provoca sepsi nei neonati che ingeriscono i batteri intorno al momento della nascita. Il processo coinvolto nella capacità di E. coli di viaggiare dal tratto enterico al flusso sanguigno è poco compreso. Questo modello in vitro valuta la capacità dei ceppi di E. coli di viaggiare attraverso le cellule epiteliali intestinali.
Abstract
I neonati ingeriscono ceppi materni di E. coli che colonizzano il loro tratto intestinale intorno al momento del parto. I ceppi di E. coli con la capacità di traslocare attraverso l'intestino invadono il flusso sanguigno del neonato, causando batteriemia pericolosa per la vita. La metodologia qui presentata utilizza cellule epiteliali intestinali polarizzate cresciute su inserti semipermeabili per valutare la transcitosi degli isolati neonatali di batteriemia di E. coli in vitro. Questo metodo utilizza la linea cellulare intestinale T84 stabilita che ha la capacità di crescere fino alla confluenza e formare giunzioni strette e desmosomi. Dopo aver raggiunto la confluenza, i monostrati maturi T84 sviluppano resistenza transepiteliale (TEER), che può essere quantificata utilizzando un voltmetro. I valori di TEER sono inversamente correlati con la permeabilità paracellulare dei componenti extracellulari, compresi i batteri, attraverso il monostrato intestinale. Il passaggio transcellulare dei batteri (transcitosi), d'altra parte, non altera necessariamente le misurazioni TEER. In questo modello, il passaggio batterico attraverso il monostrato intestinale viene quantificato fino a 6 ore dopo l'infezione e vengono effettuate misurazioni ripetute di TEER per monitorare la permeabilità paracellulare. Inoltre, questo metodo facilita l'uso di tecniche come l'immunocolorazione per studiare i cambiamenti strutturali nelle giunzioni strette e altre proteine di adesione cellula-cellula durante la transcitosi batterica attraverso l'epitelio polarizzato. L'uso di questo modello contribuisce alla caratterizzazione dei meccanismi attraverso i quali E. coli neonatale transcitosi attraverso l'epitelio intestinale per produrre batteriemia.
Introduction
L'Escherichia coli è la causa più comune di sepsi ad esordio precoce nei neonati 1,2,3. Il tasso di mortalità della batteriemia neonatale di E. coli può raggiungere il 40% e la meningite è una possibile complicanza associata a gravi disabilità dello sviluppo neurologico2. L'ingestione di ceppi materni di E. coli da parte del neonato può produrre batteriemia neonatale; Questo processo è stato replicato in modelli animali 2,4. Una volta ingeriti, i batteri patogeni viaggiano dal lume intestinale neonatale attraverso la barriera intestinale ed entrano nel flusso sanguigno, causando setticemia. I ceppi neonatali invasivi di E. coli che producono batteriemia variano nella loro capacità di invadere le cellule epiteliali intestinali 1,5. Tuttavia, la loro capacità di transcitare l'epitelio intestinale dopo l'invasione non è stata completamente caratterizzata.
Questo modello di transcitosi intestinale è un utile metodo in vitro per emulare il passaggio batterico attraverso l'epitelio intestinale. L'obiettivo generale dei metodi presentati in questo manoscritto è quello di confrontare la capacità degli isolati neonatali di E. coli di transcitare l'epitelio intestinale. Il modello qui descritto utilizza cellule T84, che sono cellule di adenocarcinoma intestinale umano immortalizzate 6,7. Le cellule T84 vengono coltivate fino alla confluenza su una membrana semipermeabile con due compartimenti separati. Il razionale per l'utilizzo di questa tecnica è che, come accade in vivo, queste cellule intestinali si polarizzano e sviluppano giunzioni strette mature 6,8. Il lato a contatto con la membrana diventa il lato basale. Il lato opposto delle cellule diventa il lato apicale, simile al lume intestinale dove i patogeni ingeriti aderiscono e invadono. La membrana transwell è permeabile ai batteri, ma le cellule intestinali polarizzate formano giunzioni strette, che compromettono il movimento paracellulare batterico9. Pertanto, questo metodo offre il vantaggio di un ambiente controllato in vitro che utilizza una linea cellulare umana per studiare il processo di transcitosi batterica, compresa la via transcellulare. Mentre esistono altri metodi per studiare la transcitosi dei batteri attraverso l'epitelio intestinale, il metodo transwell qui presentato offre maggiore facilità e accessibilità. Sono disponibili tecniche alternative, come quelle che utilizzano campioni ex vivo installati nei sistemi di camere di Ussing. Tuttavia, utilizzano campioni di tessuto che potrebbero non essere facilmente accessibili, in particolare se la ricerca intende studiare la fisiologia umana10. Gli organoidi intestinali rappresentano un altro esempio di alternativa in vitro per lo studio delle interazioni ospite-batteri11. Mentre i monostrati organoidi possono anche essere utilizzati nel sistema transwell per studiare la transcitosi batterica, richiedono l'isolamento e la crescita delle cellule staminali e l'uso di specifici fattori di crescita per indurre la differenziazione12. Pertanto, il loro uso è più dispendioso in termini di tempo e associato a costi maggiori rispetto al metodo transwell descritto in questo manoscritto.
La valutazione del passaggio batterico attraverso l'epitelio intestinale utilizzando questo sistema transwell in vitro è stata eseguita con successo per vari agenti patogeni. Questi studi hanno dimostrato l'utilità del sistema transwell utilizzando cellule T84 per caratterizzare la transcitosi dei batteri attraverso l'epitelio intestinale polarizzato13,14,15. Tuttavia, l'applicazione di questo metodo transwell per confrontare la capacità di transcitosi dei ceppi neonatali di E. coli produttori di batteriemia non è stata descritta in dettaglio. Questo manoscritto fornisce ad altri ricercatori un protocollo transwell standard che è affidabile e facile da usare e non richiede risorse troppo costose.
Per confrontare la capacità dei ceppi neonatali invasivi di E. coli di transcitare l'epitelio intestinale, il lato apicale del monostrato epiteliale intestinale può essere infettato da un numero noto di cellule batteriche. Dopo l'incubazione, il mezzo sul lato basale dell'epitelio può essere raccolto e i batteri quantificati per determinare la quantità di transcitosi batterica nel tempo. In questo manoscritto, i metodi presentati sono utilizzati per studiare la capacità di transcitosi di ceppi clinici neonatali di E. coli recuperati da neonati ospedalizzati con batteriemia. I criteri di inclusione per la selezione di questi isolati clinici neonatali per gli studi di transcitosi sono stati pubblicati in precedenza 1,2,16. Quando questo metodo viene eseguito utilizzando diversi ceppi di E. coli, le loro capacità di transcitosi possono essere confrontate. Attraverso questo processo, il modello di transcitosi intestinale fornisce dati preziosi per caratterizzare i fattori di virulenza di E. coli che contribuiscono al processo multifase che culmina nello sviluppo della batteriemia neonatale.
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Protocol
NOTA: Eseguire tutte le manipolazioni delle cellule T84, dei batteri, delle piastre e dei reagenti in un armadio di sicurezza di livello 2 (BSL-2) per evitare la contaminazione. Utilizzare aree separate e incubatori per tutto il lavoro che coinvolge cellule T84 sterili, cellule T84 infette ed E. coli. Gli isolati clinici di E. coli testati con i metodi qui descritti sono stati ottenuti seguendo le linee guida dell'Institutional Review Board presso il nostro istituto 1,16.
1. Preparazione di inserti di transcitosi con cellule T84 (circa 1-2 settimane prima dell'esperimento)
- Coltivare cellule T84 della American Type Culture Collection (ATCC) in terreno di coltura tissutale (MTC + antibiotici) costituito dal terreno di coltura Modified Eagle di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12 di prosciutto (1: 1, concentrazione finale: 50% ciascuno), siero bovino fetale al 5% e miscela di antibiotici doppi penicillina / streptomicina all'1% (100 U / ml). Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2.
NOTA: Una variante di questa formulazione di mezzo senza penicillina / streptomicina (MTC senza antibiotici) viene utilizzata per le fasi successive (sezione 2 e successive) della procedura. Assicurarsi che venga utilizzata la formulazione corretta per ogni passaggio. - Lavorando all'interno di un armadio di biosicurezza (BSC), seminare le cellule T84 in inserti transwell di coltura cellulare a membrana in polietilene tereftalato con pori da 3 μm realizzati per piastre a 24 pozzetti. Includere repliche di inserti transwell per ogni condizione sperimentale desiderata più controlli non infetti per monitorare la possibile contaminazione.
- In una piastra a 24 pozzetti progettata per contenere inserti transwell, riempire il numero desiderato di pozzetti di raccolta con 1 ml di TCM + antibiotici.
- In ogni pozzetto, posizionare un inserto transwell.
- Semina questi inserti con 1 x 105 cellule T84 sospese in 500 μL di TCM + antibiotici. Quantificare il numero di cellule utilizzando un emocitometro con colorazione blu tripano o un contatore automatico di cellule17.
- Incubare le piastre transwell contenenti inserti seminati nelle stesse condizioni in cui sono state coltivate le cellule.
- Verificare con microscopia ottica che i monostrati abbiano iniziato a diventare confluenti dopo la semina dell'inserto, circa 48 ore dopo la semina.
- Ogni 2 giorni dopo la semina, misurare e registrare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) utilizzando un volt / ohmmetro epiteliale (EVOM) per valutare la maturità del monostrato. Una volta che gli inserti raggiungono un TEER di almeno 1.000 Ω·cm2, sono considerati pronti per il saggio18.
NOTA: Gli inserti impiegano in genere 7-10 giorni per raggiungere questo TEER dopo la semina. Le cellule T84 mostreranno una confluenza del 100% al microscopio ottico una volta raggiunta questa resistenza.- Conservare la sonda EVOM con gli elettrodi immersi in 0,15 M KCl quando non in uso.
- Prima di misurare il TEER, decontaminare la sonda dell'elettrodo immergendola in 5 ml di etanolo al 70% in un tubo conico da 50 ml per 10-15 minuti. Rimuovere la sonda, scrollarsi di dosso l'etanolo in eccesso e lasciarlo asciugare all'aria all'interno del BSC per 10 minuti. Trattenere il tubo di etanolo.
- Testare l'EVOM e la sonda posizionando la sonda decontaminata a secco in un pozzetto sterile contenente 1 ml di TCM + antibiotici con un inserto sterile all'interno contenente 500 μL di TCM + antibiotici. Assicurarsi che la lettura EVOM sia <200 Ω. Registrare questo valore vuoto per utilizzarlo nei successivi calcoli di resistenza descritti al punto 1.3.6.
- Rimuovere la sonda dal tubo di TCM + antibiotici. Conservare questo tubo per la conservazione della sonda durante l'esperimento.
- Abbassare delicatamente la sonda nel primo inserto con l'elettrodo lungo nel pozzetto di raccolta e l'elettrodo corto all'interno dell'inserto. Lasciare che l'elettrodo lungo tocchi il fondo del pozzo di raccolta, ma non spingere verso il basso in quanto ciò potrebbe disturbare il monostrato epiteliale.
- Ripetere questo processo per misurare e registrare la resistenza in Ohm (Ω) per ogni inserto. Al termine, decontaminare la sonda nell'etanolo immergendola per altri 10-15 minuti. Quindi, spostare nuovamente la sonda decontaminata nella soluzione KCl per lo stoccaggio. Sottrarre la resistenza al bianco ottenuta al punto 1.3.3 da ciascun valore ottenuto da ciascun inserto contenente celle T84. Moltiplicare la resistenza risultante (Ω) per ciascun inserto per l'area del fondo di ciascun inserto (cm 2) per ottenere la misura finale TEER (Ω·cm2).
- Una volta che il TEER raggiunge almeno 1.000 Ω·cm2, il monostrato epiteliale è maturo e pronto per i test di infezione.
- Man mano che il TEER matura, fornire alle cellule un terreno fresco ogni 1-2 giorni.
- In una nuova piastra a 24 pozzetti, aggiungere 1 ml di TCM + antibiotici in un pozzetto per ogni inserto seminato in preparazione.
- Usando una pinza sterile, trasferire con attenzione gli inserti nei pozzetti appena riforniti.
- Sostituire il supporto negli inserti.
- Rimuovere i vecchi fluidi dagli inserti inclinando la piastra e utilizzando un aspiratore a vuoto interno per rimuovere delicatamente il fluido con una punta di pipetta lungo il lato dell'inserto. L'aspiratore consente la regolazione dell'aspirazione a basso livello per prevenire la rottura delle celle. Non lasciare che la punta della pipetta tocchi il fondo dell'inserto, poiché ciò interromperebbe il monostrato epiteliale in via di sviluppo.
- Aggiungere 500 μL di MTC + antibiotici agli inserti. Visualizza il monostrato con microscopia ottica per verificare che rimanga intatto.
- Ogni 1-2 giorni, misurare il TEER su ciascun inserto come descritto sopra nei passaggi 1.3.2-1.3.6.
2. Preparazione delle cellule T84 1 giorno prima dell'esperimento con MTC senza antibiotici
- Misurare e registrare il TEER il giorno prima dell'esperimento.
- Sostituire il MTC nello stesso modo in cui si verifica durante la preparazione e la manutenzione della cella precedente. Tuttavia, la MTC senza antibiotici viene invece utilizzata in preparazione all'infezione (1 ml nel pozzetto della piastra e 500 μL nell'inserto).
3. Colture di E. coli (iniziate 1 giorno prima dell'esperimento)
ATTENZIONE: Utilizzare precauzioni di livello 2 (BSL-2) quando si lavora con ceppi clinici patogeni di E. coli.
- Prendi un tubo conico marcato da 15 ml con 5 ml di brodo di lisogenia sterile (LB) e usa un anello sterile per inoculare il brodo con una colonia da un ceppo batterico (E. coli). Ripetere questo processo, creando un tubo di coltura notturno per ogni ceppo da testare.
- Incubare la coltura per la notte, con i tappi dei tubi allentati, in uno shaker incubatore (250 rpm, 37 °C).
4. Preparazione dell'inoculo di E. coli , delle cellule epiteliali e dei materiali (la mattina dell'esperimento)
NOTA: Utilizzare MTC senza antibiotici riscaldati fino a 37 °C da questo punto in poi.
- Aggiungere 250 μL da ogni coltura LB durante la notte a 25 ml di MTC senza antibiotici in un tubo conico da 50 mL (uno per singolo ceppo). Tenere allentati i tappi dei tubi. Posizionare questi nuovi tubi di coltura nello shaker con le stesse impostazioni (250 giri/min, 37 °C) per esattamente 2 ore. Eseguire i passaggi secondari rimanenti durante l'attesa.
- Misurare il TEER su ciascun inserto, come descritto nei passaggi 1.3.2-1.3.6. Registrarli come TEER al tempo (t) = 0 h.
- Spostare gli inserti nei pozzetti in una nuova piastra e cambiare il supporto usando la tecnica descritta al punto 1.4.3. Tuttavia, questa volta, riempire i nuovi pozzetti di raccolta con 500 μL di MTC senza antibiotici e riempire gli inserti con 400 μL di MTC senza antibiotici. Conservare gli inserti all'interno dell'incubatore di coltura tissutale fino al momento dell'infezione.
- Disporre un numero sufficiente di piastre di agar LB quadrate da riscaldare a temperatura ambiente (RT) per una successiva placcatura e quantificazione batterica.
5. Inoculazione delle cellule (inizio dell'esperimento)
- Dopo esattamente 2 ore, rimuovere le colture batteriche mattutine dallo shaker e centrifugarle per 10 minuti (1.900 x g, 4 °C).
NOTA: Per tutti i seguenti passaggi, tenere tutte le sospensioni batteriche sul ghiaccio per ridurre al minimo la crescita. - Risospendere il pellet di batteri in MTC senza antibiotici. Utilizzare uno spettrofotometro per regolare la densità ottica (OD) a 0,7-0,9 e diluire ulteriormente con MTC senza antibiotici a una concentrazione di 1 x 106 unità formanti colonie (CFU)/ml (circa 1:100 diluizione). Utilizzare questa sospensione batterica per infettare ogni inserto con 1 x 105 CFU per 100 μL di volume.
- Etichettare la piastra del pozzetto e infettare ciascun inserto con 100 μL di inoculo OD-aggiustato (totale di 1 x 105 CFU per inserto). Il test è ora iniziato. Annotare l'ora e registrarla come t = 0 h.
- Placcare la sospensione batterica dell'inoculo per quantificare il CFU/mL utilizzando il metodo della diluizione in traccia, placcando 10 μL aliquote su piastre di agar LB quadrate19.
6. Quantificazione della transcitosi
- Ogni 30 minuti dopo l'inoculazione, riempire nuovi pozzetti con 500 μL di MTC senza antibiotici. Trasferire gli inserti in questi nuovi pozzetti utilizzando un diverso set di pinze sterili per ogni diverso ceppo batterico.
- Raccogliere il supporto dal pozzo di raccolta utilizzato per ciascun inserto in tubi etichettati separati. Posizionare questi tubi sul ghiaccio. Riportare le piastre del pozzo all'incubatore tra i punti temporali.
- Per ogni inserto, combinare brevemente i supporti raccolti da t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h e t = 2 h e vortice. Placcare i mezzi raccolti su piastre di agar LB utilizzando il metodo di diluizione della traccia per quantificare la quantità di batteri transcitosi nelle prime 2 ore dell'esperimento.
NOTA: Recuperare i batteri ogni 30 minuti e tenerli sul ghiaccio assicura che la crescita batterica nei pozzetti di raccolta sia ridotta al minimo e che le misurazioni vengano eseguite su batteri prevalentemente transcitosi. - Posizionare le piastre di agar LB marcate per la diluizione del binario nell'incubatore batterico a 37 °C senza CO2 supplementare e riportare la piastra transwell T84 all'incubatore di coltura tissutale.
- A t = 4 h, ripetere il passaggio 6.3 combinando i mezzi raccolti da t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h e t = 4 h.
- A t = 6 h, ripetere il passaggio 6.3 combinando i mezzi raccolti da t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h e t = 6 h. Inoltre, a t = 6 h, placcare il mezzo dai pozzetti di controllo.
7. Fine dell'esperimento
- Misurare e registrare il TEER alla fine dell'esperimento, t = 6 h. Utilizzare la procedura descritta nei passaggi 1.3.2-1.3.6.
- Decontaminare la sonda immergendola in etanolo al 70% per 10-15 minuti. Eliminare gli inserti o salvarli/elaborarli per ulteriori applicazioni, se lo si desidera. Lasciare incubare le piastre di agar LB durante la notte e disinfettare e/o smaltire in modo sicuro tutti gli altri materiali utilizzati.
- Dopo l'incubazione durante la notte, contare manualmente le colonie batteriche sulle piastre LB di diluizione della traccia per determinare la quantità di inoculo e la quantità di transcitosi di E. coli. Assicurarsi che le piastre di controllo non mostrino alcuna crescita batterica.
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Representative Results
Figura 1: T84 TEER nel tempo. Man mano che lo strato di celle T84 matura sull'inserto, la resistenza elettrica del monostrato aumenta. Con un TEER di almeno 1.000 Ω·cm2, lo strato cellulare è sufficientemente sviluppato per diminuire il trasporto batterico paracellulare e consentire la misurazione del transito batterico principalmente transcellulare. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Durante la proliferazione delle cellule sterili T84 descritte nella sezione 1, i TEER attraverso i monostrati T84 aumentano continuamente nel tempo, superando i 1.000 Ω·cm2 circa dopo 7 giorni dalla semina (vedere Figura 1). Sebbene la polarizzazione delle cellule epiteliali e la maturazione del TEER siano più robuste con le cellule T84 che con altre cellule intestinali, come Caco-2, potrebbe essere ancora necessaria una risoluzione dei problemi6. Il TEER di un inserto non deve diminuire drasticamente tra una misurazione e l'altra. Un tale declino del TEER potrebbe indicare una rottura meccanica del monostrato epiteliale. Si dovrebbe assicurarsi che durante il cambio del mezzo, la punta dell'aspiratore non tocchi mai il fondo dell'inserto della coltura cellulare. Se si sospetta questo tipo di danno, può essere visualizzato al microscopio ottico come assenza di cellule epiteliali vicino alla posizione di aspirazione. Oltre ai danni causati dalla manipolazione, una diminuzione del TEER potrebbe indicare contaminazione.
Figura 2: Transcitosi degli isolati neonatali di E. coli nel tempo. Dopo aver infettato gli inserti T84, gli isolati clinici neonatali di E. coli che raggiungono con successo il pozzo di raccolta vengono quantificati utilizzando il metodo di diluizione della pista. Diversi ceppi di E. coli possono essere confrontati in termini di capacità di transcitosizzare l'epitelio intestinale. L'E. coli DH5 alfa non patogeno è stato incluso come comparatore. I grafici mostrano i CFU medi e gli errori standard in ogni punto temporale. I confronti dei valori medi di transcitosi sono stati effettuati con test t a una coda, che hanno dimostrato differenze significative tra gli isolati neonatali di E. coli #1 rispetto a #2 a 2 h (* p < 0,05), 4 h (** p < 0,04) e 6 h (***p < 0,04) dopo l'infezione. Al contrario, il ceppo non patogeno di E. coli DH5 alfa ha subito una transcitosi minima, come mostrato nel terzo grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La transcitosi quantificata può essere rappresentata come mostrato nella Figura 2. In questo esempio, gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando tre inserti, ciascuno infetto da due diversi isolati di E. coli invasivo neonatale. Anche un ceppo non patogeno, DH5 alfa, è stato testato per il confronto. Sono stati inclusi anche due inserti di controllo sterili (non viene mostrato alcun grafico poiché non sono stati isolati batteri). I dati di questa procedura sono utili per descrivere la capacità di un singolo ceppo di E. coli di transcitare l'epitelio intestinale. I dati possono anche consentire un confronto delle capacità di transcitosi di diversi ceppi (vedere la sezione di discussione per ulteriori applicazioni).
Figura 3: TEER immediatamente prima dell'infezione e 6 ore dopo l'infezione. Il TEER degli inserti aumenta tipicamente dopo l'infezione da ceppi neonatali produttori di batteriemia di E. coli 2. Gli inserti infetti mostrano un aumento maggiore di TEER rispetto agli inserti di controllo non infetti. Il TEER è risultato significativamente maggiore nei monostrati T84 dopo 6 ore di infezione con E. coli ceppo neonatale #1 (*p < 0,01) ed E. coli ceppo #2 (**p < 0,03), come calcolato dai t-test. Anche il TEER nei monostrati T84 di controllo non infetti è aumentato, ma la differenza tra i valori pre-infezione e post-infezione non era statisticamente significativa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La Figura 3 mostra i risultati tipici di TEER prima e dopo l'infezione con due isolati clinici neonatali di E. coli con diverse capacità di transcitosi delle cellule epiteliali intestinali. La velocità e la quantità di transcitosi variano tra i ceppi, come mostrato nella Figura 2, ma il TEER aumenta significativamente dopo l'infezione con entrambi i ceppi patogeni.
I risultati possono essere alterati in presenza di contaminazione in questo esperimento. I ceppi neonatali di E. coli utilizzati non hanno causato danni sufficienti al monostrato epiteliale per produrre una diminuzione del TEER, eppure i batteri sono stati in grado di transcitosi. È plausibile che un organismo contaminante, se presente, possa causare danni alle cellule intestinali e una conseguente diminuzione del TEER. Gli inserti di controllo sterili servono a identificare tale possibile contaminazione. Il terreno di coltura tissutale utilizzato in questa procedura contiene l'indicatore di pH rosso fenolo. In generale, il mezzo appare di un rosa chiaro quando è sterile o infetto da un piccolo inoculo. Con una crescita significativa o contaminazione, il mezzo può diventare torbido, giallo o maleodorante. Prima dell'infezione, i supporti in tutti gli inserti T84 appaiono normalmente rosa chiaro.
Dopo l'incubazione notturna, il posto finale per verificare la contaminazione è sulle piastre di agar LB. Le piastre di controllo non dovrebbero mostrare alcuna crescita. Le piastre ricavate dai pozzetti di raccolta di inserti infetti da E. coli dovrebbero contenere colonie di E. coli omogenee, rotonde e gialle . Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, tutto il lavoro deve essere eseguito in armadi di biosicurezza. Armadi e incubatori separati dovrebbero essere utilizzati per la coltivazione di tessuti sterili, la coltura di tessuti infetti da E. coli e la manipolazione batterica. Gli spazi di lavoro devono essere mantenuti puliti e deve essere utilizzata una tecnica sterile in tutto.
Figura 4: Rappresentazione schematica del sistema transwell e delle relative strutture cellulari intestinali. (A) Vista della sezione dell'inserto del transwell (blu); Le linee verticali nella parte inferiore dell'inserto indicano i pori permeabili. Le cellule epiteliali intestinali polarizzate formano un monostrato nella parte inferiore dell'inserto. Il terreno di coltura tissutale è mostrato in rosa, con una sonda EVOM a due poli immersa in esso. I fili della sonda sul lato opposto sono agganciati all'apparato EVOM (non mostrato). (B) Diagramma semplificato delle componenti della giunzione stretta delle cellule epiteliali intestinali. Le frecce verticali rappresentano possibili vie di passaggio batterico dal lato apicale a quello basolaterale del monostrato epiteliale intestinale polarizzato. Abbreviazioni: ZO = zona occludens proteins; JAM = molecole di adesione giunzionale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Crescita apicale degli isolati neonatali di E. coli nel tempo. Le misurazioni di E. coli nei supernatanti sovrastanti le cellule T84 all'interno di inserti transwell possono essere eseguite come endpoint aggiuntivo opzionale. La figura dimostra che la crescita apicale di entrambi i ceppi patogeni di E. coli che sono stati testati per la transcitosi non era significativamente diversa nel tempo. Le barre di errore indicano deviazioni standard. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo metodo deriva da tecniche utilizzate in gastroenterologia e malattie infettive20. Modelli in vitro della barriera epiteliale intestinale sono stati utilizzati per chiarire i meccanismi attraverso i quali i contenuti luminali interagiscono con questa componente rilevante dell'immunità innata 6,8. Le interazioni ospite-patogeno di E. coli neonatale invasivo sono state anche caratterizzate separatamente attraverso analisi genetiche, studi di resistenza antimicrobica e tecniche immunologiche 1,5,16,21. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi molecolari alla base della capacità degli isolati neonatali di E. coli di entrare nel flusso sanguigno attraverso l'intestino3.
La tecnica di transcitosi qui dimostrata consente una caratterizzazione più dettagliata dei ceppi invasivi neonatali di E. coli che producono setticemia dopo l'acquisizione enterale. La batteriemia neonatale è un processo a più fasi e la transcitosi è uno dei passaggi rilevanti. Rispetto ai modelli di invasione, questo metodo di transcitosi offre ulteriori informazioni sui meccanismi coinvolti nella patogenesi della batteriemia. In alcuni casi, E. coli patogeno invade l'intestino tenue senza raggiungere il flusso sanguigno, limitando l'infezione a causare la malattia localizzata22. Pertanto, la capacità dei batteri di invadere semplicemente l'epitelio intestinale potrebbe non riflettere la loro capacità di passare completamente attraverso la barriera epiteliale. Questo modello può essere utilizzato per studiare il processo di passaggio batterico attraverso l'epitelio intestinale attraverso le vie transcellulari o paracellulari, in particolare se sono incorporate tecniche aggiuntive come la microscopia elettronica20. Rispetto ai modelli animali in vivo, questo modello in vitro è più efficiente e consente un migliore controllo di diverse variabili potenziali. Inoltre, contribuisce al benessere degli animali fornendo un'alternativa alla sperimentazione in vivo.
Nonostante questi vantaggi, questo esperimento ha ancora i suoi limiti. Per uno, questo test non tiene conto delle differenze nella crescita batterica sul lato apicale dell'epitelio durante l'incubazione. Tali differenze di crescita possono influenzare la quantità di transcitosi per ciascun ceppo. Gli utenti possono scegliere di misurare la crescita apicale per una caratterizzazione più completa dei risultati ottenuti con questo modello. Un esempio della crescita apicale dei due isolati di E. coli utilizzati per gli esperimenti di transcitosi nei metodi presentati in questo manoscritto è mostrato nella Figura supplementare 1. Inoltre, sebbene questo modello ricrei ragionevolmente il monostrato epiteliale intestinale, non rappresenta completamente tutti i componenti della barriera intestinale che protegge il flusso sanguigno dagli agenti patogeni ingeriti. Tuttavia, alcune proprietà dell'epitelio intestinale possono essere studiate con questo modello. Ad esempio, le cellule T84 secernono cloruro e producono mucina23. L'invasione da parte di E. coli produttore di diarrea è associata ad un aumento della secrezione di cloruro nelle cellule T84 e ad una significativa diminuzione del TEER oltre le 6 ore successive all'infezione24. È possibile che l'invasione da parte di ceppi di E. coli produttori di batteriemia aumenti anche la secrezione di cloruro in questo modello e che una diminuzione di TEER possa verificarsi dopo 6 ore di infezione. Questo modello può essere adattato per studi sulla relazione tra trasporto ionico e invasione batterica se lo desiderano altri ricercatori. La mucina è una barriera fisica che protegge l'epitelio dagli agenti patogeni. L'infezione con altri ceppi di E. coli diminuisce l'espressione della mucina da parte delle cellule T8425. Anche il ruolo della mucina nella patogenesi della transcitosi neonatale di E. coli attraverso l'epitelio intestinale può essere studiato con questo modello. Un altro uso di questo modello potrebbe essere quello di studiare gli effetti citotossici delle ciclomoduline batteriche e il loro possibile ruolo nel processo di transcitosi dei ceppi neonatali di E. coli. Ad esempio, il fattore necrotizzante citotossico-1 (CNF-1), prodotto da alcuni ceppi patogeni di E. coli, prende di mira le Rho GTPasi, che sono cruciali nella regolazione della funzione di giunzione stretta e dell'apoptosi delle cellule eucariotiche infette26. Questo modello transwell può essere adattato per comprendere meglio i meccanismi attraverso i quali queste citotossine influenzano l'epitelio intestinale27. Quando si utilizza questo modello per studiare l'interazione dei ceppi neonatali di E. coli con l'epitelio intestinale, è importante considerare che le cellule T84 utilizzate per modellare l'epitelio intestinale provengono da una metastasi polmonare dell'adenocarcinoma del colon in un adulto6. Mentre gli studi sulle cellule T84 hanno riprodotto effetti specifici sulla permeabilità intestinale che si sono tradotti in effetti simili nelle cellule intestinali umane neonatali e animali neonatali28,29, l'epitelio intestinale fetale e neonatale può comportarsi in modo diverso in presenza di E. coli invasivo.
Potrebbe essere necessaria una risoluzione dei problemi per ottimizzare questo modello e la qualità dei dati forniti. L'uso di inserti di controllo sterili è discusso in dettaglio nella sezione dei risultati rappresentativi. Altri ceppi non invasivi di E. coli possono anche essere inclusi come controlli di transcyctosi negativi / minimi. Inoltre, una diversa linea cellulare, come Caco-2, può essere utilizzata per valutare la capacità dei ceppi neonatali di E. coli di transcitosi dell'epitelio intestinale polarizzato. L'invasione e la transcitosi di E. coli sono risultate maggiori per le cellule T84 rispetto alle cellule Caco-230. Pertanto, queste differenze devono essere considerate quando questo modello viene utilizzato per valutare la transcitosi batterica con queste e altre cellule epiteliali che polarizzano e formano giunzioni strette. L'esecuzione delle misurazioni TEER di ogni singolo inserto transwell richiede diversi secondi e, quando vengono testati più ceppi, è necessario prendere in considerazione il tempo aggiuntivo dell'operatore. Continuano a essere sviluppati metodi più efficienti per monitorare il TEER nei sistemi transwell. Questi dispositivi più recenti consentono di monitorare il TEER simultaneamente in più inserti transwell e in tempo reale31. I ricercatori che considerano queste opzioni dovrebbero decidere se il tempo risparmiato potrebbe potenzialmente compensare l'aumento del prezzo di questi nuovi dispositivi rispetto alle misurazioni a singolo elettrodo descritte nel presente documento.
Nonostante alcune possibili sfide, questo test consente ai ricercatori di studiare meccanismi specifici coinvolti nella patogenesi della batteriemia di E. coli oltre la semplice quantità di transcitosi. Se combinato con tecniche di microbiologia molecolare, questo processo può essere utilizzato per individuare gli effetti dei singoli geni sulla capacità di E. coli di transcitare l'epitelio intestinale, come è stato tentato in modelli animali32. Questo modello può anche essere modificato dalla co-coltura delle cellule immunitarie o dall'aggiunta di citochine, fattori di crescita e interventi farmaceutici per simulare risposte immunitarie e farmacodinamiche più complesse33.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio Sarah Morrison rilasciata dalla University of Missouri-Kansas City School of Medicine all'IA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
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