Summary
Escherichia coli orsakar sepsis hos nyfödda som får i sig bakterierna runt födseln. Processen som är involverad i E. colis förmåga att resa från det enteriska området till blodomloppet är dåligt förstådd. Denna in vitro-modell bedömer förmågan hos E. coli-stammar att resa genom tarmepitelcellerna.
Abstract
Nyfödda intar moderns E. coli-stammar som koloniserar deras tarmkanal runt leveranstiden. E. coli-stammar med förmågan att translokera över tarmen invaderar den nyfödda blodomloppet och orsakar livshotande bakterieemi. Metoden som presenteras här använder polariserade tarmepitelceller som odlas på semipermeabla insatser för att bedöma transcytosen av neonatala E. coli-bakterieemiisolat in vitro. Denna metod använder den etablerade T84 tarmcellinjen som har förmågan att växa till sammanflöde och bilda täta korsningar och desmosomer. Efter att ha nått sammanflöde utvecklar mogna T84-monolager transepitelresistens (TEER), som kan kvantifieras med hjälp av en voltmeter. TEER-värdena är omvänt korrelerade med den paracellulära permeabiliteten hos extracellulära komponenter, inklusive bakterier, över tarmmonoskiktet. Den transcellulära passagen av bakterier (transcytos) förändrar å andra sidan inte nödvändigtvis TEER-mätningarna. I denna modell kvantifieras bakteriell passage över tarmmonolagret i upp till 6 timmar efter infektion, och upprepade mätningar av TEER görs för att övervaka den paracellulära permeabiliteten. Dessutom underlättar denna metod användningen av tekniker som immunfärgning för att studera strukturella förändringar i täta korsningar och andra cell-till-cell-vidhäftningsproteiner under bakteriell transcytos över det polariserade epitelet. Användningen av denna modell bidrar till karakteriseringen av de mekanismer genom vilka neonatal E. coli transcytos över tarmepitelet för att producera bakterieemi.
Introduction
Escherichia coli är den vanligaste orsaken till tidig sepsis hos nyfödda 1,2,3. Dödligheten hos neonatal E. coli-bakteriemi kan nå 40%, och hjärnhinneinflammation är en möjlig komplikation som är förknippad med allvarliga neurodevelopmental funktionshinder2. Intag av moderns E. coli-stammar av nyfödda kan producera neonatal bakterieemi; Denna process har replikerats i djurmodellerna 2,4. När de väl har intagits reser patogena bakterier från neonatal tarmlumen över tarmbarriären och kommer in i blodomloppet och orsakar septikemi. Neonatala invasiva E. coli-stammar som producerar bakteriemi varierar i deras förmåga att invadera tarmepitelceller 1,5. Men deras förmåga att transcytose tarmepitelet efter invasion har inte karakteriserats fullständigt.
Denna tarmtranscytosmodell är en användbar in vitro-metod för att emulera bakteriell passage över tarmepitelet. Det övergripande målet med de metoder som presenteras i detta manuskript är att jämföra förmågan hos neonatala E. coli-isolat att transcytosa tarmepitelet. Modellen som beskrivs här använder T84-celler, som är odödliga humana intestinala adenokarcinomceller 6,7. T84-celler odlas till sammanflöde på ett semipermeabelt membran med två separata fack. Motiveringen för att använda denna teknik är att, som händer in vivo, dessa tarmceller polariserar och utvecklar mogna täta korsningar 6,8. Sidan i kontakt med membranet blir basalsidan. Den motsatta sidan av cellerna blir den apikala sidan, som liknar tarmlumen där intagna patogener fäster och invaderar. Transwellmembranet är permeabelt för bakterier, men de polariserade tarmcellerna bildar täta korsningar, vilket försämrar bakteriell paracellulär rörelse9. Således ger denna metod fördelen med en kontrollerad in vitro-miljö som använder en mänsklig cellinje för att studera processen med bakteriell transcytos, inklusive den transcellulära vägen. Medan det finns andra metoder för att undersöka transcytos av bakterier över tarmepitelet, ger transwell-metoden som presenteras här större lätthet och tillgänglighet. Alternativa tekniker, såsom de som använder ex vivo-prover som ställts in i Ussing-kammarsystem, finns tillgängliga. De använder dock vävnadsprover som kanske inte är lättillgängliga, särskilt om forskningen avser att studera mänsklig fysiologi10. Tarmorganoider representerar ett annat exempel på ett in vitro-alternativ för att studera värd-bakterieinteraktioner11. Medan organoidmonolager också kan användas i transwellsystemet för att studera bakteriell transcytos, kräver de isolering och tillväxt av stamceller och användning av specifika tillväxtfaktorer för att inducera differentiering12. Således är deras användning mer tidskrävande och förknippad med större kostnader jämfört med transwellmetoden som beskrivs i detta manuskript.
Bedömningen av bakteriell passage över tarmepitelet med hjälp av detta in vitro-transwellsystem har framgångsrikt utförts för olika patogener. Dessa studier har visat nyttan av transwellsystemet som använder T84-celler för att karakterisera transcytos av bakterier över det polariserade tarmepitelet13,14,15. Tillämpningen av denna transwellmetod för att jämföra transcytosförmågan hos bakteriemimi producerande neonatala E. coli-stammar har emellertid inte beskrivits i detalj. Detta manuskript ger andra forskare ett standard transwell-protokoll som är pålitligt och enkelt att använda och inte kräver resurser som är för dyra.
För att jämföra förmågan hos neonatala invasiva E. coli-stammar att transcytosa tarmepitelet kan den apikala sidan av tarmepitelmonolagret infekteras med ett känt antal bakterieceller. Efter inkubation kan mediet på epitelets basala sida samlas in och bakterierna kvantifieras för att bestämma mängden bakteriell transcytos över tiden. I detta manuskript används de presenterade metoderna för att studera transcytosförmågan hos neonatala E. coli kliniska stammar som återhämtats från nyfödda på sjukhus med bakterieemi. Inklusionskriterierna för urval av dessa neonatala kliniska isolat för transcytosstudier har tidigare publicerats 1,2,16. När denna metod utförs med olika E. coli-stammar kan deras transcytosförmåga jämföras. Genom denna process ger tarmtranscytosmodellen värdefulla data för att karakterisera virulensfaktorerna för E. coli som bidrar till flerstegsprocessen som kulminerar i utvecklingen av neonatal bakterieemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Utför alla manipuleringar av T84-celler, bakterier, plattor och reagenser i ett säkerhetsskåp för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) för att undvika kontaminering. Använd separata områden och inkubatorer för allt arbete som involverar sterila T84-celler, infekterade T84-celler och E. coli. De kliniska E. coli-isolat som testats med de metoder som beskrivs här erhölls enligt riktlinjerna från Institutional Review Board vid vår institution 1,16.
1. Förbereda transcytosinsatser med T84-celler (cirka 1-2 veckor före experimentet)
- Grow American Type Culture Collection (ATCC) T84-celler i vävnadsodlingsmedium (TCM + antibiotika) bestående av Dulbeccos modifierade Eagle Medium: Hams F-12 näringsblandning (1: 1, slutlig koncentration: 50% vardera), 5% fetalt bovint serum och 1% (100 U / ml) penicillin / streptomycin dubbel antibiotikablandning. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 %CO2.
OBS: En variant av denna mediumformulering utan penicillin/streptomycin (TCM w/o antibiotika) används för de senare stegen (avsnitt 2 och framåt) i proceduren. Se till att rätt formulering används för varje steg. - Genom att arbeta inuti ett biosäkerhetsskåp (BSC) frö T84-cellerna till transwellinsatser av polyetentereftalatmembranceller med 3 μm porer gjorda för 24-brunnsplattor. Inkludera transwell-insatsreplikat för varje önskat experimentellt tillstånd plus oinfekterade kontroller för att övervaka eventuell kontaminering.
- I en 24-brunnsplatta utformad för att hålla transwellinsatser fyller du önskat antal uppsamlingsbrunnar med 1 ml TCM + antibiotika.
- Placera en transwellinsats i varje brunn.
- Frö dessa insatser med 1 x 105 T84-celler suspenderade i 500 μL TCM + antibiotika. Kvantifiera antalet celler med hjälp av en hemocytometer med trypanblå fläck eller en automatiserad cellräknare17.
- Inkubera transwellplattorna som innehåller fröade insatser under samma förhållanden som cellerna odlades i.
- Kontrollera med ljusmikroskopi att monolagren har börjat bli sammanflytande efter sådd av skäret, cirka 48 timmar efter sådd.
- Var 2: e dag efter sådd, mät och registrera det transepiteliala elektriska motståndet (TEER) med hjälp av en epitelvolt / ohm-mätare (EVOM) för att bedöma monolagrets mognad. När skären når en TEER på minst 1 000 Ω·cm2 anses de vara klara för analys18.
OBS: Insatserna tar vanligtvis 7-10 dagar att nå denna TEER efter sådd. T84-cellerna kommer att visa 100% sammanflöde under ljusmikroskopi när detta motstånd har uppnåtts.- Förvara EVOM-sonden med elektroderna nedsänkta i 0,15 M KCl när de inte används.
- Innan du mäter TEER, dekontaminera elektrodsonden genom att sänka ner den i 5 ml 70% etanol i ett 50 ml koniskt rör i 10-15 minuter. Ta bort sonden, skaka av överflödig etanol och låt den lufttorka inuti BSC i 10 minuter. Behåll röret med etanol.
- Testa EVOM och sonden genom att placera den torra dekontaminerade sonden i en steril brunn som innehåller 1 ml TCM + antibiotika med en steril insats inuti innehållande 500 μL TCM + antibiotika. Se till att EVOM-avläsningen är < 200 Ω. Registrera detta tomma värde för att använda det i de senare motståndsberäkningarna som beskrivs i steg 1.3.6.
- Ta bort sonden från röret med TCM + antibiotika. Behåll detta rör för lagring av sonden under hela experimentet.
- Sänk försiktigt sonden i den första insatsen med den långa elektroden i uppsamlingsbrunnen och den korta elektroden inuti insatsen. Låt den långa elektroden vidröra botten av uppsamlingsbrunnen, men tryck inte ner eftersom det kan störa epitelmonoskiktet.
- Upprepa denna process för att mäta och registrera motståndet i Ohms (Ω) för varje insats. När du är klar, dekontaminera sonden i etanolen genom att sänka ner den i ytterligare 10-15 minuter. Flytta sedan den dekontaminerade sonden tillbaka till KCl-lösningen för lagring. Subtrahera det blindmotstånd som erhålls i steg 1.3.3 från varje värde som erhålls från varje insats som innehåller T84-celler. Multiplicera det resulterande motståndet (Ω) för varje skär med arean på botten av varje skär (cm 2) för att få den slutliga TEER-mätningen (Ω·cm2).
- När TEER når minst 1 000 Ω·cm2 är epitelmonolagret moget och redo för infektionsanalyser.
- När TEER mognar, förse cellerna med färskt medium var 1-2: e dag.
- I en ny 24-brunnsplatta, tillsätt 1 ml TCM + antibiotika till en brunn för varje sådd insats som förbereds.
- Använd sterila pincett och överför försiktigt insatserna till de nyligen påfyllda brunnarna.
- Byt ut media i insatserna.
- Ta bort det gamla mediet från insatserna genom att luta plattan och använda en intern vakuumsugare för att försiktigt ta bort mediet med en pipettspets längs sidan av insatsen. Andningsskyddet möjliggör reglering av sug på låg nivå för att förhindra störningar i cellerna. Låt inte pipettspetsen röra botten av insatsen, eftersom detta kommer att störa det utvecklande epitelmonoskiktet.
- Tillsätt 500 μL TCM + antibiotika till insatserna. Visualisera monolagret med ljusmikroskopi för att verifiera att det förblir intakt.
- Mät TEER var 1–2:e dag över varje skärande medel enligt beskrivningen ovan i steg 1.3.2–1.3.6.
2. Förbereda T84-cellerna 1 dag före experimentet med TCM w / o antibiotika
- Mät och registrera TEER dagen före experimentet.
- Byt ut TCM på samma sätt som under föregående cellförberedelse och underhåll. TCM w/o antibiotika används dock istället som förberedelse för infektionen (1 ml i plattbrunnen och 500 μL i insatsen).
3. E. coli-kulturer (startade 1 dag före experimentet)
VARNING: Använd försiktighetsåtgärder på biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) när du arbetar med patogena kliniska E. coli-stammar.
- Ta ett märkt 15 ml koniskt rör med 5 ml steril lysogenibuljong (LB) och använd en steril slinga för att inokulera buljongen med en koloni från en bakteriestam (E. coli). Upprepa denna process och skapa ett odlingsrör över natten för varje stam som ska testas.
- Inkubera nattkulturen, med rörens lock lossade, i en inkubatorskakare (250 rpm, 37 °C).
4. Förbereda E. coli-inokulum , epitelceller och material (på experimentets morgon)
OBS: Använd TCM utan antibiotika som värmts upp till 37 °C från och med nu.
- Tillsätt 250 μl från varje LB-odling över natten till 25 ml TCM utan antibiotika i ett 50 ml koniskt rör (ett per enskild stam). Håll rörens lock lossnade. Placera dessa nya odlingsrör i skakapparaten vid samma inställningar (250 rpm, 37 °C) i exakt 2 timmar. Utför de återstående delstegen medan du väntar.
- Mät TEER över varje skärande del, enligt beskrivningen i steg 1.3.2–1.3.6. Registrera dessa som TEER vid tiden (t) = 0 h.
- Flytta insatserna till brunnar i en ny platta och byt media med den teknik som beskrivs i steg 1.4.3. Men den här gången fyller du de nya uppsamlingsbrunnarna med 500 μL TCM w / o-antibiotika och fyller insatserna med 400 μL TCM w / o antibiotika. Håll insatserna inuti vävnadsodlingsinkubatorn tills infektionstiden.
- Ange ett tillräckligt antal kvadratiska LB-agarplattor för att värmas till rumstemperatur (RT) för senare plätering och bakteriekvantifiering.
5. Inokulering av cellerna (experimentets början)
- Efter exakt 2 timmar, ta bort morgonbakteriekulturerna från shakern och centrifugera dem i 10 minuter (1 900 x g, 4 °C).
OBS: För alla följande steg, håll alla bakteriesuspensioner på is för att minimera tillväxten. - Återsuspendera bakteriepelleten i TCM w / o antibiotika. Använd en spektrofotometer för att justera den optiska densiteten (OD) till 0,7-0,9 och späd ytterligare med TCM w/o-antibiotika till en koncentration av 1 x 106 kolonibildande enheter (CFU)/ml (cirka 1:100 utspädning). Använd denna bakteriesuspension för att infektera varje insats med 1 x 105 CFU per 100 μL volym.
- Märk transwellplattan och infektera varje insats med 100 μl av den OD-justerade inokulatet (totalt 1 x 105 CFU per skär). Analysen har nu börjat. Notera tiden och registrera den som t = 0 h.
- Plätera bakteriesuspensionen av inokulat för att kvantifiera CFU/ml med hjälp av spårutspädningsmetoden och plätera 10 μL alikvoter på kvadratiska LB-agarplattor19.
6. Kvantifiering av transcytos
- Var 30:e minut efter inokulering fyller du nya brunnar med 500 μL TCM utan antibiotika. Överför insatserna till dessa nya brunnar med en annan uppsättning sterila pincett för varje bakteriestam.
- Samla media från den använda uppsamlingsbrunnen för varje insats i separata märkta rör. Placera dessa rör på is. Återför transwellplattorna till inkubatorn mellan tidpunkterna.
- För varje insats, kombinera det uppsamlade mediet från t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h och t = 2 h och virvel kort. Platta det uppsamlade mediet på LB-agarplattor med hjälp av spårutspädningsmetoden för att kvantifiera mängden bakterier som transcytoseras under experimentets första 2 timmar.
OBS: Att hämta bakterierna var 30:e minut och hålla dem på is säkerställer att bakterietillväxten i uppsamlingsbrunnarna minimeras och mätningar görs på övervägande transcytoserade bakterier. - Placera de märkta spårutspädnings-LB-agarplattorna i bakterieinkubatorn vid 37 °C utan kompletterande CO2 och återför T84-transwellplattan till vävnadsodlingsinkubatorn.
- Vid t = 4 h, upprepa steg 6.3 genom att kombinera det uppsamlade mediet från t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h och t = 4 h.
- Vid t = 6 h, upprepa steg 6.3 genom att kombinera det uppsamlade mediet från t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h och t = 6 h. Dessutom, vid t = 6 h, platta media från kontrollbrunnarna.
7. Slut på experimentet
- Mät och registrera TEER i slutet av experimentet, t = 6 h. Använd proceduren som beskrivs i steg 1.3.2-1.3.6.
- Dekontaminera sonden genom att sänka ner den i 70% etanol i 10-15 min. Kassera inläggen eller spara/bearbeta dem för ytterligare applikationer om så önskas. Låt LB-agarplattorna inkubera över natten och desinficera och/eller kassera alla andra använda material på ett säkert sätt.
- Efter inkubation över natten, räkna bakteriekolonierna manuellt på spårutspädning LB-plattorna för att bestämma inokulummängden och mängden E. coli-transcytos. Se till att kontrollplattorna inte visar någon bakterietillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: T84 TEER över tid. När T84-cellskiktet mognar på insatsen ökar monoskiktets elektriska motstånd. Vid en TEER på minst 1 000 Ω·cm2 är cellskiktet tillräckligt utvecklat för att minska den paracellulära bakterietransporten och möjliggöra mätning av främst transcellulär bakterietransitering. Felstaplarna anger standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Under proliferationen av de sterila T84-celler som beskrivs i avsnitt 1 stiger TEER över T84-monolagren kontinuerligt över tiden och överstiger 1 000 Ω·cm2 ungefär efter 7 dagar efter sådd (se figur 1). Även om epitelcellspolariseringen och mognaden av TEER är mer robusta med T84-celler än med andra tarmceller, såsom Caco-2, kan viss felsökning fortfarande krävas6. TEER för ett skär bör inte minska dramatiskt mellan mätningarna. En sådan nedgång i TEER kan indikera en mekanisk störning av epitelmonoskiktet. Man bör se till att under mediumförändringen vidrör aspiratorns spets aldrig botten av cellodlingsinsatsen. Om denna typ av skada misstänks kan den visualiseras med ljusmikroskopi som en frånvaro av epitelceller nära aspirationsplatsen. Förutom skador från hantering kan en minskning av TEER indikera förorening.
Figur 2: Transcytos av neonatala E. coli-isolat över tid. Efter infektion av T84-insatserna kvantifieras neonatala E. coli kliniska isolat som framgångsrikt når uppsamlingsbrunnen med hjälp av spårutspädningsmetoden. Olika E. coli-stammar kan jämföras med avseende på deras förmåga att transcytose tarmepitelet. Den icke-patogena E. coli DH5 alfa inkluderades som en komparator. Diagrammen visar de genomsnittliga CFU: erna och standardfelen vid varje tidpunkt. Jämförelserna av de genomsnittliga transcytosvärdena gjordes med ensidiga t-tester, som visade signifikanta skillnader mellan neonatala E. coli-isolat #1 kontra #2 vid 2 h (*p < 0,05), 4 h (**p < 0,04) och 6 h (***p < 0,04) efter infektion. Däremot genomgick den icke-patogena E. coli-stammen DH5 alfa minimal transcytos, vilket visas i den tredje plotten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den kvantifierade transcytosen kan representeras som visas i figur 2. I detta exempel utfördes experimenten med hjälp av tre insatser, var och en infekterad med två olika neonatala invasiva E. coli-isolat. En icke-patogen stam, DH5 alfa, testades också för jämförelse. Två sterila kontrollinsatser ingick också (inget diagram visas eftersom inga bakterier isolerades). Data från denna procedur är användbara för att beskriva förmågan hos en enda E. coli-stam att transcytose tarmepitelet. Uppgifterna kan också möjliggöra en jämförelse av transcytosförmågan hos olika stammar (se diskussionsavsnittet för ytterligare tillämpningar).
Figur 3: TEER omedelbart före infektion och 6 timmar efter infektion. TEER för insatserna ökar vanligtvis efter infektion med neonatala E. coli-bakterieproducerande stammar2. De infekterade skären visar en större ökning av TEER än de oinfekterade kontrollinsatserna. TEER var signifikant större i T84 monolager efter 6 timmars infektion med neonatal E. coli stam #1 (*p < 0,01) och E. coli stam #2 (**p < 0,03), beräknat med t-tester. TEER i de icke-infekterade kontrollmonolagren T84 ökade också, men skillnaden mellan värdena före och efter infektion var inte statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 visar typiska TEER-resultat före och efter infektion med två neonatala E. coli kliniska isolat med olika förmåga att transcytosa tarmepitelceller. Hastigheten och mängden transcytos varierar mellan stammar, som visas i figur 2, men TEER ökar signifikant efter infektion med båda patogena stammarna.
Resultaten kan ändras i närvaro av kontaminering i detta experiment. De neonatala E. coli-stammarna som användes orsakade inte tillräcklig skada på epitelmonolagret för att producera en minskning av TEER, men bakterierna kunde transcytos. Det är troligt att en förorenande organism, om den är närvarande, kan orsaka skador på tarmcellerna och en efterföljande minskning av TEER. De sterila kontrollinsatserna hjälper till att identifiera sådan eventuell förorening. Vävnadsodlingsmediet som används i denna procedur innehåller den fenolröda pH-indikatorn. I allmänhet framträder mediet en klar rosa när den är steril eller infekterad med en liten inokulum. Med betydande tillväxt eller förorening kan mediet bli grumligt, gult eller illaluktande. Före infektion verkar mediet i alla T84-skär normalt klarrosa.
Efter inkubation över natten är den sista platsen att kontrollera kontaminering på LB-agarplattorna. Kontrollplattorna ska inte visa någon tillväxt. Plattorna gjorda av uppsamlingsbrunnarna av E. coli-infekterade insatser bör innehålla homogena, runda, gula E. coli-kolonier. För att minimera risken för kontaminering bör allt arbete utföras i biosäkerhetsskåp. Separata skåp och inkubatorer bör användas för steril vävnadsodling, E. coli-infekterad vävnadsodling och bakteriell manipulation. Arbetsytorna ska hållas rena och en steril teknik ska användas hela tiden.
Figur 4: Diagrammatisk representation av transwellsystemet och relevanta tarmcellsstrukturer. (A) Sektionsvy av transwellinsatsen (blå); De vertikala linjerna längst ner på insatsen indikerar de permeabla porerna. De polariserade tarmepitelcellerna bildar ett monolager längst ner på insatsen. Vävnadsodlingsmediet visas i rosa, med en tvåkantig EVOM-sond nedsänkt i den. Sondtrådarna på motsatt sida är anslutna till EVOM-apparaten (visas inte). (B) Förenklat diagram över de snäva korsningskomponenterna i tarmepitelceller. De vertikala pilarna representerar möjliga vägar för bakteriell passage från den apikala till den basolaterala sidan av det polariserade tarmepitelmonoskiktet. Förkortningar: ZO = zona ockludens proteiner; JAM = korsningsvidhäftningsmolekyler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Apikal tillväxt av neonatala E. coli-isolat över tid. Mätningar av E. coli i supernatanter som ligger över T84-celler i transwellinsatser kan utföras som en valfri, ytterligare slutpunkt. Figuren visar att den apikala tillväxten av båda patogena E. coli-stammarna som testades för transcytos inte var signifikant annorlunda över tiden. Felstaplarna anger standardavvikelser. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod härrör från tekniker som används i gastroenterologi och infektionssjukdom20. In vitro-modeller av tarmepitelbarriären har använts för att belysa de mekanismer genom vilka luminalinnehållet interagerar med denna relevanta komponent av medfödd immunitet 6,8. Värd-patogeninteraktionerna för invasiv neonatal E. coli har också karakteriserats separat genom genetisk analys, studier av antimikrobiell resistens och immunologiska tekniker 1,5,16,21. Emellertid, lite är känt om de molekylära mekanismer som ligger till grund för förmågan hos E. coli neonatala isolat att komma in i blodomloppet genom tarmen3.
Transcytostekniken som demonstreras häri möjliggör en mer detaljerad karakterisering av de neonatala E. coli-invasiva stammarna som producerar septikemi efter enteralt förvärv. Neonatal bakteriemi är en flerstegsprocess, och transcytos är ett av de relevanta stegen. Jämfört med invasionsmodeller erbjuder denna transcytosmetod ytterligare information om mekanismerna som är involverade i patogenesen av bakterieemi. I vissa fall invaderar patogena E. coli tunntarmen utan att nå blodomloppet, vilket begränsar infektionen till att orsaka lokaliserad sjukdom22. Således kan bakteriernas förmåga att helt enkelt invadera tarmepitelet inte återspegla deras förmåga att helt passera genom epitelbarriären. Denna modell kan användas för att studera processen för bakteriell passage över tarmepitelet genom de transcellulära eller paracellulära vägarna, särskilt om ytterligare tekniker som elektronmikroskopi införlivas20. Jämfört med in vivo-djurmodeller är denna in vitro-modell effektivare och möjliggör bättre kontroll av flera potentiella variabler. Dessutom bidrar det till djurens välbefinnande genom att tillhandahålla ett alternativ till in vivo-experiment .
Trots dessa fördelar har detta experiment fortfarande sina begränsningar. För det första tar denna analys inte hänsyn till skillnader i bakterietillväxt på epitelets apikala sida under inkubation. Sådana tillväxtskillnader kan påverka mängden transcytos för varje stam. Användare kan välja att mäta apikal tillväxt för en mer omfattande karakterisering av resultaten som erhållits med denna modell. Ett exempel på den apikala tillväxten av de två E. coli-isolat som används för transcytosexperimenten i de metoder som presenteras i detta manuskript visas i kompletterande figur 1. Dessutom, även om denna modell rimligen återskapar tarmepitelmonoskiktet, representerar den inte helt alla komponenter i tarmbarriären som skyddar blodomloppet från intagna patogener. Ändå kan vissa egenskaper hos tarmepitelet studeras med denna modell. Till exempel utsöndrar T84-celler klorid och producerar mucin23. Invasion av diarréproducerande E. coli är associerad med ökad kloridsekretion i T84-celler och en signifikant minskning av TEER efter 6 timmar efter infektion24. Det är möjligt att invasion av bakterieimiproducerande E. coli-stammar också ökar kloridsekretionen i denna modell och att en minskning av TEER kan inträffa efter 6 timmars infektion. Denna modell kan anpassas för studier av sambandet mellan jontransport och bakterieinvasion om så önskas av andra forskare. Mucin är en fysisk barriär som skyddar epitelet mot patogener. Infektion med andra E. coli-stammar minskar mucinuttrycket av T84-celler25. Mucins roll i patogenesen av neonatal E. coli-transcytos över tarmepitelet kan också studeras med denna modell. En annan användning av denna modell kan vara att studera de cytotoxiska effekterna av bakteriella cyklomoduliner och deras möjliga roll i processen för transcytos av neonatala E. coli-stammar. Till exempel riktar sig cytotoxisk nekrotiserande faktor-1 (CNF-1), som produceras av vissa patogena E. coli-stammar, mot Rho GTPaser, som är avgörande för att reglera tät korsningsfunktion och apoptos hos infekterade eukaryota celler26. Denna transwellmodell kan anpassas för att bättre förstå de mekanismer genom vilka dessa cytotoxiner påverkar tarmepitelet27. När man använder denna modell för att studera interaktionen mellan neonatala E. coli-stammar och tarmepitelet är det viktigt att tänka på att T84-cellerna som används för att modellera tarmepitelet kommer från en lungmetastasering av kolon adenokarcinom hos en vuxen6. Medan studier i T84-celler har reproducerat specifika effekter på tarmpermeabiliteten som har översatts till liknande effekter i humana nyfödda och neonatala djurs tarmceller28,29, kan fostrets och neonatala tarmepitel bete sig annorlunda i närvaro av invasiv E. coli.
Viss felsökning kan krävas för att optimera den här modellen och kvaliteten på de data som den tillhandahåller. Användningen av sterila kontrollinsatser diskuteras i detalj i avsnittet om representativa resultat. Andra icke-invasiva E. coli-stammar kan också inkluderas som negativa / minimala transcyktoskontroller. Dessutom kan en annan cellinje, såsom Caco-2, användas för att bedöma förmågan hos de neonatala E. coli-stammarna att transcytos polariserat tarmepitel. Invasionen och transcytosen av E. coli har visat sig vara större för T84-celler jämfört med Caco-2-celler30. Därför måste dessa skillnader beaktas när denna modell används för att utvärdera bakteriell transcytos med dessa och andra epitelceller som polariserar och bildar täta korsningar. Att göra TEER-mätningar av varje enskild transwellinsats kräver flera sekunder, och när flera stammar testas måste den extra operatörstiden beaktas. Effektivare metoder för övervakning av TEER i transwellsystem fortsätter att utvecklas. Dessa nyare enheter gör det möjligt att övervaka TEER samtidigt i flera transwellinsatser och i realtid31. Forskare som överväger dessa alternativ skulle behöva avgöra om den sparade tiden potentiellt kan kompensera det ökade priset på dessa nyare enheter jämfört med de enelektrodmätningar som beskrivs häri.
Trots vissa möjliga utmaningar tillåter denna analys forskare att studera specifika mekanismer som är involverade i patogenesen av E. coli-bakteriemi utöver bara mängden transcytos. I kombination med molekylära mikrobiologiska tekniker kan denna process användas för att fastställa effekterna av enskilda gener på E. colis förmåga att transcytosa tarmepitelet, vilket har försökts i djurmodeller32. Denna modell kan också modifieras genom samodling av immunceller eller tillsats av cytokiner, tillväxtfaktorer och farmaceutiska ingrepp för att simulera mer komplexa immun- och farmakodynamiska svar33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett Sarah Morrison-studiebidrag utfärdat av University of Missouri-Kansas City School of Medicine till AI
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, Å The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
